TWI651414B - 用於偵測生物樣本的生物標記、探針、套組及其用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明有關於一種用於偵測生物樣本的生物標記、探針、套組及其用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的方法。前述生物標記及探針包含在特定SNP位點以及與該SNP位點相關之至少一基因表現產物，可偵測特定SNP位點的特定基因型及對應之基因產物至少一者的表現量，準確判斷子宮內膜異位症惡化程度，進而應用於非侵入式判斷子宮內膜異位症惡化程度的套組及其定性判斷方法。

Description

用於偵測生物樣本的生物標記、探針、套組及其用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的方法
本發明是有關於一種用於偵測生物樣本的生物標記、探針及其應用，特別是有關於一種用於偵測生物樣本的生物標記、探針、套組及其用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的方法。
子宮內膜異位症(endometriosis)是一種良性但使人虛弱的婦科疾病，與慢性盆腔疼痛、痛經以及不孕症有關。約10%的育齡婦女受子宮內膜異位症影響，造成子宮腔外的類子宮內膜組織(endometrium-like tissues)之生長異常。這些良性腹膜表面的生長物會異位入侵，模擬惡性腫瘤轉移的進展，且伴隨血管生成和細胞移行。組織病理學觀察及基因分析顯示，子宮內膜樣(endometrioid)癌及 卵巢透明細胞癌均源自於子宮內膜異位症。雖然有關子宮內膜異位症的病因已提出一些假說，但其確切的發病機制仍不明。個體對子宮內膜異位症易感性涉及多重因素，包括荷爾蒙異常、免疫反應異常、環境因素、個體解剖型態、以及基因或表觀遺傳體質(epigenetic predisposition)等。
微小RNA(microRNAs；miRNA)是指小型非編碼單鏈RNAs，在轉錄後可調節各種生物過程，包括細胞分化、增殖及凋亡。藉由miRNA定位(targeting)的mRNA轉錄物，可加速其轉錄物的分解或抑制轉譯，端視其互補的程度。miRNA或其結合目標物中的單核苷酸多型性(single-nucleotide polymorphisms；SNP)與miRNA異常表現及致癌作用有關。微陣列及功能研究結果顯示，miRNA的含量與良性疾病、惡性疾病及女性生殖道的生殖障礙有關，但miRNA基因多型性與子宮內膜異位症之間的關係仍不詳。
小核仁RNA(small nucleolar RNAs；snoRNAs)為非編碼RNA，其成熟序列(60-300nt)比miRNA更長。snoRNAs可分為序列特徵不同的兩大類，box C/D或box H/ACA，可作為小核醣核蛋白顆粒的導引成分，通過互補辨識序列，分別催化rRNA 2'-O-甲基化以及假嘌呤基化(pseudouridylation)。在真核細胞核仁中，核醣體RNA藉由snoRNAs進行後轉錄編輯，之後經切割產生18S、5.8S及28S rRNAs。在移位到細胞質之前，這些rRNAs片段與成熟的大次單元及小次單元之RPs進行組 裝。snoRNAs與RPs二者都是核醣體生合成關鍵的調節蛋白，對於細胞週期的進程特別重要。近來研究顯示，snoRNAs及RPs的調升(upregulation)可以控制人類腫瘤的進展。有假說認為藉由抑制第1型RNA聚合酶(RNA polymerase I)或使snoRNA/RP沉默，可以干擾進行核醣體組裝，進而阻止細胞增殖並誘使細胞凋亡，並被提出作為抗惡性疾病的新策略。
然而，目前尚無有效的策略，以非侵入的方式判斷子宮內膜異位症惡化狀態。有鑑於此，亟需開發一種新的策略，以利於判斷子宮內膜異位症惡化狀態。
因此，本發明之一態樣是在提供一種用於偵測生物樣本的生物標記，該生物標記包含特定SNP位點的特定基因型，以及與該特定SNP位點具有表型關聯性之至少一序列，以判斷生物樣本之子宮內膜異位症的惡化狀態。
本發明之另一態樣係在提供一種定性偵測生物樣本的生物標記表現量的方法，其係建立生物標記與子宮內膜異位症之惡化狀態之相關性模式後，再根據該相關性模式判斷待測生物樣本之生物標記表現量，藉此判斷待測生物樣本之子宮內膜異位症之惡化程度。
本發明之又一態樣係在提供一種用於偵測生物樣本的生物標記表現量的探針。
本發明之又一態樣係在提供一種用於偵測生物 樣本的生物標記表現量的套組，其包含上述探針。
根據本發明之上述態樣，提出一種用於偵測生物樣本的生物標記，包含單核苷酸多型性(SNP)位點以及與該SNP位點具有表型關聯性之至少一序列。在一實施例中，上述SNP位點之SNP編號可例如為rs11614913及/或rs1834306，且該SNP位點具有一基因型。在上述實施例中，前述至少一序列可包括但不限於一DNA序列、該DNA序列編碼之一RNA序列及/或該RNA序列編碼之一胺基酸序列，且該至少一序列可例如參與核醣體生合成SNORD基因及RP基因，其包括但不限於源自於核仁小RNA(small nucleolar RNA)C/D box 116(SNORD 116)基因、核醣體P蛋白(ribosomal P protein)2(RPLP2)基因、核醣體蛋白(ribosomal protein)L26(RPL26)基因、RPL38基因、核醣體蛋白(ribosomal protein)S25(RPS25)基因、RPS27基因及/或RPS28基因，藉此判斷生物樣本之子宮內膜異位症惡化狀態。
在上述實施例中，上述SNP位點rs11614913之基因型可包含例如C等位基因、CC基因型或CT基因型。
在上述實施例中，上述SNP位點rrs1834306之基因型可包含例如A等位基因或AA基因型。
根據本發明之另一態樣，提出一種定性偵測生物樣本的生物標記表現量的方法，包含建立相關性模式，以及利用相關性模式判斷待測生物樣本之生物標記表現量。在一實施例中，建立相關性模式包含偵測複數個參考生物樣 本，以獲得複數個第一風險性資料，以及建立第一風險性資料與子宮內膜異位症之複數個惡化狀態之相關性，使SNP位點之一者對應於前述基因或蛋白質之一者、第一表現量之一者及/或前述惡化程度之一者。在上述實施例中，第一風險性資料包含複數個單核苷酸多型性位點及與SNP位點具有表型關聯性之複數個基因或複數個蛋白質的第一表現量，其中SNP位點之SNP編號包括rs11614913及rs1834306，前述基因或蛋白質可例如參與核醣體生合成SNORD基因及RP基因或其蛋白質，其包括但不限於SNORD 116、RPLP2、RPL26、RPL38、RPS25、RPS27以及RPS28。當第二風險性資料與前述SNP位點之該者及前述基因或蛋白質之該者相符，且對應之顯著性差異值(P)小於0.05時，則判斷待測生物樣本具有惡化程度之該者。
在上述實施例中，上述參考生物樣本及待測生物樣本包含離體(ex vivo)之血液樣本或組織樣本。
在上述實施例中，上述第一表現量為調升的。
在上述實施例中，上述惡化狀態可包括但不限於上述參考生物樣本之臨床分期、CA123含量以及疼痛指數。
根據本發明之又一態樣，提出一種用於偵測生物樣本的生物標記表現量的探針，其特徵在於此探針用於偵測上述之生物標記。
根據本發明之再一態樣，提出一種用於偵測生物樣本的生物標記表現量的套組，包含上述之探針。
應用本發明之用於判斷子宮內膜異位症惡化狀態的生物標記，其係包含特定SNP位點的特定基因型及對應之基因產物至少一者的表現量，藉由建立生物標記與子宮內膜異位症之惡化狀態的相關性模式，可準確判斷待測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度，進而應用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的探針及套組。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：〔圖1A〕至〔圖1D〕係繪示與子宮內膜異位症及其相關臨床症狀相關的癌症相關MiRSNPs的風險分析。
〔圖2A〕至〔圖2B〕係繪示受MIR196A2基因變體影響之RNA結構(圖2A)及其下游目標基因的表現(圖2B)。
〔圖3A〕至〔圖3D〕係繪示子宮內膜細胞之MIR196A2在rs11614913處之基因變異造成rRNA編輯及蛋白質合成功能障礙的結果。
〔圖4A〕至〔圖4D〕係繪示在子宮內膜異位症進程中，核醣體生合成調升的結果。
承前所述，本發明提供一種生物標記、探針、套組及其用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的方法，其係藉由偵測特定SNP位點的特定基因型及對應之 基因或蛋白質至少一者的表現量，以準確判斷子宮內膜異位症惡化程度。
申言之，本發明此處所稱的生物標記，可包含例如單核苷酸多型性(SNP)位點以及與該SNP位點具有表型關聯性之至少一序列。在一實施例中，上述SNP位點之SNP編號可例如為rs11614913及/或rs1834306。在此實施例中，上述SNP位點具有基因型，其中rs11614913對應之基因型包含C等位基因、CC基因型或CT基因型，而rs1834306對應之基因型包含A等位基因或AA基因型。此外，在其他實施例中，上述SNP位點更可選擇性包括rs2910164、rs7372209、rs895819、rs6505162及rs3746444，以進行綜合分析。
在上述實施例中，前述至少一序列可包括但不限於DNA序列、該DNA序列編碼之RNA序列及/或該RNA序列編碼之胺基酸序列。在一例示中，前述至少一序列可包括例如參與核醣體生合成SNORD基因及RP基因，其包括但不限於源自於核仁小RNA(small nucleolar RNA)C/D box 116(SNORD 116)基因、核醣體P蛋白(ribosomal P protein)2(RPLP2)基因、核醣體蛋白(ribosomal protein)L26(RPL26)基因、RPL38基因、核醣體蛋白(ribosomal protein)S25(RPS25)基因、RPS27基因及/或RPS28基因，藉此判斷生物樣本之子宮內膜異位症惡化狀態。在此說明的是，以上僅為例舉，並非用以限制本發明於上述所載。
上述生物標記可進一步用於非侵入式定性偵測 生物樣本的生物標記表現量的方法。本發明此處所稱的生物樣本可包括參考生物樣本及待測生物樣本，例如離體(ex vivo)之血液樣本或組織樣本，其中前述組織樣本可例如頭髮、體液、分泌物等。此處所稱的參考生物樣本是用來建立相關性模式，以利於後續判斷待測生物樣本的子宮內膜異位症惡化程度。
申言之，在一實施例中，本發明之定性偵測生物樣本的生物標記表現量的方法可包含建立相關性模式，以及利用相關性模式判斷待測生物樣本之生物標記表現量。
在上述實施例中，建立相關性模式包含偵測複數個參考生物樣本，以獲得複數個第一風險性資料。在此實施例中，第一風險性資料可包含例如複數個單核苷酸多型性位點及與SNP位點具有表型關聯性之複數個基因或複數個蛋白質的第一表現量。在一例示中，SNP位點之SNP編號可包括rs11614913及rs1834306。在另一例示中，適用於前述基因或蛋白質的例子可包括但不限於SNORD 116、RPLP2、RPL26、RPL38、RPS25、RPS27以及RPS28。在此例示中，前述基因或蛋白質的第一表現量通常為調升的(upregulated)，以利於促進核醣體生合成。
在獲得第一風險性資料後，上述建立相關性模式更包含建立第一風險性資料與子宮內膜異位症之複數個惡化狀態之相關性，使SNP位點之一者對應於前述基因或蛋白質之一者，前述第一表現量之一者及/或前述惡化程度之一者。舉例而言，rs11614913處的C等位基因與不孕症以 及增加疼痛嚴重程度相關，且SNORD 116、RPLP2、RPL38及RPS28的表現量較高。又例如，rs1834306處的A等位基因與不孕症及重度子宮內膜異位症(advanced endometriosis stage)相關。以上僅舉例說明第一風險性資料與子宮內膜異位症之複數個惡化狀態之相關性，惟本發明不限於此。
接著，利用上述相關性模式判斷待測生物樣本之生物標記表現量。在一實施例中，判斷待測生物樣本之生物標記表現量的步驟包括非侵入式偵測該待測生物樣本，以獲得複數個第二風險性資料。之後，比對第二風險性資料與第一風險性資料，以判斷第二風險性資料是否與第一風險性資料之一者相符，並獲得對應之顯著性差異值(P)。
當第二風險性資料與前述SNP位點之該者及前述基因或蛋白質之該者相符，且對應之顯著性差異值(P)小於0.05時，則判斷待測生物樣本具有惡化程度之該者。
舉例而言，當第二風險性資料與rs11614913處的C等位基因相符，且對應之P值小於0.05時，則判斷待測生物樣本具有罹患不孕症以及疼痛嚴重程度加劇之風險。
本發明此處所稱的風險型等位基因(risk allele)是指具有該等位基因之個體會提高該個體提高罹病風險，通常與該等位基因對特定疾病之勝算比(odds ratio；OR)或次要等位基因頻率(minor allele frequencies；MAF)呈現正相關。
本發明此處所稱的保護型等位基因 (protective allele)是指具有該等位基因之個體可藉由破壞特定蛋白質的功能，提供該個體抵抗疾病的能力，或降低罹病風險。
本發明此處所稱的調升(upregulated或upregulation)是指增加特定細胞成分(例如DNA、RNA、蛋白質等)的表現量。反之，調降(downregulated或downregulation)則指減少特定細胞成分(例如DNA、RNA、蛋白質等)的表現量。
補充說明的是，在其他實施例中，可綜合上述複數個第一風險性資料進行風險分析，以進一步評估子宮內膜異位症之惡化狀態的風險。
以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
實施例1 1.建立族群實驗模式
此族群試驗模式包含實驗組及控制組。實驗組包括218位受試者，皆在台灣中國醫藥大學附設醫院(CMUH)經過剖檢或內視鏡的病理學診斷後，確診為子宮內膜異位症。病患與疾病相關的生殖狀態經臨床報告確認。子宮內膜異位症的嚴重程度根據美國生殖醫學會(ASRM)，區分為：第1階段，輕微；第2階段，輕度；第3階段，中度； 第4階段，重度。控制組由202位年齡與實驗組相仿的健康女性所組成，皆在同一間醫院經過例行生理檢驗。即使健康檢查是正常的，若超音波檢測出卵巢囊腫或子宮內膜異位相關症狀者，則從控制組中排除。上述實驗組及控制組經CMUH院內的人體試驗委員會核准，並獲得每位參與者的知情同意。
2.單核苷酸多型性的基因分型
根據商業套組提供的標準操作方法(例如基因體DNA套組；Qiagen,Valencia,CA,USA)，由周邊血液白血球或細胞團塊(cell pellet)萃取出基因體DNA。利用Taqman SNP基因分型分析系統(Applied Biosystem Inc.,Carlsbad,CA,USA)進行PCR，以增幅6個含有SNP位點的DNA片段，其中使用的探針編號(ABI probe ID)及序列列於表1。探針與待測DNA片段完全配對，則產生正訊號。偵測PCR產物的螢光訊號，以獲得基因變異。
3.統計分析
上述病患的6個SNP等位基因及基因分型的頻率分佈係利用SPSS軟體(第10.0版，SPSS Inc.,IL.,USA)進行卡方分析後，以百分比表示等位基因及基因分型。以分布頻率最高的等位基因作為參考基準，計算出等位基因及基因分型的頻率在95%信賴區間(95% CIs)的勝算比(odds ratio；ORs)。利用單因子變異數分析(one-way ANOVA)評估不同藥物/載體處理的細胞組別之間的綜合風險分析與差異。利用單一樣本t檢定(simple t-test)評估不同處理的二個組別是相同或不同。
4.細胞培養、基因轉染、細胞分選及功能性研究
人類子宮內膜細胞株(endometrial cells)HEC1A〔寄存編號：BCRC 60552或ATCC HTB-112)〕與RL95-2〔(寄存編號：BCRC 60103或ATCC CRL-1671)〕，人類卵巢透明細胞癌細胞株ES-2(寄存編號：BCRC 60067或ATCC CRL-1978)與TOV-21G(寄存編號：BCRC 60407或ATCC CRL-11730)，係購自於食品工業發展研究所(FIRDI)生物資源保存及研究中心(BCRC)(台灣300新竹市東區食品路311號)或美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)(10801 University Boulevard Manassas,VA 20110 USA)。具有綠螢光蛋白(green fluorescein protein；GFP)報導基因的載體pCMV-MIR用來構築miR196a2-C質體，其中miR196a-2C質體利用 QuikChange II定點突變套組(Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA,USA)在SNP位點rs11614913處導入突變(C變T)，以產生miR196a2-T質體。所得質體的序列經直接定序確認無誤(圖未繪示)。
進行微矩陣分析時，取5x105的HEC1A子宮內膜細胞至直徑6公分的培養盤內進行培養。接著，根據製造商提供的方法，利用多聚胺陽離子脂質體lipofectamine(Invitrogen,Waltham,MA,USA)進行轉染，將上述質體導入HEC1A細胞內。轉染24小時後，在細胞培養液中加入最終濃度200μg/mL的抗生素G418，以篩選出轉染成功的細胞。轉染48小時後，利用流式細胞儀(flow cytometry,Bectom Dickinson,San Jose,CA,USA)按照GFP的程度分選出陽性反應的細胞，其中有超過90%之陽性反應的細胞是轉染成功的細胞。細胞分選效率則利用鏡檢計算具有螢光的細胞。
進行抗核醣體生合成試驗，包括細胞生長、細胞移行及細胞週期分析時，卵巢透明細胞癌細胞株在含或不含RNA聚合酶I抑制劑CX-5461(Selleckchem,Houston,TX,USA)的培養液中維持五天。
5.微矩陣試驗
根據製造商的操作手冊，利用TRIzol試劑由上述分選的細胞取得總RNA。利用Agilent生物分析儀(Agilent Bioanalyzer；Agilent Technologies Inc.,Santa Clara,CA,USA)評估RNA的品質。每個樣本的總 RNA經過反轉錄及分段處理後，接著雜交至帶有人類外顯子基因的基因晶片(GeneChip human gene 1.0 ST Array；Affymetrix Inc.,Santa Clara,CA,USA)上。基因晶片經清洗並進行掃描後，所得的CEL檔之初步基因表現數據再利用dChip演算法進行標準化(normalized)及處理。之後，利用TM4演算法進一步分群及可視化。利用相同的RNA樣本進行定量PCR分析，以驗證微矩陣試驗的數據。為了研究臨床關聯性，從基因表現資料庫(GEO，網址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)下載微矩陣數據集(microarray dataset)(基因表現資料庫GEO的編號：GSE6364)，包括16個正常子宮內膜以及21個子宮內膜異位病變的基因表現圖譜。進行資料探勘(data mining)時，以正常子宮內膜選定的基因表現量為1.0，將各基因表現量予以標準化。
6.免疫螢光染色
取8個石蠟包埋塊進行切片，以分別顯示從遠端子宮內膜異位症、連續非典型子宮內膜異位症及卵巢透明細胞癌在組織病理的連續轉變。在此實施例中，5個包埋塊在miR196A2之rs11614913處為C/C基因型，3個包埋塊在miR196A2之rs11614913處為T/T基因型。以免疫螢光染色法，利用稀釋倍率1：100之兔抗核仁磷酸蛋白(anti-nucleophosmin，anti-NPM)單株抗體(ab52644)及抗核仁素(anti-nucleolin，anti-NCL)單株抗體(ab129200)(Abeam PLC,Cambridge,MA)檢測活化的 核仁及核醣體生合成。免疫染色是根據兩個病理學家獨立計分，特定的核仁染色計分如下：陰性(0)、弱陽性(1+)、中等陽性(2+)或強陽性(3+)。本實施例綜合染色陽性細胞的百分比以及核仁染色強度進行統計分析。計算H計分=ΣPi xi，其中i代表染色腫瘤細胞之強度(0至3+)，而Pi代表每個染色強度組別的染色腫瘤細胞之百分比(0 to 100%)。上述方法已揭露病理學期刊(The Journal of pathology)第229期第559-568頁(2013年)，此處一併列為參考文獻。針對不一致的個案，由第三方的研究人員評分，並由多數分數決定最後的染色強度分數。
實施例2.建立評估子宮內膜異位症嚴重程度的預測模式 1.miRNA基因中與癌症相關的SNPs(MiRSNPs)之風險分析
在國際人類基因組單體型圖計劃(HapMap)資料庫(網址：www.hapmap.org)中，從miRNA區域中選出中國北京漢族人群(Han Chinese in Beijing；CHB)之次要等位基因頻率(minor allele frequencies；MAF)超過4%的六個非多餘的SNPs，亦稱為MiRSNPs。這些MiRSNPs作為不同癌症的風險因子，如表1所列。這些MiRSNPs位於未成熟或成熟的miRNAs中，干擾其穩定性及折合型態。此實施例的結果顯示，miR-100基因在rs1834306處的基因變異(p=3.5 x 10-3，OR：1.64；95% CI：1.24-2.17)，以及miR-196a2基因在rs11614913處的 基因變異(p=3.5 x 10-3，OR：1.65；95% CI：1.24-2.19)，二者皆與子宮內膜異位症的罹病風險相關，如表2所示。在rs11614913處的C等位基因對子宮內膜異位症的易感性(susceptibility)呈顯性影響；而在rs11614913處具有CC基因型或CT基因型的病患，罹患子宮內膜異位症的風險增加(p=7 x 10-4，OR：2.45；95% CI：1.54-3.51)。在rs1834306處的A等位基因對子宮內膜異位症的易感性則有隱性影響(p=9.1 x 10-3，OR：2.17；95% CI：1.35-3.51)(表3)。雖然miR26a1在rs7372209處的T等位基因會增加子宮內膜異位症的風險(表2)，作為參考的C等位基因為保護型，可抗子宮內膜異位症的進展(表3)，不過上述差異經過Bonferroni校正方法校正後，不具顯著性。
2.MiRSNPs與臨床表型的關聯性
請參閱圖1A至圖1D，其係繪示與子宮內膜異位症及其相關臨床症狀相關的癌症相關MiRSNPs的風險分析。圖1A係繪示病患MiRSNP之等位基因分佈，其係藉由卡方檢驗分析，根據指定的子宮內膜異位症相關臨床症狀，以95%信賴區間表示之。圖1B係繪示rs11614913(MIR196A2中的C等位基因)與rs1834306(MIR100中的A等位基因)的綜合等位基因型分析，以預測子宮內膜異位症相關不孕症。圖1C係繪示rs11614913(MIR196A2中的C等位基因)與rs1834306(MIR100中的A等位基因)的綜合等位基因型分析，以預測子宮內膜異位症相關不孕症。圖1D係繪示不同保護型等位基因效應的患者的CA125含量，其係綜合具有rs895819(MIR2A7中的C等位基因)及rs6505162(MIR423中的A等位基因)不同保護型等位基因的患者確認而得。圖1B至圖1D綜合評估的效果分別以0、1、2表示，其中標示0者為：不具風險或具有MiRSNP的保護性基因型/等位基因型；標示1者為：具有一個MiRSNP風險型或保護型基因型/等位基因型；標示2者為：具有二個MiRSNP風險型或保護型基因型/等位基因。標示*為：P<0.05；標示**為：P<0.01；標示***為：P<0.001。
此實施例係利用病例找出與子宮內膜異位症相關表型進展有關的MiRSNPs，其中子宮內膜異位症相關表型包括不孕症、臨床分期、CA125含量及疼痛指數，如圖1A所示。過去研究顯示，MIR100之rs1834306處的A等位 基因可判斷大腸癌進展時間，在此實施例中顯示與不孕症(p=0.040)及重度子宮內膜異位症(advanced endometriosis stage；p=0.041)相關(圖1A)。MIR196A2之rs11614913處的C等位基因參與不孕症(p=0.016)且增加疼痛嚴重程度(p=0.012)，MIR26A1之SNP rs7372209則與任何臨床症狀無關。MIR27A之rs895819以及MIR423之rs6505162被認為是抗子宮內膜異位症之保護型等位基因(表3)，而所測到的CA125含量下降(p值分別為0.0058及0.039；圖1A)，確實具有關聯性。上述數據確認MIR100及MIR196A2基因變異，與子宮內膜異位症風險及癌症進展具有相關性。
本發明利用疾病相關的基因型分析方式，評估MIR196A2之rs11614913(CC or CT)以及MIR100之rs1834306(AA)二種前子宮內膜異位症(pro-endometriosis)功能性SNPs可能的累積效應。結果顯示，病患及控制組的風險評分完全不同(p<10-5；圖1B)。相較於低度風險病患(不具有不利的基因型)，中度風險病患(具有一種不利的基因型)的勝算比(OR)為5.31(95% CI：3.26-8.66)，而高度風險病患(具有二種不利的基因型)的勝算比為8.84(95% CI：4.06-19.2；表4)。同理，以MIR196A2之rs11614913(C)與MIR100之rs1834306(G)的風險型等位基因綜合評估，可預測會發生子宮內膜異位症相關的不孕症(p<0.001，圖1C)。在此實施例中，不具有風險型等位基因的病患，沒有一位會產生不孕症。反之， 以MIR27A and MIR423之次要等位基因頻率綜合評估，可按CA125含量不同而將病患分成三群(p<0.001；圖1D)。
3.MIR196A2之rs11614913的變異導致子宮內膜細胞的rRNA編輯/修飾及蛋白質合成功能障礙
過去研究顯示，MiRSNPs會改變miRNA的二級結構及穩定性，造成基因表現及細胞訊息網絡的改變，進而使癌症進展。對此，本發明使用MaxExpect演算軟體(MaxExpect algorithm；http：//ma.urmc.rochester.edu/RNA structure Web/Serv ers/MaxExpect/MaxExpect.html)來預測miRNAs前體(pre-miRNAs)及miRNAs可能的結構變化。相較於正常或正位子宮內膜(eutopic endometrium)，雖然在子宮內膜異位症組織中的miRNA-100是調升的’(upregulated)，不過近來研究顯示，miRNA-100在癌症透過非典型上皮-間葉轉化(epithelial-mesenchymal transition；EMT)的過程中，扮演抑制腫瘤的作用。
請參閱圖2A至圖2B，其係繪示受MIR196A2 基因變體影響之RNA結構(圖2A)及其下游目標基因的表現(圖2B)。圖2A係繪示利用MaxExpect演算法分析miR196a2在rs11614913處的基因變體，以預測miRNA前體(pri-miRNA)及miRNA前體的結構。miR196a2-T變體在成熟miR196a2莖環(stem-loop)結構中多出一個環形(loop)結構，如圖2A右邊箭頭所示。圖2B係繪示利用定量PCR(quantitative PCR；qPCR)比較轉染miR196a2-C載體或miR 196a2-T載體之子宮內膜細胞株HEC1A及RL95-2中，miR196a2下游預測目標物mRNA的含量(表5)。相關數據以三重覆的平均值及標準偏差表示。標示*為：P<0.05；標示**為：P<0.01；標示***為：P<0.001。
本發明著重於MIR196A2之rs11614913處的基因變異的效應(圖2A)。與過去利用自由能分析結果一致，miR196a2前體(pre-miR196a2)之C變U(T)的變異會在髮夾結構中多出一個環形結構，使得穩定性下降，並使成熟miR196a2量變少。qPCR的結果顯示，相較於轉染miR 196a2-C載體(rs11614913處為C等位基因)之子宮內膜細胞(圖2B)，轉染miR 196a2-T載體(rs11614913處為T等位基因)之子宮內膜細胞中，HEC1A細胞株(具有T/C基因型背景)排名前14個目標基因之6個基因(表5)以及RL95-2細胞株(具有T/T基因型)排名前14個目標基因中之9個基因的表現量是調升的，代表C變T的取代不足以使基因沉默(insufficient silencing)。前述的目標基因表現量雖然改變甚微，但可能會影響下游的訊息傳遞。
請參閱圖3A至圖3D，其係繪示子宮內膜細胞之MIR196A2在rs11614913處之基因變異造成rRNA編輯及蛋白質合成功能障礙的結果。子宮內膜細胞株HEC1A係以miR196a2-C載體或miR196a2-T載體轉染。圖3A係繪示snoRNAs(圖3A上方)及RPs(圖3A下方)受rs11614913變體影響之微矩陣分析結果。圖3B與圖3C分別繪示利用定量PCR確認轉染細胞中snoRNA(圖3B)及RP(圖3C)基因表現的結果。相關數據以三重覆的平均值及標準偏差表示。 圖3D係繪示GEO資料庫(GSE6364)之微矩陣分析的結果，以評估在子宮內膜異位病變(n=21，以E表示)及正常子宮內膜(n=16，以N表示)中，選定的snoRNA and RP基因之表現量。標示*為：P<0.05；標示**為：P<0.01；標示***為：P<0.001。
為了研究子宮內膜細胞之MIR196A2多型性在生物學上的關聯性，利用微矩陣分析轉染miR196a2-T質體或miR196a2-C質體之子宮內膜細胞的基因表現圖譜。miR196a2-C質體可引起多數已知C/D snoRNAs有超過1.5倍的改變(圖3A上方)。近一半的已知人類RPs也有中等程度的增加(倍數變化>1.3；圖3A下方)。利用定量PCR(qPCR)以大於二倍之snoRNAs及RPs評估，藉此確認上述微矩陣數據。qPCR的結果顯示，大部分的snoRNAs及RPs的表現形態與微矩陣的數據一致，不過以qPCR檢測之SNORD54與SNORD45A的表現量較低(圖3B至圖3C)。在高度表現之RPs中，60S酸性核醣體蛋白P2(acidic ribosomal protein P2；RPLP2)、RPL27A、RPS27(亦稱為金屬泛激蛋白-1(metallopanstimulin-1；MPS-1)以及60S核醣體蛋白L38(ribosomal protein L38；RPL38)，經證實可受miR196a2-C質體調控。
為了界定臨床顯著性，此實施例運用GEO資料庫(編號：GSE6364)的微矩陣數據，分析子宮內膜異位症病變處及正常的子宮內膜處特定的snoRNAs及RPs的表現。在子宮內膜異位症組織中，8個RPs中有6個具有調升的 現象(圖3D)。受限於探針組的設計，snoRNA基因中僅選擇核仁小RNA(small nucleolar RNA)C/D box 116(SNORD 116)進行分析，發現相較於控制組(以N表示)，子宮內膜異位症組織(以E表示)的SNORD 116表現量較高。上述特定的基因中，子宮內膜異位症病患的SNORD 116、RPLP2、RPL38及40S核醣體蛋白S28(RPS28)表現量較高(圖3D，以E表示)，此與利用miR196a2-C質體在體外試驗的結果一致。綜言之，上述結果指出，在子宮內膜異位症進展中，會活化整體的核醣體生合成。
4.核醣體生合成調升誘發子宮內膜異位症進展
核醣體生合成發生在細胞核仁，特別在癌細胞中，核醣體生合成的產能量及代謝量是最大的。先前的結構-功能研究顯示，細胞核仁異常與癌症進展相關，代表轉型細胞適應出新的代謝特徵。因此，在子宮內膜異位症的進展中，核醣體生合成的活化可以提供細胞轉型為惡性的驅動力。
請參閱圖4A至圖4D，其係繪示在子宮內膜異位症進程中，核醣體生合成調升的結果。圖4A係顯示連續非典型子宮內膜異位症及卵巢透明細胞癌之組織切片，其中有5個組織塊在MIR196A2之rs11614913處具有C/C基因型，有3個組織塊在MIR196A2之rs11614913處具有T/T基因型。圖4B係顯示後續將進行抗核仁磷酸蛋白(anti-NPM)與抗核仁素(anti-NCL)染色的組織切片。代表性的染色照片是來自於在MIR196A2之rs11614913處具 有C/C基因型的組織切片。染色計分如前所述，以100個細胞核仁的平均值及標準偏差表示。圖4C與圖4D係顯示組織切片影像放大的細胞核仁(anti-NPM染色，圖4C)與DFC(anti-NCL染色，4D)。同一患者遠端子宮內膜異位症的組織切片作為圖4A至圖4D的控制組。標示*為：P<0.05；標示**為：P<0.01；標示***為：P<0.001。
為了驗證上述假設，此實施例收集5例在MIR196A2之rs11614913處具有風險型C/C基因型以及3例具有風險型T/T基因型的卵巢透明細胞癌樣本，進行免疫染色分析(圖4A)。此實施例利用抗核仁磷酸蛋白(anti-NPM)抗體檢測活化細胞核，並利用抗核仁素(anti-NCL)抗體檢測緻密纖維組份(dense fibrillary component；DFC)，也就是具有高度活化核醣體生合成的區域。結果顯示，與遠端子宮內膜異位病變相比，鄰接癌症組織的非典型子宮內膜異位症的NCL與NPM之染色強度較大(圖4B至圖4D)。與前述結果一致，癌組織細胞核仁膨脹到整個區域(如anti-NPM抗體的結果所示)，該區域具有高度活化核醣體生合成(如anti-NCL抗體的結果所示)(圖4B至圖4D)。留意的是，具有T/T基因型的組織塊之染色強度，比具有C/C基因型的組織塊之染色強度還弱。不過這兩組之間增加的模式相近(圖4C至圖4D)。由核仁增加以及緻密纖維組份(DFC)型態擴大的數據可以證明，子宮內膜異位症會惡化成非典型子宮內膜異位症甚至卵巢癌。
功能性MiRSNPs可影響人類疾病，包括癌症進 展。本發明評估六種癌症相關的MiRSNPs，發現在MIR196A2之rs11614913處的基因變異與子宮內膜異位症病程進展相關。rs11614913處的C等位基因與病患產生不孕症及嚴重疼痛具有高度相關。上述子宮內膜細胞的功能性特徵證明，風險型等位基因可透過調控多個snoRNAs與RPs之表現量，而在核醣體生合成中扮演重要角色。
相較於正常的子宮內膜，上述snoRNAs與RPs在子宮內膜異位症病變處通常為調升(upregulated)，推測在細胞核仁內活化的核醣體生合成，促使子宮內膜異位症發生。針對NPM與NCL的免疫螢光染色結果亦確認，核仁完整性的改變與子宮內膜異位症惡化成非典型子宮內膜異位症及卵巢透明細胞癌有關。利用CX-5461(第1型RNA聚合酶抑制劑)處理後，可抑制rs11614913具有C/C基因型的卵巢透明細胞的細胞增殖及移行，使細胞週期停在G2/M期並使細胞凋亡(apoptosis)。有關在子宮內膜異位症進程及惡性轉化(malignant transformation)中提到MIR196A2之基因變體所扮演的角色，目前尚無相關文獻提及。
MIR196A2之功能性SNP rs11614913與肺癌及乳癌的癌症進展有關。雖然不同癌症類型及種族間存有差異，不過，過去多數研究認為，rs11614913處具有CC或CT基因型的病患結果較差，而認為C等位基因是風險型等位基因。與前述實施例的結果一致，rs11614913-C比rs11614913-T的結構更穩定，在臨床樣本中也看到，rs11614913-C的成熟miR196a2增加。MIR196A2位於染 色體12上的HOXC叢集區。將近三分之一已知或推定miR196a2目標物(表5)是Hox基因家族的成員，Hox基因家族編碼含有同源域的轉錄因子，對於胚胎發育相當重要。Hox蛋白參與細胞分裂、附著/移行及細胞凋亡，而這些蛋白質的調控異常(dysregulation)與子宮內膜異位症進程、胚胎植入及惡性腫瘤相關。然而，多數的Hox蛋白對臨床使用的荷爾蒙藥物等類固醇荷爾蒙敏感，而且Hox蛋白之含量變化隨著月經週期而變化。這或許可以解釋在臨床樣本中，Hox蛋白未能呈現一致之表現模式的原因。
另一方面，作為miR196a2下游的效應蛋白(effector)的snoRNAs與RPs，二者整體表現量增加，代表細胞增殖以及擴大子宮內膜異位症組織，關鍵在於增加核醣體活性。上述數據指出，在臨床樣本中，rs11614913-C增加SNORD 116、RPLP2、RPS27、RPS25、RPL26、RPL38及RPS28的表現量。針對NPM(活化的細胞核仁)與NCL(細胞核仁的DFC區)的螢光染色結果顯示，相較於遠端子更內膜異位症，連續非典型的子宮內膜異位症的核醣體生合成較活化，而癌症組織的染色模式則更大。因此，本發明認為活化核醣體生合成，可驅動子宮內膜異位症轉為惡化。
RPs表現過量，有助於細胞轉型(cell transformation)，且可作為人類癌症的預後指標(prognostic markers)。過去結果顯示，核醣體P蛋白(ribosomal P protein)(RPLP0、RPLP1、RPLP2)的表現與婦科腫瘤的侵襲(invasiveness)及轉移(metastasis) 有關。雖然對於SNORD116功能的資訊有限，不過SNORD116是C/D box snoRNAs的其中一種，而C/D box snoRNA主要控制rRNAs的2'-O-核醣之甲基化，過往累積的證據指出，snoRNAs可繞過核醣體/致癌壓力的反應，控制細胞命運及致癌。
snoRNAs與RPs除了在核醣體組裝及蛋白質合成中具有關鍵功能外，它們也在細胞核仁外發揮新的作用，例如調整其他致癌基因或腫瘤抑制因子的活性及功能。rs 11614913-C的幾種下游的效應蛋白，包括RPS27、RPL26、RPS25及RPL26，在核醣體/致癌壓力的鼠雙微體基因2同源物(mouse double minute 2 homolog；MDM2)-p53反饋環(feedback loop)中都有參與。藉由例如化學性抑制第I型RNA聚合酶，破壞rRNA的合成、編輯及處理，使MDM2的分解並穩定/活化p53，導致細胞凋亡或老化。同理，抗C/D box snoRNAs的特定siRNAs藉由活化p53，可抑制細胞週期進行並減少腫瘤生長。隨著RNA編輯的新功能參與在癌症進程中，定位rDNA轉錄(targeting rDNA transcription)及細胞核仁是治療癌症可行的策略，對血液惡性腫瘤中也已顯示出成效。
值得一提的是，人類癌症對於抗第I型RNA聚合酶療法的敏感性具有差異，端視腫瘤蛋白53(tumor protein 53；TP53)的狀態。基因分析顯示，在子宮內膜異位症相關的卵巢癌中，TP53發生突變的機率不高(~10%)，在子宮內膜異位症進程中，如果發現TP53突變，則被認為 是末期基因事件。本發明指出，在子宮內膜異位症進程中，會促進核醣體生合成的活性，而且在轉為惡性過程中，核醣體生合成的活性會更明顯。這表示對於治療子宮內膜異位症及其相關的卵巢癌而言，抗第I型RNA聚合酶療法可能是有效的。另外，隨著與核醣體生合成相關的snoRNAs與RPs表現量調升，MIR196A2在rs11614913處的基因變異可用於預測子宮內膜異位症病患的指標。
補充說明的是，miRNA基因變異如何調升核醣體生合成相關的基因表現，特別是rs11614913處的C等位基因可形成更穩定且量更多的成熟miR196a2，目前仍然未知。另外，上述實施例選定的snoRNAs與RPs並不是基於目標位置與miRNA之互補程度，而推定直接定位於miR196a2處。有趣的是，近來研究提供證據，miRNAs可藉由直接或間接的機制，促進特定的基因調升。這些線索支持在miR196a2為主的核醣體生合成的調升中，可能還有其他因子參與。
綜言之，本發明雖以特定的SNP位點、特定種類的基因表現量、臨床疾病惡化程度之特定分類標準、特定的分析模式或特定的評估方式作為例示，說明本發明之生物標記、探針、套組及其用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的方法，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之生物標記、探針、套組及其用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的方法，亦可使用其他 SNP位點、其他種類的基因表現量、其他的惡化程度、其他分析模式或其他的評估方式進行。
由上述實施例可知，本發明之生物標記及其用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的方法，其優點在於建立生物標記與子宮內膜異位症之惡化狀態的相關性，藉由偵測生物樣本之生物標記，可準確判斷子宮內膜異位症惡化程度，進而應用於非侵入式定性判斷子宮內膜異位症惡化程度的探針及套組。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 偵測SNP位點rs1834306的探針(C_11483095_10_F)
<400> 2
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 偵測SNP位點rs2910164的探針(C_15946974_10)
<400> 3
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 偵測SNP位點rs7372209的探針(C_29123986_10)
<400> 4
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 偵測SNP位點rs895819的探針(C_11483095_10_F)
<400> 5
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 偵測SNP位點rs6505162的探針(C_11613678_10)
<400> 6

Claims (13)

  1. 一種用於偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記，包含：一單核苷酸多型性(SNP)位點，其中該SNP位點之SNP編號為rs11614913及/或rs1834306，且該SNP位點具有一基因型；以及與該SNP位點具有表型關聯性之至少一序列，其中該至少一序列是選自於由一DNA序列、該DNA序列編碼之一RNA序列、該RNA序列編碼之一胺基酸序列及其任意組合所組成之一族群，且該至少一序列包含SNORD基因及RP基因，且其中該SNP位點與該至少一序列係用於偵測該生物樣本之該子宮內膜異位症惡化程度。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述之用於偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記，其中該SNORD基因及該RP基因包含源自於核仁小RNA(small nucleolar RNA)C/D box 116(SNORD 116)基因、核醣體P蛋白(ribosomal P protein)2(RPLP2)基因、核醣體蛋白(ribosomal protein)L26(RPL26)基因、RPL38基因、核醣體蛋白(ribosomal protein)S25(RPS25)基因、RPS27基因及/或RPS28基因。
  3. 根據申請專利範圍第1項所述之用於偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記，其中該rs11614913之該基因型包含C等位基因、CC基因型或CT基因型。
  4. 根據申請專利範圍第1項所述之用於偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記，其中該rs1834306之該基因型包含A等位基因或AA基因型。
  5. 一種定性偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記表現量的方法，包含：建立一相關性模式，包含：偵測複數個參考生物樣本，以獲得複數個第一風險性資料，其中該些第一風險性資料包含複數個SNP位點及與該些SNP位點具有表型關聯性之複數個基因或複數個蛋白質的複數個第一表現量，該些SNP位點之SNP編號包括rs11614913及rs1834306，且該些基因或該些蛋白質是選自於下述所組成之一族群：SNORD 116、RPLP2、RPL26、RPL38、RPS25、RPS27以及RPS28；以及建立該些第一風險性資料與子宮內膜異位症之複數個惡化狀態之相關性，使該些SNP位點之一者對應於該些基因或該些蛋白質之一者、該些第一表現量之一者及/或該些惡化程度之一者；根據該相關性模式判斷一待測生物樣本之該生物標記表現量，包含：非侵入式偵測該待測生物樣本，以獲得複數個第二風險性資料，其中該些第二風險性資料包含該些單核苷酸多型性位點及與該些SNP位點具有表型關聯性之該些基因或該些蛋白質的複數個第二表現量；比對該些第二風險性資料與該些第一風險性資料，以判斷該些第二風險性資料是否與該些第一風險性資料之一者相符，並獲得對應之一顯著性差異值(P)；以及當該些第二風險性資料與該些SNP位點之該者及該些基因或該些蛋白質之該者相符，且對應之該顯著性差異值(P)小於0.05時，則判斷該待測生物樣本具有該些惡化程度之該者。
  6. 根據申請專利範圍第5項所述之定性偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記表現量的方法，其中該些參考生物樣本及該待測生物樣本包含離體(ex vivo)之一血液樣本或一組織樣本。
  7. 根據申請專利範圍第5項所述之定性偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記表現量的方法，其中該rs11614913對應之一基因型包含C等位基因、CC基因型或CT基因型。
  8. 根據申請專利範圍第5項所述之定性偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記表現量的方法，其中該rs1834306對應之一基因型包含A等位基因或AA基因型。
  9. 根據申請專利範圍第5項所述之定性偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記表現量的方法，其中該些第一表現量為調升的。
  10. 根據申請專利範圍第5項所述之定性偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記表現量的方法，其中該些惡化狀態包括該參考生物樣本之一臨床分期、一CA123含量以及一疼痛指數。
  11. 一種用於偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記表現量的探針，其特徵在於該探針用於偵測如申請專利範圍第1項至第4項任一項所述之生物標記，該生物標記包含一SNP位點以及與該SNP位點具有表型關聯性之至少一序列，該SNP位點之SNP編號為rs11614913及/或rs1834306，該至少一序列是選自於由一DNA序列、該DNA序列編碼之一RNA序列及/或該RNA序列編碼之一胺基酸序列的任意組合所組成之一族群，且該DNA序列包含SNORD基因及RP基因。
  12. 根據申請專利範圍第11項所述之用於偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記表現量的探針，其中該SNORD基因及該RP基因包含源自於SNORD116基因、RPLP2基因、RPL26基因、RPL38基因、RPS25基因、RPS27基因及/或RPS28基因。
  13. 一種用於偵測生物樣本之子宮內膜異位症惡化程度的生物標記表現量的套組，包含如申請專利範圍第11項至第12項任一項所述之探針。
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Liu, Xiaoyan, et al. "Association of SNPs in miR-146a, miR-196a2, and miR-499 with the risk of endometrial/ovarian cancer." Acta Biochim Biophys Sin 47.7 (2015): 564-566.
Liu, Xiaoyan, et al. "Association of SNPs in miR-146a, miR-196a2, and miR-499 with the risk of endometrial/ovarian cancer." Acta Biochim Biophys Sin 47.7 (2015): 564-566. https://researchoutput.ncku.edu.tw/zh/publications/up-regulation-of-ribosome-biogenesis-by-mir196a2-genetic-variatio(Up-regulation of ribosome biogenesis by genetic variation promotes endometriosis development and progression之前導摘要) Published – 2016/1/1 Ni, Jinhong, and Yangang Huang. "Role of polymorphisms in miR-146a, miR-149, miR-196a2 and miR-499 in the development of ovarian cancer in a Chinese population." Int J Clin Exp Pathol 9.5 (2016): 5706-5711. *
Ni, Jinhong, and Yangang Huang. "Role of polymorphisms in miR-146a, miR-149, miR-196a2 and miR-499 in the development of ovarian cancer in a Chinese population." Int J Clin Exp Pathol 9.5 (2016): 5706-5711.

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