CN111973749B - 一种抗肿瘤免疫治疗的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)在协同增强抗肿瘤免疫治疗中的新用途。岩藻聚糖硫酸酯与抗肿瘤免疫治疗剂抗体联用，能显著抑制多种恶性肿瘤的生长，并明显增强抗肿瘤免疫治疗剂的抗肿瘤免疫治疗作用，证明岩藻聚糖硫酸酯可作为功能组分制备与抗肿瘤免疫疗法联用的药物或医用食品。

Description

一种抗肿瘤免疫治疗的药物组合物

技术领域

本发明涉及药物领域，特别涉及一种具有协同抗肿瘤效果的药物组合物。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病，常规的手术、放疗、化疗和靶向治疗虽然对于早期肿瘤具有比较好的治疗效果，但对于晚期肿瘤的效果非常有限。近几年，肿瘤免疫疗法取得了令人瞩目的临床效果，是目前最有潜力治愈恶性肿瘤的治疗手段。因此，肿瘤免疫疗法在2013年《科学》杂志评选的十大科学突破中位居榜首，并于2018年入选诺贝尔生理学或医学奖。目前已有大量免疫检查点抗体被批准用于治疗晚期肿瘤，如治疗性疫苗、嵌合抗原受体、T细胞免疫疗法、肿瘤淋巴浸润细胞过继治疗等方法，均在临床试验中表现出了较好的治疗效果。

免疫检查点单抗作为肿瘤免疫疗法的代表，可通过阻断肿瘤微环境中的免疫抑制信号，恢复免疫细胞的功能发挥抗肿瘤作用。其中，研究最为深入、应用最成熟的免疫检查点是细胞程序性死亡受体1(PD-1)、程序性死亡配体1和2(PD-L1/L2)、细胞毒性T细胞抗原4(CTLA-4)，以及淋巴细胞激活基因3(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(TIGIT)和T细胞激活V区免疫球蛋白抑制剂(VISTA)等(RandophJ.Nolle，Science，2020)。PD-1抗体能够阻断肿瘤细胞上的PD-L1与活化T细胞表面的抑制性受体PD-1结合，从而活化肿瘤特异性T细胞，重建免疫系统对肿瘤细胞的杀伤作用。然而，由于肿瘤组织中存在多种内源性和外源性的免疫抵抗机制，PD-1抗体只有20％左右的临床反应率。因此，寻找提高肿瘤免疫反应的新方法，以增强肿瘤免疫治疗的临床效果，是当今癌症医疗领域的重大需求。

岩藻聚糖硫酸酯是海藻及某些海洋动物(如海参、海胆等)中所特有的硫酸多糖，具有广泛的生物活性，如抗糖尿病、抗病毒、抗凝血及免疫调节活性等。岩藻聚糖硫酸酯的多种生物活性与其化学结构中的硫酸基含量和取代位置、相对分子质量、单糖组成及其连接方式等结构信息密切相关。经过文献检索发现，虽然不同来源和结构的岩藻聚糖硫酸酯，均有不同的抗肿瘤效果[Lei Wu，Carbohydr Polym.2016，154:96-111；Shen HY,Mol MedRep.2017，15(5):2620-2624]，但将其与治疗性抗体联合通过口服或注射用于肿瘤的防治，尚未见报道。

发明内容

本发明涉及一种岩藻聚糖硫酸酯在增强抗肿瘤免疫治疗中的应用，具体是与抗肿瘤免疫治疗剂型联用可显著增强其抗肿瘤效果。

本发明涉及一种药物组合物，其特征在于包括岩藻聚糖硫酸酯和抗肿瘤免疫治疗剂。

如上所述的药物组合物，其特征在于抗肿瘤免疫治疗剂选自PD-1抑制剂、PD-L1抑制剂、CTLA-4抑制剂、LAG-3抗体、TIM-3抗体、TIGIT抗体、VISTA抗体中的一种或多种。

如上的药物组合物，其特征在于PD-1抑制剂为PD-1抗体，和/或PD-L1抑制剂为PD-L1抗体；所述抗体优选：Keytruda、Opdivo、Pidilizumab、Libtayo、Tecentriq、Bavencio、Imfinzi、Durvalumab、Avelumab、KN035、Atezolizumab、CS1001、AK105、SHR-1316、TQB2450、AMP-514、杰诺单抗、KL-A167、PDR011、GLS-010、AK103、BAT1306、达伯舒、拓益、艾瑞卡、KN046、Ipilimumab、Yervoy、BMS986016、REGN3767、LAG525、和/或TSR-022、MBG-453、MTIG7192A、JNJ-61610588中的一种或多种。优选的，岩藻聚糖硫酸酯的结构单元包括：岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、和/或木糖。

优选的，岩藻聚糖硫酸酯中岩藻糖含量为10％～90％，硫酸基含量为15％～40％，重均分子量为3kD～1000kD。

优选的，岩藻糖含量优选30％-80％、40％-70％、50％-60％。

优选的，硫酸基含量优选18％-35％、20％-30％、25％-30％。

岩藻聚糖硫酸酯的重复片段，优选以下结构：

如上所述的药物组合物，其特征在于：所述岩藻聚糖硫酸酯选自：a)主链由α-1,3-连接的硫酸化岩藻糖组成；(b)主链由α-1,3和α-1,4交替连接的硫酸化岩藻糖组成；(c)主链由β-1,4-葡萄糖醛酸和α-1,2-甘露糖组成，且分支结构含有α-1,3-硫酸化岩藻寡糖组成；(d)主链由α-1,2以及α-1,3和/或α-1,4-连接方式的硫酸化岩藻糖组成，中的一种或多种。

本发明还涉及一种可以增强肿瘤免疫治疗的岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：岩藻糖含量40％-80％、硫酸基含量在20％-30％、分子量范围为150kDa至1000kDa。

如上所述的可以增强肿瘤免疫治疗的岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：还包含4％-10％甘露糖、4％-10％葡萄糖醛酸、5％-15％葡萄糖，1.5％-10％半乳糖、5％-25％木糖。

优选的，岩藻聚糖硫酸酯的重均分子量为30kD～900kD、50kD～850kD、100kD～800kD、150kD～750kD、200kD～700kD、250kD～650kD、300kD～600kD、400kD～500kD。

优选的，岩藻聚糖硫酸酯的结构单元包括：岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、和/或木糖。

优选的，岩藻聚糖硫酸酯中岩藻糖含量为10％～90％，硫酸基含量为15％～40％，重均分子量为3kD～1000kD。

优选的，岩藻糖含量优选30％-80％、40％-70％、50％-60％。

优选的，硫酸基含量优选15％-35％、20％-30％、25％-30％。

优选的，岩藻聚糖硫酸酯的重复片段如上所定义。

如上所述的岩藻聚糖硫酸酯，为经口给药、舌下给药、胃或肠给药、局部给药、经皮给药、注射给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和/或吸入给药等。其剂型可以为：片剂、胶囊剂、粉剂、注射剂、糖浆剂、溶液剂、缓释剂、速释剂、控释剂、乳剂、微乳剂、纳米制剂、靶向制剂、栓剂、膏剂、凝胶剂、固体分散体、包合物、和/或贴剂。。

如上任一项所述的药物组合物用于制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤优选：胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、皮肤癌、前列腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、子宫肌瘤、淋巴癌、骨髓癌、食管癌、肠癌、鼻癌、骨癌、头颈癌、口腔癌、肾癌、卡波西肉瘤。

本发明还涉及一种抗肿瘤的方法，其特征在于给予患者如上任一项所述的药物组合物。所述肿瘤优选：胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、皮肤癌、前列腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、子宫肌瘤、淋巴癌、骨髓癌、食管癌、肠癌、鼻癌、骨癌、头颈癌、口腔癌、肾癌、卡波西肉瘤。

如上任一项所述的药物组合物，岩藻聚糖硫酸酯和肿瘤免疫治疗剂可以一起给药、分开单独给药；给药途径各自独立地选自：经口给药、舌下给药、胃或肠给药、局部给药、注射给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、经皮给药、和/或吸入给药等。其剂型可以为：片剂、胶囊剂、粉剂、注射剂、糖浆剂、溶液剂、缓释剂、速释剂、控释剂、乳剂、微乳剂、纳米制剂、靶向制剂、栓剂、膏剂、凝胶剂、固体分散体、包合物、和/或贴剂。

如上任一项所述的药物组合物，其特征在于：岩藻聚糖硫酸酯为经口给药、舌下给药、胃或肠给药、局部给药、经皮给药、注射给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和/或吸入给药等。肿瘤免疫治疗剂为经口给药、舌下给药、胃或肠给药、局部给药、注射给药、静脉注射、皮下注射、肌肉注射、经皮给药、和/或吸入给药等。其剂型可以为：片剂、胶囊剂、粉剂、注射剂、糖浆剂、溶液剂、缓释剂、速释剂、控释剂、乳剂、微乳剂、纳米制剂、靶向制剂、栓剂、膏剂、凝胶剂、固体分散体、包合物、和/或贴剂。

如上任一项所述的药物组合物，其特征在于：岩藻聚糖硫酸酯与肿瘤免疫治疗剂可以一起制备成单一制剂、或者给自制备成单一制剂，然后一起给药。

如上任一项所述的药物组合物，其特征在于：岩藻聚糖硫酸酯和/或肿瘤免疫治疗剂可以制备成口服制剂、局部制剂、注射制剂、缓释制剂、控释制剂、或速释制剂。

如上任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述制剂为片剂、胶囊剂、粉剂、注射剂、糖浆剂、溶液剂、缓释剂、速释剂、控释剂、乳剂、微乳剂、纳米制剂、靶向制剂、栓剂、膏剂、凝胶剂、固体分散体、包合物、和/或贴剂。

如上任一项所述的药物组合物，其特征在于：岩藻聚糖硫酸酯与肿瘤免疫治疗剂同时给药。或者岩藻聚糖硫酸酯在给药肿瘤免疫治疗剂之前，提前1-60天进行给药；优选的提前7-50天，优选的14-50天，优选的21-40天，更优选的28-35天，最优选的30-34天。

如上任一项所述的药物组合物，其特征在于：其中所述药物中岩藻聚糖硫酸酯和肿瘤免疫治疗剂的用量比例为岩藻聚糖硫酸酯：肿瘤免疫抑制剂＝(10-500)：(0.1-10)(质量比例)；优选(20-400)：(0.5-8)、(40-300)：(1-6)、(80-200)：(2-5)、或(100-150)：(3-4)。

进一步的岩藻聚糖硫酸酯为口服，肿瘤免疫抑制剂为注射。

如上任一项所述的药物组合物，其特征在于：其中所述药物还包含其它的治疗剂。

如上任一项所述的药物组合物，其特征在于：任选地包含药学上可接受的辅料。

本发明还涉及一种岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：将褐藻(如海带、裙带菜、泡叶藻、羊栖藻、海蕴、巨藻、墨角藻等)粉碎，收集过筛。加入水，升温至60-80℃，投入藻粉，提取。经离心后，分别收集上清液和藻渣。藻渣用同上方法再提取，离心收集上清液。合并两次上清液，搅拌加入氯化钙溶液，离心后，收集上清液，并浓缩。将浓缩液加入乙醇，静置。离心后收集沉淀，得到褐藻糖胶粗品。将沉淀用水复溶，过滤后，再用超滤膜过滤，进行浓缩脱盐，浓缩液经干燥后，即得岩藻聚糖硫酸酯。

如上所述的一种岩藻聚糖硫酸酯的制备方法，其特征在于：将褐藻(如海带、裙带菜、泡叶藻、羊栖藻、海蕴、巨藻、墨角藻等)粉碎，收集过40目筛后藻粉。向提取罐中加入500-2000L纯化水，搅拌升温至60-80℃，投入藻粉30-60Kg，搅拌提取1-2h。经离心后，分别收集上清液和藻渣。藻渣转入提取罐，同上方法提取1-2h，离心收集上清液。合并两次上清液，搅拌加入1-5％氯化钙，去除褐藻胶，离心后，收集上清液，并浓缩至500-1000L。将浓缩液转移至醇沉罐中，加入1000-2000L乙醇，静置2-4h。离心后收集沉淀，得到褐藻糖胶粗品。将沉淀用纯化水复溶，经板框过滤后，再用30KDa超滤膜过滤，进行浓缩脱盐，浓缩液经喷雾干燥后，即得岩藻聚糖硫酸酯。

如以泡叶藻、墨角藻为原料，经过提取纯化后，得到的硫酸多糖分别为岩藻糖硫酸酯A(Fucoidan A)和岩藻糖硫酸酯F(Fucoidan F)。经过分析，所得产品中岩藻糖含量在50％以上，硫酸基含量在20％以上。

本发明还涉及两种岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：产品Fucoidan A中岩藻糖含量58.5％，甘露糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，木糖含量分别为7.5％，5.3％，8.1％，3.8％和17.8％,硫酸基含量在22.7％，分子量210kDa。Fucoidan F中岩藻糖含量65.8％，甘露糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，木糖含量分别为5.7％，5.5％，9.9％，5.3％和8.2％,硫酸基含量在26.3％，分子量610kDa。

本发明通过口服灌胃或者饮食喂养荷瘤小鼠岩藻聚糖硫酸酯，发现岩藻聚糖硫酸酯能显著提高肿瘤对肿瘤免疫治疗剂的反应性，并且在肿瘤形成之前对小鼠预先喂养岩藻聚糖硫酸酯，可进一步增强其与肿瘤免疫治疗剂抗肿瘤的协同效应，证明岩藻聚糖硫酸酯通过与治疗性免疫抗体联用，能显著抑制多种恶性肿瘤的生长，具有开发为辅助抗肿瘤药物和特殊医用食品的潜力。

附图说明

图1：岩藻聚糖硫酸酯饮食可增效PD-1抗体治疗黑色素瘤。

图2：岩藻聚糖硫酸酯自身对黑色素瘤生长无明显抑制作用。

图3：岩藻聚糖硫酸酯预处理可显著增强PD-1抗体的协同抗肿瘤效应。

图4：岩藻聚糖硫酸酯预处理联合PD-1抗体可促进肿瘤内淋巴细胞浸润和免疫系统活化。

图5：岩藻聚糖硫酸酯饮食可协同促进PD-1抗体杀伤乳腺癌细胞。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明作进一步说明。

本发明使用的材料与试剂：岩藻聚糖硫酸酯，C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠；小鼠黑色素瘤细胞(B16)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)。B16细胞培养使用DMEM培养基，添加10％胎牛血清和100μg/mL双抗(青霉素-链霉素)；4T1细胞使用RPMI-1640培养基，添加10％胎牛血清和100μg/mL双抗；T细胞使用RPMI-1640培养基，添加10％胎牛血清、100μg/mL双抗、0.05mMβ-巯基乙醇和1X非必需氨基酸溶液。PD-1抗体由G4杂交瘤细胞上清分离纯化提取。其他试剂包括：小鼠肿瘤淋巴细胞分离液、水合氯醛粉末，小鼠CD3、CD28抗体，NK1.1、CD3、CD8、CD4流式抗体。

本发明相关的实验步骤：

岩藻聚糖硫酸酯的提取与理化指标分析

将不同来源的褐藻(如海带、裙带菜、泡叶藻、羊栖藻、海蕴、巨藻、墨角藻等)粉碎，收集过40目筛后藻粉。向提取罐中加入500-2000L纯化水，搅拌升温至60-80℃，投入藻粉30-60Kg，搅拌提取1-2h。经离心后，分别收集上清液和藻渣。藻渣转入提取罐，同上方法提取1-2h，离心收集上清液。合并两次上清液，搅拌加入1-5％氯化钙，去除褐藻胶，离心后，收集上清液，并浓缩至500-1000L。将浓缩液转移至醇沉罐中，加入1000-2000L乙醇，静置2-4h。离心后收集沉淀，得到褐藻糖胶粗品。将沉淀用纯化水复溶，经板框过滤后，再用30KDa超滤膜过滤，进行浓缩脱盐，浓缩液经喷雾干燥后，即得岩藻聚糖硫酸酯。如以2种不同来源的褐藻原料(如以泡叶藻、墨角藻为原料)，采用上述工艺，经过提取纯化后，可以得到岩藻糖硫酸酯A(Fucoidan A)和岩藻糖硫酸酯F(Fucoidan F)。经过分析，所得产品Fucoidan A中岩藻糖含量58.5％，甘露糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，木糖含量分别为7.5％，5.3％，8.1％，3.8％和17.8％,硫酸基含量在22.7％，分子量210kDa。Fucoidan F中岩藻糖含量65.8％，甘露糖，葡萄糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，木糖含量分别为5.7％，5.5％，9.9％，5.3％和8.2％,硫酸基含量在26.3％，分子量610kDa。

肿瘤皮下移植

将0.25％胰酶消化处于对数生长期的小鼠黑色素瘤细胞(B16)，1200rpm离心5分钟。之后用PBS洗涤两到三次，分别离心，再调整细胞浓度至1.5M/mL。将细胞置于冰上备用，混匀细胞后用胰岛素针抽取133或200μL(即2或3*10⁵个细胞)于小鼠右下腹皮下种瘤。

肿瘤乳腺移植

将0.25％胰酶消化处于对数生长期的小鼠乳腺癌细胞(4T1)，1200rpm离心5分钟。之后用PBS洗涤两到三次，分别离心，再调整细胞浓度至2*10⁷个细胞/mL，将细胞置于冰上备用。将BALB/c小鼠称重，腹腔注射5倍于小鼠重量的7％水合氯醛麻醉。待小鼠麻醉后用胶布将小鼠腹部朝上固定在加热板上。混匀细胞后用胰岛素针抽取50μL(即1*10⁶个细胞)于小鼠左侧腋下第一对乳腺脂肪垫处种瘤。

岩藻聚糖硫酸酯给药

岩藻聚糖硫酸酯以饮水的方式处理小鼠，按小鼠体重每天给予定量的岩藻聚糖硫酸酯。实验共分三组(岩藻聚糖硫酸酯A组、F组、正常饮水对照组)，每组5-6只小鼠。按小鼠每天饮水量约为4mL计算，每笼5只，均重20g，每次配置200mL岩藻聚糖硫酸酯水溶液，作为唯一饮水来源。称取岩藻聚糖硫酸酯A和F各1g，溶解于200mL超纯水后，121℃高压灭菌15分钟，使岩藻聚糖硫酸酯浓度为5mg/mL。为防止微生物污染，每天更换一次新鲜配制的岩藻聚糖硫酸酯水溶液。

肿瘤浸润淋巴细胞分离和分析

将肿瘤切割成小块，5mL注射器物理研磨后过70μm筛网，滤过得到细胞悬液。在50mL离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，用电动移液器缓慢的将生理盐水稀释的细胞悬液加至淋巴细胞分离液上层，400g梯度离心30分钟，离心时升速调至最大，降速调为0。离心后管内可见四层：最下层-肿瘤细胞，下层液体-淋巴细胞分离液，中间白膜层-单个核细胞(包括淋巴细胞)，最上层-细胞碎片。用巴氏管吸取中间白膜层，生理盐水洗涤后流式分析CD3⁺T细胞。

脾脏和淋巴结免疫细胞分析

利用二氧化碳麻醉处死小鼠，摘取脾脏和引流淋巴结置于加有PBS的培养皿中，两个载玻片磨砂面相互摩擦使得淋巴结破裂，释放淋巴细胞，同样的方法摩擦脾脏释放淋巴细胞到PBS中。1200rpm离心5分钟，弃上清，加入20mL红细胞裂解液ACK重悬细胞，室温静置10分钟裂解红细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清，10mL PBS重悬细胞，过70μm筛网获得单细胞悬液。PBS洗涤细胞悬液，分别加入0.3μL小鼠CD3、NK1.1、CD8、CD4流式抗体，4℃避光孵育30分钟。孵育结束用PBS清洗并重悬细胞后进行流式分析。

组织切片和HE染色

将小鼠肿瘤组织用OCT包埋剂包埋，-80℃冰箱储存。使用冰冻切片机做10μm连续冰冻切片，切片快速置于冷丙酮中固定10分钟。PBS洗片2次，每次5分钟。使用苏木素染液染核2分钟，洗去多余染色液，1％盐酸酒精溶液分化10秒，洗去多余分化液，伊红染色1分钟，使用95％乙醇一次、95％乙醇二次、85％乙醇、75％乙醇、二甲苯各五分钟脱水，树脂封片。

统计分析

统计分析采用双侧非配对t检验，实验结果用平均值±标准误差(Mean±SD)表示，P＜0.05认定为有显著差异。

实施例1口服岩藻聚糖硫酸酯与注射PD-1抗体增强抗肿瘤效果实验

首先建立黑色素瘤小鼠模型，检测岩藻聚糖硫酸酯是否能增强PD-1抗体治疗皮下移植黑色素瘤的效果。黑色素瘤B16细胞用DMEM培养基，加上10％胎牛血清和100ug/ml双抗(青霉素-链霉素)培养，细胞扩增至足够数量时用0.25％胰酶消化。实验小鼠分为3组：对照组(PD-1抗体治疗)、岩藻聚糖硫酸酯A组(PD-1抗体治疗联合岩藻聚糖硫酸酯A饮水)、岩藻聚糖硫酸酯F组(PD-1抗体治疗联合岩藻聚糖硫酸酯F饮水)。种瘤时用胰岛素针抽取133uL1.5M/mL的均匀细胞悬液于C57BL/6小鼠右下腹皮下种瘤，即每只小鼠2*10⁵个B16细胞，并于种瘤当天开始给予实验组小鼠5mg/mL岩藻聚糖硫酸酯饮水直至实验结束(包括岩藻聚糖硫酸酯A和岩藻聚糖硫酸酯F，每天换一次新鲜配置的岩藻聚糖硫酸酯饮水)。种瘤7天后，小鼠皮下形成可触及肿瘤块。此时对所有小鼠开始注射PD-1抗体，其后每三天注射一次PD-1抗体，共五次。PD-1抗体注射采用腹腔注射，每只小鼠注射PD-1抗体200μg。从第7天开始，每三天测量肿瘤大小，即每次PD-1抗体注射的同时，测量肿瘤大小，绘制肿瘤体积曲线。PD-1抗体注射结束后若未达到实验终点，需继续测量。肿瘤体积以长径*短径*短径/2计算。当对照组肿瘤至实验终点(肿瘤半径≥15mm)时结束测量，取肿瘤称重。结果表明：在给予B16荷瘤小鼠PD-1抗体治疗的同时，联合岩藻聚糖硫酸酯饮食可明显抑制肿瘤生长，且岩藻聚糖硫酸酯A和F都有显著功效(图1)。

实施例2口服岩藻聚糖硫酸酯不能显著抑制黑色素瘤生长实验

本实验的目的是研究在不进行免疫抗体治疗的情况下，岩藻聚糖硫酸酯是否能单独抑制肿瘤生长。胰酶消化处于对数生长期的小鼠黑色素瘤B16细胞，PBS洗涤两次后调整细胞浓度至1.5M/mL。实验小鼠分为3组：对照组、岩藻聚糖硫酸酯A组、岩藻聚糖硫酸酯F组。胰岛素针抽取133μL 1.5M/mL的均匀细胞悬液于C57BL/6小鼠右下腹皮下种瘤(即2*10⁵个细胞/只)，并于种瘤当天开始给予实验组小鼠5mg/mL岩藻聚糖硫酸酯饮水直至实验结束。种瘤7天后开始测量肿瘤大小，当对照组肿瘤至实验终点(肿瘤半径≥15mm)时结束测量，取肿瘤称重。结果显示：单独岩藻聚糖硫酸酯饮食对黑色素瘤生长没有显著抑制作用，证明岩藻聚糖硫酸酯自身不足以抑制黑色素瘤生长(图2)。

实施例3预口服岩藻聚糖硫酸酯进一步增强PD-1抗体抗肿瘤效应实验

实施例1和实施例2的结果显示，虽然岩藻聚糖硫酸酯自身不足以显著抑制恶性肿瘤生长，但能显著增强PD-1抗体的疗效。为进一步验证此功能，在皮下成瘤前先用岩藻聚糖硫酸酯预处理小鼠，待小鼠成瘤后再联合PD-1抗体，考察联合治疗效果。实验小鼠分为三组：对照组(PD-1抗体治疗)；岩藻聚糖硫酸酯A组(PD-1抗体治疗联合岩藻聚糖硫酸酯A)；岩藻聚糖硫酸酯F组(PD-1抗体治疗联合岩藻聚糖硫酸酯F)。岩藻聚糖硫酸酯组在种瘤前24天开始，分别给予5mg/mL岩藻聚糖硫酸酯饮水直至实验结束，24天后抽取200μL 1.5*10⁶个/mL的均匀细胞悬液于C57BL/6小鼠右下腹皮下种瘤(即3*10⁵个肿瘤细胞/只)。实验方案如图3-A所示，种瘤10天后对所有小鼠进行PD-1抗体注射治疗，其后每三天进行一次PD-1治疗，共治疗四次，每次每只小鼠注射PD-1抗体200μg，同时跟踪测量肿瘤大小。四次PD-1治疗后结束测量，取肿瘤称重。结果发现岩藻聚糖硫酸酯A组肿瘤明显小于单纯PD1抗体治疗组(图3-B)，且岩藻聚糖硫酸酯预处理组与对照组的肿瘤重量差异比实施例1中更大(图3-C对比图1-D)，证明岩藻聚糖硫酸酯预处理可进一步增强其与PD-1抗体的协同抗肿瘤效应。

同时，分离小鼠脾脏和引流淋巴结中的CD8⁺T细胞和NK细胞，同时通过密度梯度离心法分离肿瘤浸润淋巴细胞，然后通过流式分析评估三组小鼠的肿瘤免疫状态。结果表明：岩藻聚糖硫酸酯A组的肿瘤浸润CD3⁺T细胞比例显著高于对照组(图4-A)。脾脏和引流淋巴结中CD8⁺T细胞(图4-B)以及NK细胞(图4-C)数量也在岩藻聚糖硫酸酯组中显著增高，证实岩藻聚糖硫酸酯预处理能激活免疫系统，进一步增强与PD-1抗体的协同抗肿瘤效应。

实施例4口服岩藻聚糖硫酸酯协同PD-1抗体促进乳腺癌细胞坏死实验

应用BALB/c小鼠乳腺癌模型，将7-8周的雌性BALB/c小鼠用7％水合氯醛麻醉后，胰岛素针抽取50uL 20M/mL的均匀4T1细胞悬液在左侧腋下第一对乳腺脂肪垫处种瘤(1*10⁶细胞/只)。实验小鼠分为3组：对照组(PD-1抗体治疗)、岩藻聚糖硫酸酯A组(PD-1抗体治疗联合岩藻聚糖硫酸酯A饮水)、岩藻聚糖硫酸酯F组(PD-1抗体治疗联合岩藻聚糖硫酸酯F饮水)，并于种瘤当天开始给予实验组小鼠5mg/mL岩藻聚糖硫酸酯饮水直至实验结束。种瘤7天后开始测量肿瘤大小并进行PD-1抗体治疗，其后每三天进行一次PD-1治疗，每次每只小鼠注射PD-1抗体200μg，一共治疗六次。抗体治疗同时测量肿瘤大小，当对照组肿瘤至实验终点(肿瘤半径≥15mm)时结束测量，取肿瘤称重和分析(图5-A),可见岩藻聚糖硫酸酯饮水组中的肿瘤组织坏死严重(图5-B)，组织切片HE染色表现为红色云雾状的肿瘤细胞核破裂，以及胞浆浸润红染(图5-C左下部分)。将坏死的肿瘤组织切除后发现，岩藻聚糖硫酸酯A组对应的存活肿瘤组织显著减少(图5-D)。以上结果表明，岩藻聚糖硫酸酯饮食可协同PD-1抗体治疗促进乳腺肿瘤坏死，从而协同提升PD-1抗体对该肿瘤的疗效。

以上描述是本发明的一般性描述。根据情况或实际需要，可进行形式的变化和等值的替代，虽然本文采用特定的术语，但这些术语意在描述，而不是为了限制的目的。本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围之内。

Claims (6)

1.一种药物组合物，其特征在于包括岩藻聚糖硫酸酯和抗肿瘤免疫治疗剂，

所述抗肿瘤免疫治疗剂选自PD-1抗体和/或PD-L1抗体；所述岩藻聚糖硫酸酯的重复单元选自以下结构：

其中，岩藻糖含量40％-80％、硫酸基含量在20％-30％、分子量范围为150kDa至1000kDa；还包含4％-10％甘露糖、4％-10％葡萄糖醛酸、5％-15％葡萄糖，1.5％-10％半乳糖、5％-25％木糖。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于抗体选自：Keytruda、Opdivo、Pidilizumab、Libtayo、Tecentriq、Bavencio、Imfinzi、Durvalumab、Avelumab、KN035、Atezolizumab、CS1001、AK105、SHR-1316、TQB2450、AMP-514、杰诺单抗、KL-A167、PDR011、GLS-010、AK103、BAT1306、达伯舒、拓益、艾瑞卡、KN046、Ipilimumab、Yervoy、BMS986016、REGN3767、LAG525、和/或TSR-022、MBG-453、MTIG7192A、JNJ-61610588中的一种或多种。

3.如权利要求1-2任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述岩藻聚糖硫酸酯选自：a)主链由α-1,3-连接的硫酸化岩藻糖组成；(b)主链由α-1,3和α-1,4交替连接的硫酸化岩藻糖组成；(c)主链由β-1,4-葡萄糖醛酸和α-1,2-甘露糖组成，且分支结构含有α-1,3-硫酸化岩藻寡糖组成；(d)主链由α-1,2以及α-1,3和/或α-1,4-连接方式的硫酸化岩藻糖组成，中的一种或多种。

4.一种可以增强抗肿瘤免疫治疗剂的岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：所述岩藻聚糖硫酸酯的重复单元选自以下结构：

其中，岩藻糖含量40％-80％、硫酸基含量在20％-30％、分子量范围为150kDa至1000kDa；还包含4％-10％甘露糖、4％-10％葡萄糖醛酸、5％-15％葡萄糖，1.5％-10％半乳糖、5％-25％木糖，所述抗肿瘤免疫治疗剂选自PD-1抗体和/或PD-L1抗体。

5.如权利要求4所述的岩藻聚糖硫酸酯，其特征在于：所述岩藻聚糖硫酸酯选自：a)主链由α-1,3-连接的硫酸化岩藻糖组成；(b)主链由α-1,3和α-1,4交替连接的硫酸化岩藻糖组成；(c)主链由β-1,4-葡萄糖醛酸和α-1,2-甘露糖组成，且分支结构含有α-1,3-硫酸化岩藻寡糖组成；(d)主链由α-1,2以及α-1,3和/或α-1,4-连接方式的硫酸化岩藻糖组成中的一种或多种。

6.如权利要求1-3中任一项所述的药物组合物用于制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤选自：胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、皮肤癌、前列腺癌、黑色素瘤、甲状腺癌、子宫肌瘤、食管癌、肠癌、鼻癌、头颈癌、口腔癌、肾癌、卡波西肉瘤。

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