CN108785668B - 免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒 - Google Patents

免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108785668B
CN108785668B CN201810051881.8A CN201810051881A CN108785668B CN 108785668 B CN108785668 B CN 108785668B CN 201810051881 A CN201810051881 A CN 201810051881A CN 108785668 B CN108785668 B CN 108785668B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
immunomagnetic composition
cancer
immunomagnetic
composition
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810051881.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108785668A (zh
Inventor
徐伟成
陈三元
江智圣
谢佳宏
林佑融
蔡长海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hong Mingqi
Original Assignee
Hong Mingqi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hong Mingqi filed Critical Hong Mingqi
Priority to AU2018262962A priority Critical patent/AU2018262962B2/en
Priority to PCT/CN2018/084769 priority patent/WO2018201981A1/zh
Priority to EP18793787.5A priority patent/EP3636269A4/en
Priority to CA3062089A priority patent/CA3062089C/en
Publication of CN108785668A publication Critical patent/CN108785668A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108785668B publication Critical patent/CN108785668B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/804—Blood cells [leukemia, lymphoma]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • A61K2039/82—Colon

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了一种免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒，免疫磁性组成物包含核心层、壳层、以及外层。壳层是由复合物所构成，且壳层包覆核心层。复合物是由褐藻多醣、氧化右旋糖酐及超顺磁性氧化铁纳米粒子经疏水性作用力结合而形成。外层包含至少一种抗体，且抗体嫁接于壳层外构成外层。借此，前述免疫磁性组成物可用于制备抗癌的药物。

Description

免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒
技术领域
本发明系关于一种组成物及其制备方法，特别是一种以特殊物理形态为特征的免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒。
背景技术
癌症又名为恶性肿瘤，是一种细胞不正常增生的状态，且这些增生的细胞可能侵犯身体的其他部分，为由控制细胞分裂增殖机制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不断增加的趋势，癌症系国人十大死因之一，且已连续二十七年为居十大死因的榜首。
常规的癌症治疗方法包括手术治疗、放射线治疗及化疗等。免疫疗法为上述治疗方法以外的另一种治疗癌症的方法，是通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。而免疫检查哨(immune checkpoint)为几种免疫治疗中最受重视的一种，从2015年至今，已经有超过50项利用免疫检查哨抑制剂(immune checkpoint inhibitor)的复方疗法展开了临床试验。但免疫检查哨抑制剂会关闭人类的免疫系统的回馈机制，使细胞毒性T细胞(CD8+T细胞)于攻击癌细胞之余，也会产生皮肤溃烂、肠胃溃疡等自体免疫反应。
增加体内对于肿瘤具有专一性的免疫细胞也被视为癌症治疗中相当具有希望的一环。目前的技术大多从患者身上取得肿瘤中的免疫细胞，并于体外进行培养，利用微米尺寸的结构体(例如微珠microbead)来模仿抗原呈现细胞(antigen presenting cell,APCs)，进行T细胞的增生和训练，最后回输至患者体内用以猎杀癌细胞。但这样的方式耗时且耗材，且患者体内的癌细胞容易产生变异，使回输的免疫细胞失去本来应该发挥的效果。另一方面，用来进行增生的微珠由于尺寸过大只能用于体外培养，无法经由人体血液循环进入目标区域。此外，此类载体除了表面嫁接的抗体或是包覆的有效成分外，形成载体的材料通常为赋形剂，对于治疗本身并没有太大的帮助，且会限制施打时的剂量，成为此类材料天生的缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于制备抗癌的药物的免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒。
有鉴于此，本发明的一目的是在提供一种免疫磁性组成物，其包含核心层、壳层和外层。前述壳层是由复合物构成，壳层包覆核心层，其中复合物是由褐藻多醣(fucoidan)、氧化右旋糖酐(dextran)及超顺磁性氧化铁纳米粒子经疏水性作用力(hydrophobicinteraction)结合而形成。前述外层包含至少一种抗体，且前述抗体嫁接于壳层外构成外层，其中抗体为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂。
依据前述的免疫磁性组成物，其中前述免疫磁性组成物可为球体，且球体的粒径介于80nm至350nm之间。
依据前述的免疫磁性组成物，其中前述褐藻多醣可萃取自裙带菜(Undariapinnatifida)、梨形囊巨藻(Macrocystis pyrifera)或墨角藻(Fucus vesiculosus)。
依据前述的免疫磁性组成物，其中氧化右旋糖酐可具有醛基，氧化右旋糖酐可由分子质量介于5kDa至270kDa之间的右旋糖酐制备而得。
依据前述的免疫磁性组成物，其中前述免疫检查哨抑制剂可选自PD-L1抗体、PD-1抗体、CTLA-4抗体及TIM-3抗体所组成的群组，前述杀手T细胞增生剂可选自CD3抗体、CD28抗体及4-1BB抗体所组成的群组。
依据前述的免疫磁性组成物，其中前述核心层可另含有活性物质。
借此，本发明的免疫磁性组成物利用具有抗癌活性的褐藻多醣、氧化右旋糖酐以及超顺磁性氧化铁纳米粒子作为载体组成，进而形成外层具有抗体且可在核心层包覆活性物质的纳米等级结构；其大小及表面电荷合适，可增长体内循环时间，并渗透进入肿瘤，增强褐藻多醣对于肿瘤的作用。而外层的抗体可为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂，使本发明的免疫磁性组成物除了本身材料的抗癌功能外，还可以同时为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂，大幅改善肿瘤的微环境，且本发明的免疫磁性组成物可大幅改善单独以相同的抗体进行免疫治疗的抗癌效果，可以更少的抗体用量达到更佳的肿瘤抑制能力。另外，制造完成的免疫磁性组成物可利用冻干形成粉状晶体于无菌下长期保存，在有需要时以溶剂回溶即可使用，显示其方便和稳定性佳的特性。
本发明的另一目的是在提供一种免疫磁性组成物的制备方法，前述方法包含提供水相溶液、提供油相溶液、进行乳化反应、移除乳液中的有机溶剂和进行抗体嫁接等步骤。在提供水相溶液的步骤中，前述水相溶液包含褐藻多醣和氧化右旋糖酐。在提供油相溶液的步骤中，前述油相溶液包含有机溶剂和超顺磁性氧化铁纳米粒子。在进行乳化反应的步骤中，先是混合前述水相溶液和前述油相溶液以形成乳液。再移除乳液中的有机溶剂，以形成磁性褐藻多醣载体。在进行抗体嫁接的步骤，是混合磁性褐藻多醣载体和至少一种抗体，以形成免疫磁性组成物，其中抗体可为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂。
依据前述的免疫磁性组成物的制备方法，其中前述免疫检查哨抑制剂可选自PD-L1抗体、PD-1抗体、CTLA-4抗体及TIM-3抗体所组成的群组，前述杀手T细胞增生剂可选自CD3抗体、CD28抗体及4-1BB抗体所组成的群组。
依据前述的免疫磁性组成物的制备方法，其中褐藻多醣和氧化右旋糖酐的重量比例可为1：0.1至1：4。
依据前述的免疫磁性组成物的制备方法，其中氧化右旋糖酐可具有醛基，氧化右旋糖酐可由分子质量可介于5kDa至270kDa之间的右旋糖酐制备而得。
依据前述的免疫磁性组成物的制备方法，其中有机溶剂可为甲醇(methane)、二氯甲烷(dichloromethane)或三氯甲烷(chloroform)。
借此，本发明的免疫磁性组成物的制备方法，不同于他种标靶载体的复杂制造过程，也不需要利用多余的界面活性剂来稳固结构，材料的取得与制作也相当容易。
本发明的再一目的是在提供一种如前述免疫磁性组成物的用途，其是用于制备抗癌的药物，所述癌症为乳腺癌或大肠癌。
依据前述的免疫磁性组成物的用途，其中前述抗癌的药物可为抑制癌症细胞增生的药物、抑制乳腺癌转移的药物或引发乳腺癌肿瘤免疫反应的药物。
本发明的又一目的是在提供一种用于治疗癌症的试剂盒，所述癌症为乳腺癌或大肠癌，其包含如前述免疫磁性组成物和磁场产生装置。
借此，本发明的用于治疗癌症的试剂盒包含本发明的免疫磁性组成物和磁场产生装置，可通过磁场产生装置作为磁导引的辅助工具，将本发明的免疫磁性组成物集中累积于患部，达到局部放大治疗的效果，避免全身性的免疫反应。是以本发明的用于治疗癌症的试剂盒同时具有物理性的标靶和生物性的标靶作用，是以其仅需使用公知施打纯抗体剂量的百分之一，却得以展现更优异的肿瘤抑制能力，并增长2倍以上的半生存期。
上述发明内容旨在提供本发明的简化摘要，以使阅读者对本发明具备基本的理解。此发明内容并非本发明的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。
附图说明
为让本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，结合附图说明如下：
图1绘示本发明的免疫磁性组成物的结构示意图；
图2绘示本发明的免疫磁性组成物的制备方法的步骤流程图；
图3A至图3F为磁性褐藻多醣载体的结构分析图；
图4A至图4C为磁性载体IO@Fu的结构分析图；
图5A和图5B为磁性载体IO@Dex的结构分析图；
图6A至图6C为磁性褐藻多醣载体的稳定性分析结果图；
图7A和图7B为磁性褐藻多醣载体冻干前后的穿透式电子显微镜照片图；
图8为本发明的免疫磁性组成物的一实施方式的结构分析图；
图9为本发明的免疫磁性组成物的一实施方式的X射线光电子能谱学(XPS)分析结果图；
图10A和图10B为本发明的免疫磁性组成物的另一实施方式的结构分析图；
图11A至图11F为本发明的免疫磁性组成物的标靶能力和细胞结合能力的分析结果图；
图12A至图12D为本发明的免疫磁性组成物的细胞结合能力的分析结果图；
图13A至图13C为本发明的用于治疗癌症的试剂盒集中累积至肿瘤的分析结果图；
图13D为本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒治疗效果的苏木素-伊红染色搭配普鲁士蓝染色结果图；
图14A至图14E为本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒于乳腺癌肺转移小鼠模型中抑制癌症细胞增生和癌症转移的分析结果图；
图15A至图15C为本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒于大肠癌小鼠模型中抑制癌症细胞增生的分析结果图；
图16A至图16I为施用本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒后，肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞数量变化和细胞因子含量变化的分析结果图；
图17A和图17B为本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒的反应位点的分析结果图；
图17C和图17D为本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒的TUNEL检测结果图；
图18A至图18E为施用本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒后小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润程度分析图；
图19A至图19D为施用本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒后小鼠血液生化分析结果图；以及
图20为施用本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒后小鼠的病理切片图。
具体实施方式
本说明书公开内容提出一种新颖的免疫磁性组成物，其是将褐藻多醣和氧化右旋糖酐以疏水性作用力与超顺磁性氧化铁纳米粒子结合后，再嫁接抗体而得，所制得的免疫磁性组成物可大幅改善单独以相同的抗体进行免疫治疗的抗癌效果，可以更少的抗体用量达到更佳的肿瘤抑制能力。此外，本说明书也公开一种新颖用于治疗癌症的试剂盒，其是包含本案的免疫磁性组成物和磁场产生装置，可进一步提升本发明的免疫磁性组成物的抗癌效果。说明书中以乳腺癌肺转移和大肠癌的小鼠动物模型，来验证本案的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒在免疫治疗上的功效和机制。
以下为本说明书中所用特定名词的说明：
说明书中前述的“褐藻多醣(fucoidan)”是一种水溶性食物纤维，萃取自褐色海藻表面独有的黏滑成分。褐藻多醣富含岩藻糖，为一种生物安全性高，且抗氧化、抗凝血、抗血栓、抗病毒及抗癌等多种生物活性的天然多醣。
说明书中前述的“右旋糖酐(dextran)”是一种复合且支链的葡聚糖(由许多葡萄醣分子构成的多醣)，其构成的分子质量可从3Da至2000kDa不等。右旋糖酐中的直链部分由经α-1,6糖苷键相连在一起的葡萄糖分子组成，而支链由α-1,3糖苷键引出。而说明书中前述的“氧化右旋糖酐(oxidized dextran)”是将右旋糖酐进行表面修饰，使右旋糖酐上的羟基氧化成醛基，得到后续可进一步嫁接抗体的氧化右旋糖酐。
请参照图1，其绘示本发明的免疫磁性组成物100的示意图。免疫磁性组成物100包含核心层110、壳层120和外层130。
核心层110可含有活性物质，而活性物质可为细胞因子或抗癌药物。
壳层120是由复合物构成，壳层120包复核心层110，其中复合物是由褐藻多醣、氧化右旋糖酐及超顺磁性氧化铁纳米粒子经疏水性作用力结合而形成。进一步地说，构成壳层120的复合物所使用的褐藻多醣可萃取自裙带菜(Undaria pinnatifida)、梨形囊巨藻(Macrocystis pyrifera)或墨角藻(Fucus vesiculosus)，所使用的氧化右旋糖酐可具有醛基，且其可由分子质量介于5kDa至270kDa之间的右旋糖酐制备而得。而褐藻多醣、氧化右旋糖酐及超顺磁性氧化铁纳米粒子之间的疏水性作用力可经由乳化作用或纳米沉淀法等方法形成，但本发明并不欲以此为限。
外层130包含至少一种抗体131，且抗体131嫁接于壳层120外构成外层130。其中抗体131可为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂，而免疫检查哨抑制剂可选自PD-L1抗体、PD-1抗体、CTLA-4抗体及TIM-3抗体所组成的群组，杀手T细胞增生剂可选自CD3抗体、CD28抗体及4-1BB抗体所组成的群组。
进一步地说，前述免疫磁性组成物100可为球体，且球体的粒径介于80nm至350nm之间。此外，前述免疫磁性组成物呈空心状。
请参照图2，其绘示本发明的免疫磁性组成物的制备方法300的步骤流程图。在图2中，免疫磁性组成物的制备方法300包含步骤310、步骤320、步骤330、步骤340和步骤350。
步骤310是提供水相溶液，水相溶液包含褐藻多醣和氧化右旋糖酐，其中所使用的褐藻多醣可萃取自裙带菜(Undaria pinnatifida)、梨形囊巨藻(Macrocystis pyrifera)或墨角藻(Fucus vesiculosus)，所使用的氧化右旋糖酐可具有醛基，其可由分子质量介于5kDa至270kDa之间的右旋糖酐制备而得。褐藻多醣和氧化右旋糖酐以1：0.1至1：4的重量比例混合。
步骤320是提供油相溶液，油相溶液包含有机溶剂和超顺磁性氧化铁纳米粒子，其中有机溶剂可为甲醇(methane)、二氯甲烷(dichloromethane)或三氯甲烷(chloroform)。
步骤330是进行乳化反应，将步骤310所提供的水相溶液和步骤320所提供的油相溶液混合形成乳液。
在步骤340中，可通过减压蒸发等方法移除乳液中的有机溶剂，以形成磁性褐藻多醣载体。
步骤350是进行抗体嫁接，将磁性褐藻多醣载体和至少一种抗体嫁接，以形成免疫磁性组成物。所使用的抗体可为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂，其中免疫检查哨抑制剂可选自PD-L1抗体、PD-1抗体、CTLA-4抗体及TIM-3抗体所组成的群组，杀手T细胞增生剂可选自CD3抗体、CD28抗体及4-1BB抗体所组成的群组。
据此，经由前述方法制备而得的免疫磁性组成物可于后续用作为抗癌的药物，例如可作为抑制癌症细胞增生的药物、抑制癌症转移的药物和引发肿瘤免疫反应的药物。且经由前述方法制备而得的免疫磁性组成物呈空心状，因此可进一步包覆活性物质于核心层，以增强免疫磁性组成物的抗癌效果。
此外，经由前述方法制备而得的免疫磁性组成物可搭配磁场产生装置构成用于治疗癌症的试剂盒，所述磁场产生装置可为磁铁、三维场磁铁或磁振造影仪等可以产生磁场的装置，通过磁场产生装置产生的磁场作为磁导引的辅助工具，将本发明的免疫磁性组成物集中累积于患部，达到局部放大治疗的效果，使本发明的用于治疗癌症的试剂盒仅需使用公知施打纯抗体剂量的百分之一，却得以展现更优异的肿瘤抑制能力，并增长2倍以上的半生存期。
兹以下列具体试验例进一步示范说明本发明，用以有利于本发明所属技术领域的技术人员，可在不需过度解读的情形下完整利用并实践本发明，而不应将这些试验例视为对本发明范围的限制，但用于说明如何实施本发明的材料及方法。
<试验例>
一、本发明的免疫磁性组成物及其制备方法
1.1磁性褐藻多醣载体的结构和稳定性分析
在本试验例中，先制备未嫁接抗体的磁性褐藻多醣载体，以测试最佳制备条件，并利用扫描式电子显微镜(scanning electron microscopy；SEM)和穿透式电子显微镜(transmission electron microscopy；TEM)观察磁性褐藻多醣载体的形态。利用纳米粒径及介面电位分析仪(Delsa Nano C particle analyzer,BECKMAN COULTER)分析磁性褐藻多醣载体的介面电位(zeta potential)、粒径和磁性褐藻多醣载体在二次蒸馏(DDW)和磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的稳定性。
在制备磁性褐藻多醣载体前，先分别制备超顺磁性氧化铁纳米粒子和氧化右旋糖酐，在本试验例中所使用的氧化右旋糖酐具有醛基，以利后续嫁接抗体。超顺磁性氧化铁纳米粒子(下文中将以“IO”表示)的设计合成参考自2004年由Shouheng Sun团队所发表的文献(Shouheng Sun et al.,Monodisperse MFe2O4(M＝Fe,Co,Mn)Nanoparticles.Journalof the American Chemical Society 2004,126(1):273-279)，制备条件为将2mmol的Fe(acac)3、10mmol的1,2-十六烷二醇、6mmol的油酸和6mmol的乙酰胺在20ml的芐基醚20ml中混合后，在氮气环境下于100℃回流30分钟。再将前述反应物加热至200℃1小时后，再加热至285℃30分钟以完成IO的成核和生长。将反应物冷却至室温后，以6000rpm离心10分钟收集IO，并以乙醇纯化3次，以完成IO的制备。
具有醛基的氧化右旋糖酐(下文中将以“Dex”表示)的制备方法如下：将右旋糖酐(分子量为5kDa至270kDa)在室温下避光溶解于含有过碘酸钠溶液(10mM)的含水氧化缓冲液(0.5-10mg ml-1，pH＝5.5)中氧化30分钟。利用Amicon(分子量为3kDa)透析修饰后Dex以除去过碘酸钠。并利用冷冻干燥机(FreeZone 1L Benchtop Freeze Dry Systems,Labconco,Kansas)再分散和冻干前述Dex。所制得Dex利用核磁共振(Nuclear MagneticResonance；NMR)分析结构，并利用比色法醛基测定试剂盒(MAK140,sigma)分析其修饰的程度。
在本试验例中，磁性褐藻多醣载体的制备条件如下：将0.5mg/ml的褐藻多醣(萃取自墨角藻)和0.5mg/ml的Dex混合作为水相溶液。将2mg的IO溶于0.2ml的二氯甲烷中作为油相溶液。将前述水相溶液和油相溶液混合后，以均质机(Double Eagle Enterprise Co，Ltd)以120W的功率乳化50秒，以得到乳液。使用旋转蒸发器除去二氯甲烷后，利用磁选设备(MagniSort，eBioscience)纯化所制得的磁性褐藻多醣载体(下文中将以“IO@FuDex”表示)，并将IO@FuDex以DDW或0.1M的PBS(pH＝6)重新悬浮以进一步进行抗体嫁接。此外，本试验例中另分别以0.5mg/ml的褐藻多醣或0.5mg/ml的Dex作为水相溶液，以溶于二氯甲烷的IO作为油相溶液，利用相同制备方法制备磁性载体IO@Fu(水相溶液为褐藻多醣)或IO@Dex(水相溶液为具有醛基的氧化右旋糖酐)。所制备好的IO@FuDex、IO@Fu和IO@Dex利用扫描式电子显微镜和穿透式电子显微镜分析的形态；利用纳米粒径及介面电位分析仪分析介面电位和粒径；以及利用超导量子干涉磁量仪来进行磁性分析。
请参照图3A至图6C，图3A至图3F为磁性褐藻多醣载体的结构分析图，其中图3A为IO@FuDex的扫描式电子显微镜照片图，图3B至图3F为IO@FuDex的穿透式电子显微镜照片图。图4A至图4C为磁性载体IO@Fu的结构分析图，其中图4A和图4B为IO@Fu的扫描式电子显微镜照片图，图4C为IO@Fu的穿透式电子显微镜照片图。图5A和图5B为磁性载体IO@Dex的结构分析图，其中图5A为IO@Dex的扫描式电子显微镜照片图，图5B为IO@Dex的穿透式电子显微镜照片图。图6A至图6C为磁性褐藻多醣载体的稳定性分析结果图，其中图6A为IO@FuDex、IO@Fu和IO@Dex的流体力学尺寸分布图，图6B为IO@FuDex、IO@Fu和IO@Dex的介面电位分析图，图6C为IO@FuDex和IO的磁性分析图。
图3A的结果显示，通过扫描式电子显微镜的观察，可以看出IO@FuDex为球状结构，并因为电子显微镜的中空环境而有塌陷的现象，代表其为中空结构。由图3B的结果显示，通过穿透式电子显微镜可观察到IO@FuDex因塌陷而重迭的壳层所造成的暗对比。图3C为将壳层处放大的穿透式电子显微镜照片图，也可以见到许多大小约为5nm的超顺磁性氧化铁纳米粒子，证明其为壳层的组成的结构。而在图3D的暗场观测以及图3E和图3F的元素分布探测下，则可再次看出明显的中空结构以及氧化铁分布于载体中的状况。
图4A至图5B的结果显示，IO@Fu和IO@FuDex一样具有均匀的结构，而IO@Dex则不稳定，在蒸发的过程趋于聚集在一起，导致可观察到广泛的粒径分布和随机形态外观。
而图6A和图6C的结果显示，IO@FuDex在流体中呈现均一粒径，粒径大小介于80nm至350nm之间，且平均粒径为141.5nm，其小于IO@Fu的平均粒径(241nm)。而IO@FuDex和IO@Fu因主体由褐藻多醣所组成，其中所含的硫酸盐使IO@FuDex和IO@Fu具有强的负介面电位，但因IO@FuDex的主体中另具有Dex，使得IO@FuDex的负介面电位(-32.8mV)低于IO@Fu的负介面电位(-58.4mV)，因此IO@FuDex之间强力的排斥力可保持胶体的稳定性和良好的分散性。而由图6C的结果显示，超顺磁性氧化铁纳米粒子(IO)具有相当高的单位重量的饱和磁化强度，而IO@FuDex因包含超顺磁性氧化铁纳米粒子、褐藻多醣以及氧化右旋糖酐，其数值略为下降，但仍保有57.5emu g-1的高数值，显示其磁性的强度并不因为形成复合载体结构而下降，有利于使用磁选设备进行磁性纯化，以获得高产量的IO@FuDex。
本试验例中另以不同分子量的氧化右旋糖酐制备磁性褐藻多醣载体，其是如图2中步骤310提供水相溶液中，使用分子量为5kDa至270kDa的右旋糖酐来制备氧化右旋糖酐，再将氧化右旋糖酐与褐藻多醣以1:0.2的重量比例混合，其余步骤320至步骤340的细节与试验例1.1所述大致上相同，在此不再赘述。再以纳米粒径及介面电位分析仪分析所制得的磁性褐藻多醣载体的粒径大小，其结果如下表一所示：
表一、以不同分子量的右旋糖酐所制成的磁性褐藻多醣载体的平均粒径
右旋糖酐分子量(kDa) 平均粒径(nm)
5 132±14.5
12 130±9.8
25 141±16.2
50 162±23.6
80 176±26.8
150 203±48.6
270 264±32.6
此外，本试验例中以不同的褐藻多醣和氧化右旋糖酐混合比例制备磁性褐藻多醣载体，其是如图2中步骤310提供水相溶液中，将褐藻多醣和右旋糖酐以1：0.1至1：4的重量比例混合，其余步骤320至步骤340的细节与试验例1.1所述大致上相同，在此不再赘述。再以纳米粒径及介面电位分析仪分析所制得的磁性褐藻多醣载体的粒径大小，其结果如下表二所示：
表二、以不同重量比的褐藻多醣和氧化右旋糖酐所制成的磁性褐藻多醣载体的平均粒径
褐藻多醣：右旋糖酐(重量比) 平均粒径(nm)
1:0.1 145±6.9
1:0.2 153±11.6
1:1 130±9.8
1:2 141±16.2
1:3 162±23.6
1:4 176±26.8
为测试冻干后再回溶的IO@FuDex是否仍具有相同的结构，本试验例进一步利用冷冻干燥机将制备完成的IO@FuDex冻干形成粉状晶体，再将冻干后的晶体回溶于水溶液中，并利用穿透式电子显微镜观察IO@FuDex冻干前和冻干后的结构。
请参照图7A和图7B，图7A为IO@FuDex冻干前的穿透式电子显微镜照片图，图7B为IO@FuDex冻干后再回溶的穿透式电子显微镜照片图。结果显示，IO@FuDex冻干前的结构为中空的球型，大小约为80nm至350nm之间。而冻干后的晶体，可以快速的回溶于水溶液中，且再回溶的IO@FuDex结构于穿透式电子显微镜下，仍保持为中空、且大小与冻干前载体相符的球体。显示IO@FuDex的稳定性极佳。
1.2实施例1-3的制备
以前述最佳制备IO@FuDex的条件进一步制备本发明的免疫磁性组成物。将制备好的IO@FuDex分别与含有不同抗体且含有氰基硼氢化钠(5μM)的缓冲溶液(0.1M,pH＝6)在4℃下进行抗体嫁接4-6小时，Dex中的醛基与抗体上的一级胺会形成席夫碱，在使用氰基硼氢化钠进行还原胺化反应后，会使抗体嫁接达到化学稳定状态。最后使用磁选设备纯化所制得的免疫磁性组成物。请参照下表三，为本发明的实施例1-3所使用的抗体，其中实施例1所使用的抗体为CD3抗体和CD8抗体，实施例2所使用的抗体为PD-L1抗体，实施例3所使用的抗体为PD-L1抗体、CD3抗体和CD8抗体。
表三
PD-L1抗体 CD3抗体 CD8抗体
IO@FuDex - - -
实施例1 - + +
实施例2 + - -
实施例3 + + +
所制备好的实施例利用穿透式电子显微镜分析的形态和元素分析，以及X射线光电子能谱学(XPS)测定实施例3中的元素构成。
请参照图8，为实施例3的结构分析图。结果显示，实施例3的结构为尺寸约为80-350nm的球形中空结构。并可通过电子显微镜的元素分析，看到实施例3外层因为有抗体的存在，而均匀的出现清晰的氮讯号(N)。在未嫁接抗体前，载体成分只有醣类以及氧化铁，并无带有氮的材料；然而，嫁接抗体后，因为抗体具有许多的胺基以及肽键，而带有大量的氮，可证明本发明的免疫磁性组成物带有抗体。
请再参照图9，为本发明的实施例3的X射线光电子能谱学分析结果图。结果显示，可以看出实施例3相对应于IO@FuDex多出了键结能位于399eV的根信号，而此信号即为氮信号，代表在实施例3中，抗体成功的嫁接于载体上。
1.3实施例5的制备和结构确认
本发明的免疫磁性组成物因呈空心状，因此可进一步于核心层中包覆如细胞因子或抗癌药物等活性物质。在本试验例中的活性物质以介白素-2(Interleukin-2,IL-2)为例，进一步制备包覆IL-2的实施例5。
在本试验例中，实施例5的制备条件如下：将0.5mg/ml的褐藻多醣、0.5mg/ml的Dex和50μg的IL-2混合作为水相溶液。将2mg的IO溶于0.2ml的二氯甲烷中作为油相溶液。将前述水相溶液和油相溶液混合后，以均质机以120W的功率乳化50秒，以得到乳液。使用旋转蒸发器除去二氯甲烷后，利用磁选设备纯化所制得的实施例5。所制备好的实施例利用扫描式电子显微镜分析的形态，并利用纳米粒径及介面电位分析仪分析其粒径。
请参照图10A和图10B，为实施例5的结构分析图，其中图10A为实施例5的扫描式电子显微镜照片图，图10B为实施例5的流体力学尺寸分布图。结果显示，实施例5的IL-2包覆率高达99.93％。而因为IL-2填满核心层，使实施例5的平均粒径大小由纯载体的161.2nm增加至356.2nm，证明本发明的免疫磁性组成物可进一步地于核心层中包覆活性物质，例如小红莓药物(Doxorubicin)、紫杉醇药物(Docetaxel或Paclitaxel)以及虾红素(Astaxanthin；ASTX)等活性物质，也可利用相同的方式包覆在本发明的免疫磁性组成物中。
1.4本发明的免疫磁性组成物的标把能力分析
本试验例将制备完成的实施例1-3进行标把能力分析和细胞结合能力分析，以验证本发明的免疫磁性组成物是否能逆转T细胞免疫力下降的现象，并促进小鼠的肿瘤衰退。试验上选择具有转移能力、侵袭性和表达PD-L1的三阴性乳腺癌细胞株(4T1)作为实验模型。为了方便于荧光显微镜下观察，在荧光显微镜分析组别的实施例1-3分别接上量子点。
为评估标靶效率，试验上分别将实施例1-3和4T1细胞株(4×105)在含牛血清白蛋白(BSA)的培养基于4℃下培育30分钟，再利用流式细胞仪(Novocyte Flow Cytometer,ACEA Biosciences)进行分析。而为评估细胞结合能力，将接有量子点的IO@FuDex和实施例2分别与4T1细胞株培育1、4、12和24小时，再利用流式细胞仪或荧光显微镜(Carl Zeiss,Thornwood)进行分析。
请参照图11A至图11F，为本发明的免疫磁性组成物的标靶能力和细胞结合能力的分析结果图。其中图11A为嫁接浓度为1.4μg/ml(低浓度；L)、7μg/ml(中浓度；M)和35μg/ml(高浓度；H)的PD-L1抗体的实施例2于体外标靶能力的测试结果。图11B为实施例2和嫁接IgG的IO@FuDex于体外标靶能力的测试结果。图11C为IO@FuDex在第1、4、12和24小时与4T1细胞株结合能力的分析结果图。图11D为实施例2在第1、4、12和24小时与4T1细胞株结合能力的分析结果图。图11E为嫁接浓度为1.4μg/ml(低浓度；L)、7μg/ml(中浓度；M)和35μg/ml(高浓度；H)的CD3抗体/CD28抗体的实施例3于体外标靶能力的测试结果。图11F为实施例2和实施例3在第1和24小时与4T1细胞株结合能力的分析结果图。
图11A的结果显示，经过1小时的培育后，实施例2(H)的组别具有最高的平均荧光强度(median fluorescence index,MDI)显示实施例2与4T1细胞株(其表达PD-L1)结合的量与其表面抗体密度密切相关，因此后续试验实施例2所嫁接的PD-L1浓度为高浓度(35μg/ml)。而在图11B的结果显示，接有IgG的IO@FuDex没有观察到MDI移位，显示实施例2对4T1细胞株的亲和力来自PD-L1抗体，而非与IO@FuDex的任何非特异性相互作用。
而图11C和图11D的结果显示，IO@FuDex与细胞结合的量具有时间依赖性，其在培育后第12小时后有明显的细胞吸收。相比之下，实施例2在培育后第1小时中即具有细胞结合的现象，随后MDI呈现缓慢移位，显示随着培育时间的增加，实施例2与细胞的结合量增加，此结果显示将PD-L1抗体嫁接于IO@FuDex后，会改变原本IO@FuDex和4T1细胞株的结合能力。
为了使本发明的免疫磁性组成物可同时为免疫检查哨抑制剂和杀手T细胞增生剂，实施例3为同时嫁接PD-L1抗体、CD3抗体和CD28抗体于IO@FuDex所得的免疫磁性组成物。请参照图11E，为嫁接不同浓度的CD3抗体/CD28抗体的实施例3的标靶能力分析，图11E的结果显示，于体外经过1小时的培育后，实施例3(H)的组别具有最高的MDI，显示实施例3(H)组别与CD8+T细胞具有强亲和力。而图11F的结果显示，实施例3与4T1细胞株之间具有和实施例2相似的结合力，显示于IO@FuDex上嫁接多个抗体不会影响其对于4T1细胞株的亲和力。
请参照图12A至图12D，为实施例3与CD8+T细胞结合能力的分析结果图。试验上将接有量子点的实施例3与CD8+T细胞培育30分钟，使用Alexa Fluor 488Phalloidin和DAPI对CD8+T细胞进行固定染色，并使用共轭焦显微镜确认实施例3位于CD8+T细胞的亚细胞位置。其中图12A表明细胞核的位置，图12B表明实施例3的位置，图12C为明视野下的显微照片图，图12D为合并后的显微照片图，其中比例尺表示5μm的长度。结果显示，在CD8+T细胞中可见多个实施例3，证明实施例3确实能与CD8+T细胞结合。
二、免疫磁性组成物的用途
2.1本发明的免疫磁性组成物的治疗癌症的疗效
本试验例以乳腺癌肺转移和大肠癌的小鼠模型进一步测试本发明的免疫磁性组成物是否具有治疗癌症的功效，以及其是否可经由磁导引累积于患部。
2.1.1本发明的免疫磁性组成物治疗乳腺癌肺转移的疗效
本试验例使用带有稳定表达生物性冷光酵素的luciferase基因的4T1-Luc肿瘤小鼠为乳腺癌肺转移的动物模型(其是由中国医药大学附设医院分子医学中心所提供)，将含有标记125I的实施例1-3的制剂经由右股静脉施用于4T1-Luc肿瘤小鼠中，而试验上另有一实施例4(本发明的用于治疗癌症的试剂盒)，实施例4为施用含有标记125I的实施例3制剂，并搭配利用表面圆形的磁体(直径为0.5cm,0.5Tesla)进行磁导引。后续使用单一光子发射电脑断层扫描(SPECT)监测实施例3和实施例4的在肿瘤组织中的动态累积。
请参照图13A至图13C，为本发明的用于治疗癌症的试剂盒集中累积至肿瘤的分析结果图。图13A为标记有125I的实施例3或实施例4在4T1-Luc肿瘤小鼠中第0、4、6、12和24小时的时间活性曲线，其中n＝4。图13B为4T1-Luc肿瘤小鼠在施用标记有125I的实施例3或实施例4后，第24小时的全身单一光子发射电脑断层扫描图。图13C为4T1-Luc肿瘤小鼠在施用标记有125I的实施例3或实施例4后，第24小时的生物分布定量图，其中n＝4，*表示具有统计上的显著差异(p<0.05)。
图13A的结果显示，实施例3的在肿瘤的累积在施用后第6小时达到每克组织注射剂量的最大浓度(5.08％ID/g)。相较之下，实施例4通过磁导引可以促进其在肿瘤的剂量区域性，可见实施例4在24小时内于肿瘤中持续累积，在第24小时，实施例4在肿瘤中的累积量为实施例3的3.6倍。而由图13B的结果显示，在施用实施例3或实施例4后24小时，实施例3和实施例4之间的放射性同位素具有不同的生物分布模式。图13C的生物分布定量图显示，实施例3和实施例4主要在肿瘤、肝脏、脾脏和膀胱中累积，而肌肉、脑、心脏、肺脏、胃、肾脏、结肠和血液中积累较少(小于5％ID/g)。其中实施例3和实施例相比，可见实施例4不仅增加了在肿瘤的累积，更显著降低其在肝脏和脾脏的系统累积，显示实施例4可以有效地集中到作用部位。
本试验例进一步分别经由右股静脉施用IgG(对照组)、IO@FuDex、实施例1-4至4T1-Luc肿瘤小鼠中，施用方式为肿瘤接种后8天，每4天连续施用3次(q4dx3)。请参照图13D，为4T1-Luc肿瘤小鼠施用实施例1-4后4周的苏木素-伊红染色搭配普鲁士蓝染色结果图，其中比例尺表示50μm的长度。图13D的结果显示，其他组别相较，实施例4在肿瘤组织中可观察到分散的普鲁士蓝染色结果。
为了确认本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒对于4T1-Luc肿瘤小鼠具有治疗效果，本试验例进一步分别经由右股静脉施用IgG(对照组)、IO@FuDex、实施例1-4至4T1-Luc肿瘤小鼠中，施用方式为肿瘤接种后8天，每4天连续施用3次(q4dx3)。而肿瘤体积为每2-3天使用数字卡尺(mitutoyo)进行监测，并以下述公式I计算肿瘤体积：
Figure GDA0003165369550000161
并以非侵入式活体分子影像系统(Non Invasion In Vivo Imaging System,IVIS,Xenogen)进行生物冷光评估。4T1-Luc肿瘤小鼠的存活率以Kaplan-Meier法进行分析。
请参照图14A至图14E，为本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒于乳腺癌肺转移小鼠模型中抑制癌症细胞增生和癌症转移的分析结果图。图14A为4T1-Luc肿瘤小鼠在施用实施例1-4后24小时的非侵入式活体分子影像系统扫描结果图。图14B为4T1-Luc肿瘤小鼠在施用实施例1-4后的肿瘤体积统计图。图14C为4T1-Luc肿瘤小鼠在施用实施例1-4后的生存曲线。图14D为4T1-Luc肿瘤小鼠在施用实施例1-4后的肿瘤和肺脏的照片图。图14E为4T1-Luc肿瘤小鼠在施用实施例1-4后肺转移的统计图。
图14A和图14B的结果显示，和对照组相比，IO@FuDex可以抑制肿瘤生长，但不具统计上的显著差异。而实施例1-4不但具抗肿瘤效果，且具有统计上显著的差异(*表示p<0.05，**表示p<0.01)，特别是实施例4在30天内几乎抑制肿瘤生长。图14C的结果显示，施用对照组、IO@FuDex、实施例1、实施例2、实施例3和实施例4的4T1-Luc肿瘤小鼠的中位数存活期分别为24天、34天、34天、43天和44天。而施用实施例4的4T1-Luc肿瘤小鼠的中位数存活期则可显著延长到63天。实施例4中的PD-L1抗体剂量虽然只有一般施打纯抗体剂量的百分之一，却得以展现更优异的肿瘤抑制能力，以及增长2倍以上的半生存期。此外，图14D的结果显示，实施例1-4皆具有抗肿瘤转移能力。在图14D中，与其他组别相比，施用实施例3和实施例4显著地抑制肺部肿瘤转移，另由图14E的结果显示，对照组4T1-Luc肿瘤小鼠的肺部有超过20个结节的肺转移，而施用实施例4的4T1-Luc肿瘤小鼠的肺部平均发现少于5个结节的肺转移。因此，上述的结果显示，本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒具有显著的抑制肿瘤和抗肿瘤转移作用。而与对照组相比，IO@FuDex未显著的降低肿瘤的转移，推测本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒所具有抗肿瘤转移作用，除了褐藻多醣的抑制作用外，可能也与肿瘤微环境的动态反应有关。
2.1.2本发明的免疫磁性组成物治疗大肠癌的疗效
本试验例使用带有稳定表达生物性冷光酵素的luciferase基因的CT-26细胞株来建立大肠癌的动物模型(其是由中国医药大学附设医院分子医学中心所提供)，将IgG(对照组)、IO@FuDex和实施例3分别经由右股静脉施用于CT-26肿瘤小鼠中，而试验上另有施用实施例3并搭配利用表面圆形的磁体(直径为0.5cm,0.5Tesla)进行磁导引的实施例4(本发明的用于治疗癌症的试剂盒)；以及施用IO@FuDex并搭配利用表面圆形的磁体进行磁导引的比较例1。施用方式为肿瘤接种后8天，每4天连续施用3次(q4dx3)。每2-3天使用数字卡尺进行肿瘤体积监测，并以前述的公式I计算肿瘤体积，并以非侵入式活体分子影像系统进行生物冷光评估。CT-26肿瘤小鼠的存活率以Kaplan-Meier法进行分析。
请参照图15A至图15C，为本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒于大肠癌小鼠模型中抑制癌症细胞增生的分析结果图。图15A为CT-26肿瘤小鼠在施用实施例3-4后24小时的非侵入式活体分子影像系统扫描结果图。图15B为CT-26肿瘤小鼠在施用实施例3-4后的肿瘤体积统计图。图15C为CT-26肿瘤小鼠在施用实施例3-4后的生存曲线。
图15A和图15B的结果显示，和对照组相比，IO@FuDex可以抑制肿瘤生长，但不具统计上的显著差异。施用IO@FuDex并搭配磁引导的比较例1可以提高IO@FuDex的治疗效果。而本发明的实施例3-4不但具抗肿瘤效果，且具有统计上显著的差异(*表示p<0.05，**表示p<0.01)，特别是实施例4在30天内几乎抑制肿瘤生长。图15C的结果显示，施用实施例3和实施例4显著地延长了小鼠的生存时间，再次证明本发明的免疫磁性组成物具有抑制肿瘤生长和转移的效果。
2.2施用本发明的免疫磁性组成物后的免疫作用分析
本试验例进一步以4T1肿瘤模型，探讨本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒在肿瘤内微环境的免疫作用。试验上监测早期肿瘤(10天)到晚期(30天)4T1-Luc肿瘤小鼠的肿瘤、血液、腹水和脾脏中淋巴球数量的变化。
请参照图16A至图16I，为施用本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒后，肿瘤微环境中肿瘤浸润淋巴细胞数量变化和细胞因子含量变化的分析结果图。图16A和图16B的结果显示，施用实施例1-4的组别可以显著地增加抗肿瘤淋巴细胞，如CD8+T细胞和CD4+T细胞的数量，特别是施用实施例4的组别(p<0.01)。而图16C和图16D的结果显示，施用实施例1-4的组别可以显著地降低前肿瘤抗肿瘤淋巴细胞，如CD4+CD225+Foxp3+Treg(调节性T细胞)和CD11b+CD206+F4/80+TAM(肿瘤相关巨噬细胞)的数量，特别是施用实施例4的组别可大幅降低调节性T细胞(Treg)数量(p<0.01)。而在图16E至图16G中，收集不同组别的4T1-Luc肿瘤小鼠血清，分析由TAM分泌的TNF-α、VEGF和TGF-β的含量，可发现施用实施例1-4的组别可以显著地降低TNF-α、VEGF和TGF-β等促炎细胞因子的含量，特别是施用实施例4的组别(p<0.01)。而在图16H和图16I中，通过细胞内颗粒酶B(GrB+)和Ki67的表现的水平评估CD8+T细胞的活化程度，可见施用实施例1-4的组别可以有效地激活CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的功能，特别是施用实施例4的组别(p<0.01)。
在前述试验例证实施用本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒可以改变肿瘤微环境后，本试验例进一步探讨本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒对于肿瘤特异性免疫反应和全身效应的变化。试验上，收集不同组别的4T1-Luc肿瘤小鼠的肿瘤、血清、脾脏，监测INF-γ+CD44+T细胞和CD8+CD3+T细胞的变化，以及利用TUNEL检测观察不同组别4T1-Luc肿瘤小鼠的皮肤组织的细胞凋亡状况。
请参照图17A和图17B，为本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒的反应位点的分析结果图。图17A为不同组别的4T1-Luc肿瘤小鼠的INF-γ+CD44+T细胞的变化结果图。图17B为不同组别的4T1-Luc肿瘤小鼠的CD8+CD3+T细胞的变化结果图。
图17A的结果显示，INF-γ+CD44+T细胞在施用实施例1-4后增值的数量提高，特别是施用实施例4的组别高度增殖。而图17B的结果显示，施用实施例1-3后，CD8+CD3+T细胞在血清和脾脏中均有扩增，但施用实施例4的组别和施用实施例3的组别相比，磁导引会降低CD8+CD3+T细胞在血清和脾脏中的扩增。
皮肤毒性所引起的搔痒症和白斑症是免疫检查哨抑制剂治疗中的副作用之一，由于免疫相关的不良事件往往出现在长期的情况下，本试验例在肿瘤接种后4周，对4T1-Luc肿瘤小鼠的皮肤组织进行TUNEL检测，以评估浸润的T细胞是否诱导免疫应答并引起皮肤组织损伤。
请参照图17C和图17D，为本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒的TUNEL检测结果图。图17C为TUNEL检测不同组别4T1-Luc肿瘤小鼠的皮肤组织凋亡指数统计结果图，其中凋亡指数是以TUNEL+凋亡细胞核的比例除以细胞核总数(随机选择的镜检范围)，并通过二因子的变异数分析和Newman-Keuls事后比较检验评估不同组之间的差异。图17D为TUNEL检测不同组别的4T1-Luc肿瘤小鼠的荧光显微照片图，其中比例尺表示50μm的长度。
图17C和图17D的结果显示，施用实施例1-3后，会增加可被TUNEL标记(绿色)的凋亡细胞，其中施用实施例3的组别诱导凋亡指数与对照组相比增加了3.3倍。但施用实施例4的组别和施用实施例3的组别相比，磁导引可以有效降低皮肤组织中凋亡细胞的数量。
2.3本发明的免疫磁性组成物的免疫相关不良事件测试
本试验例进一步以施用本发明的免疫磁性组成物或用于治疗癌症的试剂盒的4T1肿瘤模型，试验上将实施例3或实施例4施用于4T1肿瘤小鼠，并在肿瘤接种后4周，对4T1肿瘤小鼠进行免疫相关不良事件(Immune-related adverse events,irAEs)测试，分析本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒的安全性。
本试验例通过观察经由实施例3以及实施例4治疗后四周的小鼠，其CD4+T细胞以及CD8+T于主要器官的浸润程度来判断副作用的影响。请参照图18A至图18E，为施用本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒后小鼠CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润程度分析图，其中图18A为肝脏的分析结果图，图18B为肺脏的分析结果图，图18C为脾脏的分析结果图，图18D为肾脏的分析结果图，图18E为大肠的分析结果图。结果显示，实施例3于肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和大肠的T细胞浸润程度低于对照组，而实施例4因为具有磁铁的吸引作用，更能显著地减少于周边的累积(肝脏、肺脏、脾脏、肾脏和大肠)，进而减低T细胞的浸润。
本试验例进一步通过血液生化分析，分析肝功能指数(AST和ALT)、肾功能指数(肌酸酐)以及血糖来判断副作用的影响。请参照图19A至图19D，为施用本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒后小鼠血液生化分析结果图，其中图19A为AST值分析图，图19B为ALT值分析图，图19C为肌酸酐值分析图，图19D为血糖值分析图。由图可知，施用实施例3或实施例4的治疗组别与对照组的生化值仍保持于正常值的范围之中，显示本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒具有一定程度的安全性。
此外，小鼠肿瘤接种后四周进行病理切片分析，请参照图20，为施用实施例3和实施例4后小鼠的病理切片图。结果显示，施用实施例3或实施例4的治疗组别在肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、和大肠中相对于对照组没有明显的组织损伤，显示本发明的免疫磁性组成物和用于治疗癌症的试剂盒具有一定程度的安全性。
综合上述，本发明的免疫磁性组成物的制备方法的制程简单，利用具有抗癌活性的褐藻多醣作为载体组成，并结合超顺磁性氧化铁纳米粒子，形成外层可嫁接抗体并可包覆活性物质于核心层的免疫磁性组成物，所制备出的免疫磁性组成物为纳米等级结构，其大小合适可渗透进入肿瘤，增强褐藻多醣对于肿瘤的作用。而外层的抗体可为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂，使本发明的免疫磁性组成物除了本身材料的抗癌功能外，还可以同时为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂，大幅改善肿瘤的微环境，且本发明的免疫磁性组成物可大幅改善单独以相同的抗体进行免疫治疗的抗癌效果，可以更少的抗体用量达到更佳的肿瘤抑制能力。另外，制造完成的免疫磁性组成物可利用冻干形成粉状晶体于无菌下长期保存，在有需要时以溶剂回溶即可使用，显示其方便和稳定性佳的特性。
本发明的用于治疗癌症的试剂盒包含本发明的免疫磁性组成物和磁场产生装置，可通过磁场产生装置产生磁场，作为磁导引的辅助工具，将本发明的免疫磁性组成物集中累积于患部，在肿瘤中具有旺盛的免疫细胞增生，且可降低体循环的免疫反应，可进一步提升本发明的免疫磁性组成物的抗癌效果。由前述试验数据确认其具有针对局部进行治疗的能力，是以本发明的用于治疗癌症的试剂盒同时具有物理性的标靶和生物性的标靶作用，有助于免疫治疗以及搭配化疗，或免疫治疗的复方治疗，避免过强的免疫反应造成严重副作用。
然本发明已以实施方式公开如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各种的更动与润饰，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定的为准。

Claims (20)

1.一种免疫磁性组成物，其特征在于，包含：
核心层；
壳层，是由复合物构成，所述壳层包覆所述核心层，其中所述复合物是由褐藻多醣、氧化右旋糖酐及多个超顺磁性氧化铁纳米粒子经疏水性作用力结合而形成；以及
外层，包含至少一种抗体，且所述至少一种抗体嫁接于所述壳层外构成所述外层，其中所述至少一种抗体为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂。
2.如权利要求1所述的免疫磁性组成物，其特征在于，所述免疫磁性组成物为球体，且所述球体的粒径介于80nm至350nm之间。
3.如权利要求1所述的免疫磁性组成物，其特征在于，所述褐藻多醣是萃取自裙带菜、梨形囊巨藻或墨角藻。
4.如权利要求1所述的免疫磁性组成物，其特征在于，所述氧化右旋糖酐具有醛基。
5.如权利要求4所述的免疫磁性组成物，其特征在于，所述氧化右旋糖酐是由分子质量介于5kDa至270kDa之间的右旋糖酐制备而得。
6.如权利要求1所述的免疫磁性组成物，其特征在于，所述免疫检查哨抑制剂是选自PD-L1抗体、PD-1抗体、CTLA-4抗体及TIM-3抗体所组成的群组。
7.如权利要求1所述的免疫磁性组成物，其特征在于，所述杀手T细胞增生剂是选自CD3抗体、CD28抗体及4-1BB抗体所组成的群组。
8.如权利要求1所述的免疫磁性组成物，其特征在于，所述核心层中另含有活性物质。
9.一种免疫磁性组成物的制备方法，其特征在于，包含：
提供水相溶液，所述水相溶液包含褐藻多醣和氧化右旋糖酐；
提供油相溶液，所述油相溶液包含有机溶剂和超顺磁性氧化铁纳米粒子；
进行乳化反应，是混合所述水相溶液和所述油相溶液以形成乳液；
移除所述乳液中的所述有机溶剂，以形成磁性褐藻多醣载体；以及
进行抗体嫁接，是混合所述磁性褐藻多醣载体和至少一种抗体，以形成所述免疫磁性组成物，其中所述至少一种抗体为免疫检查哨抑制剂及/或杀手T细胞增生剂。
10.如权利要求9所述的免疫磁性组成物的制备方法，其特征在于，所述免疫检查哨抑制剂是选自PD-L1抗体、PD-1抗体、CTLA-4抗体及TIM-3抗体所组成的群组。
11.如权利要求9所述的免疫磁性组成物的制备方法，其特征在于，所述杀手T细胞增生剂是选自CD3抗体、CD28抗体及4-1BB抗体所组成的群组。
12.如权利要求9所述的免疫磁性组成物的制备方法，其特征在于，所述褐藻多醣和所述氧化右旋糖酐的重量比例是1：0.1至1：4。
13.如权利要求9所述的免疫磁性组成物的制备方法，其特征在于，所述氧化右旋糖酐具有醛基。
14.如权利要求9所述的免疫磁性组成物的制备方法，其特征在于，所述氧化右旋糖酐是由分子质量介于5kDa至270kDa之间的右旋糖酐制备而得。
15.如权利要求9所述的免疫磁性组成物的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、二氯甲烷或三氯甲烷。
16.一种如权利要求1至8任一项所述的免疫磁性组成物的用途，其特征在于，其是用于制备抗癌的药物，所述癌症为乳腺癌或大肠癌。
17.如权利要求16所述的免疫磁性组成物的用途，其特征在于，所述抗癌的药物为抑制癌症细胞增生的药物。
18.如权利要求16所述的免疫磁性组成物的用途，其特征在于，所述抗癌的药物为抑制乳腺癌转移的药物。
19.如权利要求16所述的免疫磁性组成物的用途，其特征在于，所述抗癌的药物为引发乳腺癌肿瘤免疫反应的药物。
20.一种用于治疗癌症的试剂盒，所述癌症为乳腺癌或大肠癌，其特征在于，包含：
如权利要求1至8任一项所述的免疫磁性组成物；以及
磁场产生装置。
CN201810051881.8A 2017-05-01 2018-01-16 免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒 Active CN108785668B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2018262962A AU2018262962B2 (en) 2017-05-01 2018-04-27 Immunomagnetic nanocapsule, fabrication method and use thereof, and kit for treating cancer
PCT/CN2018/084769 WO2018201981A1 (zh) 2017-05-01 2018-04-27 免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒
EP18793787.5A EP3636269A4 (en) 2017-05-01 2018-04-27 IMMUNOMAGNETIC COMPOSITION, PROCESS OF PREPARATION AND USE, AND CANCER TREATMENT KIT
CA3062089A CA3062089C (en) 2017-05-01 2018-04-27 Immunomagnetic nanocapsule, fabrication method and use thereof, and kit for treating cancer

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762492525P 2017-05-01 2017-05-01
US62/492,525 2017-05-01

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108785668A CN108785668A (zh) 2018-11-13
CN108785668B true CN108785668B (zh) 2022-03-18

Family

ID=64094609

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810051881.8A Active CN108785668B (zh) 2017-05-01 2018-01-16 免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP3636269A4 (zh)
CN (1) CN108785668B (zh)
AU (1) AU2018262962B2 (zh)
CA (1) CA3062089C (zh)
TW (1) TWI664983B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111973749B (zh) * 2020-09-07 2023-03-21 威海人生药业集团股份有限公司 一种抗肿瘤免疫治疗的药物组合物
RU2747550C1 (ru) * 2020-11-24 2021-05-06 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины" (ФИЦ ФТМ) Средство для профилактики интерстициальной пневмонии
KR102567421B1 (ko) * 2021-12-16 2023-08-17 주식회사 포투가바이오 αCTLA-4를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법
WO2023113546A1 (ko) * 2021-12-16 2023-06-22 주식회사 포투가바이오 αCTLA-4를 포함하는 수지상 세포 모방 기능성 나노구조체 및 이의 제조방법
CN115120736B (zh) * 2022-06-28 2024-07-02 中国科学院海洋研究所 一种多功能基因载体及其在递送miRNA中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1951495A (zh) * 2005-10-25 2007-04-25 朱宏 恶性肿瘤磁热疗用纳米靶向药物
WO2010116209A1 (en) * 2009-04-10 2010-10-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fucoidans as ligands for the diagnosis of degenerative pathologies
CN102716414A (zh) * 2012-05-28 2012-10-10 大连圣弘医药有限公司 一种含褐藻多糖硫酸酯的抗肿瘤药物组合物及其制备方法
CN103126985A (zh) * 2011-11-29 2013-06-05 财团法人交大思源基金会 双乳化核壳纳米结构及其制备方法
CN105343900A (zh) * 2015-09-16 2016-02-24 中国海洋大学 褐藻多糖为载体的淋巴靶向核磁造影剂及制备方法和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104013640B (zh) * 2013-03-01 2016-09-28 赖媛淑 褐藻糖胶在制备治疗恶病质及癌症的药物中的应用
TWI482782B (zh) * 2013-05-31 2015-05-01 Univ Nat Chiao Tung 架接抗體之雙乳化核殼奈米結構
US10034924B2 (en) * 2013-12-20 2018-07-31 The Johns Hopkins University Methods and compositions for enhanced cellular selectivity using nanocarrier-associated ligands

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1951495A (zh) * 2005-10-25 2007-04-25 朱宏 恶性肿瘤磁热疗用纳米靶向药物
WO2010116209A1 (en) * 2009-04-10 2010-10-14 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Fucoidans as ligands for the diagnosis of degenerative pathologies
CN103126985A (zh) * 2011-11-29 2013-06-05 财团法人交大思源基金会 双乳化核壳纳米结构及其制备方法
CN102716414A (zh) * 2012-05-28 2012-10-10 大连圣弘医药有限公司 一种含褐藻多糖硫酸酯的抗肿瘤药物组合物及其制备方法
CN105343900A (zh) * 2015-09-16 2016-02-24 中国海洋大学 褐藻多糖为载体的淋巴靶向核磁造影剂及制备方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
用于大鼠脑胶质瘤磁共振成像的乳铁蛋白偶联的超顺磁性氧化铁纳米粒的研究;谢辉;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20120715(第7期);第1-108页 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201841624A (zh) 2018-12-01
EP3636269A1 (en) 2020-04-15
AU2018262962B2 (en) 2021-04-08
AU2018262962A1 (en) 2019-12-19
CA3062089A1 (en) 2019-11-22
CA3062089C (en) 2022-02-22
EP3636269A4 (en) 2021-02-17
CN108785668A (zh) 2018-11-13
TWI664983B (zh) 2019-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108785668B (zh) 免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒
Ruman et al. Nanocarrier-based therapeutics and theranostics drug delivery systems for next generation of liver cancer nanodrug modalities
US20210338593A1 (en) Multistage delivery of active agents
Chen et al. Lipid insertion enables targeted functionalization of paclitaxel-loaded erythrocyte membrane nanosystem by tumor-penetrating bispecific recombinant protein
Lin et al. GSH-responsive SN38 dimer-loaded shape-transformable nanoparticles with iRGD for enhancing chemo-photodynamic therapy
US9782342B2 (en) Composite magnetic nanoparticle drug delivery system
Jadon et al. Docetaxel-loaded lipid-polymer hybrid nanoparticles for breast cancer therapeutics
Wang et al. 3-Carboxyphenylboronic acid-modified carboxymethyl chitosan nanoparticles for improved tumor targeting and inhibitory
Tian et al. Stem cell membrane vesicle–coated nanoparticles for efficient tumor‐targeted therapy of orthotopic breast cancer
CN108042490B (zh) 纳米载药系统、其制备方法、药物组合物及在治疗癌症中的应用
CN103596558A (zh) 聚合物壳纳米微胶囊
Wang et al. Phenylboronic acid-decorated gelatin nanoparticles for enhanced tumor targeting and penetration
Saniee et al. Glutamate-urea-based PSMA-targeted PLGA nanoparticles for prostate cancer delivery of docetaxel
Liu et al. Thermosensitive selenium hydrogel boosts antitumor immune response for hepatocellular carcinoma chemoradiotherapy
US10736964B2 (en) Immunomagnetic nanocapsule and kit for treating cancer
JP6771509B2 (ja) 免疫磁気組成物、その調製方法、その使用方法及び癌治療用キット
Ye et al. Bone metastasis target redox-responsive micell for the treatment of lung cancer bone metastasis and anti-bone resorption
Raj et al. Prospects of bacteriotherapy with nanotechnology in nanoparticledrug conjugation approach for cancer therapy
Tang et al. Nanovector assembled from natural egg yolk lipids for tumor-targeted delivery of therapeutics
Bai et al. Hyaluronan and calcium carbonate hybrid nanoparticles for colorectal cancer chemotherapy
CN109662955A (zh) 一种齐墩果酸接枝的壳聚糖载药纳米颗粒及其制备和应用
Dhande et al. Biodistribution study of 99mTc-gemcitabine-loaded spherulites in Sprague–Dawley rats by gamma scintigraphy to investigate its lung targeting potential
WO2018201981A1 (zh) 免疫磁性组成物及其制备方法、用途和治疗癌症的试剂盒
Yang et al. Curcumin-loaded pH-sensitive carboxymethyl chitosan nanoparticles for the treatment of liver cancer
Zhang et al. Optimizing molecular weight of octyl chitosan as drug carrier for improving tumor therapeutic efficacy

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220117

Address after: Chinese Taiwan Road No. 91 in Taichung City

Applicant after: Hong Mingqi

Address before: No. 91, Shiba Road, North District, Taichung City

Applicant before: CHINA MEDICAL University

Applicant before: Siyuan foundation of Jiaotong University

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant