JP6265979B2 - チエノトリアゾロジアゼピン化合物を使用するリンパ腫の治療方法 - Google Patents

Description

本発明は、チエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を使用するＢ細胞悪性癌およびＴ細胞悪性癌の治療方法に関する。

ブロモドメイン含有タンパク質はクロマチン構造のリモデリングを介した遺伝子発現調節において重要な役割を果たしている。ブロモドメインおよびエクストラターミナル（Ｅｘｔｒａｔｅｒｍｉｎａｌ）（ＢＥＴ）ファミリーのメンバーであるＢＲＤ２／３／４のインヒビターを使用した場合の、Ｂ細胞およびＴ細胞急性および慢性血液悪性疾患における抗腫瘍活性が報告されている。Ｂ細胞悪性疾患はＢ細胞新生物またはＢ細胞リンパ腫としても公知であり、Ｂ細胞が過剰産生された場合または悪性である場合に生じる癌である。Ｂ細胞悪性疾患には、例えば、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、脾臓周辺帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）が含まれる。未分化大Ｔ細胞リンパ腫のようなＴ細胞悪性疾患は、Ｔリンパ腫の悪性トランスフォーメーションを表すリンパ系新生物の異種群である。

本開示は、あるＢ細胞悪性癌およびＴ細胞悪性癌の治療方法を提供する。

１つの実施形態においては、本発明は、式１：

［式中、Ｒ_１は、１〜４の炭素数を有するアルキルである；Ｒ_２は、水素原子、ハロゲン原子、または所望によりハロゲン原子もしくはヒドロキシル基により置換されていてもよい１〜４の炭素数を有するアルキルである；Ｒ_３は、ハロゲン原子、所望によりハロゲン原子、１〜４の炭素数を有するアルキル、１〜４の炭素数を有するアルコキシもしくはシアノにより置換されていてもよいフェニル、−ＮＲ_５−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_６（ここで、Ｒ_５は水素原子または１〜４の炭素数を有するアルキルであり、ｍは０〜４の整数であり、Ｒ_６は、所望によりハロゲン原子により置換されていてもよいフェニルまたはピリジルである）または−ＮＲ_７−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｒ_８（ここで、Ｒ_７は水素原子または１〜４の炭素数を有するアルキルであり、ｎは０〜２の整数であり、Ｒ_８は、所望によりハロゲン原子により置換されていてもよいフェニルまたはピリジルである）である；そしてＲ_４は−（ＣＨ_２）_ａ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ_９（ここで、ａは１〜４の整数であり、Ｒ_９は、１〜４の炭素数を有するアルキル、１〜４の炭素数を有するヒドロキシアルキル、１〜４の炭素数を有するアルコキシ、または所望により、１〜４の炭素数を有するアルキル、１〜４の炭素数を有するアルコキシ、アミノもしくはヒドロキシ基により置換されていてもよいフェニルもしくはピリジルである）または−（ＣＨ_２）_ｂ−ＣＯＯＲ_１０（ここで、ｂは１〜４の整数であり、Ｒ_１０は、１〜４の炭素数を有するアルキルである）である］により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物またはその医薬上許容される塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供する。

１つの実施形態においては、本発明は、（ｉ）（Ｓ）−２−［４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ−［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアミドまたはその二水和物、（ｉｉ）メチル（Ｓ）−｛４−（３’−シアノビフェニル−４−イル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル｝アセタート、（ｉｉｉ）メチル（Ｓ）−｛２，３，９−トリメチル−４−（４−フェニルアミノフェニル）−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル｝アセタート、および（ｉｖ）メチル（Ｓ）−｛２，３，９−トリメチル−４−［４−（３−フェニルプロピオニルアミノ）フェニル］−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ−］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル｝アセタートから、独立して選択されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供する。

１つの実施形態においては、本発明は、式２：

の構造を有する（Ｓ）−２−［４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ−［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアミドを含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供する。

１つの実施形態においては、本発明は、式１により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を、ヒトである患者に投与することによる、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供する。

式（１）の医薬上許容される量を使用してＢ細胞悪性癌を治療するための１つの実施形態においては、該Ｂ細胞悪性癌には、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および脾臓周辺帯リンパ腫が含まれる。式（１）の医薬上許容される量を使用してＴ細胞悪性癌を治療するもう１つの実施形態においては、該Ｔ細胞悪性癌には未分化大Ｔ細胞リンパ腫が含まれる。

１つの実施形態においては、本発明は、式２：

の構造を有する（Ｓ）−２−［４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ−［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアミドを含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供する。

１つの実施形態においては、本発明は、式２により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を、ヒトである患者に投与することによる、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供する。

式（２）の医薬上許容される量を使用してＢ細胞悪性癌を治療するための１つの実施形態においては、該Ｂ細胞悪性癌には、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および脾臓周辺帯リンパ腫が含まれる。式（２）の医薬上許容される量を使用してＴ細胞悪性癌を治療するもう１つの実施形態においては、該Ｔ細胞悪性癌には未分化大Ｔ細胞リンパ腫が含まれる。

前記の概要および以下の本発明の詳細な説明は、添付図面と共に読まれると、より良く理解されるであろう。

図１は、ＤＬＢＬＣ細胞系、ＤｏＨＨ_２、Ｕ−２９３２、Ｋａｒｐａｓ（カルパス）４２２、ＳＵ−ＤＨＬ−６およびＶａｌにおいて種々の濃度の式２により誘導された細胞周期変化を示す。Ｘ軸，細胞系。Ｙ軸，各細胞周期相における細胞の百分率。 図２Ａ〜２Ｃは式２への４８時間の曝露の後のＤｏＨＨ_２ ＤＬＢＬＣ細胞系およびＬ−８２ ＡＬＣＬ細胞系における細胞老化の誘導を示す。Ｙ軸は、β−ガラクトシダーゼに対して陽性である細胞の百分率である。 図３Ａおよび３ＢはＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＩ細胞系、ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＳＵ−ＤＨＬ−４、ＳＵ−ＤＨＬ−５、ＳＵ−ＤＨＬ−６、ＳＵ−ＤＨＬ−７、Ｖａｌ、ＯＣＩ−Ｌｙ７、Ｕ−２９３２、ＤｏＨＨ_２およびＫａｒｐａｓ ４２２の発現レベルを示す。Ｘ軸，細胞系。Ｙ軸，ＧＡＰＤＨに対するｍＲＮＡの量。 図４Ａおよび４ＢはＡＬＣＬ細胞系、ＭＡＣ１、ＦＥ−ＰＤ、Ｋａｒｐａｓ ２９９、ＳＵ−ＤＨＬ−１、ＳＵＰＭ−２、Ｌ８２、ＪＢ６およびＴＳにおけるＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４の発現レベルを示す。Ｘ軸，細胞系。Ｙ軸，ＧＡＰＤＨに対するｍＲＮＡの量。 図５Ａ〜５Ｆは、ＤＬＢＣＬ細胞系、ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＯＣＩ−Ｌｙ３、Ｕ−２９３２、ＤｏＨＨ_２、Ｋａｒｐａｓ ４２２およびＳＵ−ＤＨＬ−６において式２の用量を増加させた後のＭＹＣ ｍＲＮＡレベルを示す。Ｙ軸，未処理サンプルに対するｍＲＮＡの量。 図６Ａ〜６ＤはＡＬＣＬ細胞系、Ｌ８２、Ｋａｒｐａｓ ２９９、ＦＥ−ＰＤおよびＳＵ−ＤＨＬ−１における漸増量の式２の投与の後のＭＹＣ ｍＲＮＡレベルを示す。Ｙ軸，未処理サンプルに対するｍＲＮＡの量。 図７Ａ〜７Ｃは１μＭの式２の２時間の曝露およびそれに続く洗い落としの後のＤＬＢＣＬ細胞系、ＤｏＨＨ_２、Ｋａｒｐａｓ ４２２およびＳＵ−ＤＨＬ−２に関するＭＹＣ ｍＲＮＡレベルを示す。 図８Ａ〜８Ｃは、ＩＣ５０用量の式２での２４時間の処理およびそれに続く洗い落としの後の、ＤＬＢＣＬ細胞系、ＤｏＨＨ_２、Ｕ−２９３２およびＳＵ−ＤＨＬ−６の増殖に対する式２の経時的効果を示す。 図９Ａ〜９Ｂは、漸増量の式２の投与の後でＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ細胞系、ＳＵ−ＤＨＬ−２およびＵ−２９３２におけるｍＲＮＡレベル（ＩＲＦ４、Ａ２０、ＢＩＲＣ３）をＮＦκＢが標的化することを示す。Ｘ軸，細胞系。Ｙ軸，未処理サンプルに対する変化倍率。

１つの実施形態においては、本発明は、チエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量でのＢ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供する。１つのそのような実施形態においては、該チエノトリアゾロジアゼピン化合物は、以下の式（１）：

［式中、Ｒ_１は、１〜４の炭素数を有するアルキルである；Ｒ_２は、水素原子、ハロゲン原子、または所望によりハロゲン原子もしくはヒドロキシル基により置換されていてもよい１〜４の炭素数を有するアルキルである；Ｒ_３は、ハロゲン原子、所望によりハロゲン原子、１〜４の炭素数を有するアルキル、１〜４の炭素数を有するアルコキシもしくはシアノにより置換されていてもよいフェニル、−ＮＲ_５−（ＣＨ_２）_ｍ−Ｒ_６（ここで、Ｒ_５は水素原子または１〜４の炭素数を有するアルキルであり、ｍは０〜４の整数であり、Ｒ_６は、所望によりハロゲン原子により置換されていてもよいフェニルまたはピリジルである）または−ＮＲ_７−ＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−Ｒ_８（ここで、Ｒ_７は水素原子または１〜４の炭素数を有するアルキルであり、ｎは０〜２の整数であり、Ｒ_８は、所望によりハロゲン原子により置換されていてもよいフェニルまたはピリジルである）である；そしてＲ_４は−（ＣＨ_２）_ａ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ_９（ここで、ａは１〜４の整数であり、Ｒ_９は、１〜４の炭素数を有するアルキル、１〜４の炭素数を有するヒドロキシアルキル、１〜４の炭素数を有するアルコキシ、または所望により、１〜４の炭素数を有するアルキル、１〜４の炭素数を有するアルコキシ、アミノもしくはヒドロキシ基により置換されていてもよいフェニルもしくはピリジルである）または−（ＣＨ_２）_ｂ−ＣＯＯＲ_１０（ここで、ｂは１〜４の整数であり、Ｒ_１０は、１〜４の炭素数を有するアルキルである）である］またはその医薬上許容される塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物により表される。

１つの実施形態においては、本発明は、式（１）により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量でのＢ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供し、ここで、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌は、独立して、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫から選択される。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

１つのそのような実施形態においては、ホジキンリンパ腫は、独立して、結節性硬化性古典的（ｎｏｄｕｌａｒ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｃｌａｓｓｉｃａｌ）ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、混合細胞性（ｍｉｘｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）ＣＨＬ、リンパ球枯渇性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）ＣＨＬ、リンパ球リッチ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｒｉｃｈ）ＣＨＬおよび結節性リンパ球優勢（ｎｏｄｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）ホジキンリンパ腫から選択される。

もう１つのそのような実施形態においては、非ホジキンリンパ腫は、独立して、エイズ関連リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腫、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、エテロパシー（ｅｔｅｒｏｐａｔｈｙ）型Ｔ細胞リンパ腫、濾胞リンパ腫、肝脾ガンマ−デルタＴ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、鼻Ｔ細胞リンパ腫、小児リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、Ｔ細胞白血病、形質転換リンパ腫、治療関連Ｔ細胞リンパ腫およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症から選択される。

１つの実施形態においては、本発明は、式１により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

１つの実施形態においては、本発明は、式１により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、脾臓周辺帯リンパ腫の治療方法を提供する。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

１つの実施形態においては、本発明は、式１により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、未分化大Ｔ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

もう１つの実施形態においては、本発明は、（ｉ）（Ｓ）−２−［４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ−［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアミドまたはその二水和物、（ｉｉ）メチル（Ｓ）−｛４−（３’−シアノビフェニル−４−イル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル｝アセタート、（ｉｉｉ）メチル（Ｓ）−｛２，３，９−トリメチル−４−（４−フェニルアミノフェニル）−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル｝アセタート、および（ｉｖ）メチル（Ｓ）−｛２，３，９−トリメチル−４−［４−（３−フェニルプロピオニルアミノ）フェニル］−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ−］［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル｝アセタートからなる群から選択される、式１により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を含む。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

もう１つの実施形態においては、本発明は、Ｙ−８０３およびＯＴＸ−０１５としても公知である（Ｓ）−２−［４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ−［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアミド（式２）：

を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供する。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

１つの実施形態においては、本発明は、式（２）により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量でのＢ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌の治療方法を提供し、ここで、Ｂ細胞悪性癌またはＴ細胞悪性癌は、独立して、ホジキンリンパ腫または非ホジキンリンパ腫から選択される。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

１つのそのような実施形態においては、ホジキンリンパ腫は、独立して、結節性硬化性古典的（ｎｏｄｕｌａｒ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｃｌａｓｓｉｃａｌ）ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、混合細胞性（ｍｉｘｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）ＣＨＬ、リンパ球枯渇性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）ＣＨＬ、リンパ球リッチ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｒｉｃｈ）ＣＨＬおよび結節性リンパ球優勢（ｎｏｄｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔ）ホジキンリンパ腫から選択される。

もう１つのそのような実施形態においては、非ホジキンリンパ腫は、独立して、エイズ関連リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腫、芽細胞性ＮＫ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病／小リンパ球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、エテロパシー（ｅｔｅｒｏｐａｔｈｙ）型Ｔ細胞リンパ腫、濾胞リンパ腫、肝脾ガンマ−デルタＴ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、鼻Ｔ細胞リンパ腫、小児リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、Ｔ細胞白血病、形質転換リンパ腫、治療関連Ｔ細胞リンパ腫およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症から選択される。

もう１つの実施形態においては、本発明は、式２により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の治療方法を含む。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

１つの実施形態においては、本発明は、式２により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、脾臓周辺帯リンパ腫の治療方法を提供する。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

１つの実施形態においては、本発明は、式２により表されるチエノトリアゾロジアゼピン化合物を含む組成物の医薬上許容される量を患者に投与することによる、未分化大Ｔ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。１つのそのような実施形態においては、患者はヒトである。

式１および式２により表される化合物の製造は、米国特許第５，７１２，２７４号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている方法を含む当技術分野において既に記載されている方法に従い、当業者により化学合成により達成されうる。

式１または式２により表される化合物は経口運搬用の医薬上許容される担体と混合されうる。該担体には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤ならびに他の機能的および非機能的賦形剤が含まれうる。

式１または式２により表される化合物の用量は、体重、年齢、健康状態、食事および患者により示される他の関連要因ならびに式１または式２のバイオアベイラビリティおよび式１または式２の製品製剤を考慮して、当業者により決定されうる。１つの実施形態においては、式１または式２の化合物の経口用量は４０〜１００ｍｇの範囲でありうる。

該治療方法の予想外の結果を例示する以下の非限定的な実施例により本発明を更に詳しく説明する。

実施例１：リンパ腫細胞増殖に対する式２の効果
２２個のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、８個の未分化大Ｔ細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、４個のマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、および３個の脾臓周辺帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）樹立ヒト細胞系において、式２の抗増殖活性を評価した。１０％ ウシ胎児血清、１％ Ｌ−グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシン−ネオマイシン（〜５，０００単位のペニシリン、５ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１０ｍｇ／ｍＬのネオマイシン）で補足されたＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）培地内で細胞系を培養した。

増殖アッセイのために、９６ウェルプレート内に１０^４細胞／ウェルの密度で細胞を播いた。式２の化合物（ＯｎｃｏＥｔｈｉｘ ＳＡ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を１０ｍＭのストック溶液としてＤＭＳＯに溶解し、ついで幾つかのアリコートに分割し、−８０℃で保存した。各実験のために、ストック溶液のアリコートを解凍し、培地内に系列希釈し、２〜３日以内に使用した。細胞をＤＭＳＯ（対照）または漸増量の式２の化合物（５回の重複実験）で３７℃で７２時間処理した。細胞増殖を検出するために、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５ｍｇ／ｍＬのストック溶液として調製し、濾過滅菌した。ついで０．５ｍｇ／ｍＬと同等のＭＴＴ溶液の量を各ウェルに加え、暗所で３７℃で４時間インキュベートした。ついで細胞を２５％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）細胞溶解バッファーで細胞溶解し、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＤ３４０装置で５７０ｎｍの吸光度を測定した。Ｒ統計パッケージ（Ｒ：Ａ Ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、用量反応曲線によりＳ字形モデルをフィットさせることにより、５０％の成長抑制（ＧＩ_５０）をもたらす濃度に対応する用量を評価した。

表１に要約されている結果は、感受性がＧＩ_５０＜５００ｎＭにより定義された場合、ＤＬＢＣＬ系の６８％（１５／２２）、ＳＭＺＬ系の１００％（３／３）、ＡＬＣＬ系の６２％（５／８）およびＭＣＬ系の０％（０／３）が式２の化合物による成長抑制に対して感受性であることを示した。興味深いことに、胚中心型のＤＬＢＣＬに由来する細胞系（ＧＢＣ−ＤＬＢＣＬ）と活性化Ｂ細胞様型のＤＬＢＣＬに由来する細胞系（ＡＢＣ−ＤＬＢＣＬ）との間で感受性における見掛け上の相違は認められなかった。

ＤＬＢＣＬ細胞系に対する式２の化合物の考えられうる細胞毒性効果を調べるために、１００〜１５００ｎＭの範囲（ＧＩ_５０値の範囲を含む）の用量の化合物への７２時間の曝露の後、細胞死の度合を評価した。細胞死を評価するために、細胞をＤＭＳＯまたは種々の用量の式２の化合物で７２時間処理し、回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、ついでＰＢＳ中のヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）で染色した。Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＤ３４０で５３５ｎｍで吸光度を測定した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、細胞死の百分率の分析を行った。式２の化合物は低いＧＩ_５０値でＤＬＢＣＬ系の僅かな比率のみにおいて（ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＴＭＤ８、ＯＣＩ−Ｌｙ３）細胞死を誘導することを、結果（表１）は示した。

また、４個のＤＬＢＣＬ細胞系（Ｋａｒｐａｓ ４２２、ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｕ２９３２）および４個のＡＬＣＬ細胞系（ＦＥ−ＰＤ、Ｋ２９９、Ｌ８２、ＳＵ−ＤＨＬ−１）において、アポトーシスの誘導に対する式２の化合物の効果を評価した。細胞をＤＭＳＯ（対照）または種々の用量の式２の化合物で７２時間処理し、ついでＣｌｉｃｋ−ｉＴ ＥｄＵフローサイトメトリーアッセイキット（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および７−ＡＤＤ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を使用してＤＮＡ含量に関して分析した。ＦｌｏｗＪｏ ７．６．３ソフトウェア（Ｃｙｔｅｋ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用して、アポトーシス率の分析を行った。結果はＤＬＢＣＬまたはＡＬＣＬ細胞系のいずれにおいてもアポトーシスの誘導を示さなかった。

式２の化合物は、細胞生存性の顕著な低減にもかかわらず、著しい細胞死もアポトーシスも誘導しなかったため、５つのＤＬＢＣＬ細胞系（ＤｏｈＨ２、Ｋａｒｐａｓ ４２２、ＳＵ−ＤＨＬ−６、ＶＡＬ、Ｕ−２９３２）において、細胞周期に対する式２の化合物の効果を評価した。細胞をＤＭＳＯ（対照）または種々の用量の式２の化合物で２４時間処理し、ついで回収し、ＰＢＳ中で１回洗浄し、８０％ エタノール中で４℃で少なくとも１時間固定した。固定細胞を、ＲＮアーゼＡ（７５ｋＵ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中のヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ）で染色し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＤＮＡ含量に関して分析した。ＭｏｄＦｉｔ ＬＴソフトウェアパッケージ（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｐｓｈａｍ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）を使用して、細胞周期分析を行った。図１に示されているとおり、結果は、式２の化合物がＧ１停止を用量依存的に誘導することを示した。

式２の化合物は、アポトーシスの誘導を伴うことなく、細胞生存性の顕著な低減およびＧ１停止を誘導したため、代表的なＤＬＢＣＬおよびＡＬＣＬ細胞系において細胞老化の誘導を評価した。細胞を式２の化合物で４８時間処理し、ついでガラクトシダーゼに関して染色した。図２に示されているとおり、結果は、ＤＬＢＬＣおよびＡＬＣＬ細胞系の両方において老化細胞の顕著な増加を示した。このことは、式２の化合物が、主として、リンパ腫細胞に静細胞効果を及ぼすことを示唆している。

実施例２：ｃ−ＭＹＣ癌遺伝子のダウンレギュレーションに対する式２の化合物の効果
米国特許出願公開第２０１００２８６１２７号（その全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されているとおり、式２の化合物はＢＥＴブロモドメインタンパク質２、３および４（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４）の競合的インヒビターであることが既に示されている。ＢＲＤ４の阻害はｃ−ＭＹＣ癌遺伝子のダウンレギュレーションを引き起こすことが示されている［Ｄｅｌｍｏｒｅ ＪＥ，Ｉｓｓａ ＧＣ，ＬｅｍｉｅｕｘＭＥら：ＢＥＴ ｂｒｏｍｏｄｏｍａｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｃ−Ｍｙｃ．Ｃｅｌｌ ２０１１；１４６：１−１４］。したがって、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４のｍＲＮＡおよびタンパク質の基底レベル、ならびにｃ−ＭＹＣのｍＲＮＡおよびタンパク質レベルに対する式２の化合物の効果を、選択されたＤＬＢＣＬおよびＡＬＣＬ細胞系において評価した。

タンパク質レベルを評価するために、ウエスタンブロット分析を以下のとおりに行った。細胞を熱ＳＤＳ細胞溶解バッファー（ｐＨ ７．４のＴｒｉｓ−ＨＣｌ中の２．５％ ＳＤＳ）中で可溶化し、１５秒間にわたって超音波処理した。種々のサンプルにおけるタンパク質含量を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）を用いて決定した。予想分子量に基づいて、８％ ポリアクリルアミドゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ライセート（４０μｇ）を分画した。分離されたタンパク質を電気的転移によりニトロセルロース膜上にブロットした。該膜をＴＢＳ−Ｔバッファー（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０および５％ウシ血清アルブミンを含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））中で１時間ブロッキングした。ついで膜を、ＴＢＳ−Ｔ中で希釈された一次抗体と共に一晩インキュベートした。以下の抗体を使用した：抗ＢＲＤ２（ａｂ３７６３３，ＡｂＣａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、抗ＢＲＤ３（ａｂ５６３４２，ＡｂＣａｍ）、抗ＢＲＤ４（ａｂ７５８９８，ＡｂＣａｍ）および抗ＧＡＰＤＨ（ＭＡＢ３７４，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）。膜をＴＢＳ−Ｔ中で３回（それぞれ１０分間）洗浄し、ついで、適当なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ）を含有するＴＢＳ−Ｔ中で１時間インキュベートした。該膜をＴＢＳ−Ｔ中で３回（それぞれ１０分間）洗浄し、ついで、製造業者の説明（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従い、化学発光検出の増強のために処理した。サンプルの同等なローディングがＧＡＰＤＨに関するプローブにより確認された。

ｍＲＮＡ分析を以下のとおりに行った。ＲＮＡイージーキット（ｅａｓｙ ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ ＡＧ，Ｈｏｍｂｒｅｃｈｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、細胞からＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌｅｗａｒｅ，ＵＳＡ）を使用して、全ＲＮＡの濃度を２６０ｎｍで分光光度的に決定した。リアルタイムＰＣＲキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）用のスーパースクリプト第１鎖合成系（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）を該製造業者の説明に従い使用して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲ系（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）のＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＰＣＲ増幅を行った。Ｐｒｉｍｅｒ３ソフトウェア・パケージ（Ｒｏｚｅｎ Ｓ，Ｓｋａｌｅｔｓｋｙ Ｈ：Ｐｒｉｍｅｒ３ ｏｎ ｔｈｅ ＷＷＷ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｌ ｕｓｅｒｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｒｓ．Ｉｎ：Ｍｉｓｅｎｅｒ Ｓ，Ｋｒａｗｅｔｚ ＳＡ（編）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ １３２：Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｔｏｗｏｔａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ；Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，２０００，ｐｐ ３６５−３８６）を使用して、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３およびＢＲＤ４のためのプライマーセット（表２）を設計した。ｃ−ＭＹＣのためのプライマーセットを、公開されている研究成果から得た。全てのサンプルを三重に分析した。各サンプルの特異的ｍＲＮＡの相対量を、平均サイクル閾値（Ｃｔ）値に基づいて、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対する標準化による実験的変動に関する補正と共にデルタ−デルタＣｔを用いて計算した。

それぞれ図３および４に示されているとおり、ＢＲＤ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の基底レベルはＤＬＢＣＬ細胞系およびＡＬＣＬ細胞系において広範に変動し、一方、試験した全ての細胞系は低レベルのＢＲＤ４のｍＲＮＡおよびタンパク質ならびにごく僅かなレベルのＢＲＤ３のｍＲＮＡおよびタンパク質を示すことを、結果は示した。興味深いことに、ＢＲＤ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の基底レベルは式２の化合物による成長阻害に対する感受性に相関しなかった。試験したＤＬＢＣＬ系においては、最高のＢＲＤ２ ｍＲＮＡレベル（ＳＵ−ＤＨＬ−６ ＧＩ_５０＝１１０ｎＭ）および最低のＢＲＤ２ ｍＲＮＡレベル（ＤｏＨＨ２ ＧＩ_５０＝９０ｎＭ）を示す系に関して、類似したＧＩ_５０値が得られた。同様に、試験したＡＬＣＬ系においては、最高のＢＲＤ２ ｍＲＮＡレベル（Ｌ８２ ＧＩ_５０＝３６ｎＭ）および最低のＢＲＤ２ ｍＲＮＡレベル（ＦＥ−ＰＤ ＧＩ_５０＝１５８ｎＭ）を示す系に関して、類似したＧＩ_５０値が得られた。

それぞれ図５および６に示されているとおり、ｍＲＮＡ分析の結果は、試験した６個中５個（５／６）のＤＬＢＣＬ細胞系および試験した４個中４個（４／４）のＡＬＣＬ細胞系において、式２の化合物への２４時間の曝露がｃ−ＭＹＣ ｍＲＮＡの顕著なダウンレギュレーションをもたらすことを示した。興味深いことに、ｃ−ＭＹＣの最小ダウンレギュレーションを示したＤＬＢＣＬ系は式２の化合物による非常に感受性な成長阻害を示した（ＳＵ−ＤＨＬ−６ ＧＩ_５０＝１１０ｎＭ）。

式２の化合物により誘導される、ｃ−ＭＹＣのダウンレギュレーションが可逆的であったかどうかを評価するために、３個のＤＬＢＣＬ系（ＤｏＨＨ２、Ｋａｒｐａｓ ４２２、ＳＵ−ＤＨＬ−２）を式２の化合物で２時間処理し、ついで、式２の化合物を含有する培地を、式２の化合物を含有しない培地と交換した（「洗い落とし」）。洗い落とし後、図７に示されているとおり、種々の速度論で、３個全ての細胞系においてｃ−ＭＹＣ ｍＲＮＡ発現の時間依存的回復が観察された。関連実験において、図８に示されているとおり、ＧＩ_５０濃度の式２の化合物で２４時間処理されたＤＬＢＣＬ細胞は「洗い落とし」後に再増殖し始めた。

実施例３：ＮＦκＢのダウンレギュレーションに対する式２の化合物の効果
式２の化合物は、米国特許出願公開第２０１００２８６１２７号に開示されているとおり、ＢＥＴブロモドメインタンパク質２、３および４（ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４）の競合的インヒビターであることが既に示されており、ＢＲＤ４は、ある状況において腫瘍抑制因子として作用しうる転写因子ＮＦκＢの調節に関与すると報告されている［Ｈｕａｎｇ Ｂ，Ｙａｎｇ ＸＤ，Ｚｈｏｕ ＭＭ，Ｏｚａｔｏ Ｋ，Ｃｈｅｎ ＬＦ：Ｂｒｄ４ ｃｏａｃｔｉｖａｔｅｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｖｉａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ ＲｅｌＡ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２００９；２９：１３７５−１３８７］。したがって、ＮＦκＢ標的（ＩＲＦ４、Ａ２０、ＢＩＲＣ３）のｍＲＮＡ発現に対する式２の化合物の効果を５個のＤＬＢＣＬ（ＤｏＨＨ_２、Ｋａｒｐａｓ ４２２、ＳＵ−ＤＨＬ−２、ＳＵ−ＤＨＬ−６、Ｕ２９３２）細胞系において評価した。結果は、式２の化合物がＮＦκＢ標的のダウンレギュレーションを誘導することを示した。代表的な結果を図９に示す。

本開示は、該開示の精神または必須属性から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化されうる。したがって、該開示の範囲を示すものとしては、前記明細書ではなく、添付の特許請求の範囲が参照されるべきである。前記説明は該開示の好ましい実施形態に向けられているが、他の変更および修飾が当業者に明らかであり、本開示の精神または範囲から逸脱することなく施されうることが注目される。

Claims (1)

1. 式２：
   

   

   により表される（Ｓ）−２−［４−（４−クロロフェニル）−２，３，９−トリメチル−６Ｈ−チエノ［３，２−ｆ］［１，２，４］トリアゾロ−［４，３−ａ］［１，４］ジアゼピン−６−イル］−Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）アセトアミドまたはその医薬上許容される塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物を有効成分として含む、Ｂ細胞悪性癌の治療剤であって、該Ｂ細胞悪性癌が脾臓周辺帯リンパ腫である、治療剤。
   

Images