KR101767906B1 - 항체 결합 이중 유액 나노캡슐 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

항체 결합 이중 유액 나노캡슐이 제공된다. 수상 코어를 둘러싸는 유상 쉘로 구성되는 이중 유액 나노 캡슐의 표면에 연결기가 도입되고, 이중 유액 나노캡슐을 항체와 연결한다.

Description

항체 결합 이중 유액 나노캡슐 및 그 제조 방법 {ANTIBODY-CONJUGATED DOUBLE-EMULSION NANOCAPSULE AND PREPARATION METHODS THEREOF}
본 출원은 2013년 5월 31일 출원된 대만 출원 102119370호, 2013년 11월 5일 출원된 대만 출원 102140127호, 2014년 4월 24일자 출원된 미국 출원 14/260,726호에 기초한 우선권을 주장하며, 명세서의 전체 내용이 여기에 참고로 포함된다.
본 발명은 항체 결합 나노 구조에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 항체 결합 이중 유액 나노캡슐에 관한 것이다.
현재, 나노캡슐을 갖는 몇몇 나노캡슐이 유기 재료로부터 제조되어 약물을 수송하는 약물 전달체가 된다(국제공개번호 : WO2007002690호, 공개일자 : 2007.01.04). 이들 나노캡슐은 지질 이중층으로 구성된 리포솜과 양쪽성 폴리머로 구성된 미셀을 포함한다(국제공개번호 : WO2009037310호, 공개일자 : 2009.03.26).
그러나, 상술한 나노캡슐의 구조는 불안정하고, 이들 나노캡슐의 제조는 복잡하여 제어하기 어렵다.
한 측면에서, 항체 결합 이중 유액 나노캡슐이 제공된다. 지름 약 50nm 내지 약 400nm를 갖는 항체 결합 이중 유액 나노캡슐은 수상 코어, 상기 수상 코어를 둘러싸는 유상 쉘 및 적어도 항체를 포함한다. 유상 쉘의 조성물은 폴리머 및 복수의 소수성 자성의 나노입자를 포함하고 다른 계면활성제를 포함하지 않는다. 상기 폴리머는 연결성 폴리비닐알코올 또는 폴리비닐알코올(PVA)과 연결성 폴리머의 조합이고, 상기 연결성 폴리비닐알코올 및 상기 연결성 폴리머는 연결기를 갖는다. 상기 항체는 커플링제를 통해 연결기에 화학적으로 결합된다.
하나의 실시예에 따르면, 연결기는 카르복시기, 티올기, 알데히드기, 아민기 또는 히드록시기일 수 있다.
다른 실시예에 따르면, 상기 연결성 폴리비닐알코올은 카르복시메틸화 폴리비닐알코올(CMPVA), 티올화 폴리비닐알코올(TPVA), 또는 PVA-TPVA의 공중합체이다.
다른 실시예에 따르면, 상기 연결성 폴리머는 폴리아크릴산(PAA), 폴리메타크릴산(PMAA), 카르복시메틸화 폴리비닐알코올(CMPVA), 티올화 폴리비닐알코올(TPVA), 티올화 폴리메타크릴산(TPMAA), 또는 PVA-TPVA의 공중합체이다.
다른 실시예에 따르면, 상기 소수성 자성의 나노입자는 소수성 기능기로 수식된 표면을 갖고, Fe2O3, Fe3O4, CoFe2O4 또는 MnFe2O4 로 이루어진 나노입자이다.
다른 실시예에 따르면, 상기 항체는 트라스투주맙의 유방암 항체, 세툭시맙의 결장암 항체, 파니투무맙의 표피 생장 인자 수용체 항체, 또는 베바시주맙의 혈관형성 억제제 항체를 포함한다.
다른 실시예에 따르면, 상기 커플링제는 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산 카르복시산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (SMCC), N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염 (EDC), N-히드록시술포숙신이미드 나트륨염 (Sulfo-NHS), 또는 3-(2-피리딜디티오)프로시온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (SPDP)이다.
다른 실시예에 따르면, 상기 유상 쉘은 소수성 약물을 더 포함한다.
다른 실시예에 따르면, 상기 수상 코어는 친수성 약물을 더 포함한다.
다른 측면에서, 상기 항체 결합 이중 유액 나노캡슐을 제조하는 단일 유화 방법이 제공된다. 먼저, 연결기를 갖는 연결성 폴리비닐알코올을 포함하고 다른 폴리머 및 다른 계면활성제를 포함하지 않는 수용액이 제조된다. 또한, 복수의 소수성 자성의 나노입자를 포함하는 유기용액이 제조된다. 상기 수용액과 상기 유기용액을 혼합하여 복수의 이중 유액 나노캡슐을 포함하는 유화 용액을 형성한다. 그 후, 상기 유기용액에서 사용된 유기용매를 제거하여 이중 유액 나노캡슐을 얻는다. 상기 이중 유액 나노캡슐을 포함하는 제 1 분산 용액 및 커플링제와 결합된 항체를 포함하는 제 2 분산 용액이 각각 제조된다. 상기 제 1 분산 용액과 상기 제 2 분산 용액을 혼합하여 상기 연결기와 상기 커플링제를 화학적으로 반응시켜 복수의 항체 결합 이중 유액 나노캡슐을 얻는다.
하나의 실시예에 따르면, 친수성 약물이 상기 수용액에 첨가될 수 있다.
다른 실시예에 따르면, 소수성 약물이 상기 유기용액에 첨가될 수 있다.
다른 측면에서, 상기 항체 결합 이중 유액 나노캡슐을 제조하는 이중 유화 방법이 제공된다. 폴리비닐알코올을 포함하고 다른 폴리머 및 다른 계면활성제를 포함하지 않는 제 1 수용액 및 복수의 소수성 자성의 나노입자를 포함하는 유기용액이 각각 제조된다. 상기 제 1 수용액과 상기 유기용액을 혼합하여 유중수 유화 용액인 제 1 유화 용액을 형성한다. 그 후, 연결기를 갖는 연결성 폴리머를 포함하고 다른 폴리머 및 다른 계면활성제를 포함하지 않는 제 2 수용액이 제조된다. 상기 제 1 유화 용액과 상기 제 2 수용액을 혼합하여 이중 유액 나노캡슐을 포함하는 제 2 용액을 형성한다. 그 후, 상기 유기용액에서 사용된 유기용매를 제거하여 이중 유액 나노캡슐을 얻는다. 상기 이중 유액 나노캡슐을 포함하는 제 1 분산 용액 및 커플링제와 결합된 항체를 포함하는 제 2 분산 용액이 각각 제조된다. 상기 제 1 분산 용액과 상기 제 2 분산 용액을 혼합하여 상기 연결기와 상기 커플링제를 화학적으로 반응시켜 항체 결합 이중 유액 나노캡슐을 얻는다.
하나의 실시예에 따르면, 친수성 약물이 상기 제 1 수용액에 첨가될 수 있다.
다른 실시예에 따르면, 소수성 약물이 상기 유기용액에 첨가될 수 있다.
상술한 일반적 기재 및 후술하는 상세한 설명은 예시이며, 청구항의 발명의 상세한 설명을 위해 제공되는 것이다.
상술한 것은 기본적 이해를 제공하기 위해 본 명세서의 간략화된 개요를 나타낸다. 이 개요는 명세서의 광범위한 개요는 아니며, 본 발명의 핵심적인 요소를 규정하거나 본 발명의 범위를 기술하는 것은 아니다. 그 목적은 본 명세서의 몇몇 개념을 간략화된 형태로서 후술하는 더욱 상세한 설명의 전주로서 나타내는 것이다. 많은 수반하는 특징들은 주로 후술하는 상세한 설명 및 첨부된 도면과 함께 더욱 잘 설명될 것이다.
도 1a는 본 발명의 한 실시예에 따른 항체 결합 이중 유액 나노캡슐의 단면도이다.
도 1b는 본 발명의 다른 실시예에 따라 약물 전달체로 사용된 도 1A의 이중 유액 나노캡슐의 단면도이다.
도 2a는 본 발명의 한 실시예에 따라 연결기를 갖는 이중 유액 나노캡슐을 제조하는 단일 유화 방법의 흐름도이다.
도 2b는 본 발명의 다른 실시예에 따라 연결기를 갖는 이중 유액 나노캡슐을 제조하는 이중 유화 방법의 흐름도이다.
도 2c는 본 발명의 실시예에 따라 항체-커플링제 복합체와 연결기를 갖는 이중 유액 나노캡슐을 반응시키는 방법의 흐름도이다.
도 3은 다양한 평균 분자량을 갖는 다양한 폴리비닐알코올을 사용한 비어있는 이중 유액 나노캡슐(double-emulsion nanocapsule, DENC)의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지이다.
도 4a 및 4b는 트라스투주맙 유방암 항체 연결 전과 후 DENC의 SEM 이미지이다.
도 5a는 pH4에서 TPMAA의 다양한 양을 포함하는 DENC에 봉입된 소수성 PTX의 약물 방출 프로파일을 나타낸다.
도 5b는 pH4에서 TPMAA의 다양한 양을 포함하는 DENC에 봉입된 친수성 Dox의 약물 방출 프로파일을 나타낸다.
도 5c는 pH 4 및 pH 7에서 DENC에 봉입된 PTX 및 Dox의 약물 방출 프로파일을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 각각 pH 7 및 pH 4에서 PVA TPMAA 혼합물을 함유하는 트라스투주맙-DENC의 전송 전자 현미경(TEM) 이미지이다.
도 7a는 Dox를 둘러싸는 트라스투주맙-DENC의 다양한 양이 첨가된 SkBr3 세포의 유동세포계수 분석 결과를 나타낸다.
도 7b는 Dox를 둘러싸는 IgG-DENC의 다양한 양이 첨가된 SkBr3 세포의 유동세포계수 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 SkBr3 세포, 봉입된 Dox, Dox를 봉입하는 IgG-DENC, 및 Dox를 봉입하는 트라스투주맙-DENC의 공초점 현미경 이미지를 나타낸다.
도 9는 SkBr3 세포가 다양한 샘플로 배양된 후 SkBr3 세포의 세포 생존력을 나타낸다.
도 10은 1일째(A) 및 3일째(B) 누드 쥐 실험의 SVIS 이미지이다.
도 11은 상이한 시간에서 고형암의 부피의 변화를 나타낸다.
도 12는 PVA 및 PAA 혼합물을 포함하는 트라스투주맙-DENC의 SEM 이미지이다.
도 13a-13c는 각각 분자량 25000, 47000, 및 78000을 갖는 TPVA를 포함하는 이중 유액 나노캡슐의 SEM 이미지이다.
첨부되는 도면과 함께 하기에 제공되는 상세한 설명은 본 실시예의 상세를 위해 의도되며, 본 실시예가 구현되고 사용될 수 있는 유일한 형태를 나타내기 위해 의도된 것은 아니다. 상세한 설명은 본 실시예의 기능을 설명하고 실시예를 구현하기 위한 단계 및 순서를 설명한다. 그러나 동일하거나 동등한 기능 및 순서는 상이한 실시예에 의해 구현되어도 좋다.
항체 결합 이중 유액 나노캡슐
도 1a는 본 발명의 한 실시예에 따른 항체 결합 이중 유액 나노캡슐의 단면도이다. 도 1a에 따르면, 항체 결합 이중 유액 나노캡슐(100)은 수상 코어(125)를 둘러싸는 유상 쉘(110)로부터 형성된다. 상기 유상 쉘(110)의 조성물은 폴리머(115) 및 복수의 소수성 자성의 나노입자(120)를 포함한다. 상기 유상 쉘(110)의 표면은 연결기(130)와 커플링제(도 1A에 도시되지 않음)를 통해 상기 연결기(130)에 결합된 항체(135)를 포함한다. 상기 항체 결합 이중 유액 나노캡슐(100)의 지름은 약 50nm 내지 약 400nm이다.
상기 폴리머(115)는 폴리비닐알코올(PVA)로부터 연결기(130)를 갖도록 변형된 적어도 하나의 연결성 폴리비닐알코올을 포함하거나, 폴리비닐알코올과 연길기(130)를 갖는 연결성 폴리머의 조합을 포함한다. 더 나아가, 상기 유상 쉘(110)의 조성물은 어떠한 다른 계면 활성제 또는 다른 폴리머를 포함하는 것을 필요로 하지 않는다는 것이 강조된다.
상기 폴리비닐알코올 또는 연결성 폴리비닐알코올은 그 자체가 상기 유상 쉘(110) 내부의 상기 수상 코어(125)와 상기 유상 쉘(110) 외부의 수용액을 향하여 그 친수기를 향하게 할 수 있다. 따라서, 어떠한 다른 계면 활성제 또는 어떠한 다른 폴리머 없이도 상기 유화 쉘(110)의 내부의 수상 유상 계면(water-oil interface)과 외부의 유상 수상 계면(oil-warter interface)이 동시에 안정화될 수 있다.
상기 연결기(130)는 카르복시기, 티올기, 알데히드기, 아민기 또는 히드록시기일 수 있다. 예를 들어, 상기 연결성 폴리비닐알코올은 카르복시메틸화 폴리비닐알코올(CMPVA), 티올화 폴리비닐알코올(TPVA), 또는 PVA-TPVA의 공중합체일 수 있다. 상기 연결성 폴리머는 폴리아크릴산(PAA), 폴리메타크릴산(PMAA), 또는 티올화 폴리메타크릴산(TPMAA), 또는 PVA-TPVA의 공중합체일 수 있다.
상기 PAA, PMAA, CMPVA, TPVA 및 TPMAA의 화학 구조는 하기 표 1에 표시되어 있다.
표 1 : 실시예에 따른 연결성 PVAs를 포함하는 연결성 폴리머
Figure 112015114993467-pct00001
상기 항체(135)는 필요로되는 임의의 항체일 수 있다. 상기 항체의 선택은 연결(bounded)되어야 할 항원에 좌우된다. 예를 들어, 커플링제-항체 결합체(135)는 트라스투주맙의 유방암 항체(상업적인 명칭은 Herclon 또는 Hercepttn), 세툭시맙의 결장암 항체, 파니투무맙의 표피 생장 인자 수용체 항체, 또는 베바시주맙의 혈관형성 억제제 항체일 수 있다.
상기 소수성 자성의 나노입자(120)는 소수성 기능기로 수식된 표면을 갖고, Fe2O3, Fe3O4, CoFe2O4 또는 MnFe2O4 로 이루어진 나노입자일 수 있다. 상기 소수성 자성의 나노입자(120)는 상기 상기 유상 쉘(110)을 안정화하여 유상 쉘(110)이 붕괴(collapsing)하는 것을 방지할 수 있다. 자기 공명 영상(MRI)의 조영제인 것과 더불어, 상기 소수성 자성의 나노입자(120)는 국부적으로 열을 가하고나서 고주파 자기장(HFMF)하에서 자성유체 온열치료(MFH)에 의해 상기 유상 쉘(110)을 파괴(break)하기 위해 사용될 수 있다.
상기 이중 유액 나노캡술(100)은 소수성 약물과 친수성 약물을 그 안에 각각 수용하는 유상 쉘(110)과 수상 코어(125)을 포함하기 때문에, 상기 이중 유액 나노캡슐(100)은 상기 소수성 약물, 친수성 약물 또는 그 조합의 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 게다가, 약물의 방출률(release rate)은 인가된 외부 교류 자기장의 길이와 온/오프 상태에 의해 제어될 수 있다.
도 1b는 본 발명의 다른 실시예에 따라 약물 전달체로 사용된 도 1A의 이중 유액 나노캡슐의 단면도이다. 도 1b에서, 친수성 약물(145)은 상기 이중 유액 나노캡슐(100)의 수상 코어(125)에 수용된다. 소수성 약물(140)은 상기 이중 유액 나노캡슐(100)의 유상 쉘(110)에 수용된다. 예를 들어, 상기 친수성 약물(145)은 독소루비신(DOXO) 또는 시스플라틴(cisplatin)일 수 있고, 상기 소수성 약물(140)은 패클리택셀(PTX), 도세탁셀(Dtxl), 캠토테신(CPT), 커큐민(cucurmine)일 수 있다.
항체결합 이중 유액 나노캡슐의 제조 방법
항체결합 이중 유액 나노캡슐의 제조 방법은 2개의 스테이지를 포함한다. 제 1 스테이지에서, 연결기를 가지는 이중 유액 나노캡슐이 단일 유화 방법 또는 이중 유화 방법에 의해 제조된다. 제 2 스테이지에서, 상기 획득된 이중 유액 나노캡슐이 항체결합 이중 유액 나노캡슐을 형성하기 위해 항체와 반응한다.
도 2a는 본 발명의 한 실시예에 따라 연결기를 갖는 이중 유액 나노캡슐을 제조하는 단일 유화 방법의 흐름도이다. 도 2a에서, 연결성 PVA를 포함하는 수용액(스텝 202a)과 소수성의 자성 나노입자를 포함하는 유기용액(스텝 202b)가 각각 제조된다. 이어서, 유화용액(emulsion solution)을 형성하기 위해(스텝 22) 상기 수용액과 유기용액이 혼합된다.(스텝 212) 그리고 연결기를 가지는 이중 유액 나노캡술을 획득하기 위해(스텝 235) 상기 유화용액속의 유기 용매는 제거된다.(스텝 230)
스텝 202a 에서 특히, 친수성 약물이 상기 수용액에 더 첨가될 수 있다. 상기 스텝 202b에서 특히, 소수성 약물이 상기 유기 용액에 더 첨가될 수 있다.
상기 유기 용액이 소수성의 자성 나노입자만을 포함할 경우, 상기 유기 용매는 상기 소수성의 자성 나노입자를 효과적으로 용해하거나 분산하고, 물과 혼합되지 않고, 더 낮은 끓는점의 특성을 가지는 것이 적합하다. 상기 유기 용액이 소수성 약물을 더 포함하는 경우, 상기 유기 용매는 상기 소수성 약물을 효과적으로 분산시키거나 용해하는 특성을 가지는 것이 더욱 적합하다.
더 낮은 끓는점을 가진 유기 용매를 선택하는 이유는 상기 이주 유액 나노캡슐의 외부 형상이 제어할 수 없는 역효과에 의해 영향을 받는 것을 방지하기 위한 오버 히팅없이 상기 유기 용매가 쉽게 제거될 수 있기 때문이다. 상기 유기 용매의 끓는점은 90℃ 보다 더 낮아질 수 있다. 상기 유기 용매는 예를 들어, 클로로포름, 디클로로메탄, 트리클로로에탄 또는 아세토니트릴일 수 있다.
스텝 212 에서 특히, 상기 혼합 방법은 예를 들어, 초음파 처리일 수 있다. 스텝 230에서 특히, 상기 유기 용매를 제거하는 방법은 상온에서 휘발 또는 감압 증류일 수 있다.
도 2b는 본 발명의 다른 실시예에 따라 연결기를 갖는 이중 유액 나노캡슐을 제조하는 이중 유화 방법의 흐름도이다. 도 2b에서, PVA를 포함하는 제 1 수용액(스텝 205a)과 소수성의 자성 나노입자를 포함하는 유기용액(스텝 205b)가 각각 제조된다. 유중수형(water-in-oil) 유화용액 인 제 1 유화 용액을 형성하기 위해(스텝 215a) 소량의 제 1 수용액과 다량의 유기용액이 혼합된다.(스텝 210) 이것이 제 1 유화 스테이지이다.
스텝 205a에서 특히, 친수성 약물이 상기 제 1 수용액에 더 첨가될 수 있다. 스텝 205b에서 특히, 소수성 약물이 상기 유기 용액내에 더 첨가될 수 있다. 스텝 205b에서 상기 유기 용액을 위한 상기 유기 용매의 선택은 도 2A에서의 스텝 202b와 동일하므로 여기서는 생략한다.
그리고 나서, 연결성 폴리머를 함유하는 제 2 수용액이 제조된다.(스텝 215b) 제 2 유화 용액을 형성하기 위해(스텝 225) 상기 제 1 유화 용액과 제 2 수용액이 혼합된다.(스텝 220). 이것이 제 2 유화 스테이지이다.
특히 스텝 210과 220에서 혼합 방법은 예를 들어, 초음파 처리(ultrasound sonication)일 수 있다. 스텝 230에서 특히, 상기 유기 용매를 제거하는 방법은 상온에서 휘발 또는 감압 증류일 수 있다.
도 2c는 본 발명의 실시예에 따라 항체-커플링제 복합체와 연결기를 갖는 이중 유액 나노캡슐을 반응시키는 방법의 흐름도이다. 도 2c에서, 이중 유액 나노입자를 함유하는 제 1 분산 용액(스텝 240a)와 항체-커플링제 복합체를 함유하는 제 2 분산 용액(스텝 240b)이 각각 제조된다. 상기 항체-커플링제 복합체가 상기 이중 유액 나노입자 상의 결합기와 반응하도록 상기 제 1 및 2 분산 용액이 혼합된다.(스텝 245) 다음으로, 항체결합 이중 유액 나노입자를 얻기 위해(스텝 255) 원심분리에 의해 결합되지 않은 항체가 제거된다.
일반적으로, 항체-커플링제 복합체를 형성하기 위해 상기 항체는 커플링제와 결합하는 유리 1차 아민기(free primary amine group)를 사용한다. 몇몇 실시예에 따르면, 상기 항체-결합제 복합체를 형성하기 위해 몇몇 적당한 커플링제가 하기의 표 2에 표시되어 있다. 예를 들어, 상기 연결기가 티올기인 경우, 상기 커플링제는 SMCC 또는 SPDP일 수 있다. 이중 유화 방법에서 사용되는 상기 연결 폴리머의 연결기가 카르복시기인 경우, 상기 커플링제는 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염 (EDC) 또는 N-히드록시술포숙신이미드 나트륨염 (Sulfo-NHS)일 수 있다.
표 2 : 몇몇 일반적인 커플링제
Figure 112015114993467-pct00002
상기 제 1 분산 용액(스텝 24Oa)와 제 2 분산 용액(스탭 240b)을 위한 용매의 선택은 상기 사용된 커플링제에 좌우된다. 예를 들어, SMCC가 커플링제로 사용된다면, 0.1M NA3PO4와 0.15M NaCl을 포함하고, pH값이 7.4인 인산염 완충 식염수(PBS)용액이 사용될 수 있다. EDC 그리고 sulfo-NHS가 커플링제로 사용된다면, 0.1M 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES)와 0.5M NaCl을 함유하고 pH값이 6.0인 MES 완충 용액이 사용될 수 있다.
이하에 기술되는 실시예에서, "이중 유액 나노입자"는 "DENC"로 축약하여 표시하고, "항체결합 이중 유액 나노입자"는 항체-DENC"로 축약하여 표시하기로 한다.
실시예 1 : 올레산으로 피복된 Fe3O4 나노입자 제조
본 실시예에서, 약 5nm의 지름을 가진 올레산으로 피복된 Fe3O4 나노입자(이하, IO-OA 나노입자 라고 함)가 제조된다. 본 실시예에 따른 IO-OA 나노입자의 제조방법은 하기에 기술된다. 보다 구체적으로, IO-OA 나노입자의 제조 방법은 참조문헌으로 포함된 Sun, S. H.; Zeng, H.; Robinson, D. B ; Raoux, S.; Rice, P. .;Wang, S. X.; Li, G. X. Journal of the American Chemical Society, 2004, 126, (1),273-279를 참조할 수 있다.
Fe(acac)3 0.708 g, 1,2-헥사데칸디올 2.58 g, 올레산 0.565 g, 올레일아민 0.535 g, 벤질에테르 20mL이 쓰리넥 플라스크(three-necked flask)에 첨가된다. 상기 혼합은 IO-OA 나노입자를 형성하기 위해 질소 대기와 순환 냉각수 상태하에서 각각 100℃에서 30분, 200℃ 80분, 285℃ 30분간 가열된다. 다음으로, 획득된 IO-OA 나노입자는 에탄올로 분산된 후 상부 용액을 제거하기 위해 600rpm에서 원심분리된다. 7번을 반복한 후, 획득된 IO-OA 나노입자는 에탄올에 저장된다.
실시예 2: 티올화 폴리메타크릴산 제조
본 실시예에서, 티올화 폴리메타크릴산(TPMAA)이 제조되었다. 실시예에 따른 제조 방법이 하기에 기술되고, 합성 기법 Ⅰ이 또한 동시에 언급된다.
Figure 112015114993467-pct00003
합성기법 Ⅰ
PMAA 30중량%를 함유하는 수용액 250mg에 pH8의 PBS용액 5ml, 촉매 EDC 75mg 및 촉매 sulfo-NHS 40mg이 순차적으로 첨가되었다. 15분 동안 혼합 및 교반한 후, 시스테아민 5mg이 첨가되었다. 상기 혼합물은 아미드 결합을 형성하고 TPMAA를 형성하기 위해 상기 시스테아민의 1차 아민기와 PMAA의 카르복시기와 반등하도록 다음날 까지 교반되었다. 촉매 EDC와 sulfo-NHS를 제거하기 위해 투석(Dialysis)이 사용되었고, 그 후 TPMAA 결정을 획득하기 위해 동결 건조에 의해 수분이 제거되었다.
실시예 3: PVA-TPMAA 공중합체 제조
본 실시예에서, PVA-TPMAA 공중합체가 제조되었다. 실시예에 따른 제조 방법이 하기에 기술된다.
상기에서 획득된 PVA 및 TPMAA가 혼합되었다. 그 후, 부생성물 물과 PVA-TPMAA 공중합체를 형성하기 위해 농축 황산이 첨가되었다. 다음으로, PVA-TPMAA 공중합체 생성물을 획득하도록 PVA-TPMAA 공중합체와 TPMAA와 PVA의 반응물을 분리하기 위해 포화된 탄산나트륨이 사용되었다.
실시예 4: 티올화 폴리비닐알코올 제조
본 실시예에서, 티올화 폴리비닐알코올(TPVA)가 제조되었다. 실시예에 따른 제조 방법이 하기에 기술되었고, 동시에 합성 기법 Ⅱ도 하기에 언급되었다. TPVA의 제조에 대한 참조는 Gupta 8 , Anjum S and Skram S. Preparation of thiolated polyvinyl alcohol hydrogels. Journal of Applied Polymer Science. 2013;129; 815-21 이다.
Figure 112015114993467-pct00004
합성 기법 Ⅱ
PVA는 PVA 수용액 2 중량%를 형성하기 위해 초순수에서 용해되었다. 티오글리콜산 20-99% (v/v)과 황산 수용액 0.1-1 중량%가 상기 PVA 수용액에 천천히 첨가되었다. 상기 혼합물은 에스테르화 반응을 수행하기 위해 기름 중탕으로 가열되었다. 다음으로, 침전물을 형성하기 위해 메탄올이 상기 PVA 에스테르화 용액에 천천히 투입되었다. 상기 침전물은 분말을 획득하기 위해 메탄올에 의해 여러번 집진되고 정화되었다. 그리고 나서 상기 분말은 TPVA 백색 결정 분말을 획득하기 위해 동결건조되었다.
실시예 5: 카르복시메틸화 폴리비닐알코올 제조
본 실시예에서, 카르복시메틸화 폴리비닐알코올(CMPVA)가 제조되었고, 실시예에 따른 방법은 하기에 기술되었다. 합성 기법 Ⅲ도 동시에 언급되었다. 상기 CMPVA의 제조에 대한 참조는 Yu C and Li B Preparation and characterization of carboxymethyl polyvinyl alcohol-graphite nanosheet composites. Polymer Composites. 2008; 29: 998-1005 이다.
Figure 112015114993467-pct00005
합성 기법 Ⅲ
먼저, PVA의 -OH기를 활성화하기 위해 수산화나트륨(NaOH)이 PVA 수용액 2 중량%에 첨가되었다. 클로로아세트산나트륨(ClCH2COONA)의 에탄올 용액을 형성하기 위해 클로로아세트산(ClCH2COOH)이 수산화나트륨(NaOH)에 의해 중화되고 에탄올에 용해되었다. 특히 CMPVA의 나트륨염(sodium salt)을 형성하기 위해 상기 2개의 용액이 혼합되었다. 5시간 후, pH값을 6으로 조절핫기 위해 적당한 양의 HCS가 첨가되었다. 이어서, CMPVA를 정화시키기 위해 충분한 양의 알코올이 첨가되었다. 상기 에탄올 정화 단계는 여러번 반복되었다.
실시예 6: PVA/TPMAA 혼합물을 함유하는 항체-DENC의 제조
본 실시예에서, 도 2B에서 이중 유화 방법을 사용함으로써 PVA/TPMAA 혼합물을 함유하는 DENC가 제조되었다. 사용된 약물은 친수성 독소루비신(Dox)와 시스플라틴, 그리고 소수성 패클리탁셀(PTX)와 캠토테신(CPT)을 포함한다. 그리고나서, 도 2C의 방법을 사용함으로써 상기 항체가 PVA/TPMAA 혼합물을 함유하는 DENC에 결합되었다.
친수성 약물의 제 1 수용액과 PVA, 소수성 약물의 CHCl3 용액과 IO-0A 나노입자, 그리고 PVA의 제 2 수용액 및 TPMAA가 각각 제조되었다. 상기 친수성 약물의 제 1 수용액과 PVA에서, 상기 PVA의 농도는 2Omg/mL이고, 친수성 약물(독소루비신 또는 시스플라틴)의 농도는 8mg/mL였다. 상기 소수성 약물의 CHCl3 용액에서, 상기 IO-OA 나노입자의 농도는 20mg/mL였다. 뿐만 아니라, 상기 소수성 약물이 패클리탁셀이었을 경우 패클리탁셀의 농도는 30mg/mL, 그리고 상기 소수성 약물이 캠토테신이었을 경우 캠토테신의 농도는 5mg/mL 였다. PVA와 TPMAA의 제 2 수용액에서, PVA의 농도는 20mg/mL였고, TPMAA의 농도는 2mg/mL였다. 상기 사용된 PVA의 평균 분자량은 각각 16,000, 25,000, 31,000 및 47,000이었다. TPMAA에서, 카르복시기의 약 37%가 티올기를 가지도록 변성되었다.
친수성 약물과 PVA를 함유하는 제 1 수용액 O.2 ml과 IO-OA 나노입자와 소수성 약물을 함유한 CHCl3 용액 0.5ml이 20kHz의 주파수에서 초음파 처리에 의해 혼합되고 유화되었다.유화 후에, PVA와 TPMAA를 함유하는 제 2 수용액 1.5ml가 더 첨가되었고, PVA/TPMAA 혼합물을 함유하는 DENC를 획득하기 위해 20kHZ의 주파수에서 초음파 처리에 의해 상기 혼합물이 다시 유화되었다. CHCl3를 증발시키기 위해 최종적으로 획득된 유화 용액을 오픈 공간에 위치시킴으로써 휘발성 CHCl3가 제거되었다. 상기 CHCl3를 증발시키는 온도는 상기 DENC의 형태를 변화시킬 수 있다. 다음으로, 상기 PVA/TPMAA 혼합물을 함유하는 DENC가 인산나트륨 0.1M과 염화나트륨(NaCl) 0.15M을 함유하는 PBS 용액 3mL에서 분산되었다.
단지 하나의 약물이 상기 DENC에 의해 봉입된 경우, 상기 DENC의 봉입 효율(encapsulation efficiency) 과 지름이 하기의 표 3에 표시되어 있다. 표 3으로부터, 상기 소수성 약물의 봉입 효율이 친수성 약물의 봉입 효율보다 대체적으로 더 높았다는 것을 알 수 있다. 따라서, 소수성 약물을 봉입하는 DENC의 지름이 더 컸다. 게다가, 친수성 약물의 봉입 효율이 75% 이상이었고, 소수성 약물을 봉입하는 DENC를 제종하기 위한 이중 유화 방법을 사용하는데 더 적합하다.
표 3: 단일 친수성 약물 또는 단일 소수성 약물의 봉입 효율
Figure 112015114993467-pct00006
도 3은 다양한 평균 분자량을 갖는 다양한 폴리비닐알코올을 사용한 비어있는 이중 유액 나노캡슐(double-emulsion nanocapsule, DENC)의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지이다. 도 3에서, 빈 DENC에 함유된 PVA의 평균 분자량은 각각 16000, 25000, 31000 및 47000이었다. 상기 빈 DENC는 약물을 봉입하지 않았다. 도 3으로부터, PVA의 평균 분자량이 클수록, 빈 DENC의 지름이 작아졌다.
다음으로, 트라스투주맙의 유방암 항체 1mg과 커플링제 SMCC 4.8mg이 인산나트륨 0.1M과 0.15M 염화나트륨(NaCl)을 함유하는 PBS 2ml과 5ml에서 각각 용해되었고, 그리고 나서 함께 혼합되었다. 이어서 상기 혼합물은 트라스투주맙-SMCC 복합체는 인산나트륨 0.1M과 0.15M 염화나트륨(NaCl)을 함유하는 PBS 1ml에서 재분산되었다.
상기 DENC의 분산 용액과 트루스투주맙-SMCC 복합체가 4℃에서 2시간동안 혼합되고 반응되었다. 원심분리후, 반응하지 않은 트루스투주맙-SMCC 복합체가 제거되었고, 트루스투주맙-DENC의 생성물이 초순수 4mL에서 재분산되었다.
상기 커플링제 SMCC는 TPMAA의 -SH 연결기와 트라스투주맙의 유방암 항체의 -NH2기를 연결시키는 브릿지가 되었다. 그래서, 트라스투주맙이 SMCC와 TPMAA의 티올기를 통해 DENC의 유상쉘의 외부 표면에 부착되었다.
도 4a 및 4b는 트라스투주맙 유방암 항체 연결 전과 후 DENC의 SEM 이미지이다. 상기 사용된 PVA는 16000의 평균 분자량을 가졌다. 도 4a에서, TPMAA/PVA 혼합물을 함유하는 빈 DENC는 초순수에 의해 세척되었고, 초순수에 의해 재분산되었고, 이어서 동결 건조되었다. 상기 빈 DENC는 여전히 중공형(hollow spherical) 구조를 유지한다. 도 4b에서, 도 4a의 상기 빈 DENC는 트루스투주맙-SMCC 복합체에 결합되었다. 상기 빈 DENC의 표면이 트루스투주맙-SMCC 복합체에 의해 변형되었기 때문에, 트루스투주맙-DENC의 형태가 변화되었다.
실시예 7: PVA/TPMAA 혼합물을 함유하는 DENC에 봉입된 약물의 방출에 대한 용액의 pH 값의 효과
본 실시예에서, PVA/TPMAA 혼합물을 함유하는 항체-DENC에 봉입된 약물의 방출에 대한 용액의 pH 값의 효과가 테스트되었다. 유상쉘은 분자량 16000을 가지는 PVA와 TPMAA로 구성되었다. 사용된 약물은 친수성 독소루비신(Dox)와 소수성 패클리탁셀(PTX)가 포함되었다.
TPMAA는 티올 기능기를 가지는 변형된 PMAA 폴리머이고, PMAA는 pH-감응형 폴리머이다. PMAA의 곁사슬 상의 카르복시산기와 메틸기가 다양한 pH값을 가지는 다양한 환경에서 다른 모양(apperance)을 나타나도록 PMAA에 영향을 미치는 주요 인자이다. 중성적인 환경에서, PMAA는 랜덤하게 꼬여있고(coiled) 친수성이다. 산 환경에서, PMAA는 구체 유사(globule-like) 구조로 변형되고 수축되고 소수성이 된다. 트라스투주맙 유방암 항체 연결을 위해 티올기에 의해 변형된 후 PMAA의 pH-감응형 특성이 보존될 수 있는 것이 요망되었다. 따라서, 이중 약물을 봉입하는 DENC는 약물의 방출양을 관찰하기 위해 각각 중성 환경(pH 7)과 산 환경(pH 4)에 놓여졌다.
도 5a는 pH4에서 TPMAA의 다양한 양을 포함하는 DENC에 봉입된 소수성 PTX의 약물 방출 프로파일을 나타낸다. 도 5b는 pH4에서 TPMAA의 다양한 양을 포함하는 DENC에 봉입된 친수성 Dox의 약물 방출 프로파일을 나타낸다. 도 5a와 5b에서, TPMAA의 변경 비율(modification percentage)은 37%였다. 도 5a와 5b로부터, 제조 과정동안 TPMAA의 첨가량이 증가되었고, pH 4의 산 환경에서 PTX와 Dox의 방출량이 모두 증가되었다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과는 TPMAA가 산 환경에서 DENC로부터 약물의 방출량을 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다.
도 5c는 pH 4 및 pH 7에서 DENC에 봉입된 PTX 및 Dox의 약물 방출 프로파일을 나타낸다. 도 5c에서, TPMAA의 변경비율은 37%였다. TPMAA의 첨가량은 1 중량%였다. 도 5c로부터, pH 4에서 약물의 방출량이 pH 7에서 약물의 방출량보다 상당히 크다는 것을 알 수 있다. pH 4의 산 환경에서, 소수성 PTX의 방출량은 친수성 Dox의 방출량보다 컸다.
도 6a 및 6b는 각각 pH 7 및 pH 4에서 PVA TPMAA 혼합물을 함유하는 트라스투주맙-DENC의 전송 전자 현미경(TEM) 이미지이다. TPMAA의 첨가량은 1 중량%였고, TPMAA의 변경 비율은 37%였다. 도 6a는 트루스투주맙-DENC가 중성 환경에서 구형 쉘(spherical shell)을 가졌다는 것을 보여준다. 도 6B는 트루스투주맙-DENC의 쉘이 산 환경에서 수축 및 변형되었다는 것을 보여준다.
특히 약물 방출 행태가 상기 TPMAA가 산 환경에서 수축했고 소수성으로 변형되었다는 것과 일치했다. 많은 수소 이온이 환경에 존재할 경우, 상기 쉘안의 TPMAA가 수축하기 시작하고, 따라서, 상기 쉘이 변형되고 압출된다. 따라서, 유상 쉘내에 위치하는 상기 소수성 약물은 수상 코어내에 위치하는 친수성 약물보다 많이 방출될 수 있다.
실시예 8: HER-2 과발현 세포에 대한 트라스투주맙-결합 전달체의 인식
본 실시예에서, 트라스투주맙-DENC가 HER-2 과발현 세포를 타겟으로 할 수 있는지 여부가 확인되었다. 상기 선택된 HER-2 과발현 세포 복제는 SkBr3(인간 유방 선암) 세포였다. 실험에 사용된 트라스투주맙-DENC의 쉘은 16000의 분자량을 가지는 PVA와 TPMAA의 혼합물로 구성되었다. TPMAA의 첨가량은 1 중량%였고, TPMAA의 변경 비율은 37%였다.
먼저, 친수성 Dox를 봉입한 DENC는 유방암 항체 트라스투주맙과 항체 lgG와 각각 결합되었다. 그 후, 친수성 독소루비신(Dox)를 봉입한 항체-DENC과 SkBr3 세포가 37℃에서 30분간 함께 배양되었다. Dox는 형광(580nm의 파장에서 방출하고, 488nm의 파장에서 여기되는)을 방출하기 때문에, 플로우 사이토미터(flow cytometer)가 항원-항체 반응을 통해 상기 SkBr3 세포의 세포 표면상에 결합된 Dox의 형광강도를 감지할 수 있다.
도 7a는 Dox를 둘러싸는 트라스투주맙-DENC의 다양한 양이 첨가된 SkBr3 세포의 유동세포계수 분석 결과를 나타낸다. 도 7a에서, Dox를 봉입한 트라스투주맙-DENC은 T로 표시되고, control로 표시된 곡선에서 Dox를 봉입한 트라스투주맙-DENC의 첨가량은 제로였다. Dox를 봉입한 트라스투주맙-DENC의 첨가량이 많을 경우 더 많은 SkBr3 세포가 더 높은 형광 강도를 가진다는 것이 보여진다. 이런 결과는 Dox를 봉입한 트라스투주맙-DENC가 SkBr3 세포를 인식할 수 있고 SkBr3 세포 표면상에 결합할 수 있다는 것을 보여준다.
도 7b는 Dox를 봉입한 IgG-DENC의 다양한 양이 첨가된 SkBr3 세포의 유동세포계수 분석 결과를 나타낸다. 도 7B에서, 상기 Dox를 봉입한 IgG-DENC가 IgG로 표시되고, control로 표시된 곡선에서 Dox를 봉입한 SgG-DENC의 첨가량은 제로였다. 이것은 Dox를 봉입한 IgG-DENC의 첨가량에 상관없이, 상기 형광강도 분포는 거의 동일하다는 것을 보여줄 수 있다. 이런 결과는 Dox를 봉입한 IgG-DENC가 SkBr3 세포에 대해 어떠한 특효성도 없다는 것을 보여준다.
상기 결과를 더욱 확증하기 위해, Dox를 봉입한 IgG-DENC와 SkBr3 세포 뿐만 아니라, Dox를 봉입한 트라스투주맙-DENC와 SkBr3 세포를 각각 배양한 후, SkBr3 세포의 핵이 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)의 염료에 의해 염색되었다. 형광 Dox와 핵의 분산은 공초점 현미경을 통해 관측되었다. 게다가, 순수 SkBr3 세포와 유리 Dox가 역시 상기 공초점 현미경을 통해 관측되었다. 획득된 결과는 도 8에 도시되어 있다.
도 8은 SkBr3 세포, 유리 Dox, Dox를 봉입한 IgG-DENC, 및 Dox를 봉입한 트라스투주맙-DENC의 공초점 현미경 이미지를 나타낸다. 도 8에서, "cell", "Dox", "IgG-Dox" 및 "T-Dox"로 표시된 각 컬럼은 각각 SkBr3 세포, 자유 Dox, Dox를 봉입하는 IgG-DENC, Dox를 봉입하는 트라스투주맙-DENC을 나타낸다. "nucleus", "Dox" 및 "image merge"(이미지 중첩)으로 표시된 각 라인은 각각 핵의 위치, Dox, 핵과 Dox의 위치의 중첩된 이미지를 나타낸다.
도 8은 Dox를 봉입한 트라스투주맙-DENC와 SkBr3 세포의 핵의 위치가 많이 중첩을 가졌다는 것을 보여준다. 이것은 Dox를 봉입하는 트라스투주맙-DENC이 실제로 SkBr3 세포를 인식할 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 다른 샘플에서, 거의 핵만 관측될 수 있고, 거의 어떤 Dox 이미지도 핵 이미지와 중첩하는 것으로 관측되지 않았다. 이것은 다른 샘플들은 거의 SkBr3 세포 상에 결합되지 않았다는, 다시 말해, 다른 샘플들은 SkBr3 세포를 인식할 수 없다는 것을 의미하다.
실시예 9: HER-2 과발현 세포에 대한 다양한 DENC의 세포독성 효과
본 실시예에서, HER-2 과발현 세포에 대한 다양한 DENC의 세포독성이 조사되었다. DENC의 쉘은 16000의 분자량을 가지는 PVA와 TPMAA의 혼합물이었다. TPMAA의 첨가량은 1 중량%였고, TPMAA의 변경 비율은 37%였다.
결합되지 않은 빈 DENC (대조군), PTX를 봉입하는 DENC(PTX군), Dox를 봉입하는 DENC(Dox군), 트라스투주맙-DENC(T군), PTX를 봉입하는 트라스투주맙-DENC(T-PTX군), PTX 및 Dox를 봉입하는 DENC(PTX-Dox), PTX 및 Dox를 봉입하는 트라스트주맙-DENC(T-PTX-Dox)를 각각 SkBr3 세포 배양물에 첨가한 다음 각각 37℃에서 24시간 동안 공배양했다. 다음으로, 각 샘플의 세포 생존능력을 평가하기 위해 세포 생존율 측정기법(MTT assay)이 사용되었다. 획득된 결과는 하기의 표 4에 표시되고, 도 9에 도시된다.
표 4: SkBr3 세포에 대한 다양한 DENC의 세포독성 효과
Figure 112015114993467-pct00007
* ( 트라스투주맙-DENC의 세포 생존능력/ DENC의 세포 생존능력) X 100%에 의해 산출됨
표 4 및 도 9에서 보여지는 결과로부터, 빈 DENC는 SkBr3에 대한 세포독성 효과를 가지지 않았고, 따라서, SkBr3 세포에 대해 무독성이었다는 것을 알 수 있다. 그러나, 트라스투주맙과 결합된 빈 DENC 후에, 세포 생존능력은 약 75% 감소하였다. 트라스투주맙과 결합된 전, 후 PTX를 봉입하는 DENC의 세포 생존능력과 비교하여, 세포 생존능력은 트라스투주맙과 결합전 PTX를 봉입하는 DENC의 단지 약 48%인, 약 56%로부터 27%까지 감소하였다. 트라스투주맙과 결합된 전, 후 Dox를 봉입하는 DENC의 세포 생존능력과 비교하여, 세포 생존능력은 트라스투주맙과 결합전 Dox를 봉입하는 DENC의 단지 약 84%인, 약 35%로부터 29%까지 감소하였다. 트라스투주맙과 결합된 전, 후 PTX와 Dox를 봉입하는 DENC의 세포 생존능력과 비교하여, 세포 생존능력은 트라스투주맙과 결합전 PTX와 Dox를 봉입하는 DENC의 단지 약 59%인, 약 24%로부터 14%까지 감소하였다.
상기의 비교로부터, 트라스투주맙과 결합된 후, 모든 DENC가 SkBr3 세포에 대한 더 좋은 세포독성 효과를 가진다는 것을 알 수 있다.
실시예 10: 생체내 동물 실험
본 실시예에서, SkBr3 고형종양을 가지고 있는 누드 쥐가 생체내 동물 실험에 이용되었다. DENC이 쉘이 16000의 분자량을 가지는 PVA와 TPMAA의 혼합물로 구성되었다. TPMAA의 첨가량은 1중량%였고, TPMAA의 변경 비율은 37%였다. 상기 쉘은 시아닌 염료 5.5(Cy5.5)에 링크되었다.
먼저, 누드 쥐의 DENC 분포가 비침습 생체내 이미징 시스템(MS)를 사용함으로써 관측되었다. 3700 G 자석이 상기 누드 쥐의 왼쪽 사이드 상에 있는 종양에 부착되었고, 누드 쥐의 오른쪽 사이드 상에 있는 종양에는 어떠한 자석도 부착되지 않았다. MS하에서 상기 누드 쥐에 DENC를 주입한 후 첫째날과 셋째날의 결과가 도 10의 A와 B에 도시되었다.
도 10의 A에서 보여지는 첫째날의 이미지에서, 상기 왼쪽 사이드상의 종양(110a)와 오른쪽 사이드상의 종양(110b) 모두에 많은 양의 DENC가 축적되었다. 그러나, 도 10의 B에서 보여지는 셋째날의 이미지에서는, 왼쪽 종양(110b) 상의 DENC의 축적양이 오른쪽 종양(120b) 상의 DENC의 축적양보다 굉장히 많았고, 상기 왼쪽 종양(110b) 상의 축적양이 상기 오른쪽 종양(120b)의 축적양의 약 2배였다. 따라서, 외부의 인가된 자기장이 누드 쥐에서 자기-감응형 DENC의 분포에 영향을 미칠수 있다.
다음으로, 누드 쥐 이종이식 종양 모델이 다양한 DENC의 치료 효과를 분석하기 위해 사용되었다. 상기 실험에서, 테스트된 다양한 DENC가 종양 치료를 위해 첫번째날, 다섯번째날, 아홉번째날, 열세번째날에 각각 누드 쥐의 네일(nail) 정맥으로 주입되었다. 그리고 나서, IVIS가 1-30일 동안 종양의 사이즈를 관측하기 위해 사용되었다. 획득된 결과는 도 11에서 도시되었다.
도 11에 도시된 실험 그룹은 생리식염수(saline), 빈 DENC, PTX를 봉입하는 DENC(PTX), Dox를 보입하는 DENC(Dox), PTX를 봉입하는 트라스투주맙-DENC(T-DENC), PTX와 Dox를 보입하는 DENC(PTX-Dox), 자기장이 적용되지 않고 PTX와 Dox를 봉입하는 트라스투주맙-DENC(T-PTX-DOX No MT) 및 PTX와 Dox를 봉입하는 트라스투주맙-DENC(T-PTX-DOX)를 포함한다. 각 실험 그룹은 종양 사이트에 부착된 2000G 자석을 가지고, 단지 T-PTX-DOX No MT의 그룹만 종양 사이트에 어떠한 자석도 가지지 않았다.
도 11에서 보여지는 결과로부터, T-PTX-DOX 그룹의 치료 효과가 가장 훌륭하고, 30일 후 원래 종양 사이즈가 단지 1.98배로 증가되었다. 그러나, 염류용액 그룹에 대해서는, 30일 후 원래 종양 사이즈의 17.6배가 증가되었다.
실시예 11: PVA와 PVA-TPMAA 공중합체의 혼합물을 함유하는 항체-DENC
본 실시예에서, PVA와 PVA-TPMAA 공중합체의 혼합물을 함유하는 DENC가 도 2b의 이중 유화 방법에 의해 제조된다. 봉입된 약물은 실시예로서 친수성 독소루비신(Dox)와 소수성 패클리탁셀(PTX)을 가졌다. 상기 2개의 약물은 암 치료를 위한 일반적인 항함화학요법 약물이다. 그리고 나서, PVA와 PVA-TPMAA 공중합체의 혼합물을 함유하는 DENC가 쉘 상에 항체와 결합된다.
PVA와 PVA-TPMAA 공중합체의 혼합물을 함유하는 DENC의 제조는 실시예 6에서 PVA와 TPMAA의 혼합물을 함유하는 DENC와 유사하다. 단지 차이는 PVA와 TPMAA의 제 2 수용액이 PVA-TPMAA 공중합체 수용액의 2 중량%로 대체되고, PVA-TPMAA 공중합체에서 TPMAA의 변경 비율이 37%였다는 것이다. 마지막으로, 상기 획득된 PVA와 PVA-TPMAA 공중합체의 혼합물을 함유하는 트라스투주맙-DENC는 초순수에서 분산되었다.
먼저, PVA-TPMAA 공중합체에서 TPMAA의 함량(content)이 항체 결합 비율, DENC 지름 및 봉입 효율(encapsulating efficiency)에 영향을 미치는가가 조사되었다. 상기 획득된 결과는 하기의 표 5에 개시된다. 표 5로부터, 항체는 DENC와 결합하기 위해 TPMAA의 티올기를 필요로하기 때문에, 상기 항체 결합 비율은 상기 TPMAA 함량이 많을 때 더 높아졌다는 것을 알 수 있다. 더 나아가, 항체 결합 비율이 높으면 높을 수록, DENC 지름이 더 커졌다. 약물의 봉입 효율은 TPMAA 함량에 큰 영향을 받지 않았고, 따라서, 항체 결합 비율에 의해서도 큰 영향을 받지 않았다. 이는 항체가 DENC와 결합되기 전에 약물이 DENC에 봉입되었다는 것일 수 있다.
표 5: 항체 결합 비율, DENC의 지름 및 약물의 봉입 효율에 대한 PVA-TPMAA 공중합체에서 TPMAA 함량의 효과
Figure 112015114993467-pct00008
다음으로, DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 대한 효과를 알아보기 위해 유기 용매 클로로포름의 휘발 온도 및 휘발 시간이 조사되었다. PVA-TPMAA 공중합체의 TPMAA에 대한 PVA의 몰비는 4 : 1이었다. 상기 획득된 결과는 하기의 표 6에 개시된다. 표 6에서, 55℃ 이하에서 클로로포름의 휘발 온도와 휘발 시간은 DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 명백한 효과를 가지지 않았다.
표 6: DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 대한 유기 용매 클로로포름의 휘발 온도 및 휘발 시간의 효과
Figure 112015114993467-pct00009
다음으로, DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 대한 유화 시간의 효과가 조사되었다. PVA-TPMAA 공중합체의 TPMAA에 대한 PVA의 몰비는 4 : 1이었다. 상기 획득된 결과는 하기의 표 7에 개시된다. 표 7에서, 제 1 및 2 유화시간의 길이는 DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 명백한 효과를 가지지 않았다.
표 7. DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 대한 유화 시간의 효과
Figure 112015114993467-pct00010
PVA 분자량과 생성물 형태에 대한 PVA-TPMAA의 TPMAA 함량의 효과가 조사되었다. 획득된 결과는 하기의 표 8에 개시된다. 표 8에서, PVA의 분자량이 25000에서부터 61000까지 였을 때, TPMAA 함량이 증가하면서 DENC의 지름이 증가하였다. PVA가 47000의 분자량을 가졌을 때, 나노구조의 약 반 정도가 코어-쉘 구조를 가졌다. PVA가 61000의 분자량을 가졌을 때, 단지 적은 나노구조만이 코어-쉘 구조를 가졌다. PVA가 78000의 분자량을 가졌을 때, 어떠한 나노입자도 형성되지 않았다. 이런 결과는 PVA의 분자량이 너무 큰 경우 어떠한 나노캡슐도 형성되지 않을 것이라는 것을 보여준다.
표 8: PVA 분자량과 생성물 형태에 대한 PVA-TPMAA의 TPMAA 함량의 효과
Figure 112015114993467-pct00011
실시예 12: PVA/TPVA 혼합물을 함유하는 항체 결합 전달체
본 실시예에서, PVA와 TPVA의 혼합물을 함유하는 이중 유액 나노캡슐(예를 들어, DENC)이 도 2b에 있는 이중 유화 방법에 의해 제조되었다. 사용된 실시 약물은 친수성 독소루비신(Dox)와 소수성 패클리탁셀(PTX)였다. 상기 2개의 약물은 암 치료를 위한 일반적인 항함화학요법 약물이다. 그리고 PVA와 TPVA의 혼합물을 함유하는 DENC는 도 2c의 방법에 의해 쉘의 표면 상에 항체와 결합되었다.
PVA와 TPVA의 혼합물을 함유하는 DENC의 제조 방법은 실시예 6에서 PVA와 TPMAA의 혼합물을 함유하는 DENC 제조 방법과 유사하다. 단지 차이는 단지 차이는 PVA와 TPMAA의 제 2 수용액이 PVA-TPMAA 공중합체 수용액의 2 중량%로 대체되고, PVA-TPMAA 공중합체에서 TPMAA의 변경 비율이 30%였다는 것이다. 마지막으로, 상기 획득된 PVA와 PVA의 혼합물을 함유하는 트라스투주맙-DENC는 초순수에서 분산되었다.
먼저, TPVA의 함량이 항체 결합 비율, DENC 지름 및 봉입 효율에 영향을 미치는가가 조사되었다. 상기 획득된 결과는 하기의 표 9에 개시된다. 표 9에서, 항체는 DENC와 결합하기 위해 TPMAA의 티올기를 필요로하기 때문에, 상기 항체 결합 비율은 상기 TPVA 함량이 많을 때 더 높아졌다는 것을 알 수 있다. 더 나아가, 항체 결합 비율이 높으면 높을 수록, DENC 지름이 더 커졌다. 약물의 봉입 효율은 TPVA 함량에 큰 영향을 받지 않았고, 따라서, 항체 결합 비율에 의해서도 큰 영향을 받지 않았다. 이는 항체가 DENC와 결합되기 전에 약물이 DENC에 봉입되었다는 것일 수 있다.
표 9: 항체 결합 비율, DENC 지름 및 봉입 효율에 대한 TPVA의 영향
Figure 112015114993467-pct00012
다음으로, DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 대한 유화 시간의 효과가 조사되었다. TPVA 함량이 30 몰%였고, PVA의 분자량은 16000이었다. 획득된 결과는 하기의 표 10에 개시되었다. 표 10에서, 제 1 및 2 유화시간의 길이는 DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 명백한 효과를 가지지 않았다.
표 10: DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 대한 유화 시간의 효과
Figure 112015114993467-pct00013
PVA 분자량과 생성물 형태에 대한 TPVA 함량의 효과가 조사되었다. 획득된 결과는 하기의 표 11에 개시된다. 표 11에서, PVA의 분자량이 25000에서부터 61000까지 였을 때, TPVA 함량이 증가할수록 DENC의 지름이 증가했다. PVA가 47000의 분자량을 가졌을 때, 나노구조의 약 반 정도가 코어-쉘 구조를 가졌다. PVA가 61000의 분자량을 가졌을 때, 단지 적은 나노구조만이 코어-쉘 구조를 가졌다. PVA가 78000의 분자량을 가졌을 때, 어떠한 나노입자도 형성되지 않았다. 이런 결과는 PVA의 분자량이 너무 큰 경우 어떠한 나노캡슐도 형성되지 않을 것이라는 것을 보여준다.
표 11: PVA 분자량과 생성물 형태에 대한 TPVA 함량의 효과
Figure 112015114993467-pct00014
실시예 13: PVA/PAA 혼합물을 함유하는 항체-DENC
본 실시예에서, PVA와 PAA의 혼합물을 함유하는 이중 유액 나노캡슐(예를 들어, DENC)이 도 2b에 있는 이중 유화 방법에 의해 제조되었다. 사용된 실시 약물은 친수성 독소루비신(Dox)와 소수성 패클리탁셀(PTX)였다. 상기 2개의 약물은 암 치료를 위한 일반적인 항함화학요법 약물이다. 그리고 PVA와 PAA의 혼합물을 함유하는 DENC는 도 2c의 방법에 의해 쉘의 표면 상에 항체와 결합되었다.
PVA와 PAA의 혼합물을 함유하는 DENC의 제조 방법은 실시예 6에서 PVA와 TPMAA의 혼합물을 함유하는 DENC 제조 방법과 유사하다. 첫번째 차이는 단지 차이는 PVA와 TPMAA의 제 2 수용액이 PVA와 PAA의 수용액으로 대체되고, PVA와 PAA의 수용액에서, PVA의 농도가 20 mg/mL였고, PAA의 농도가 2 mg/mL였다는 것이다. 두번째 차이는 SMCC의 커플링제가 유방암 항체 트라수투주맙의 1차 아민기가 PAA의 카르복시기에 결합하기 위해 EDC와 Sulfo-NHS의 조합으로 대체되었다는 것이다. PVA의 분자량은 16000이었다.
유방암 항체 트라수투주맙과 커플링제의 반응에서, MES 0.1M과 NaCl 0.5M을 함유하고, pH값이 6.0인 MES 완충 용액이 먼저 제조되었다. 그리고, DENC, EDC 50ug, sulfo-NHS 60pg이 MES 완충 용액 3ml에 순차적으로 첨가되었다. 상기 혼합물은 15분 동안 교반되고 반응되었다. 그리고 EDC의 활성화 반응을 멈추기 위해 상기 MES 완충 용액에 2-메르캅토에탄올 1ug이 첨가되었다. 다음으로, pH값 6을 7보다 크게 증가시키기 위해 고농도 PBS 용액이 상기 MES 완충 용액에 처막되었다. 이어서, 트라수투주맙-DENC를 획득하기 위해 유방암 항체 트라수투주맙 500pg이 첨가되고, 상온에서 2시간 동안 반응되었다.
상기 분산 용액이 7000rpm에서 원심분리된 후 상기 획득된 트라수투주맙-DENC는 초순수에서 분산되었고, 반응되지 않은 시약이 제거되었다. 상기 트라수투주맙-DENC를 정화하기 위해, 상기 분산과 원심분리 단계는 여러 번 반복되었다. 상기 정화된 트라수투주맙-DENC은 생리식염수와 같은 용매에서 분산되었다.
도 12는 PVA 및 PAA 혼합물을 포함하는 트라스투주맙-DENC의 SEM 이미지이다. 도 12에서, 비결합된 DENC의 구면 형상이 트라스투주맙-DENC의 불규칙 형상으로 변화되었다는 것이 관측될 수 있다.
이것은 DENC가 유방암 항체 트라수투주맙와 결합으로써 초래될 수 있다. 그러나, 상기 트라수투주맙-DENC는 SEM 이미지의 명암 대비로부터 여전히 중공 구조(hollow structure)를 가졌다는 것이 관측될 수 있었다. 게다가, PVA/PAA 혼합물을 함유하는 상기 획득된 트라수투주맙-DENC는 침전을 형성하지 않고 용액 내에서 균일하게 분산될 수 있다. 따라서, PVA/PAA 혼합물을 함유하는 상기 트라수투주맙-DENC은 실시예 6에서 PVA/TPMAA를 함유하는 트라수투주맙-DENC과 유사했다.
실시예 14: PVA/PMAA 혼합물을 함유하는 항체-DENC
본 실시예에서, PVA와 PMAA의 혼합물을 함유하는 이중 유액 나노캡슐(예를 들어, DENC)는 도 2에서의 이중 유화 방법에 의해 제조되었다. 사용된 실시 약물은 친수성 독소루비신(Dox)와 소수성 패클리탁셀(PTX)였다. 상기 2개의 약물은 암 치료를 위한 일반적인 항함화학요법 약물이다. 그리고 PVA와 PMAA의 혼합물을 함유하는 DENC는 도 2c의 방법에 의해 쉘의 표면 상에 항체와 결합되었다.
PVA와 PMAA의 혼합물을 함유하는 DENC의 제조 방법은 실시예 6에서 PVA와 TPMAA의 혼합물을 함유하는 DENC 제조 방법과 유사하다. 단지 차이는 단지 차이는 PVA와 TPMAA의 제 2 수용액이 PVA-PMAA의 제 2 수용액으로 대체되고, PVA의 분자량이 16000이었다는 것이다.
PVA와 PMAA의 혼합물을 함유하는 상기 획득된 트라수투주맙-DENC은 SEM하에 관측된 불규칙적인 형태를 가졌으나, 여전히 중공 구조를 유지했다. 게다가, PVA와 PMAA의 혼합물을 함유하는 상기 트라수투주맙-DENC은 역시 침전을 형성하지 않고 용액에서 균일하게 분산될 수 있었다. 따라서, PVA/PMAA 혼합물을 함유하는 상기 트라수투주맙-DENC은 실시예 6에서의 PVA/TPMAA 혼합물을 함유하는 트라수투주맙-DENC과 유사했다.
실시예 15: PVA/CMPVA 혼합물을 함유하는 항체-DENC
본 실시예에서, 이중 유액 나노캡슐(예를 들어, DENC)는 도 2b에서의 이중 유화 방법에 의해 제조되었다. 사용된 실시 약물은 친수성 독소루비신(Dox)와 소수성 패클리탁셀(PTX)였다. 상기 2개의 약물은 암 치료를 위한 일반적인 항함화학요법 약물이다. 그리고 PVA와 CMPMA의 혼합물을 함유하는 DENC는 도 2c의 방법에 의해 쉘의 표면 상에 항체와 결합되었다.
PVA 및 CMPVA의 혼합물을 함유하는 DENC의 제조 방법은 실시예 13에서의 PVA와 PAA의 혼합물을 함유하는 DENC와 유사했다. 단지 차이는 PVA와 PAA의 제 2 수용액이 PVA와 CMPVA의 혼합물을 함유하는 수용액으로 대체된 것이었다. PVA의 분자량은 16000였고, CMPVA의 변경 비율은 30%였다.
먼저, CMPVA 함량이 항체 결합 비율, DENC 지름 및 봉입 효율에 영향을 미치는가가 조사되었다. 상기 획득된 결과는 하기의 표 12에 개시되었다. 표 12에서, 항체는 DENC와 결합하기 위해 CMPVA의 카르복시기를 필요로하기 때문에, 상기 항체 결합 비율은 상기 TPVA 함량이 많을 때 더 높아졌다는 것을 알 수 있다. 더 나아가, 항체 결합 비율이 높으면 높을 수록, DENC의 지름이 더 커졌다.
약물의 봉입 효율은 CMPVA 함량에 큰 영향을 받지 않았고, 따라서, 항체 결합 비율에 의해서도 큰 영향을 받지 않았다. 이는 항체가 DENC와 결합되기 전에 DENC에 봉입되었다는 것일 수 있다. 그러나, 양성자는 CMPVA의 카르복시기로부터 쉽게 분리되기 때문에, PVA와 CMPVA의 혼합물을 함유하는 DENC(표 12)와 PVA와 TPVA의 혼합물을 함유하는 DENC(표 9)를 비교하면, PVA와 CMPVA의 혼합물을 함유하는 DENC에 의한 Dox의 봉입 효율이 5-10% 증가되었다.
표 12 : 항체 결합 비율, DENC 지름 및 봉입 효율에 대한 CMPVA의 효과
Figure 112015114993467-pct00015
다음으로, DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 대한 유화 시간의 효과가 조사되었다. CMPVA 함량이 30 몰%였고, PVA의 분자량은 16000이었다. 획득된 결과는 하기의 표 13에 개시되었다. 표 10에서, 제 1 및 2 유화시간의 길이는 DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 명백한 효과를 가지지 않았다.
표 13 : DENC의 지름과 약물의 봉입 효율에 대한 유화 시간의 효과
Figure 112015114993467-pct00016
다음으로, 생성물 형태에 있어서 PVA 분자량과 CMPVA 함량의 효과가 조사되었다. 획득된 결과는 하기의 표 14에 개시된다. 표 14에서, PVA의 분자량이 25000에서부터 61000까지 였을 때, CMPVA 함량이 증가할수록 DENC의 지름이 증가했다. PVA가 61000의 분자량을 가졌을 때, 단지 적은 나노구조만이 코어-쉘 구조를 가졌다. PVA가 78000의 분자량을 가졌을 때, 어떠한 나노입자도 형성되지 않았다. 이런 결과는 PVA의 분자량이 너무 큰 경우 어떠한 나노캡슐도 형성되지 않을 것이라는 것을 보여준다.
표 14: 생성물 형태에 있어서 PVA-TPMAA 공중합체의 CMPVA 함량과 PVA 분자량의 효과
Figure 112015114993467-pct00017
실시예 16: PVA-TPMAA 공중합체의 혼합물을 함유하는 항체 결합 전달체
본 실시예에서, PVA-TPMAA 공중합체의 혼합물을 함유하는 이중 유액 나노캡슐(예를 들어, DENC)은 도 2a에서의 단일 유화 방법에 의해 제조되었다. 사용된 실시 약물은 친수성 독소루비신(Dox)와 소수성 패클리탁셀(PTX)였다. 상기 2개의 약물은 암 치료를 위한 일반적인 항함화학요법 약물이다. 그리고 PVA와 TPMAA의 혼합물을 함유하는 DENC는 도 2c의 방법에 의해 쉘의 표면 상에 항체와 결합되었다.
PTX와 IO-OA 나노입자의 클로로포름 용액 뿐만 아니라, Dox와 PVA-TPMAA 공중합체의 수용액이 각각 제조되었다. Dox와 PVA-TPMAA 폴리머의 수용액에서, PVA-TPMAA 공중합체의 농도는 20mg/mL였고, Dox의 농도는 8mg/mL였다. PTX와 IO-OA 나노입자의 클로로포름 용액에서, IO-OA 나노입자의 농도는 20mg/mL였고, Dox의 농도는 30mg/mL였다.
PVA-TPMAA 공중합체를 함유하는 DENC를 얻기 위해 PTX와 IO-OA 나노입자를 함유하는 CHCl3 용액 1mL 뿐만 아니라, Dox와 PVA-TPMAA 공중합체를 함유하는 제 1 수용액 2.5mL이 20kHz의 주파수에서 초음파 처리에 의해 혼합되고 유화되었다. PVA와 공중합된 TPMAA의 변경 비율은 37%였다. 그리고 CHCl3를 증발시키기 위해 오픈 공간에 최종적으로 획득된 유화용액을 위치시킴으로써 유화용액의 휘발성 CHCl3이 제거되었다. 상기 CHCl3를 증발시키는 온도는 DENC의 형태를 변화시킬 수 있다. 다음으로, 상기 PVA-TPMAA 공중합체를 함유하는 DENC가 인산나트륨 0.1M과 염화나트륨(NaCl) 0.15M을 함유하는 3mL의 PBS 용액에서 분산되었다.
다음으로, 유방암 항체 트라수투주맙이 PVA-TPMAA 공중합체를 함유하는 상기 획득된 DENC에 결합되었다. 구체적인 결합 방법은 실시예 6의 결합 방법과 동일하므로 여기서는 생략하기로 한다.
먼저, PVA-TPMAA 공중합체에서 TPMAA 함량이 항체 결합 비율, DENC 지름 및 봉입 효율에 영향을 미치는가가 조사되었다. 상기 획득된 결과는 하기의 표 15에 개시되었다. 표 15에서, 항체는 DENC와 결합하기 위해 TPMAA의 티올기를 필요로하기 때문에, 상기 항체 결합 비율은 상기 TPVA 함량이 많을 때 더 높아졌다. 게다가, 항체 결합 비율이 높으면 높을 수록, DENC의 지름이 더 커졌다. Dox와 PTX의 봉입 효율은 TPMAA 함량에 큰 영향을 받지 않았으며, 따라서 항체 결합 비율에 의해서도 큰 영향을 받지 않았다. 이는 항체가 DENC와 결합되기 전에 DENC에 봉입되었다는 것일 수 있다.
표 15: 항체 결합 비율, DENC 지름 및 봉입 효율에 대한 TPMAA 함량의 효과
Figure 112015114993467-pct00018
실시예 17: TPVA를 함유하는 항체 결합 전달체
본 실시예에서, TPVA를 함유하는 이중 유액 나노캡슐(예를 들어, DENC)은 도 2a에서의 단일 유화 방법에 의해 제조되었다. 사용된 실시 약물은 친수성 독소루비신(Dox)와 소수성 패클리탁셀(PTX)이었다. 상기 2개의 약물은 암 치료를 위한 일반적인 항암 화학요법 약물이다. 그리고 TPVA를 함유하는 DENC는 도 2c의 방법에 의해 쉘의 표면 상에 항체와 결합되었다.
TPVA를 함유하는 DENC의 제조 방법은 실시예 16에 따른 PVA-TPMAA 공중합체를 함유하는 DENC의 제조 방법과 유사했다. 단지 차이는 PVA-TPMAA 공중합체와 Dox의 수용액이 TPVA와 Dox를 함유하는 수용액으로 대체되었다는 것이다. TPVA와 Dox의 수용액에서, TPVA의 농도는 20mg/mL였고, Dox의 농도는 8mg/mL였다. 사용된 PVA는 16000의 분자량을 가졌다.
도 13a-13c는 각각 분자량 25000, 47000, 및 78000을 갖는 TPVA를 포함하는 이중 유액 나노캡슐의 SEM 이미지이다. 도 13a-13c는 DENC의 응집(aggregation)이 TPVA의 분자량이 증가하면서 증가되었다는 것을 보여준다. 그 이유는 상기 TPVA의 분자량이 증가하면서 DENC의 소수성이 증가되었기 때문일 수 있다.
먼저, TPVA는 PVA를 티오글리콜산으로 개질하여 얻어지기 때문에, 항체 결합 비율, DENC의 지름 및 봉입 효율에 대한 효과를 알기 위해 TPVA의 변경 비율이 조사되었다. 상기 TPVA는 분자량 16000을 가진 PVA로부터 얻어졌고, 상기 획득된 결과는 하기의 표 16에 개시되었다. 표 16에서, 항체는 DENC와 결합하기 위해 TPVA의 티올기를 필요로하기 때문에, 상기 항체 결합 비율은 상기 TPVA 함량이 많을 때 더 높아졌다. 게다가, 항체 결합 비율이 높으면 높을 수록, DENC의 지름이 더 커졌다. Dox와 PTX의 봉입 효율은 TPMAA 함량에 큰 영향을 받지 않았으며, 따라서 항체 결합 비율에 의해서도 큰 영향을 받지 않았다. 이는 항체가 DENC와 결합되기 전에 약물이 DENC에 봉입되었다는 것일 수 있다.
표 16: 항체 결합 비율, DENC의 지름 및 봉입 효율에 대한 TPVA의 변경 비율의 효과
Figure 112015114993467-pct00019
실시예 18: CMPVA를 함유하는 항체 결합 전달체
본 실시예에서, CMPVA를 함유하는 이중 유액 나노캡슐(예를 들어, DENC)은 도 2a에서의 단일 유화 방법에 의해 제조되었다. 사용된 실시 약물은 친수성 독소루비신(Dox)와 소수성 패클리탁셀(PTX)였다. 상기 2개의 약물은 암 치료를 위한 일반적인 항함화학요법 약물이다. 그리고 CMPVA를 함유하는 DENC는 도 2c 방법에 의해 쉘의 표면 상에 항체와 결합되었다.
CMPVA를 함유하는 DENC의 제조 방법은 실시예 16에 따른 PVA-TPMAA 공중합체를 함유하는 DENC의 제조 방법과 유사했다. 단지 차이는 PVA-TPMAA 공중합체와 Dox의 수용액이 CMPVA와 Dox를 함유하는 수용액으로 대체되었다는 것과, CMPVA와 Dox의 수용액에서, CMPVA의 농도는 20mg/mL였고, Dox의 농도는 8mg/mL였다. 사용된 PVA는 16000의 분자량을 가졌다.
항체를 결합하는 방법은 실시예 13에서의 PVA와 PAA의 혼합물을 함유하는 DENC의 결합 방법과 유사했다. CMPVA의 카르복시기가 유방암 항체 트라수투주맙의 1차 아민기와 연결하기 위해 커플링제는 EDC와 sulfo-NHS의 조합이었다.
CMPVA는 PVA를 티오글리콜산으로 개질하여 얻어지기 때문에, 항체 결합 비율, DENC의 지름 및 봉입 효율에 대한 효과를 알기 위해 CMPVA의 변경 비율이 조사되었다. 상기 CMPVA는 분자량 16000을 가진 PVA로부터 얻어졌고, 상기 획득된 결과는 하기의 표 17에 개시되었다. 표 17에서, 항체는 DENC와 결합하기 위해 PVA의 티올기를 필요로하기 때문에, 상기 항체 결합 비율은 상기 PVA의 변경 비율이 높을 수록 더 높아졌다. 게다가, 항체 결합 비율이 높으면 높을 수록, DENC의 지름이 더 커졌다.
약물의 봉입 효율은 PVA의 변경 비율에 의해 큰 영향을 받지 않았으며, 따라서 항체 결합 비율에 의해서도 큰 영향을 받지 않았다. 이는 항체가 DENC와 결합되기 전에 약물이 DENC에 봉입되었다는 것일 수 있다. 그러나, CMPVA만이 단일 유화 방법에 사용되었기 때문에, CPMVA를 함유하는 DENC(표 17)와 PVA와 CMPVA의 혼합물을 함유하는 DENC(표 12)를 비교하면, 카르복시기가 DENC의 쉘의 외부 표면과 내부 표면 상에 분포될 수 있다. 게다가, 양성자는 CMPVA의 카르복시기로부터 쉽게 분리되기 때문에, PVA와 CMPVA의 혼합물을 함유하는 DENC에 의한 Dox의 봉입 효율이 1-5% 증가되었다.
표 17 : 항체 결합 비율, DENC의 지름, 약물의 봉입 효율에 대한 PVA 변경 비율의 효과
Figure 112015114993467-pct00020
상기의 기재를 비추어볼 때, 단일 유화 방법은 연결 PVA가 이중 유액 나노캡슐의 내부 표면과 외부 표면 모두에 연결기가 존재하도록 이중 유화 나노캡슐을 형성하게 하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이중 유화 방법은 PVA와 연결 폴리머의 혼합물이 이중 유액 나노캡슐을 형성하여 이중 유액 나노캡슐의 외부 표면상에 연결기가 존재하도록 사용될 수 있다. 상기 연결기는 필요로하는 항체와 결합하도록 사용될 수 있고, 따라서 상기 항체는 이중 유액 나노캡슐의 외부 표면상에 부착될 수 있다. 따라서, 약물을 봉입하는 이중 유액 나노캡슐은 목표된 치료를 실행하기 위해 몇몇 특정 세포를 타켓할 수 있다. 더우기, 외부에 적용되는 자기장은 약물의 축적양을 증가시키도록 사용될 수 있고, 치료 효과가 더욱 개선될 수 있다.
본 명세서(어떠한 청구항, 요약 및 도면을 포함한)에서 개시된 모든 특징은 특별히 다르게 언급되지 않은 한, 동일, 동등 또는 유사한 목적을 제공하는 대체가능한 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 개시된 각 특징은 포괄적인 동등 또는 유사한 일련의 특징 중에 단지 하나의 실시예에 불과하다.
100 : 항체 결합 이중 유액 나노캡슐 110 : 유상쉘
120 : 소수성 자성의 나노입자 130 : 연결기
135 : 항체 140 : 소수성 약물

Claims (25)

  1. 수상 코어;
    상기 수상 코어를 둘러싸는 유상 쉘로서, 유상 쉘의 조성물은 폴리머 및 소수성 자성의 나노입자를 포함하고, 다른 폴리머 및 다른 계면활성제를 포함하지 않으며, 상기 폴리머는 연결성 폴리비닐알코올 또는 폴리비닐알코올과 연결성 폴리머의 조합이고, 상기 연결성 폴리비닐알코올과 상기 연결성 폴리머는 연결기를 갖는 것인 유상 쉘; 및
    커플링제를 통해 연결기에 화학적으로 결합된 항체를 포함하고,
    항체 결합 이중 유액 나노캡슐의 지름은 50nm 내지 400nm이고,
    상기 연결성 폴리비닐알코올은 카르복시메틸화 폴리비닐알코올(CMPVA), 티올화 폴리비닐알코올(TPVA), 또는 PVA-TPVA의 공중합체인 것을 특징으로 하는 항체 결합 이중 유액 나노캡슐.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 연결기는 카르복시기, 티올기, 알데히드기, 아민기 또는 히드록시기인 것을 특징으로 하는 항체 결합 이중 유액 나노캡슐.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 연결성 폴리머는 폴리아크릴산(PAA), 폴리메타크릴산(PMAA), 또는 티올화 폴리메타크릴산(TPMAA)인 것을 특징으로 하는 항체 결합 이중 유액 나노캡슐.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 소수성 자성의 나노입자는 소수성 기능기로 수식된 표면을 가지고, Fe2O3, Fe3O4, CoFe2O4 또는 MnFe2O4 로 이루어진 나노입자인 것을 특징으로 하는 항체 결합 이중 유액 나노캡슐.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체는 트라스투주맙의 유방암 항체, 세툭시맙의 결장암 항체, 파니투무맙의 표피 생장 인자 수용체 항체, 또는 베바시주맙의 혈관형성 억제제 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 결합 이중 유액 나노캡슐.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 커플링제는 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산 카르복시산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (SMCC), N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염 (EDC), N-히드록시술포숙신이미드 나트륨염 (Sulfo-NHS), 또는 3-(2-피리딜디티오)프로시온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (SPDP)인 것을 특징으로 하는 항체 결합 이중 유액 나노캡슐.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 유상 쉘은 소수성 약물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 결합 이중 유액 나노캡슐.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 수상 코어는 친수성 약물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 결합 이중 유액 나노캡슐.
  10. 항체 결합 이중 유액 나노캡슐을 제조하는 단일 유화 방법으로서,
    연결기를 갖는 연결성 폴리비닐알코올을 포함하고 다른 폴리머 및 다른 계면활성제를 포함하지 않는 수용액을 제조하는 단계;
    소수성 자성의 나노입자를 포함하는 유기용액을 제조하는 단계;
    상기 수용액과 상기 유기용액을 혼합하여 이중 유액 나노캡슐을 포함하는 유화 용액을 형성하는 단계;
    상기 유기용액에서 사용된 유기용매를 제거하여 이중 유액 나노캡슐을 얻는 단계;
    상기 이중 유액 나노캡슐을 포함하는 제 1 분산 용액을 제조하는 단계;
    커플링제와 결합된 항체를 포함하는 제 2 분산 용액을 제조하는 단계; 및
    상기 제 1 분산 용액과 상기 제 2 분산 용액을 혼합하여 상기 연결기와 상기 커플링제를 화학적으로 반응시켜 항체 결합 이중 유액 나노캡슐을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 유화 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 연결기는 카르복시기, 티올기, 알데히드기, 아민기 또는 히드록시기인 것을 특징으로 하는 단일 유화 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 연결성 폴리비닐알코올은 카르복시메틸화 폴리비닐알코올(CMPVA), 티올화 폴리비닐알코올(TPVA), 또는 PVA-TPVA의 공중합체인 것을 특징으로 하는 단일 유화 방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 소수성 자성의 나노입자는 소수성 기능기로 수식된 표면을 가지고, Fe2O3, Fe3O4, CoFe2O4 또는 MnFe2O4 로 이루어진 나노입자인 것을 특징으로 하는 단일 유화 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 항체는 트라스투주맙의 유방암 항체, 세툭시맙의 결장암 항체, 파니투무맙의 표피 생장 인자 수용체 항체, 또는 베바시주맙의 혈관형성 억제제 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 유화 방법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 커플링제는 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산 카르복시산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (SMCC), N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염 (EDC), N-히드록시술포숙신이미드 나트륨염 (Sulfo-NHS), 또는 3-(2-피리딜디티오)프로시온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (SPDP)인 것을 특징으로 하는 단일 유화 방법.
  16. 제 10 항에 있어서,
    상기 수용액은 친수성 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 유화 방법.
  17. 제 10 항에 있어서,
    상기 유기용액은 소수성 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 단일 유화 방법.
  18. 항체 결합 이중 유액 나노캡슐을 제조하는 이중 유화 방법으로서,
    폴리비닐알코올을 포함하고 다른 폴리머 및 다른 계면활성제를 포함하지 않는 제 1 수용액을 제조하는 단계;
    소수성 자성의 나노입자를 포함하는 유기용액을 제조하는 단계;
    상기 제 1 수용액과 상기 유기용액을 혼합하여 유중수 유화 용액인 제 1 유화 용액을 형성하는 단계;
    연결기를 갖는 연결성 폴리머 및 폴리비닐알코올의 조합을 포함하고 다른 폴리머 및 다른 계면활성제를 포함하지 않는 제 2 수용액을 제조하는 단계;
    상기 제 1 유화 용액과 상기 제 2 수용액을 혼합하여 이중 유액 나노캡슐을 포함하는 제 2 용액을 형성하는 단계;
    상기 유기용액에서 사용된 유기용매를 제거하여 이중 유액 나노캡슐을 얻는 단계;
    상기 이중 유액 나노캡슐을 포함하는 제 1 분산 용액을 제조하는 단계;
    커플링제와 결합된 항체를 포함하는 제 2 분산 용액을 제조하는 단계; 및
    상기 제 1 분산 용액과 상기 제 2 분산 용액을 혼합하여 상기 연결기와 상기 커플링제를 화학적으로 반응시켜 항체 결합 이중 유액 나노캡슐을 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 유화 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 연결기는 카르복시기, 티올기, 알데히드기, 아민기 또는 히드록시기인 것을 특징으로 하는 이중 유화 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 연결성 폴리머는 폴리아크릴산(PAA), 폴리메타크릴산(PMAA), 또는 티올화 폴리메타크릴산(TPMAA)인 것을 특징으로 하는 이중 유화 방법.
  21. 제 18 항에 있어서,
    상기 소수성 자성의 나노입자는 소수성 기능기로 수식된 표면을 가지고, Fe2O3, Fe3O4, CoFe2O4 또는 MnFe2O4 로 이루어진 나노입자인 것을 특징으로 하는 이중 유화 방법.
  22. 제 18 항에 있어서,
    상기 항체는 트라스투주맙의 유방암 항체, 세툭시맙의 결장암 항체, 파니투무맙의 표피 생장 인자 수용체 항체, 또는 베바시주맙의 혈관형성 억제제 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 유화 방법.
  23. 제 18 항에 있어서,
    상기 커플링제는 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산 카르복시산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (SMCC), N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염 (EDC), N-히드록시술포숙신이미드 나트륨염 (Sulfo-NHS), 또는 3-(2-피리딜디티오)프로시온산 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (SPDP)인 것을 특징으로 하는 이중 유화 방법.
  24. 제 18 항에 있어서,
    상기 제 1 수용액은 친수성 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 유화 방법.
  25. 제 18 항에 있어서,
    상기 유기용액은 소수성 약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 유화 방법.
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