JP6247218B2 - 癌のバイオマーカー - Google Patents

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Description

連邦政府資金援助の研究または開発
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＣＡ１２９９３３により政府支援で行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
サテライト相関遺伝子の発現レベルの増加の存在を検出することに基づいた、癌を診断するための方法、および処置効力をモニターするための方法。
ゲノムワイドシーケンシングアプローチにより、１セットの転写された非コード配列の増加が明らかにされており、その非コード配列の転写には、転写サイレンシングおよび染色体完全性に結びつけられるゲノムのヘテロクロマチン領域による「広汎性転写（pervasive transcription）」が挙げられる（J. Berretta, A. Morillon, EMBO Rep 10, 973（2009年9月）；A. Jacquier, Nat Rev Genet 10, 833（2009年12月））。マウスにおいて、ヘテロクロマチンは、紡錘体複合体の形成および忠実な染色体分配に必要とされる中心体（マイナー）サテライトリピートおよび中心周囲（メジャー）サテライトリピートで構成され（M. Guenatri, D. Bailly, C. Maison, G. Almouzni, J Cell Biol 166, 493（2004年8月16日））、一方、ヒトサテライトリピートは、類似した機能を有する複数のクラスに分けられている（J. Jurkaら, Cytogenet Genome Res 110, 462（2005））。酵母におけるサテライトの双方向的転写は、ダイサー媒介性ＲＮＡ誘導性転写サイレンシング（ＲＩＴＳ）を通して、および最近同定されたダイサー非依存性経路を通して、セントロメアＤＮＡのサイレンシングを維持するが（M. Halic, D. Moazed, Cell 140, 504（2月19日））、哺乳動物におけるセントロメアサテライトサイレンシング機構は、それほど詳細には明らかにされていない（A. A. Aravin, G. J. Hannon, J. Brennecke, Science 318, 761（2007年11月2日））。マウス細胞株およびヒト細胞株におけるサテライト転写産物の蓄積は、ＤＩＣＥＲ１の欠陥（C. Kanellopoulouら, Genes Dev 19, 489（2005年2月15日）；T. Fukagawaら, Nat Cell Biol 6, 784（2004年8月））、およびＤＮＡ脱メチル化、熱ショック、またはアポトーシスの誘導（H. Bouzinba-Segard, A. Guais、C. Francastel, Proc Natl Acad Sci USA 103, 8709 (2006年6月6日)；R. Valgardsdottirら, Nucleic Acids Res 36, 423 (2008年2月)）に起因する。培養細胞におけるサテライトのストレス誘導性転写もまた、ＬＩＮＥ−１などのＲＮＡポリメラーゼ活性をコードするレトロエレメントの活性化と結びつけられている（D. Ugarkovic, EMBO Rep 6, 1035（2005年11月）；D. M. Caroneら, Chromosoma 118, 113（2009年2月））。これらのインビトロモデルにもかかわらず、原発性腫瘍における反復性ｎｃＲＮＡの全体的な発現は、アノテートされたコード配列へのマイクロアレイプラットフォームの偏り、および標準分析プログラムからの反復配列の特定的排除のために、分析されていない。
本発明は、腫瘍細胞におけるサテライトリピートの大量発現の同定、および、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む腫瘍細胞における、サテライト相関遺伝子のレベルの増加の同定に、少なくとも一部、基づいている。癌、例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、または大腸癌などの上皮由来の固形悪性腫瘍を、それらのサテライト相関遺伝子のレベルの増加の存在に基づいて診断するための方法が本明細書に記載されている。
したがって、第１の態様において、本発明は、被験対象において癌の存在を検出するインビトロ方法を提供する。方法は、被験対象由来の試験細胞を含む試料において、ＨＳＰ９０ＢＢ（熱ショックタンパク質９０ｋＤａ α（細胞質）、クラスＢメンバー２、偽遺伝子（ＨＳＰ９０ＡＢ２Ｐ））；ＮＲ００３１３３（ヒト（Homo sapiens）グアニル酸結合タンパク質１、インターフェロン誘導性偽遺伝子１（ＧＢＰ１Ｐ１）、非コードＲＮＡ）；ＢＸ６４９１４４（チューブリンチロシンリガーゼ（ＴＴＬ））；ＤＥＲＰ７（膜貫通タンパク質４５Ａ（ＴＭＥＭ４５Ａ））；ＭＧＣ４８３６（ヒト（Homo sapiens）、仮想的タンパク質に類似（Homo sapiens similar to hypothetical protein）（Ｌ１Ｈ３領域））；ＢＣ０３７９５２（ｃＤＮＡクローン）；ＡＫ０５６５５８（ｃＤＮＡクローン）；ＮＭ００１００１７０４（ＦＬＪ４４７９６仮想的）；ＯＤＦ２Ｌ（精子尾部の外側緻密線維２様（outer dense fiber of sperm tails 2-like）（ＯＤＦ２Ｌ））；ＢＣ０４１４２６（Ｃ１２ｏｒｆ５５ １２番染色体オープンリーディングフレーム５５（Ｃ１２ｏｒｆ５５））；ＲＥＸＯ１Ｌ１（ＲＮＡエキソヌクレアーゼ１相同体（Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae））様１（ＲＥＸＯ１Ｌ１））；ＡＫ０２６１００（ＦＬＪ２２４４７仮想的ＬＯＣ４００２２１（ＦＬＪ２２４４７））；ＡＫ０２６８２５（膜貫通タンパク質２１２（ＴＭＥＭ２１２））；ＫＥＮＡＥ１（ヒト（Homo sapiens）Ｋｅｎａｅ１（ＡＢ０２４６９１）についてのｍＲＮＡ（Homo sapiens mRNA for Kenae 1））；ＨＥＳＲＧ（ＥＳＲＧ仮想的ＬＯＣ７９０９５２（ＥＳＲＧ））；ＡＫ０９５４５０（ＬＯＣ２８５５４０仮想的ＬＯＣ２８５５４０）；ＦＬＪ３６４９２（ＣＣＲ４−ＮＯＴ転写複合体、サブユニット１（ＣＮＯＴ１））；ＡＫ１２４１９４（ＦＬＪ４２２００タンパク質）；ＡＫ０９６１９６（仮想的ＬＯＣ１００１２９４３４）；ＡＫ１３１３１３（ジンクフィンガータンパク質９１偽遺伝子（ＬＯＣ４４１６６６））；ＦＬＪ１１２９２（仮想的タンパク質ＦＬＪ１１２９２）；ＣＣＤＣ１２２（コイルドコイルドメイン含有１２２（coiled-coil domain containing 122）（ＣＣＤＣ１２２））；およびＢＣ０７００９３（ｃＤＮＡクローン）からなる群から選択される１つまたは複数のサテライト相関遺伝子の発現レベルを決定して、試験値を得るステップ、ならびにその試験値を基準値と比較するステップを含む。基準値より有意に上である試験値は、被験対象が癌を有することを示す。
いくつかの実施形態において、基準レベルは、正常細胞におけるサテライト相関遺伝子のレベルである。いくつかの実施形態において、正常細胞は、同じ被験対象における試験細胞と同じ型の細胞である。いくつかの実施形態において、正常細胞は、癌を有しない被験対象における試験細胞と同じ型の細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は組織試料内にある。
いくつかの実施形態において、試料は、腫瘍細胞を含むことが知られ、または含むのではないかと疑われ、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含むことが知られ、もしくは推測される血液試料、または腫瘍細胞を含むことが知られ、もしくは推測される生検試料である。
いくつかの実施形態において、方法にはさらに、基準値より有意に上である試験値の存在に基づいて被験対象を癌と診断すること、基準値より有意に上である試験値の存在に基づいて癌を有すると被験対象を同定すること、基準値より有意に上である試験値の存在に基づいて処置について被験対象を選択すること、基準値より有意に上である試験値の存在に基づいて被験対象を癌について処置すること（例えば、癌についての処置を被験対象に施すこと）、または基準値より有意に上である試験値の存在に基づいてさらなる診断試験（例えば、画像診断、生検など）について被験対象を選択することが挙げられる。
さらなる態様において、本発明は、被験対象において癌の処置の効力を評価するためのインビトロ方法を提供する。方法は、被験対象由来の最初の試料において、ＨＳＰ９０ＢＢ（熱ショックタンパク質９０ｋＤａα（細胞質）、クラスＢメンバー２、偽遺伝子（ＨＳＰ９０ＡＢ２Ｐ））；ＮＲ００３１３３（ヒト（Homo sapiens）グアニル酸結合タンパク質１、インターフェロン誘導性偽遺伝子１（ＧＢＰ１Ｐ１）、非コードＲＮＡ）；ＢＸ６４９１４４（チューブリンチロシンリガーゼ（ＴＴＬ））；ＤＥＲＰ７（膜貫通タンパク質４５Ａ（ＴＭＥＭ４５Ａ））；ＭＧＣ４８３６（ヒト（Homo sapiens）、仮想的タンパク質に類似（Homo sapiens similar to hypothetical protein）（Ｌ１Ｈ３領域））；ＢＣ０３７９５２（ｃＤＮＡクローン）；ＡＫ０５６５５８（ｃＤＮＡクローン）；ＮＭ００１００１７０４（ＦＬＪ４４７９６仮想的）；ＯＤＦ２Ｌ（精子尾部の外側緻密線維２様（outer dense fiber of sperm tails 2-like）（ＯＤＦ２Ｌ））；ＢＣ０４１４２６（Ｃ１２ｏｒｆ５５ １２番染色体オープンリーディングフレーム５５（Ｃ１２ｏｒｆ５５））；ＲＥＸＯ１Ｌ１（ＲＮＡエキソヌクレアーゼ１相同体（Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae））様１（ＲＥＸＯ１Ｌ１））；ＡＫ０２６１００（ＦＬＪ２２４４７仮想的ＬＯＣ４００２２１（ＦＬＪ２２４４７））；ＡＫ０２６８２５（膜貫通タンパク質２１２（ＴＭＥＭ２１２））；ＫＥＮＡＥ１（ヒト（Homo sapiens）Ｋｅｎａｅ１についてのｍＲＮＡ（Homo sapiens mRNA for Kenae 1）（ＡＢ０２４６９１））；ＨＥＳＲＧ（ＥＳＲＧ仮想的ＬＯＣ７９０９５２（ＥＳＲＧ））；ＡＫ０９５４５０（ＬＯＣ２８５５４０仮想的ＬＯＣ２８５５４０）；ＦＬＪ３６４９２（ＣＣＲ４−ＮＯＴ転写複合体、サブユニット１（ＣＮＯＴ１））；ＡＫ１２４１９４（ＦＬＪ４２２００タンパク質）；ＡＫ０９６１９６（仮想的ＬＯＣ１００１２９４３４）；ＡＫ１３１３１３（ジンクフィンガータンパク質９１偽遺伝子（ＬＯＣ４４１６６６））；ＦＬＪ１１２９２（仮想的タンパク質ＦＬＪ１１２９２）；ＣＣＤＣ１２２（コイルドコイルドメイン含有１２２（coiled-coil domain containing 122）（ＣＣＤＣ１２２））；およびＢＣ０７００９３（ｃＤＮＡクローン）からなる群から選択される１つまたは複数のサテライト相関遺伝子のレベルを決定して、最初の値を得るステップ；被験対象に癌についての処置を施すステップ；その後、その被験対象から得られる試料において前記１つまたは複数の（すなわち、同じ）サテライト相関遺伝子のレベルを決定して、処置値を得るステップ；ならびに最初の値を処置値と比較するステップを含む。最初の値より下である処置値が、処置が有効であったことを示す（変化なし、または減少は、処置が無効であったことを意味する）。
いくつかの実施形態において、最初の試料および２番目の試料は、腫瘍細胞を含むことが知られ、または含むのではないかと疑われ、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含むことが知られ、もしくは推測される血液試料、または腫瘍細胞を含むことが知られ、もしくは推測される生検試料である。
いくつかの実施形態において、処置は、外科的介入、化学療法、放射線療法、またはそれらの組み合わせの施与を含む。
本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、被験対象はヒトである。
本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、癌は、上皮由来の固形腫瘍、例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、または大腸癌である。
本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、方法は、ＡＫ０５６５５８、ＢＣ０３７９５２、ＨＳＰ９０ＢＢ、および／またはＡＫ０９６１９６の１つまたは複数、例えば、２つ、３つ、または４つのレベルを決定することを含む。本明細書に記載された方法のいくつかの実施形態において、方法は、ＨＳＰ９０ＢＢおよび／またはＡＫ０５６５５８の１つまたは両方のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＨＳＰ９０ＢＢのレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＡＫ０９６１９６のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＡＫ０５６５５８のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＢＣ０３７９５２のレベルを決定することを含む。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のサテライト相関遺伝子のレベルを決定することは、転写産物のレベルを決定することを含む。いくつかの実施形態において、転写産物のレベルを決定することは、その転写産物へ特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブと試料を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、プローブは標識される。
いくつかの実施形態において、「レベルを決定すること」は、存在または非存在、例えば、用いられているアッセイの検出限界より上のレベルの存在を検出することを含む。
いくつかの実施形態において、本方法は、被験対象が癌を有する可能性を決定するために用いることができる。
他に規定がない限り、本明細書に用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明に用いるものとして本明細書に記載されている。当技術分野において知られた他の適切な方法および材料も用いることができる。材料、方法、および例は、例証となるのみであり、限定することを意図したものではない。本明細書に言及された全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、全体として参照により組み入れられている。加えて、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５５１０８は、全体として参照により本明細書に具体的に組み入れられており、いくつかの実施形態において、本明細書に記載された方法は、その出願に記載された方法と併せて用いることができる。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が支配するものとする。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
異なる腫瘍、細胞株、および組織の間での、総ゲノムアラインメント化リードに占めるパーセントでメジャーサテライトのレベルを示す棒グラフである。原発性腫瘍および細胞株の遺伝子型は、各腫瘍型および細胞株の下に示されている。（Ｋｒａｓ＝ＫｒａｓＧ１２Ｄ；Ｔｐ５３、ＳＭＡＤ４、およびＡＰＣは、欠失した遺伝子を表す） 全ての原発性腫瘍、癌細胞株、および正常組織の間での、メジャーサテライトからの配列リード寄与のグラフ表示である。 図２Ａは、３つのＫｒａｓＧ１２Ｄ、Ｔｐ５３１ｏｘ／＋膵臓原発性腫瘍（腫瘍１〜３）、および腫瘍３由来の安定発現株（ＣＬ３）のノーザンブロット分析の結果を示す図である。図２Ｂは、ＤＮＡ低メチル化剤５−アザシタジン（ＡＺＡ）での処理前（０）および処理後（＋）のＣＬ３のノーザンブロット分析の結果を示す図である。 複数の成体および胎児のマウス組織由来の全ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す図である。ノーザンブロットは全て約３０分間曝露した。 １ｋｂメジャーサテライトリピートプローブとハイブリダイズした、正常膵臓（左）および原発性膵管腺癌（右）のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）の結果を示す１対の顕微鏡写真である。 新生物発生前ＰａｎＩＮ（Ｐ）病変、ＰＤＡＣ（Ｔ）に隣接、および正常膵臓（Ｎ）のＩＳＨ分析の結果を示す３枚の顕微鏡写真の１セットであり、ＰａｎＩＮにおいて陽性染色を示し、完全癌腫において発現の増加がある。ＰａｎＩＮ（左）およびＰＤＡＣ（右）病変のより高倍率（４０×）。 肝臓転移性ＰＤＡＣ細胞におけるサテライトの著しい発現を示す３枚の顕微鏡写真の１セットであり、肝臓それ自体はサテライトを発現しない（左）。大きな腺転移性腫瘍沈着は、標準組織学的評価およびサテライトの染色により容易に同定される（中央）。サテライトＩＳＨは、標準組織学的分析により容易には認識されない肝臓実質におけるミクロ転移を検出するのに十分感度が高い（右；矢じり）。全ての画像は２０×倍率である（スケールバー＝１００μｍ）。 ＤＧＥによって定量化された、ヒト膵管腺癌（ＰＤＡＣ）、正常膵臓、他の癌（Ｌ−肺、Ｋ−腎臓、Ｏ−卵巣、Ｐ−前立腺）、および他の正常ヒト組織（１−胎児脳、２−脳、３−大腸、４−胎児肝臓、５−肝臓、６−肺、７−腎臓、８−胎盤、９−前立腺、および１０−子宮）における総サテライト発現を示す棒グラフである。サテライト発現は、ヒトゲノムにアラインメントされた１００万個あたりの転写産物として示されている。 シーケンシングされたヒトＰＤＡＣ（黒色、ｎ＝１５）および正常ヒト組織（白色、ｎ＝１２）における総サテライトに占めるパーセントとしてサテライトリピートクラスの分解を示す棒グラフである。サテライトは、腫瘍における最高絶対差から正常組織における最高まで順序づけられている（左から右へ）。誤差バーは、平均値の標準誤差を表す。上位３つの癌組織（左、黒色棒）および正常組織（右、白色棒）のサテライトクラスの倍数差異が示されている（棒グラフ、中心）。 隣接した非癌性間質組織（Ｎ）と共に新生物発生前ＰａｎＩＮ（Ｐ）病変におけるヒトサテライトＨＳＡＴＩＩのＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）（上部画像）、ならびにＰＤＡＣ（Ｔ）および正常な隣接した白血球（Ｎ）の穿刺吸引細胞診を示す図である。 ヒートマップによって描かれた場合の、全てのマウス腫瘍および正常組織の間での、メジャーサテライトの他の細胞転写産物との多重線形相関分析の結果を示す図である。Ｘ軸は、メジャーサテライトの発現によって順序づけられた試料であり、ｙ軸は、メジャーサテライト発現への線形相関によって順序づけられた遺伝子である。薄い灰色（高）および濃い灰色（低）は、ｌｏｇ２（１００万個あたりのリード）である。パーセントゲノムアラインメント化リードとしてのメジャーサテライト発現（ｙ軸）は、サテライトリード（ｘ軸）によって順序づけられ、サテライトレベルとの最高線形性（Ｒ≧０．８５）を有する上位の遺伝子の拡大表示が示されている。 サテライト発現に対する線形性によって（濃い灰色；左側に最高線形性）、またはランダムに（薄い灰色）順序づけられた、全ての遺伝子の転写開始部位のＬＩＮＥ−１エレメントへの距離中央値を示すドットグラフである。１００個単位でビニングされた遺伝子によってプロットされている。 転写開始部位のＬＩＮＥ−１エレメントへの距離に対する頻度（濃い灰色）によってプロットされた、サテライト相関遺伝子またはＳＣＧを定義する最高線形性（Ｒ＞０．８５）を有する上位遺伝子を、これらの遺伝子の予想される頻度（薄い灰色）と比較して示すドットグラフである。 神経内分泌マーカーのクロモグラニンＡについてのマウスＰＤＡＣ（ＫｒａｓＧ１２Ｄ、Ｔｐ５３ ｌｏｘ／＋）の免疫組織化学法の結果を示す４枚の顕微鏡写真の１セットである。腫瘍は、クロモグラニンＡ染色の上昇の関数として描かれており（濃い灰色）、メジャーサテライト発現の相対レベルは、各腫瘍について、各画像の下部に示されている（総転写産物に占める割合）。 ヒト原発性ＰＤＡＣ ＦＦＰＥ試料へのシングルプレックスＶｉｅｗＲＮＡ色素生産性アッセイを用いるＲＮＡ−ＩＳＨの結果を示す顕微鏡写真である。組織の明視野画像上にオーバーレイされたＨＳＰ９０ＢＢ陽性（オリジナルは赤色；管の周りの濃い領域、それらの一部は矢印で示されている）上皮腺管癌腫細胞（管が示されている）が示されている。
本発明は、ヒトおよびマウスの癌におけるサテライトＲＮＡ、およびいくつかのサテライト相関遺伝子の大量産生の同定に、少なくとも一部、基づいている。したがって、本方法は、癌の早期検出に有用であり、臨床成績を予想するために用いることができる。
サテライト相関遺伝子をバイオマーカーとして用いる、癌の診断
本明細書に記載された方法は、被験対象において、癌、例えば、上皮由来の固形腫瘍、例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、または大腸癌の存在を診断し、ならびにその癌についての処置の効力をモニターするために用いることができる。
本明細書に用いられる場合、用語「過剰増殖性の」とは、自律的成長の能力を有する細胞、すなわち、急速に増殖する細胞成長によって特徴づけられる異常な状態または状況を指す。過剰増殖性疾患状態は、病的として、すなわち、疾患状態を特徴づけ、もしくは構成することとして、分類される場合もあるし、または非病的として、すなわち、正常からの逸脱であるが、疾患状態とは関連していないとして、分類される場合もある。その用語は、組織病理学的型または侵襲性の段階に関係なく、全ての型の癌性成長もしくは発癌性過程、転移性組織、または悪性形質転換した細胞、組織、もしくは器官を含むことを意味する。「腫瘍」は、過剰増殖性細胞の異常な成長である。「癌」は、例えば悪性腫瘍成長に特徴づけられる、病的疾患状態を指す。
本明細書で実証されているように、例えば、ＩＣＤ−Ｏ（国際疾病分類−腫瘍学（International Classification of Diseases-Oncology）コード（改訂版３）、セクション（8010〜8790）によって定義されるような癌、例えば、上皮由来の固形腫瘍、例えば、初期癌の存在は、膵臓癌細胞におけるサテライトリピートの転写およびプロセシングの増加による大量レベルのサテライトの存在、ならびに循環腫瘍細胞におけるＳＣＧ発現のレベルの増加の存在に関連している。したがって、方法は、腫瘍細胞、例えば、上皮由来の固形腫瘍からの細胞、例えば、膵臓癌細胞、肺癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、腎臓癌細胞、卵巣癌細胞、または大腸癌細胞であることが知られ、または推測される細胞を含む試料において、サテライトリピートの発現レベルの検出を含むことができる。代替として、または加えて、方法は、試料、例えば、腫瘍細胞、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含むことが知られ、または推測される試料における、例えば、本明細書に記載されているようなマイクロ流体デバイスを用いた、ＳＣＧのレベルの増加の検出を含むことができる。
上皮由来の癌には、膵臓癌（例えば、膵臓腺癌、または膵管内乳頭粘液性癌腫（ＩＰＭＮ、膵腫瘤））、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、前立腺癌、乳癌、腎臓癌、卵巣癌、または大腸癌を挙げることができる。例えば、本方法は、サーベイランスが標準処置である良性ＩＰＭＮと、切除術（有意の罹患率および小さいが有意な死亡の可能性と関連づけられる手順）を必要とする悪性ＩＰＭＮとを区別するために用いることができる。いくつかの実施形態において、ＩＰＭＮと診断された被験対象において、本明細書に記載された方法は、被験対象のサーベイランス／モニタリングに用いることができ、例えば、方法は、良性ＩＰＭＮが、外科的介入を正当化する悪性ＩＰＭＮになっているかどうかを決定するために選択された間隔で（例えば、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、または２４ヶ月ごとに）繰り返すことができる。加えて、いくつかの実施形態において、方法は、非小細胞肺癌を有すると推測される被験対象由来の試料において、細気管支肺胞上皮癌を反応過程（例えば、肺炎後反応過程）と区別するために用いることができる。いくつかの実施形態において、乳癌を有すると推測される被験対象由来の試料において、方法は、乳管過形成を異型乳管過形成および非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）と区別するために用いることができる。その２つの後者のカテゴリーは、切除術／放射線照射を受ける。前者は、介入を必要としない。いくつかの実施形態において、前立腺癌を有すると推測される被験対象において、方法は、異型小型腺房増殖と悪性癌を区別するために用いることができる。いくつかの実施形態において、膀胱癌を有すると推測される被験対象において、方法は、例えば、尿検体において、例えば、移行上皮癌（ＴＣＣ）を検出するために用いることができる。いくつかの実施形態において、バレット食道（Sharma、N Engl J Med. 2009、24；361(26)：2548〜56。訂正：N Engl J Med. 2010年4月15日；362(15)：1450）と診断された被験対象において、方法は、バレット食道における異形成を反応過程と区別するために用いることができる。異形成の診断は治療的介入を要求するため、その臨床的意味は重要である。他の実施形態には、とりわけ、高分化型肝細胞癌、膨大部および胆管の癌腫、神経膠腫対反応性神経膠症、黒色腫対真皮母斑、低悪性度肉腫、および膵内分泌腫瘍の診断が挙げられるが、それらに限定されない。
したがって、被験対象において、癌、例えば、上皮由来の腫瘍、例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、または大腸癌を診断するための方法が本明細書に含まれる。いくつかの実施形態において、方法は、試料を被験対象から得るステップ、ならびに試料においてＳＣＧおよび／またはサテライトの存在および／またはレベルを評価するステップ、ならびにその存在および／またはレベルを、１つまたは複数の基準、例えば、ＳＣＧもしくはサテライトの正常なレベル、例えば、非罹患の被験対象もしくはその同じ被験対象由来の正常細胞におけるレベルを表す対照基準、および／または癌に関連づけられるＳＣＧもしくはサテライトのレベル、例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、もしくは大腸癌を有する被験対象におけるレベルを表す疾患基準と比較するステップを含む。
本方法は、癌の病期、例えば、試料が前癌病変由来、初期腫瘍由来、または進行腫瘍由来の細胞を含むかどうかを決定するために用いることもできる。例えば、本方法は、被験対象が、前癌性膵臓病変、乳房病変、または前立腺病変を有するかどうかを決定するために用いることができる。用いられるマーカーがＳＣＧ転写産物またはコードされたタンパク質である場合、レベルの上昇は、病期の進行と相関する。
試料
本方法のいくつかの実施形態において、試料は、血液、血清、および／もしくは血漿、またはそれらの一部もしくは細画分、例えば、血清中の遊離ＲＮＡまたは血液中のエキソソーム内のＲＮＡであり、またはそれらを含む。いくつかの実施形態において、試料はＣＴＣを含む（または含むと推測される）。いくつかの実施形態において、試料は、尿またはその一部もしくは細画分であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、試料は、既知の、または疑いの腫瘍細胞を含み、例えば、生検試料、例えば、穿刺吸引（ＦＮＡ）細胞診、内視鏡生検、または針生検である。いくつかの実施形態において、試料は、被験対象の膵臓、肺、乳房、前立腺、腎臓、卵巣、または大腸由来の細胞を含む。いくつかの実施形態において、試料は、痰試料から得られる肺細胞、または被験対象の肺からブラッシング、洗浄、気管支鏡生検、経気管支生検、もしくはＦＮＡ、例えば、気管支鏡ＦＮＡ、蛍光透視ＦＮＡ、もしくはＣＴ誘導型ＦＮＡ（そのような方法はまた、同様に、他の組織から試料を得るために用いることができる）により得られる肺細胞を含む。いくつかの実施形態において、試料は凍結され、固定され、および／または透過処理され、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。
検出方法
当技術分野において知られた任意の方法を、本明細書に記載されているようなバイオマーカーのレベルを検出し、および／または定量化するために用いることができる。例えば、ＳＣＧ ｍＲＮＡ（転写産物）のレベルは、当技術分野において知られた方法、例えば、ノーザンブロット、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）、ＲＮＡ発現アッセイ、例えば、マイクロアレイ分析、ＲＴ−ＰＣＲ、（例えば、ランダムプライマーまたはオリゴＴプライマーを用いる）ＲＮＡシーケンシング、ディープシーケンシング、クローニング、ノーザンブロット、および例えば、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、転写産物を増幅することを用いて評価することができる。ＲＮＡ発現を決定するための分析技術は知られている。例えば、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)を参照。
いくつかの実施形態において、ＳＣＧがコード転写産物である場合（表６参照）、ＳＣＧコード化タンパク質のレベルが検出される。タンパク質の存在および／またはレベルは、当技術分野において知られた方法を用いて、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、免疫蛍光法、免疫組織化学法、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、およびウェスタンブロット分析などの定量的イムノアッセイ方法を用いて、評価することができる。
いくつかの実施形態において、方法は、バイオマーカー、例えば、ＳＣＧ転写産物／ｍＲＮＡまたはタンパク質に選択的に結合する作用物質（例えば、オリゴヌクレオチドプローブ、抗体またはその抗原結合部分など）を試料と接触させて、試料におけるバイオマーカーのレベルを評価することを含む。いくつかの実施形態において、作用物質は検出可能な標識を有する。作用物質に関しての用語「標識された」は、検出可能な物質を作用物質に結合させること（すなわち、物理的に連結させること）による作用物質の直接的標識、加えて、検出可能な物質との反応性による作用物質の間接的標識を包含する。検出可能な物質の例は、当技術分野において知られており、それには、化学発光標識、蛍光標識、放射性標識、または比色標識が挙げられる。例えば、検出可能な物質には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、および放射性材料を挙げることができる。適切な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、量子ドット、またはフィコエリトリンが挙げられる。発光材料の例には、ルミノールが挙げられる。生物発光材料の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適切な放射性材料の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。一般的に、タンパク質が検出されることになっている場合、抗体を用いることができる。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくは、モノクローナルであり得る。無傷抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。
いくつかの実施形態において、ハイスループット方法、例えば、当技術分野において知られているようなタンパク質チップまたは遺伝子チップ（例えば、12章、「Genomics」、Griffithsら編、Modern genetic Analysis、1999、W. H. Freeman and Company；EkinsおよびChu、Trends in Biotechnology、1999；17：217〜218；MacBeathおよびSchreiber、Science 2000、289（5485）：1760〜1763；Simpson、Proteins and Proteomics：A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press；2002；Hardiman、Microarrays Methods and Applications: Nuts & Bolts、DNA Press、2003参照）は、サテライトまたはＳＣＧの存在および／またはレベルを検出するために用いることができる。
いくつかの実施形態において、方法は、分岐鎖ＤＮＡアッセイを用いる改変型ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション技術を用いて、試料においてバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを直接的に検出かつ評価することを含む（例えば、Luoら, 米国特許第７，８０３，５４１号Ｂ２, 2010；Canalesら, Nature Biotechnology 24(9)：1115〜1122 (2006)；Nguyenら, Single Molecule in situ Detection and Direct Quantiication of miRNA in Cells and FFPE Tissues（ポスターが panomics.com/index.php?id=product 87で入手できる）参照）。このアッセイを実施するためのキットは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（ＶｉｅｗＲＮＡ）から市販されている。
ＣＴＣにおけるＳＣＧ転写産物の検出
いくつかの実施形態において、マイクロ流体（例えば、「ラボオンチップ」）デバイスを本方法に用いることができる。そのようなデバイスは、マイクロ流体フローサイトメトリ、連続的なサイズに基づいた分離、およびクロマトグラフィ分離に用いるのに成功している。一般的に、ＳＣＧ転写産物の発現が循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）において検出される方法は、癌の早期検出、例えば、上皮由来の腫瘍、例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、または大腸癌の早期検出に用いることができる。
デバイスは、細胞の混合物からＣＴＣを分離し、またはＣＴＣの濃縮集団を調製するために用いることができる。特に、そのようなデバイスは、全血などの複雑な混合物からのＣＴＣの単離に用いることができる。
様々なアプローチを、不均一な試料からＣＴＣを分離するために用いることができる。例えば、デバイスは、ブロックバリアの上流のマイクロ流体チャネル内に六角形パッキングパターンで配置された複数のポストのアレイを含み得る。ポストおよびブロックバリアは、異なる結合部分で機能的にすることができる。例えば、ポストは、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を捕獲するための抗ＥＰＣＡＭ抗体で機能的にすることができ（例えば、Nagrathら, Nature 450：1235〜1239（2007）参照）、任意で、下流ブロックバリアがＳＣＧ核酸もしくはタンパク質、またはサテライトを捕獲するために機能的にされてもよい。例えば、（13〜15）ならびに本明細書に列挙された出願および参考文献を参照。
試料から特定の粒子を濃縮するための工程は、一般的に、順次処理ステップに基づいており、そのステップのそれぞれは、混合物において非所望細胞／粒子の数を低減するが、いくつかの実施形態において、１つの処理ステップで十分である場合がある。様々な処理ステップを実行するためのデバイスは、分離することができ、または１つのマイクロ流体システムへ統合することができる。デバイスは、細胞／粒子結合のためのデバイス、細胞溶解のためのデバイス、細胞をアレイするためのデバイス、ならびに、例えば、サイズ、形、および／もしくは変形能、または他の判断基準に基づいての、粒子分離のためのデバイスを含む。特定の実施形態において、処理ステップは、細胞をデバイスまたはシステムへ導入する前に細胞の数を低減するために用いられる。いくつかの実施形態において、デバイスは、最初の試料混合物と比較して所望の細胞の少なくとも７５％、例えば８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％を保持し、一方、所望の細胞の集団を、１つまたは複数の非所望細胞型に対して少なくとも１００倍、例えば、１０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、またはさらに１，０００，０００倍、濃縮する。
粒子の分離のためのいくつかのデバイスは、同時的な細胞結合あり、またはなしでの、サイズに基づいた分離に依存する。いくつかの、サイズに基づいた分離デバイスは、ＣＴＣおよび流体の他の成分の側方変位を引き起こす障壁の１つまたは複数のアレイを含み、それにより、そのような成分を濃縮し、または別の形で処理する機構を提供する。サイズに従って粒子を分離するための障壁のアレイ（複数可）は、典型的には、ギャップのネットワークを画定し、ギャップを通過する流体は、次のギャップへ不均等に分けられる。篩およびアレイのサイズに基づいた分離デバイスのどちらも、細胞結合デバイスに関して、上記のように、選択的透過性障壁を組み込むことができる。
ギャップのネットワークを形成する障壁のアレイを含むデバイスは、例として、例えば、それぞれの連続的な列が、前列の期間の半分未満、差し引かれるように、障壁のねじれ型の２次元アレイを含むことができる。障壁はまた、異なるパターンで配置することもできる。可能な障壁の形およびパターンの例は、ＷＯ２００４／０２９２２１においてより詳細に論じられている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、例えば、米国特許出願公開第２００７／００２６４１３号に記載されているような、アレイに基づいたサイズ分離方法を用いる、ＣＴＣの分離および／または濃縮を提供することができる。一般的に、デバイスは、流体試料に懸濁したＣＴＣおよび他の成分などの大きな粒子の側方変位を引き起こす選択的透過性障壁の１つまたは複数のアレイを含み、それにより、そのような成分を濃縮し、または別の形で処理する機構を提供し、一方また、障壁を構成するナノチューブの高密度マトリックス内の空隙を貫通することができる、他のより小さい粒子を選択的に結合する可能性も提供する。フィルター、篩、および濃縮デバイスまたは分離デバイスを含む、サイズ、形、または変形能に基づいた粒子の濃縮のためにそのような選択的透過性障壁を利用するデバイスは、国際特許出願公開第２００４／０２９２２１号および第２００４／１１３８７７号、Huangら, Science 304：987〜990（2004）、米国特許公開第２００４／０１４４６５１号、米国特許第５，８３７，１１５号および第６，６９２，９５２号、ならびに米国特許出願第６０／７０３，８３３号、第６０／７０４，０６７号、および第１１／２２７，９０４号に記載されている。親和性捕獲に有用なデバイスは、例えば、国際特許出願公開第２００４／０２９２２１号、および米国特許出願第１１／０７１，６７９号に記載されたものである。試料における細胞の優先的溶解に有用なデバイスは、例えば、国際特許出願公開第２００４／０２９２２１号、米国特許第５，６４１，６２８号および米国特許出願第６０／６６８，４１５号に記載されたものである。細胞をアレイするのに有用なデバイスは、例えば、国際特許出願公開第２００４／０２９２２１号、米国特許第６，６９２，９５２号、ならびに米国特許出願第１０／７７８，８３１号および第１１／１４６，５８１号に記載されたものである。流体送達に有用なデバイスは、例えば、米国特許出願第１１／０７１，２７０号および第１１／２２７，４６９号に記載されたものである。２つ以上のデバイスは、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００４／０２９２２１号に記載されているように、連続して組み合わせることができる。前述の全ては、参照により本明細書に組み入れられている。
いくつかの実施形態において、デバイスは、特定の細胞型、例えば、上皮由来の細胞、例えば、腫瘍細胞へ選択的に結合する結合部分、例えば、モノクローナル抗ＥｐＣＡＭ抗体またはその断片を含む障壁を含有することができる。デバイスの障壁の全部がこれらの結合部分を含むことができる。または、障壁の一部のみがそれらを含む。デバイスはまた、マイクロ流体チャネルデバイスと流体連結する追加のモジュール、例えば、細胞計数モジュールまたは検出モジュールを含むことができる。例えば、検出モジュールは、デバイスの出力試料を可視化するように形成することができる。
一例において、検出モジュールは、分離デバイスまたは濃縮デバイスと流体連結することができる。検出モジュールは、本明細書に開示された任意の検出方法または当技術分野において知られた他の方法を用いて操作することができる。例えば、検出モジュールには、顕微鏡、細胞計数機、磁石、バイオキャビティレーザー（例えば、Gourleyら, J. Phys. D: Appl. Phys., 36：R228〜R239（2003）参照）、質量分析計、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、マイクロアレイ、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーションを実施するためのデバイス、またはハイパースペクトル画像化システム（例えば、Vo-Dinhら, IEEE Eng. Med. Biol. Mag., 23：40〜49（2004）参照）が挙げられる。いくつかの実施形態において、コンピュータ端末は、検出モジュールに接続することができる。例えば、検出モジュールは、関心対象となる細胞、タンパク質、または核酸、例えば、ＳＣＧ転写産物またはコード化タンパク質へ選択的に結合する標識を検出することができる。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体システムは、（ｉ）ＣＴＣの分離または濃縮のためのデバイス；（ｉｉ）濃縮されたＣＴＣの溶解のためのデバイス、および（ｉｉｉ）ＳＣＧ転写産物またはコード化タンパク質の検出のためのデバイスを含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているようなマイクロ流体デバイスを用いて調製されるＣＴＣ集団は、例えば、上記およびSambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第３版(Cold Spring Harbor Laboratory Press；第３版（2001年1月15日）)；およびShort Protocols in Molecular Biology, Ausubelら編（Current Protocols；第52版（2002年11月5日））に記載されているような知られた分子生物学的技術を用いるＳＣＧ転写産物またはタンパク質の発現の分析に用いられる。
一般的に、濃縮されたＣＴＣ集団におけるＳＣＧ転写産物またはコード化タンパク質の発現の検出および／または定量化のためのデバイスは、本明細書に記載されており、癌、例えば、上皮由来の腫瘍の早期検出、例えば、膵臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、腎臓癌、卵巣癌、または大腸癌の早期検出に用いることができる。
疾患過程または処置効力をモニターする方法
いくつかの実施形態において、人が癌を有し、または癌を発症するリスクが増加していることがいったん決定されているならば、処置、例えば、当技術分野において知られているような処置を施すことができる。処置の効力は、本明細書に記載された方法を用いてモニターすることができる。追加の試料は、処置後（または処置中）、例えば、処置の１回または複数回の投与が施された後、評価することができ、ＳＣＧ転写産物もしくはコード化タンパク質の発現のレベルの減少、または試料中のＳＣＧ転写産物もしくはタンパク質発現細胞の数の減少が、その処置が有効であったことを示し、一方、ＳＣＧ転写産物またはタンパク質発現細胞のレベルに変化がないことまたはその増加は、その処置が有効ではなかったことを示している。方法は、処置の経過中および／または処置が終了した後、例えば、疾患の可能性のある再発をモニターするために、複数回、繰り返すことができる。
いくつかの実施形態において、例えば、癌を引き起こし得る良性状態と診断されている被験対象、癌について処置が成功している被験対象、または例えば、遺伝的素因もしくは発癌物質への環境的曝露により、癌のリスクが増加している被験対象について、方法は、被験対象における悪性腫瘍への進行または癌の発症の早期検出として、被験対象においてその疾患をモニターするために、選択された間隔で、例えば、３ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、または２４ヶ月の間隔で、繰り返すことができる。
本発明はさらに、以下の実施例において記載されており、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない。
メジャーサテライトレベルは、細胞株および正常組織と比較して、腫瘍組織において大量に上昇している
Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製の次世代デジタル遺伝子発現（ＤＧＥ）アプリケーション（D. Lipsonら, Nat Biotechnol 27, 652（2009年7月））を利用して、原発性癌およびそれら由来の転移性前駆体において腫瘍マーカーの発現を比較した。まず、本発明者らは、活性化型Ｋｒａｓの組織標的化発現およびＴｐ５３の喪失（ＫｒａｓＧ１２Ｄ、Ｔｐ５３ｌｏｘ／＋）を通して発生した原発性マウス膵管腺癌（ＰＤＡＣ）のＤＧＥプロファイルを決定した（N. Bardeesyら, Proc Natl Acad Sci USA 103, 5947（2006年4月11日））。これらの腫瘍は、事実上、普遍的な突然変異体ＫＲＡＳ（症例の＞９０％）およびＴＰ５３の喪失（５０〜６０％）を示すヒトＰＤＡＣの組織病理学的および遺伝学的模倣体である。
Ｂａｒｄｅｅｓｙ研究室において以前に記載されているように（Bardeesyら, Proc Natl Acad Sci USA 103, 5947（2006））、異なる遺伝子型の膵臓癌を有するマウスを飼育した。正常な野生型マウスをＪａｃｋｓｏｎ研究所から購入した。動物プロトコールガイドラインの通り、動物を安楽死させた。膵臓腫瘍および正常組織を無菌的に抽出し、その後、液体窒素で急速凍結した。組織を−８０℃で保存した。以前に記載されているように（Aguirreら, Genes Dev 17, 3112（2003））、動物ＡＨ３６７およびＡＨ３６８について細胞株を新鮮に作製し、樹立細胞株を、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した。大腸および肺由来の追加のマウス腫瘍は、Ｋｅｖｉｎ Ｈａｉｇｉｓ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびＫｗｏｋ−Ｋｉｎ Ｗｏｎｇ（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）により寛大にも提供された。
新鮮な凍結組織を、ドライアイス上のミクロチューブ中、滅菌乳棒で微粉砕した。細胞株を培養し、核酸抽出前に液体窒素中で新鮮凍結した。細胞株および新鮮凍結腫瘍および正常組織由来のＲＮＡおよびＤＮＡを全て、同じ様式で処理した。ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造会社の仕様書通り、抽出した。組織および細胞株由来のＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造会社のプロトコール通り、抽出した。
精製されたＲＮＡを、デジタル遺伝子発現（ＤＧＥ）試料プレッピングおよびＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製のＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）１分子シークエンサーでの分析に供した。この方法は、以前に記載されている（Lipsonら, Nat Biotechnol 27, 652 （2009））。簡単に述べると、一本鎖ｃＤＮＡを、ＲＮＡからｄＴＵ２５ＶプライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写した。ＲＮＡを消化し、一本鎖ｃＤＮＡを、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ（登録商標）ＡＭＰｕｒｅ（登録商標）磁気ビーズでの固相可逆的固定化（ＳＰＲＩ）技術を用いて精製した。一本鎖ｃＤＮＡを変性し、その後、ポリＡテールを、ターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて３’末端に付加した。
精製されたＤＮＡを、以前に記載されている（Pushkarev, N. F. Neff, S. R. Quake,Nat Biotech 27, 847（2009））Ｈｅｌｉｃｏｓ社製のＤＮＡシーケンシング試料プレッピングプロトコールに供した。簡単に述べると、ゲノムＤＮＡを、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｓ２音響ソニケータで剪断し、平均２００ｂｐｓで１００〜５００ｂｐｓの範囲である断片を生じた。その後、剪断されたＤＮＡをＳＰＲＩでクリーニングした。その後、ＤＮＡを変性し、ポリＡテールを、ターミナルトランスフェラーゼを用いて３’末端に付加した。
その後、テール付加のｃＤＮＡまたはＤＮＡを、シーケンシングフローセルにハイブリダイズさせ、続いて「充填およびロック（Fill and Lock）」および１分子シーケンシングを行った。その後、遺伝子発現配列リードを、ＤＧＥプログラムを用いて既知のヒトまたはマウストランスクリプトームライブラリーにアラインメントした。ゲノムＤＮＡ配列リードを、マウスゲノムにアラインメントし、計数して、メジャーマウスサテライトのコピー数（ＣＮＶ）を決定した。
分析された、最初のマウス膵臓腫瘍、ＡＨ２８４は、ＤＧＥ配列が、同じマウス由来の正常肝臓転写産物についての３〜４％の差と比較して、アノテートされたマウストランスクリプトームと４８〜５２％の矛盾を示した点で注目に値した。ほとんど全部の相違した配列は、中心周囲（メジャー）マウスサテライトリピートに位置した。サテライト転写産物は、正常膵臓または肝臓における０．０２〜０．４％（１９６〜４，１１５ｔｐｍ）と比較して、腫瘍において全ての細胞転写産物の約４９％（４９５，４２１ｔｐｍ）を占める（表１）。
サテライト配列リードは、センス方向とアンチセンス方向の両方で見出され、ポリＡ精製されたＲＮＡには存在していない。したがって、腫瘍ＡＨ２８４は、大量の非ポリアデニル化ｄｓＲＮＡエレメントを含有し、同じ動物由来の正常組織に存在するものに対して＞１００倍の増加として定量的に決定された。比較として、腫瘍組織におけるサテライト転写産物のレベルは、豊富なｍＲＮＡ Ｇａｐｄｈより約８，０００倍高かった。同じマウス由来の第２の無関係の膵臓腫瘍結節は、サテライト転写産物の、より低い、しかしそれでもなお大きく上昇した、レベルを示した（総細胞転写産物の４．５％）。
（ＫｒａｓＧ１２Ｄ、Ｔｐ５３ｌｏｘ／＋）マウス由来の４個の追加の膵臓腫瘍および別の膵臓腫瘍原性遺伝子型（ＫｒａｓＧ１２Ｄ、ＳＭＡＤ４ｌｏｘ／ｌｏｘ）を有する４匹のマウスの分析により、６／８個の追加の腫瘍においてサテライト発現の増加が明らかになった（総細胞転写産物の１〜１５％の範囲）。２／３個のマウス大腸癌腫瘍（ＫｒａｓＧ１２Ｄ、ＡＰＣｌｏｘ／＋）および２／２個の肺癌（ＫｒａｓＧ１２Ｄ、Ｔｐ５３ｌｏｘ／ｌｏｘ）において、サテライト発現レベルは、総細胞転写産物の２〜１６％の範囲であった。全体で、１２／１５個（８０％）の独立したマウス腫瘍が、正常マウス組織と比較してサテライト発現のレベルが非常に増加していた（図１Ａ、表２）。
注目すべきことには、コード転写産物、リボソーム転写産物、および他の非コード転写産物の間での総ＲＮＡリードの複合分布は、原発性腫瘍と正常組織の間で有意な差異を示し（図１Ａ）、全体的な細胞転写機構が、原発性腫瘍におけるサテライト転写産物の大量発現によって影響を及ぼされることを示唆している。３つの原発性膵臓腫瘍から樹立された不死化細胞株は、サテライトリピートの最小発現を示し、インビトロ増殖中のネガティブ選択かまたはインビトロ培養条件下での安定的なサテライトサイレンシング機構の再確立かのいずれかを示唆している（図１Ａ）。サテライトを過剰発現する原発性腫瘍において注目すべきことには、コード転写産物、リボソーム転写産物、および他の非コード転写産物の間での総ＲＮＡリードの複合分布は、正常組織のそれと有意な差異を示し（図１Ｂ）、細胞転写機構が、これらの腫瘍におけるサテライト転写産物の大量発現によって影響を及ぼされることを示唆している。
メジャーサテライト転写産物は、組織型に依存して様々なサイズを有し、発現レベルは、ゲノムメチル化および増幅に結びつけられる
マウス原発性膵臓腫瘍のノーザンブロット分析を、以下の通り、実行した。ノーザンブロットを、ＮｏｒｔｈｅｒｎＭａｘ−Ｇｌｙ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて実施した。全ＲＮＡ（１０μｇ）を、等量のＧｌｙｏｘａｌ Ｌｏａｄ Ｄｙｅ（Ａｍｂｉｏｎ）と混合し、５０℃で３０分間、インキュベートした。１％アガロースゲル中での電気泳動後、ＲＮＡをＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓ膜（Ａｍｂｉｏｎ）上へうつし、紫外線で架橋結合させた。膜を、ＵＬＴＲＡｈｙｂ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中、６８℃で３０分間、プレハイブリダイズさせた。マウスＲＮＡプローブ（１１００ｂｐ）を、ＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて調製し、ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ Ｐｓｏｒａｌｅｎ−Ｂｉｏｔｉｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、製造会社の使用説明書に従い、非アイソトープ的に標識した。０．１ｎＭプローブを用いて、膜を、ＵＬＴＲＡｈｙｂ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）中、６８℃で２時間、ハイブリダイズさせた。膜を、低ストリンジェンシー洗浄で、室温で１０分間、洗浄し、続いて、６８℃で１５分間の２回の高ストリンジェンシーの洗浄を行った。非アイソトープ化学発光検出について、ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ ＢｉｏＤｅｔｅｃｔ Ｋｉｔを、製造会社の使用説明書に従って用いた。
結果は、メジャーサテライト由来転写産物が１００ｂｐから２．５ｋｂまでの範囲であることを示し（図２Ａ）、ダイサー１による複数のタンデムリピートで構成される大きな一次転写産物の予想される切断と一致し（C. Kanellopoulouら, Genes Dev 19, 489（2005年2月15日）；T. Fukagawaら, Nat Cell Biol 6, 784（2004年8月）；H. Bouzinba-Segard, A. Guais, C. Francastel, Proc Natl Acad Sci USA 103, 8709（2006年6月6日））、その発現は、中央値より上のサテライト発現を有するマウス膵臓腫瘍において、２．６倍高い（ｐ＝０．０００６、ｔ検定）。高サテライト発現を有する原発性腫瘍由来の樹立した膵臓癌細胞株は、サテライト発現がほとんどなく、本発明者らのシーケンシング結果が確認される（Ｔ３およびＣＬ３；図２Ａ）。ＣＬ３の５−アザシチジンでの処理は、サテライト転写産物の大量の再発現をもたらし、インビトロでの安定的なサテライトサイレンシングの機構としてのＤＮＡメチル化を裏付けている（図２Ｂ）。肺を例外として、ほとんどの正常な成体マウス組織は、サテライトリピートの最小発現を示す（図２Ｂ）。しかしながら、切断されていない５ｋｂサテライト転写産物の発現が、胚性組織において明らかである（図２Ｃ）。したがって、原発性膵臓腫瘍におけるサテライトリピートの異常な発現は、胚性細胞の運命を単に繰り返すだけでなく、一次５ｋｂサテライト転写産物のプロセシングの変化も反映している。１分子シーケンシングプラットフォームは、小さい反復性ｎｃＲＮＡ断片の定量化について並外れて感度が高く、それらの断片のそれぞれが、固有のリードとしてスコアリングされる。マウスメジャーサテライトの高レベル発現は、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）によって示されているように、原発性腫瘍内の全ての細胞において明らかであった（図２Ｄ）。顕著なことには、発現は、初期の新生物発生前病変、膵臓上皮内新生物（ＰａｎＩＮ）においてすでに上昇しており、完全な膵臓腺癌への移行でさらに増加した（図２Ｅ）。明確に画定された、肝臓への転移性病変が、ＲＮＡ ＩＳＨによって強く陽性であり、さもなければ組織病理学的分析によっては検出されていなかっただろう肝臓実質内の個々のＰＤＡＣ細胞も同様であった（図２Ｆ）。全載胚分析によって示されているように、低レベルの散在性発現が、肝臓および肺において明らかであったが、腫瘍細胞において明らかなレベルに匹敵するサテライト発現を正常成体または胚性組織は示さなかった。
サテライトリピートのゲノム増幅もまた、マウス膵臓腫瘍におけるこれらの転写産物の桁外れの大量の存在に寄与しているかどうかを決定するために、指標のＡＨ２８４腫瘍を、ゲノムＤＮＡシーケンシングについて上記のような次世代ＤＮＡデジタルコピー数変動（ＣＮＶ）分析を用いて分析した。
表３に示された結果より、サテライトＤＮＡは、マッチングされた正常肝臓におけるゲノム配列の２．３％と比較して、この腫瘍における総ゲノムアラインメント化リードの１８．８％を構成することが示された。メジャーサテライトリピートは、正常マウスゲノムの約３％と以前に推定されている（J. H. Martensら, EMBO J 24, 800（2005年2月23日））。したがって、サテライトリピートの発現の＞１００倍の増加を有するこの腫瘍において、リピートの約８倍の遺伝子増幅が、それらの異常な発現に寄与している可能性がある。
ヒト膵臓癌および他の上皮癌におけるサテライト転写産物の過剰発現
ヒト腫瘍もまたサテライトｎｃＲＮＡを過剰発現するかどうかを試験するために、本発明者らは、ＤＧＥ分析をヒト膵臓癌の検体へ広げた。ヒト膵臓腫瘍組織を、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ ＨｏｓｐｉｔａｌからＩＲＢプロトコールに従って、余分な廃棄されるヒト材料として入手した。腫瘍全体を切除し、核酸抽出前に、液体窒素中で新鮮凍結した。正常膵臓ＲＮＡを、２つの商業的ベンダーのＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｍｂｉｏｎから入手した。上の実施例１に記載されているように、試料を調製し、分析した。
１５個のＰＤＡＣの分析により、正常膵臓と比較して、総サテライト転写産物の発現の中央値２１倍の増加が示された。非小細胞肺癌、腎細胞癌腫、卵巣癌、および前立腺癌のコホートもまた、有意なレベルのサテライトおよびＨＳＴＡＩＩサテライトを有した。胎児脳、脳、大腸、胎児肝臓、肝臓、肺、腎臓、胎盤、前立腺、および子宮を含む他の正常なヒト組織は、若干のより高いレベルの総サテライト発現を有する（表４、図３Ａ）。
複数のクラスの間でのヒトサテライトの細分化により、腫瘍と全正常組織の間の主要な違いが明らかになった。マウスサテライトリピートはメジャーサテライトおよびマイナーサテライトへ大ざっぱに細分されるが、ヒトサテライトは、より徹底的に分類されている。全てのヒトサテライトのうち、最大の発現倍数の差異は、動原体周囲のサテライトＨＳＡＴＩＩ（平均２，４１６ｔｐｍ、サテライトリードの１０．３％）について明らかであり、それは正常ヒト膵臓においては検出不可能である（図３Ｂ）。対照的に、正常組織は、ＧＳＡＴＩＩ、βサテライト（ＢＳＲ）、およびＴＡＲ１クラスの提示がずっと高いが（それぞれ、総サテライトリードの２１．１％、１７．３％、および２．１％）、これらは、膵臓癌においてサテライトリードのごく少数を構成する。
正常に発現するヒトサテライトの最も豊富なクラスである、α（ＡＬＲ）（Okadaら, Cell 131, 1287（2007年12月28日））は、正常なヒト膵臓において２９４ｔｐｍで発現しているが、ヒト膵臓腺癌において平均して１２，５３５ｔｐｍを含む（４３倍の発現差異、サテライトリードの６０．３％）。したがって、ヒトＡＬＲリピートの過剰発現は、マウスメジャーサテライトリピートの過剰発現に匹敵するが、ヒトＰＤＡＣについて例外的な特異性を示すのは、豊富ではないＨＳＡＴＩＩである（ＧＡＰＤＨの４９倍）。ヒト膵臓腫瘍におけるＬＩＮＥ−１のサテライト転写産物との共発現もまた顕著であり、平均１６，０８９ｔｐｍ（範囲３５８〜３８，４１９）を有する。
ＡＬＲリピート以外に、正常膵臓とＰＤＡＣのサテライト発現プロファイルは著しく異なる。例えば、正常膵臓組織は、ＧＳＡＴＩＩ、ＴＡＲ１、およびＳＳＴ１クラスの提示がはるかに高いが（総サテライトリードの２６．４％、１０．６％、および８．６％）、これらは、膵臓癌においてサテライトリードのごく少数であった。対照的に、癌は、正常膵臓において発現が検出不可能であるサブタイプであるＨＳＡＴＩＩサテライトを、高レベルで発現する（１０６個の転写産物あたり４，０００個、サテライトリードの１５％）（図３Ｂ）。マウス対ヒトの膵臓癌におけるサテライト転写の定量的比較は、マウスメジャーサテライトが、豊富なＧａｐｄｈ ｍＲＮＡの中央値４６６倍、発現しているが、ヒトＡＬＲおよびＨＳＡＴＩＩサテライトは、それぞれ、ＧＡＰＤＨの１８０倍および４７倍で発現していることを示す。
サテライトレベルの増加と線形相関を持つ細胞転写産物は、ヒストンデメチラーゼおよびＲＮＡプロセシング酵素に結びつけられる、幹細胞エレメントおよび神経エレメントについて濃縮されている
異なる組織像および遺伝的バックグラウンドの２５個の異なるマウス組織についての包括的なＤＧＥプロファイルの作成は、細胞転写産物の発現をサテライトの発現と、幅広い定量的範囲にわたって相関させることを可能にした。そのような同時制御される遺伝子を同定するために、ＤＧＥによって定量化された全てのアノテートされた転写産物を、線形回帰分析に供し、サテライト発現に対する最高の相関係数を有する転写産物を順序づけた。
全てのマウス試料リードを、マウスメジャーサテライトについてのカスタムメイドライブラリー（ＵＣＳＣゲノムブラウザからの配列）にアラインメントした。ヒト試料を、Ｒｅｐｂａｓｅライブラリー（Pushkarevら, Nat Biotech 27, 847（2009））から作成された全てのサテライトリピートおよびＬＩＮＥ−１変種についてのカスタムメイド参照ライブラリーにアラインメントした。加えて、全ての試料を、トランスクリプトーム分析のためにＤＧＥプログラムに供した。全ての試料について、１０６個のゲノムアラインメント化リードごとにリードを標準化した。
マウスメジャーサテライトのトランスクリプトームへの線形相関について、全ての組織および細胞株を、メジャーサテライトのレベルに従って順序づけた。その後、全てのアノテートされた遺伝子を、全ての組織にわたって、線形回帰分析に供した。その後、遺伝子を、線形回帰のピアソン係数に従って順序づけ、Ｍａｔｌａｂによりプロットした。
最高線形相関（Ｒ＞０．８５）を有する２９７個の遺伝子の１セットの分析により、１９０個のアノテートされた細胞ｍＲＮＡおよび転位因子のサブセットが明らかになった（図４Ａ）。
細胞ｍＲＮＡのサブセットは、多様なマウス腫瘍にわたって、サテライトリピート発現のレベルとの非常に高い程度の相関を示した（本明細書では「サテライト相関遺伝子（ＳＣＧ）」と呼ばれている）。Ｒ＞０．８５を有する線形相関した遺伝子を、ＤＡＶＩＤプログラムを用いてマッピングした（Dennis, Jr.ら, Genome Biol 4, P3（2003）； Huangら, Nat Protoc 4, 44（2009））。その後、これらの遺伝子を、機能予測クラスタリングプログラムおよびＵＰＴＩＳＳＵＥデータベースを用いて分析し、これらのマッピングされた遺伝子のそれぞれを分類した。生殖細胞／幹細胞遺伝子は、精巣、卵、栄養芽細胞、および神経幹細胞において高度に発現した遺伝子を含んだ。神経遺伝子は、脳、脊髄、ならびに嗅覚、聴覚、および視覚を含む特定化された感覚ニューロンにおいて高度に発現した遺伝子を含んだ。ＨＯＸおよびジンクフィンガータンパク質は、ＩＮＴＥＲＰＲＯデータベースを用いて分類された。
ＤＡＶＩＤ遺伝子オントロジープログラムを用いる１９０個のアノテートされた転写産物の分析により、これらの転写産物のうちの１２０個（６３％）が神経細胞運命に関連があるとして同定され、５０個（２６％）が生殖細胞／幹細胞経路に結びつけられた（表５）。
加えて、ＨＯＸ関連（９個、５％）およびジンクフィンガータンパク質（１６個、８％）を含む転写制御因子について有意な濃縮が明らかであった。この遺伝子セットは、ＧＳＥＡデータベース（Subramanianら, Proc Natl Acad Sci USA 102, 15545（2005年10月25日））におけるいかなる既知の遺伝子サインとも一致させることができなかったが、オントロジー分析は、神経内分泌表現型を指摘する。神経内分泌分化は、膵臓癌を含む様々な上皮悪性腫瘍において記載されており（(Tezelら, Cancer 89, 2230（2000年12月1日））、前立腺癌において最もよく特徴づけられており、前立腺癌において、それは、より高悪性度の疾患と相関している（Cindoloら, Urol Int 79, 287（2007））。マウスＰＤＡＣにおけるより高いサテライト発現の関数としての特徴的な神経内分泌マーカーのクロモグラニンＡについての癌腫細胞染色の数の顕著な増加（図４Ｄ）が観察され、ｎｃＲＮＡの包括的に変化した発現と特定の細胞分化プログラムの間の関連を裏付けた。
ＡＬＲ（最も豊富なヒトサテライト）を用いるヒト膵臓癌および正常組織における平行分析は、合計５３９個のＳＣＧを生じ、これらのうち、２０６個が、ＤＡＶＩＤ遺伝子オントロジープログラムによってマッピングすることができ、生殖細胞／幹細胞運命と神経細胞運命の類似した濃縮があった（表６）。まとめると、これらの観察は、マウス遺伝的モデルにおいてのように、サテライト由来リピートの腫瘍関連抑制解除は、細胞ｍＲＮＡのサブセットの発現の増加と高度に相関していることを示唆している。
バイオマーカーとしての有用性があるＳＣＧのリストについては、癌と正常組織の間で最小２０倍の差異があり、かつ１００万個あたり５００個のリードの最小発現があるヒトＳＣＧを採用することにより、さらに精巧にした。結果は表７に示されている。
オリゴヌクレオチド分岐ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイを用いた確証
上で記載された（および表７に列挙された）ように、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＲＮＡシーケンシング判定基準から同定された候補ＳＣＧを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥプローブを用いてさらに評価した。４つの原発性膵管腺癌（ＰＤＡＣ）由来の全ＲＮＡを、ＱＵＡＮＴＩＧＥＮＥ Ｐｌｅｘ ＲＮＡアッセイを用いて分析した。結果は下記（表８）に示されている。
このデータに基づいて、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）原発性腫瘍検体においてＨＳＰ９０ＢＢおよびＡＫ０９６１９６について試験するために、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＶＩＥＷＲＮＡプローブを開発した。ＦＦＰＥ材料に関してＭＧＨにおいて、ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＲＮＡ−ＩＳＨ）アッセイを用いて、これらのプローブを試験した。大腸癌細胞株ＨＣＴ−１１６を用いてＮｕ／Ｎｕマウスに作製されたヒト癌皮下異種移植片上に、陽性染色が見られた。ＨＳＰ９０ＢＢを、ＭＧＨからの原発性ヒトＰＤＡＣ検体においてさらに試験した。その結果は図５に示されており、上皮腺管癌腫細胞の大量かつ特異的な染色を示した。
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、例証することを意図され、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付された特許請求の範囲によって定義される。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。

Claims (16)

  1. 被験対象において膵臓癌の存在を検出するインビトロ方法であって、
    該対象由来の試験細胞を含む試料において、ＨＳＰ９０ＢＢ（熱ショックタンパク質９０ｋＤａ α（細胞質））の発現レベルを決定して、試験値を得るステップ、ならびに
    試験値を基準値と比較するステップを含み、
    基準値より有意に上である試験値が、該対象が膵臓癌を有することを示す、方法。
  2. 基準値のレベルが、正常細胞におけるＨＳＰ９０ＢＢのレベルである、請求項１に記載の方法。
  3. 正常細胞が、同じ被験対象における試験細胞と同じ型の細胞である、請求項２に記載の方法。
  4. 正常細胞が、膵臓癌を有しない被験対象における試験細胞と同じ型の細胞である、請求項２に記載の方法。
  5. 試料が、腫瘍細胞を含むものである、請求項１に記載の方法。
  6. 試料が、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む血液試料、または腫瘍細胞を含む生検試料である、請求項５に記載の方法。
  7. 被験対象において膵臓癌の処置の効力を評価するインビトロ方法であって、
    該対象が膵臓癌の処置を受ける前の該対象由来の試料において、ＨＳＰ９０ＢＢの発現レベルを決定して、最初の値を得るステップ、
    該対象が膵臓癌の処置を受けた後、該対象から得られた試料において、前記ＨＳＰ９０ＢＢのレベルを決定して、処置値を得るステップ、ならびに
    最初の値を処置値と比較するステップを含み、
    最初の値より下である処置値が、処置が有効であることを示す、方法。
  8. 最初の試料および２番目の試料が、腫瘍細胞を含むものである、請求項７に記載の方法。
  9. 試料が、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む血液試料、または腫瘍細胞を含む生検試料である、請求項８に記載の方法。
  10. 処置が外科的介入、化学療法、放射線療法、またはそれらの組み合わせの施与を含む、請求項７または８に記載の方法。
  11. ＨＳＰ９０ＢＢのレベルを決定するステップが、転写産物のレベルを決定することを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 転写産物のレベルを決定することが、転写産物へ特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブと試料を接触させることを含む、請求項１１に記載の方法。
  13. プローブが標識されたものである、請求項１２に記載の方法。
  14. 転写産物を増幅することを含む、請求項１２に記載の方法。
  15. 転写産物のレベルを決定することが、ＲＮＡシーケンシングを実施することを含む、請求項１１に記載の方法。
  16. 被験対象がヒトである、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
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