JP6253225B2 - 顕微鏡システムおよび顕微鏡観察方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡システムおよび顕微鏡観察方法に関するものである。

従来、近赤外および赤外領域の蛍光観察を行うことができる顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２０１０−１３３９６９号公報

しかしながら、例えば、組織をスライスし、スライドガラスに設置することで作成された標本を顕微鏡観察する場合に、蛍光観察のみならず、明視野観察も行うことができることが好ましく、顕微鏡に搭載された近赤外領域に感度を有するカメラでは色再現性の高い明視野観察を行うことができないという不都合がある。一方、カメラとして、カラーカメラを採用すれば、標本の明視野観察を行うことはできるが、カラーカメラが感度を有する波長範囲が狭いため、近赤外領域以降の蛍光観察を行うことができず、可視光領域において発生する自家蛍光によって、鮮明な蛍光観察を行うことができないという不都合がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、観察方法が異なるために単一のカメラでは賄い切れない波長範囲の観察を行うことができる顕微鏡システムおよび顕微鏡観察方法を提供することを目的としている。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、組織を連続的にスライスした連続切片である、特定色の色素により染色した色素染色標本、近赤外領域の蛍光を発生する蛍光物質により染色した蛍光染色標本および染色されていない無染色標本を搭載するステージと、該ステージに搭載された前記色素染色標本、前記蛍光染色標本および前記無染色標本に照射する光を発生する光源と、該光源から発生された光を照射することにより前記色素染色標本、前記蛍光染色標本および前記無染色標本において発生した光を撮影するカラー撮像素子およびモノクロ撮像素子と、予め用意した前記蛍光染色標本および前記無染色標本に対し同一の光を照射して、前記モノクロ撮像素子により取得された２つの蛍光画像間で減算処理を行う画像処理手段と、標本の染色方法に応じて、前記カラー撮像素子と前記モノクロ撮像素子を切り替える切替手段と、前記切替手段によって、前記モノクロ撮像素子が選択されたときに、前記蛍光染色標本および前記無染色標本において発生した光から近赤外領域の波長の光を選択して前記モノクロ撮像素子に入射させる波長選択手段とを備える顕微鏡システムを提供する。

本態様によれば、ステージに搭載された標本に対して光源から発せられた光を照射することにより標本から光が発生する。標本から発せられる光は標本の観察方法に応じて異なるものとなるが、切替手段を作動させて撮像素子を切り替えることにより、各観察方法に適した分光感度特性の撮像素子により標本の撮影を行うことができる。したがって、単一のカメラでは賄い切れない波長範囲の観察を観察方法に合わせて行うことができる。

このようにすることで、標本の観察方法として近赤外領域の蛍光観察が選択された場合に、切替手段によって長波長撮像素子が選択され、標本において発生した光から、近赤外領域の波長の光が波長選択手段によって選択されて、長波長撮像素子に入射される。これにより、可視領域において多く発生する自家蛍光が低減された鮮明な蛍光画像による観察を行うことができる。

このようにすることで、蛍光染色標本から発せられて長波長撮像素子により撮影される蛍光には、染色のための蛍光物質および自家蛍光物質からの近赤外領域の蛍光が含まれ、無染色標本から発せられて長波長撮像素子により撮影される蛍光には、自家蛍光物質からの近赤外領域の蛍光が含まれる。したがって、画像処理手段によって２つの蛍光画像間で減算処理を行うことにより、対応する領域の自家蛍光を除去して、目的部位を鮮明に表す蛍光画像を取得することができる。

また、上記態様においては、前記ステージに搭載された前記色素染色標本および前記蛍光染色標本を判別する標本判別手段を備え、前記切替手段が、前記標本判別手段による判別結果に応じて前記カラー撮像素子と前記モノクロ撮像素子を切り替えてもよい。
このようにすることで、標本判別手段による標本の判別により、標本に適した観察方法を簡易に特定することができ、観察方法に適した撮像素子に切り替えて観察を行うことができる。

また、上記態様においては、前記標本判別手段は、前記カラー撮像素子により取得された画像に特定の色が存在する場合に、当該色の色素により染色された色素染色標本であると判別してもよい。
このようにすることで、観察開始時にカラー撮像素子により取得された明視野画像によって、色素染色標本であるか否かを容易に判別でき、色素染色標本である場合には明視野観察、色素染色標本ではない場合には蛍光観察等の明視野観察以外の観察方法を選択することができる。

また、上記態様においては、前記画像処理手段は、前記蛍光染色標本および前記無染色標本の位相差画像に基づいて２つの蛍光画像を位置合わせして減算処理を行ってもよい。
このようにすることで、蛍光染色標本および無染色標本が、明視野観察では判別困難な透明標本であっても、位相差画像によって形状を特定し、画像間での位置合わせを容易にして、減算処理を精度よく行うことができる。

また、上記態様においては、組織を連続的にスライスした連続切片である、特定色の色素により染色した色素染色標本、近赤外領域の蛍光を発生する蛍光物質により染色した蛍光染色標本および染色されていない無染色標本を用意する標本準備ステップと、標本の染色方法に応じて、カラー撮像素子とモノクロ撮像素子を切り替える切替ステップと、前記色素染色標本に可視光を照射してカラー撮像素子により撮影することにより明視野画像を取得する明視野撮影ステップと、前記標本準備ステップにより予め用意された前記蛍光染色標本および前記無染色標本に対し同一の光を照射して、標本から発せられる近赤外領域の蛍光をモノクロ撮像素子により撮影することにより蛍光画像をそれぞれ取得する蛍光撮影ステップと、該蛍光撮影ステップにより取得された２つの蛍光画像間で減算処理を行う演算ステップとを含む顕微鏡観察方法を提供する。

本態様によれば、標本準備ステップにおいて用意された色素染色標本に、明視野撮影ステップにおいて可視光を照射して色素染色標本の明視野画像をカラー撮像素子により取得し、切替ステップによって撮像素子をモノクロ撮像素子に切り替えた後に、標本準備ステップにおいて用意された蛍光染色標本に、近赤外光を照射して蛍光染色標本の蛍光画像をモノクロ撮像素子により取得する。その結果、カラー撮像素子により、色再現性の高い明視野画像を取得することができ、モノクロ撮像素子により、自家蛍光を抑えた鮮明な蛍光画像を取得することができる。

このようにすることで、連続切片から用意された蛍光染色標本および無染色標本に、蛍光撮影ステップにおいて近赤外光を照射することにより、２つの蛍光画像が得られる。蛍光染色標本により得られた蛍光画像においては、染色に使用した蛍光物質の存在する目的部位および自家蛍光の存在する領域が光り、無染色標本により得られた蛍光画像においては、自家蛍光の存在する領域が光っているので、これらの２つの蛍光画像に対して演算ステップにおいて減算処理を行うことにより、自家蛍光が消滅し、蛍光物質の存在する領域を特異的に光らせた鮮明な蛍光画像を得ることができる。

また、上記態様においては、前記蛍光染色標本および前記無染色標本の位相差画像を取得する位相差撮影ステップと、該位相差撮影ステップにより取得された２つの位相差画像に基づいて２つの前記蛍光画像の位置合わせを行う位置合わせステップとを含んでいてもよい。
このようにすることで、蛍光染色標本および無染色標本が透明な場合であっても、位相差画像によって形状を特定し、画像間での位置合わせを容易にして、減算処理を精度よく行うことができる。

本発明によれば、観察方法が異なるために単一のカメラでは賄い切れない波長範囲の観察を行うことができるという効果を奏する。

本発明の参考例としての発明の一参考実施形態に係る顕微鏡システムを模式的に示す全体構成図である。 図１の顕微鏡システムのカメラヘッドの構造を示す模式図である。 図２のカメラヘッドに備えられるカラーＣＣＤの分光感度特性の一例を示すグラフである。 図２のカメラヘッドに備えられるモノクロＣＣＤの分光感度特性の一例を示すグラフである。 図１の顕微鏡システムを用いた一参考実施形態に係る顕微鏡観察方法を示すフローチャートである。 図１の顕微鏡システムによる標本の明視野画像の一例を示す図である。 図１の顕微鏡システムのカラーＣＣＤにより蛍光観察した場合の蛍光画像の参考例を示す図である。 図１の顕微鏡システムのモノクロＣＣＤにより蛍光観察した場合の蛍光画像の一例を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システムを模式的に示す全体構成図である。 図９の顕微鏡システムを用いた第１の実施形態に係る顕微鏡観察方法を示すフローチャートである。 図１０の顕微鏡観察方法により取得された蛍光画像の一例を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡システムを模式的に示す全体構成図である。 図１２の顕微鏡システムを用いた第２の実施形態に係る顕微鏡観察方法を示すフローチャートである。 図１２の顕微鏡システムを用いた第３の実施形態に係る顕微鏡観察方法を示すフローチャートである。 本発明の参考例に係る顕微鏡観察方法を示すフローチャートである。

本発明の参考例としての発明の一参考実施形態に係る顕微鏡システム１および顕微鏡観察方法について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、図１に示されるように、顕微鏡本体２と、該顕微鏡本体２に取り付けられるカメラヘッド３と、該カメラヘッド３を操作する操作部４と、カメラヘッド３により取得された画像信号を処理する画像処理部５と、該画像処理部５により処理された標本Aの画像を表示するモニタ６とを備えている。

顕微鏡本体２は、標本Ａを搭載するステージ７と、標本Ａに対する明視野観察を行う明視野観察光学系８と、標本Ａの蛍光観察を行う蛍光観察光学系９とを備えている。
明視野観察光学系８および蛍光観察光学系９は、共通の光学部品として、標本Ａからの光を集光する対物レンズ１０と、該対物レンズ１０により集光された光を２つに分岐するビームスプリッタ１１と、該ビームスプリッタ１１により分岐された一方の光を集光して観察者の網膜に結像させる接眼レンズ１２と、ビームスプリッタ１１により分岐された他方の光を集光してカメラヘッド３に結像させる結像レンズ１３とを備えている。

明視野観察光学系８は、白色光を発生する白色光源１４と、該白色光源１４から発せられた白色光を調整してステージ７上の標本Ａに照射するコンデンサレンズ１５と、白色光源１４からコンデンサレンズ１５への白色光の入射・非入射を切り替えるシャッタ１６とを備え、標本Ａを透過した光を対物レンズ１０により集光し、ビームスプリッタ１１により分岐して接眼レンズ１２を介して観察者に観察させる一方、結像レンズ１３によって結像した標本Ａの光学像を、カメラヘッド３によって撮影させるようになっている。

蛍光観察光学系９は、励起光を発生する励起光源１７と、該励起光源１７から発せられた励起光を偏向して、対物レンズ１０の光軸に沿って対物レンズ１０に入射させ、ステージ７上の標本Ａに照射させる一方、標本Ａにおいて発生し、対物レンズ１０により集光された蛍光を結像レンズ１３側に透過させる蛍光キューブ１８とを備えている。

白色光源１４および励起光源１７は暖機運転のために常時点灯している。白色光源１４からの白色光は、シャッタ１６が開かれることにより、コンデンサレンズ１５を介して標本Ａに照射され、シャッタ１６が閉鎖されることにより、標本Aへの照射が遮断されるようになっている。一方、励起光源１７からの励起光は、蛍光キューブ１８が配置されることにより対物レンズ１０に入射され、空のキューブが選択されることにより、対物レンズ１０への入射が遮断されるようになっている。

標本Ａを搭載するステージ７は、標本Ａを対物レンズ１０の光軸に直交する方向に移動させるようになっている。対物レンズ１０は、倍率の異なるものが複数用意され、レボルバ１９に搭載されて、いずれかの対物レンズ１０が、ステージ７と蛍光キューブ１８との間に配置されるようになっている。

蛍光キューブ１８は、観察する蛍光の波長に合わせて、複数のもの（図中、１つのみ表示。）が対物レンズ１０とビームスプリッタ１１との間に挿脱可能に用意されている。蛍光キューブ１８の中には、近赤外領域の蛍光を透過し、可視領域の蛍光を遮断する波長特性を有するものが含まれている。また、明視野観察を行う場合には、励起光源１７からの光を遮断し、標本Ａからの光を通過させる空のキューブが、対物レンズ１０とビームスプリッタ１１との間の光路上に挿入されるようになっている。

カメラヘッド３は、図２に示されるように、結像レンズ１３により集光された光を反射するミラー２０と、該ミラー２０を光路上に挿脱するように駆動するアクチュエータ（切替手段）２１と、分光感度特性の異なる２つの撮像素子２２，２３とを備えている。一方の撮像素子はカラーＣＣＤ２３であり、図３に示される分光感度特性を有している。他方の撮像素子はモノクロＣＣＤ２２であり、図４に示される分光感度特性を有している。

アクチュエータ２１の駆動により、ミラー２０が、結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間の光路上に挿脱されるようになっている。ミラー２０が結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間の光路に挿入されると、結像レンズ１３により集光された光がミラー２０によって９０°偏向され、モノクロＣＣＤ２２のみに入射される一方、ミラー２０が光路から離脱させられると、結像レンズ１３により集光された光がカラーＣＣＤ２３のみに直接入射されるようになっている。

操作部４は、カメラヘッド３に接続されたキーボード、マウスあるいは押しボタン等の入力装置であり、観察方法を入力するようになっている。観察方法として、明視野観察が入力された場合には、カメラヘッド３のアクチュエータ２１が駆動させられてミラー２０が結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間の光路から離脱させられるようになっている。また、観察方法として、蛍光観察が入力された場合には、カメラヘッド３のアクチュエータ２１が駆動させられてミラー２０が結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間の光路に挿入されるようになっている。

画像処理部５は、カメラヘッド３のカラーＣＣＤ２３あるいはモノクロＣＣＤ２２から送られてきた信号を処理して明視野画像あるいは蛍光画像を生成し、モニタ６に出力するようになっている。モニタ６は画像処理部５から送られてきた明視野画像あるいは蛍光画像を表示するようになっている。

このように構成された本実施形態に係る顕微鏡システム１を用いた顕微鏡観察方法について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察方法は、図５に示されるように、観察を行う標本Ａを準備する標本準備ステップＳ１と、標本Ａに対して明視野観察を行う明視野観察ステップＳ２と、ＣＣＤ２２，２３を切り替える切替ステップＳ３と、標本Ａに対して蛍光観察を行う蛍光観察ステップＳ４とを含んでいる。

標本準備ステップＳ１は、標本Ａとして、明視野観察用のＥＶＧ染色標本と、蛍光観察用の蛍光免疫染色標本とを準備する。まず、観察対象物として、例えば、臓器の組織内のコラーゲンを目的物質として観察する場合には、組織を連続的にスライスして２つの連続切片を切り出し、各連続切片をスライドガラスに載せる。次いで、一方の切片に、例えば、シリウスレッド試薬を用いて染色を行うことにより、ＥＶＧ染色標本を作成する。また、他方の切片に例えば、近赤外領域に蛍光波長を有するｃｙ７の蛍光色素を用いて染色を行うことにより、蛍光免疫染色標本を作成する。作成した２つの標本Ａをステージ７上に載置する。

作成された２つの標本Ａは、連続切片であるため、その形態はほぼ同等である。連続切片は染色前にはいずれも無色透明であるが、ＥＶＧ染色標本は、シリウスレッド色素によって全体的に赤く染色されるので、図６に示されるように、画像上で赤い領域Ｒを確認することにより標本Ａ全体の形状を把握することができる。

蛍光免疫染色標本は、目的物質であるコラーゲンに特異的に集積するので、励起光の照射によりコラーゲンを光らせることができる。しかしながら、標本Ａ内に存在するゴミや目的物質以外の部位（例えば、組織内の血球）あるいは顕微鏡光学系のレンズ素材において、自家蛍光が発生する。これらの自家蛍光は可視領域において多く発生するので、仮に、可視領域の蛍光を発生する蛍光色素を用いた蛍光観察をカラーＣＣＤ２３によって行う場合には、図７に示されるように、目的物質において発生する蛍光Ｆ１が自家蛍光Ｆ２に紛れてしまい、目的物質を観察することが困難になる。本実施形態においては、近赤外領域に蛍光波長を有する蛍光色素を用いて染色している。

明視野観察ステップＳ２は、ステージ７上に載置されたＥＶＧ染色標本を対物レンズ１０の光軸上に配置するとともに、操作部４を操作してアクチュエータ２１を駆動し、ミラー２０を結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間から離脱する。そして、蛍光キューブ１８を光軸上から離脱させて空のキューブを配置する。

この状態で、白色光源１４から発せられた白色光をステージ７下方からＥＶＧ染色標本に照射し、透過した光を対物レンズ１０および結像レンズ１３で集光し、カラーＣＣＤ２３に直接入射させる。カラーＣＣＤ２３によって取得された画像信号は、画像処理部５により処理されてモニタ６に表示される。これにより、ＥＶＧ染色標本の光学像を高い色再現性で明視野観察することができる。

撮像素子切替ステップＳ３は、操作部４を操作してアクチュエータ２１を駆動し、ミラー２０を結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間に挿入させる。
そして、蛍光観察ステップＳ４は、ステージ７上に載置された蛍光免疫染色標本を対物レンズ１０の光軸上に配置するとともに、蛍光キューブ１８として、励起光を偏向して対物レンズ１０側に入射させ、可視領域の光を遮断し近赤外領域の光を透過する波長特性を有するものを対物レンズ１０と結像レンズ１３との間に挿入する。

この状態で、励起光源１７から発せられた励起光を蛍光キューブ１８の側方から入射させる。励起光は蛍光キューブ１８によって偏向されて対物レンズ１０に入射させられ、対物レンズ１０により集光されて蛍光免疫染色標本に照射される。蛍光免疫染色標本においては励起光が照射されることにより蛍光が発せられる。発せられた蛍光は対物レンズ１０によって集光され、近赤外領域の蛍光のみが蛍光キューブ１８を透過して結像レンズ１３により集光され、ミラー２０によって偏向されてモノクロＣＣＤ２２に入射される。

モノクロＣＣＤ２２によって取得された画像信号は、画像処理部５により処理されて、図８に示されるように、モニタ６に表示される。蛍光免疫染色標本に含まれる目的物質であるコラーゲンにはｃｙ７のような蛍光色素が特異的に集積しているので、蛍光色素から発せられた蛍光Ｆを観察することにより、目的物質の存否を観察することができる。

この場合において、本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、蛍光観察に際して、画像を取得する撮像素子を切り替えて、近赤外領域に感度を有するモノクロＣＣＤ２２を採用し、蛍光キューブ１８によって可視光を遮断し、近赤外領域の蛍光ＦをモノクロＣＣＤ２２に入射させるので、蛍光免疫染色標本内に存在する自家蛍光物質から発せられた自家蛍光Ｆ２の混入を低く抑えて、鮮明な蛍光観察を行うことができる。

すなわち、本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、染色方法の異なる標本Ａを観察する場合のように、観察方法が異なる場合に、カラーＣＣＤ２３とモノクロＣＣＤ２２とを切り替えて観察を行うことで、高い色再現性を有する標本Ａの全体像の明視野観察と、局在する目的物質を鮮明に表示する蛍光観察とを両立することができ、観察方法が異なるために単一のカメラでは賄い切れない波長範囲の観察を行うことができるという利点を有する。

次に、本発明の第１の実施形態に係る顕微鏡システム３０および顕微鏡観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した一参考実施形態に係る顕微鏡システム１および顕微鏡観察方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

本実施形態に係る顕微鏡システム３０は、図９に示されるように、レボルバ１９に取り付けられた対物レンズ１０の内の１つとして、位相差板を内蔵した位相差観察用対物レンズ３１を備えるとともに、リングスリットを内蔵した位相差観察用コンデンサレンズ３２が上記コンデンサレンズ１５と交換可能に配置されている点において、一参考実施形態に係る顕微鏡システム１と相違している。
また、本実施形態に係る顕微鏡システム３０においては、画像処理部３３が画像間演算を行うように構成されている点においても一参考実施形態に係る顕微鏡システムと相違している。

本実施形態に係る顕微鏡観察方法は、図１０に示されるように、標本準備ステップＳ１０において一参考実施形態に係る顕微鏡観察方法と相違するとともに、位相差観察ステップＳ１１、第２の蛍光観察ステップＳ１２および演算ステップＳ１３において一参考実施形態と相違している。

具体的には、本実施形態に係る顕微鏡システム３０においては、標本準備ステップＳ１０において、標本Ａとして、連続切片を用いて、ＥＶＧ染色標本、蛍光免疫染色標本に加えて、無染色標本を用意する。無染色標本は、染色を行っていない標本Ａを意味する。

また、位相差観察ステップＳ１１は、ステージ７上に載置された無染色標本を対物レンズ１０の光軸上に配置するとともに、操作部４を操作してアクチュエータ２１を駆動し、ミラー２０を結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間に挿入させる。そして、蛍光キューブ１８を光軸上から離脱させて空のキューブを配置する。そして、位相差観察用コンデンサレンズ３２および位相差観察用対物レンズ３１を光軸上に配置する。

この状態で、白色光源１４から発せられた白色光を、位相差観察用コンデンサレンズ３２を介して無染色標本に照射し、無染色標本を透過した光を位相差観察用対物レンズ３１および結像レンズ１３により集光し、モノクロＣＣＤ２２によって撮影することにより、無染色標本の位相差画像を取得することができる。取得された位相差画像は画像処理部３３において処理された後モニタ６に表示される。これにより無染色標本の位相差観察を行うことができる。

位相差観察を行うことにより、無染色標本が無色透明であってもその屈折率の変化にコントラストを付けた位相差画像を得ることができ、無染色標本の形状を特定することができる。そして、蛍光観察により取得された蛍光画像を用いて、目的物質の観察位置を、ステージの移動によって、観察者が目視で探索し特定することができる。

また、第２の蛍光観察ステップＳ１２は、位相差観察ステップＳ１１の状態から、シャッタ１６を閉鎖して、蛍光キューブ１８として、蛍光観察ステップＳ４において使用した蛍光キューブ１８を光軸上に挿入する。また、対物レンズ１０も、蛍光観察ステップＳ４において使用した対物レンズ１０を使用する。

この状態で、蛍光観察ステップＳ４と同様に、励起光源１７から発せられた励起光を蛍光キューブ１８の側方から入射させる。励起光は蛍光キューブ１８によって偏向されて対物レンズ１０に入射させられ、対物レンズ１０により集光されて無染色標本に照射される。無染色標本においては、蛍光染色されていないので、励起光が照射されることにより蛍光免疫染色標本のような蛍光は発生しないが、標本Ａ内に存在している蛍光物質等から自家蛍光Ｆ２が発せられる。発せられた自家蛍光Ｆ２は対物レンズ１０によって集光され、微弱な近赤外領域の自家蛍光Ｆ２のみが蛍光キューブ１８を透過して結像レンズ１３により集光され、モノクロＣＣＤ２２に入射される。

そして、演算ステップＳ１３においては、蛍光観察ステップＳ４において取得された蛍光免疫染色標本の蛍光画像から、第２の蛍光観察ステップＳ１２において取得された無染色標本の蛍光画像が減算される。
これにより、図１１に示されるように、蛍光キューブ１８を透過する微弱な近赤外領域の自家蛍光Ｆ２を蛍光免疫染色標本の蛍光画像から除去した鮮明な蛍光画像を取得することができる。

すなわち、本実施形態に係る顕微鏡観察方法によれば、蛍光観察ステップＳ４では、蛍光キューブ１８を通過してしまうような近赤外領域の自家蛍光Ｆ２が存在する場合においても、演算ステップＳ１３によってそのような自家蛍光Ｆ２を除去することができ、より高Ｓ／Ｎ比の鮮明な蛍光画像を取得することができるという利点がある。

次に、本発明の第２の実施形態に係る顕微鏡システム４０および顕微鏡観察方法について以下に説明する。
上記各実施形態においては、ＣＣＤ２２，２３の切り替え、蛍光キューブ１８の切り替え、ステージ７による標本Ａの移動、対物レンズ１０の切り替え、コンデンサレンズ１５の切り替え等を手動で行う場合について説明したが、本実施形態においては、これに代えて、これらを自動的に行うものである。

本実施形態に係る顕微鏡システム４０は、図１２に示されるように、顕微鏡本体２およびカメラヘッド３を制御する制御部４１と、制御部４１に観察方法を入力する操作部４とを設け、操作部４からの入力に基づいて、制御部４１が、撮像素子の切り替え、蛍光キューブ１８の切り替え、標本Ａの移動、対物レンズ１０の切り替え、コンデンサレンズ１５の切り替えを行う。蛍光キューブ１８、ステージ７、レボルバ１９、シャッタ１６およびコンデンサレンズ１５には、図示しないアクチュエータが設けられている。

本実施形態に係る顕微鏡観察方法は、ステージ７に２つの標本Ａ、すなわち、ＥＶＧ染色標本と蛍光免疫染色標本とを載置して、撮影を自動的に行う。
まず、制御部４１は、図１３に示されるように、操作部４から観察開始の入力がなされると、まず、標本を判別する標本判別ステップＳ２０を行うようになっている。

この標本判別ステップＳ２０においては、制御部４１は、顕微鏡本体２およびカメラヘッド３に対して明視野観察用の設定を行うようになっている。
すなわち、制御部４１は、顕微鏡本体２に対しては、ステージ７を駆動していずれかの標本Ａを対物レンズ１０の光軸上に配置し、明視野観察用のコンデンサレンズ１５および対物レンズ１０に切り替えるとともに、蛍光キューブ１８を空のキューブに設定する。また、シャッタ１６は開放する。そして、制御部４１は、カメラヘッド３に対しては、アクチュエータ２１を駆動してミラー２０を結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間から離脱する。

これにより、白色光源１４からの白色光は、コンデンサレンズ１５が配置された状態で、シャッタ１６が開かれることにより、コンデンサレンズ１５を介して標本Ａに照射され、透過した光がカラーＣＣＤ２３によって撮影される。この場合において、制御部４１は、取得された画像の彩度を算出することにより、観察している標本Ａが、ＥＶＧ染色標本であるか否かを判別するようになっている。

彩度としては、具体的には、カラーＣＣＤ２３によって取得されたＲＧＢデータを次式によりＨＳＩ変換して求めた数値Ｓを用いる。
Ｉｍａｘ＝ｍａｘ｛Ｒ，Ｇ，Ｂ｝ （１）
Ｉｍｉｎ＝ｍｉｎ｛Ｒ，Ｇ，Ｂ｝ （２）
Ｓ＝（Ｉｍａｘ−Ｉｍｉｎ）／Ｉｍａｘ （３）

彩度Ｓが所定の閾値以上であれば、標本Ａは、色情報を有しているＥＶＧ染色標本であり、閾値未満であれば、蛍光免疫染色標本であると判別することができる。
ステージ７に載置されている標本Ａが複数である場合には、各標本Ａに対して上記判別を行い、標本Ａの種別をタグ付けしておく。タグは、例えば、各標本Ａのスライドガラスの中心座標に関連付けておく。

次に、上記判別の結果、標本ＡがＥＶＧ染色標本であると判別された場合には、そのまま明視野観察ステップＳ２を行う。これは、標本判別ステップＳ２０が明視野観察の設定で行われているため、ＥＶＧ染色標本であると判別された標本Ａに対しては、設定を変更することなく明視野観察が可能だからである。
一方、上記判別の結果、標本ＡがＥＶＧ染色標本でないと判別された場合には、ステージ７を駆動して、もう一方の標本ＡすなわちＥＶＧ染色標本を対物レンズ１０の光軸上に配置する。

明視野観察ステップＳ２の結果、取得された明視野画像がモニタ６に表示される。観察者は、モニタ６上で観察部位の設定を行う（ステップＳ２１）。そして、撮影された明視野画像は図示しないメモリに記憶される。

次に、観察部位の設定が終了したことが操作部４から入力されると、制御部４１はまず、蛍光免疫染色標本に対して位相差観察を行う（ステップＳ２２）。
すなわち、制御部４１は、顕微鏡本体２に対しては、ステージ７を駆動して、判別の結果、蛍光免疫染色標本であると判別された標本Ａを対物レンズ１０の光軸上に配置し、対物レンズ１０を位相差観察用対物レンズ３１に、コンデンサレンズ１５を位相差観察用コンデンサレンズ３２に切り替える。また、制御部４１は、カメラヘッド３に対しては、アクチュエータ２１を駆動してミラー２０を結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間に挿入させる。

シャッタ１６および蛍光キューブ１８は明視野観察時の状態に維持される。
これにより、白色光源１４から発せられた白色光が標本Ａに照射され、透過した光がモノクロＣＣＤ２２により撮影されることにより、位相差画像が取得され、メモリに記憶される。

この状態で、２つの標本Ａ間の位置関係が算出される（ステップＳ２３）。すなわち、メモリに記憶された明視野画像と位相差画像とが読み出され、画素毎に特徴点検出法で用いられる以下の行列式Ｍと、検出関数Ｒとを算出することにより数点の特徴点を検出する。

Ｒ＝ｄｅｔＭ−ｋ（ｔｒＭ）^２ （５）

ここで、符号ｘ，ｙは各画素の座標値、Ｉは画素値、ｄｅｔは行列式、ｔｒは対角成分の和、ｋは調整パラメータを示す。
そして、２つの画像において対応する特徴点の座標から、ＥＶＧ染色標本と、蛍光免疫染色標本の回転量および座標値の差分を算出する。
これにより、明視野画像における標本Ａの外観と蛍光画像における各位置とを対応づけることができるようになる。

次いで制御部４１は、撮像素子を切り替える切替ステップＳ３を行った後に、蛍光免疫染色標本に対して蛍光観察を行う（ステップＳ４）。
すなわち、制御部４１は、顕微鏡本体２に対しては、蛍光観察用の対物レンズ１０、蛍光観察用の蛍光キューブ１８に切り替え、シャッタ１６を閉鎖する。ステージ７およびカメラヘッド３は位相差観察時の状態に維持される。

蛍光キューブ１８が配置されることにより、励起光源１７からの励起光が対物レンズ１０を介して標本Ａに照射され、標本Ａにおいて発生した蛍光が対物レンズ１０によって集光され、モノクロＣＣＤ２２によって撮影されることにより蛍光画像が取得される。
取得された蛍光画像は、メモリに記憶されている明視野画像と対応づけて並列に、あるいは、重畳されてモニタ６に表示される。

ＥＶＧ染色標本と蛍光免疫染色標本との回転量および座標値の差分が算出されているので、相互に共通の特徴点を有しない明視野画像と蛍光画像とを確実に対応づけることができる。したがって、観察者は、蛍光画像において蛍光が発せられている目的部位を明視野画像上において容易に特定することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、単一の明視野画像と単一の蛍光画像とを取得して比較する場合について説明したが、顕微鏡本体２の視野範囲に対して標本Ａが十分に大きい場合には、標本Ａ全体を複数の領域に分割して、各領域について順次撮影し、取得された複数の画像を座標と対応づけて記憶することにより、貼り合わせ画像を形成することとしてもよい。
この場合に、画像間の位置合わせは、貼り合わせ画像全体どうしで行ってもよいし、部分画像どうしで行ってもよい。

次に、本発明の第３の実施形態に係る顕微鏡観察方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡観察方法の説明において、上述した第２の実施形態に係る顕微鏡観察方法と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。

また、本実施形態に係る顕微鏡観察方法は、第１の実施形態に係る顕微鏡観察方法を半自動的に行うものであり、第１の実施形態と同様に、標本Ａとして、ＥＶＧ染色標本、蛍光免疫染色標本および無染色標本を用意する。

本実施形態に係る顕微鏡観察方法においては、第２の実施形態に係る顕微鏡観察方法と同様に、操作部４から観察開始の入力がなされると、図１４に示されるように、まず、標本Ａを判別する標本判別ステップＳ２０が制御部４１により行われる。
標本判別ステップＳ２０においては、３つの標本Ａに対して、ＥＶＧ染色標本か否かの判別が行われ、ＥＶＧ染色標本かそれ以外かのタグ付けが行われる。

次に、標本判別ステップＳ２０においてＥＶＧ染色標本であると判別された標本Ａに対して、明視野観察ステップＳ２が行われ、取得された明視野画像上で観察部位の設定が行われる（ステップＳ２１）。
この後に、制御部４１は切替ステップＳ３を行って、顕微鏡本体２およびカメラヘッド３に対して蛍光観察用の設定を行うようになっている。

すなわち、制御部４１は、顕微鏡本体２に対しては、蛍光観察用の蛍光キューブ１８を設定する。また、シャッタ１６は閉鎖する。そして、制御部４１は、カメラヘッド３に対しては、アクチュエータ２１を駆動してミラー２０を結像レンズ１３とカラーＣＣＤ２３との間に挿入させる。

この後に、タグ付けされた蛍光免疫染色標本および無染色標本に順次位相差観察が行われ（ステップＳ２２）、取得された位相差画像に基づいて標本間の回転量および座標値の差分等の位置関係が算出される（ステップＳ２３）。
そして、制御部４１は、ステージ７を駆動して、無染色標本および蛍光免疫染色標本に対して順次蛍光観察ステップを行い、取得した蛍光画像を記憶する（ステップＳ４）。
この後に、制御部４１は、無染色標本と蛍光免疫染色標本とを判別する第２の標本判別ステップＳ２４を行う。

第２の標本判別ステップＳ２４においては、制御部４１は、まず、取得された一方の標本Aの蛍光画像を用いて、その標本Aが蛍光免疫染色標本であるか否かを判別する。
この第２の標本判別ステップＳ２４は、取得された蛍光画像に基づいてヒストグラムを作成する。ヒストグラムは、横軸を画素値、縦軸を頻度としたグラフである。

蛍光免疫染色標本のヒストグラムは、背景となる黒（画素値約ゼロ）と蛍光色素が発する特定の画素値に分布している。一方、無染色標本のヒストグラムは、画像全体にわたって画素値が約ゼロとなっている。したがって、得られたヒストグラムが、所定の閾値以上の画素値を多く有する場合には、蛍光免疫染色標本であると判別され、閾値以上の画素値を有しない場合には無染色標本であると判別される。

これにより、蛍光免疫染色標本と無染色標本とが判別され、それぞれの標本Ａに種別がタグ付けされる。タグは、例えば、各標本Ａのスライドガラスの中心座標に関連づけて付けておく。

そして、上記ステップで取得された位置関係を用いて、蛍光免疫染色標本の蛍光画像から無染色標本の蛍光画像を減算する演算ステップＳ１３が行われる。

この場合において、蛍光画像間の減算処理を行う蛍光免疫染色標本と無染色標本とを、位相差画像を用いた位置関係の算出により、精度よく位置合わせすることができる。したがって、精度よく位置合わせされた蛍光画像間の減算処理を行うことができ、蛍光免疫染色標本の蛍光画像から自家蛍光をより確実に除去して、鮮明な蛍光画像を取得することができるという利点がある。

なお、本実施形態においては、顕微鏡本体の光学部品の設定回数を極力少なくするために、明視野観察の設定で行われる標本判別ステップＳ２０の直後に明視野観察を行い、蛍光観察ステップＳ４の直後に、蛍光観察の設定で行われる第２の標本判別ステップＳ２４を行うこととしたが、これに代えて、最初に標本判別ステップＳ２０と第２の標本判別ステップＳ２４を行って全ての標本Ａを識別してから、明視野観察ステップＳ２、蛍光観察ステップＳ４および位相差観察ステップＳ２２を行うことにしてもよい。

また、上記各実施形態は、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
例えば、本実施形態においては、結像レンズ１３により集光された光が、ミラーを介してモノクロＣＣＤに入射するようにしたが、ミラーを介してカラーＣＣＤに入射するように、モノクロＣＣＤとカラーＣＣＤとの配置を逆にしてもよい。
また、カメラヘッドについては、本実施形態においては、１つのカメラヘッド内に２つの撮像素子を配置することとしたが、カメラヘッド自体を複数用意して、顕微鏡本体２に光学部材を追加して光路を分岐することや、分光感度の異なる複数のカメラヘッドを用いて画像を取得してもよい。
また、彩度Ｓの算出や特徴点検出で記述した式は代表的な式であり、これに限定されるものではない。

また、顕微鏡観察方法としては、図１５に示されるような構成を採用してもよい。
すなわち、標本Ａとして、マルチカラー蛍光色素で染色したもの１つを用意する（ステップＳ１）。
マルチカラー蛍光染色とは、例えば１波長で励起し、発生した異なる蛍光色情報から多成分を同時に検出可能な蛍光色素で染色することを意味している。例えば、マルチカラー蛍光色素である量子ドットの糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、紫外領域波長（４００ｎｍ）で励起され、金属の組成比によって蛍光の色が緑色、黄色、赤色に変化する。

カメラヘッドにおいてはカラーＣＣＤを設定し、蛍光キューブとしてはマルチカラー蛍光に対応する蛍光キューブを設定し、シャッタを閉じる。
この状態で、励起光源から標本Ａに励起光を照射し、発せられた蛍光をカラーＣＣＤにより撮影する（ステップＳ３０）。取得されたカラー画像はモニタに表示されるので、観察者は、観察したい波長を選択する。

この状態で切替ステップＳ３により、カラーＣＣＤからモノクロＣＣＤに切り替え、観察したい特定の波長に対応する蛍光キューブを設定する。
そして、励起光源から励起光を標本Ａに照射することにより、対物レンズによって集光された蛍光の中から、観察したい特定波長の蛍光のみが蛍光キューブを透過してモノクロＣＣＤによって撮影される（ステップＳ３１）。これにより、観察したい特定波長の蛍光のみが光る蛍光画像を取得することができる。

一般に、モノクロＣＣＤはカラーＣＣＤより感度が高いので、撮影に要する露出時間を短縮することができ、標本Ａの褪色を抑えることができる。露出時間が短いため、カラーＣＣＤよりもフレームレートが早く、ステージを光軸方向に移動させて行われる標本Ａに対するピント合わせを容易にすることができる。

また、モノクロＣＣＤで取得した画像は、一般にカラーＣＣＤで取得した画像と比較して高解像度であり、撮像面にカラーフィルタを有しないことから情報を均一に取得することができ、かつ、画像処理も実施されないため、蛍光強度を定量的に確認することができる。
このことから、マルチカラー蛍光染色された標本Ａを観察する際に、カラーＣＣＤとモノクロＣＣＤとを併用して観察することで、標本A中の目的部位の選択、目的部位の高感度撮影および蛍光強度の定量的評価を行うことができる。

Ａ 標本
１，３０，４０ 顕微鏡システム
７ ステージ
１４ 白色光源（光源）
１７ 励起光源（光源）
１８ 蛍光キューブ（波長選択手段）
２１ アクチュエータ（切替手段）
２２ モノクロＣＣＤ（長波長撮像素子）
２３ カラーＣＣＤ（撮像素子）
３３ 画像処理部（画像処理手段、標本判別手段）
Ｓ１ 標本準備ステップ
Ｓ２ 明視野観察ステップ（明視野撮影ステップ）
Ｓ３ 切替ステップ
Ｓ４ 蛍光観察ステップ（蛍光撮影ステップ）
Ｓ１１ 位相差観察ステップ（位相差撮影ステップ）
Ｓ１３ 演算ステップ（位置合わせステップ）

Claims (6)

1. 組織を連続的にスライスした連続切片である、特定色の色素により染色した色素染色標本、近赤外領域の蛍光を発生する蛍光物質により染色した蛍光染色標本および染色されていない無染色標本を搭載するステージと、
   該ステージに搭載された前記色素染色標本、前記蛍光染色標本および前記無染色標本に照射する光を発生する光源と、
   該光源から発生された光を照射することにより前記色素染色標本、前記蛍光染色標本および前記無染色標本において発生した光を撮影するカラー撮像素子およびモノクロ撮像素子と、
   予め用意した前記蛍光染色標本および前記無染色標本に対し同一の光を照射して、前記モノクロ撮像素子により取得された２つの蛍光画像間で減算処理を行う画像処理手段と、
   標本の染色方法に応じて、前記カラー撮像素子と前記モノクロ撮像素子を切り替える切替手段と、
   前記切替手段によって、前記モノクロ撮像素子が選択されたときに、前記蛍光染色標本および前記無染色標本において発生した光から近赤外領域の波長の光を選択して前記モノクロ撮像素子に入射させる波長選択手段とを備える顕微鏡システム。
2. 前記ステージに搭載された前記色素染色標本および前記蛍光染色標本を判別する標本判別手段を備え、
   前記切替手段が、前記標本判別手段による判別結果に応じて前記カラー撮像素子と前記モノクロ撮像素子を切り替える請求項１に記載の顕微鏡システム。
3. 前記標本判別手段は、前記カラー撮像素子により取得された画像に特定の色が存在する場合に、当該色の色素により染色された色素染色標本であると判別する請求項２に記載の顕微鏡システム。
4. 前記画像処理手段は、前記蛍光染色標本および前記無染色標本の位相差画像に基づいて２つの蛍光画像を位置合わせして減算処理を行う請求項１から請求項３のいずれかに記載の顕微鏡システム。
5. 組織を連続的にスライスした連続切片である、特定色の色素により染色した色素染色標本、近赤外領域の蛍光を発生する蛍光物質により染色した蛍光染色標本および染色されていない無染色標本を用意する標本準備ステップと、
   標本の染色方法に応じて、カラー撮像素子とモノクロ撮像素子を切り替える切替ステップと、
   前記色素染色標本に可視光を照射してカラー撮像素子により撮影することにより明視野画像を取得する明視野撮影ステップと、
   前記標本準備ステップにより予め用意された前記蛍光染色標本および前記無染色標本に対し同一の光を照射して、標本から発せられる近赤外領域の蛍光をモノクロ撮像素子により撮影することにより蛍光画像をそれぞれ取得する蛍光撮影ステップと、
   該蛍光撮影ステップにより取得された２つの蛍光画像間で減算処理を行う演算ステップとを含む顕微鏡観察方法。
6. 前記蛍光染色標本および前記無染色標本の位相差画像を取得する位相差撮影ステップと、
   該位相差撮影ステップにより取得された２つの位相差画像に基づいて２つの前記蛍光画像の位置合わせを行う位置合わせステップとを含む請求項５に記載の顕微鏡観察方法。

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