JP6219556B2 - ベータ７インテグリンアンタゴニストを用いた消化管炎症性障害の治療評価のためのバイオマーカーの使用 - Google Patents

ベータ７インテグリンアンタゴニストを用いた消化管炎症性障害の治療評価のためのバイオマーカーの使用 Download PDF

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Description

本発明は、消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストのような、治療剤（又は医薬）の効果、効能、安全性、及び／又は投与量の評価方法に関する。特に、本発明は、消化管炎症性障害の治療のためのベータ７インテグリンアンタゴニストのような治療薬の効果、効能、安全性、及び／又は投与量の指標（「バイオマーカー」）として、患者の末梢血中の腸ホーミングリンパ球のレベル、腸ホーミングリンパ球における医薬の占有率のレベル、及び／又は腸ホーミングリンパ球におけるベータ７インテグリンレセプターのレベルの使用方法に関する。このような方法は、例えば、一又は複数のこれらのバイオマーカーを用いた、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた消化管炎症性障害の治療に対する患者の応答性の評価を含む。さらに、本発明は、医薬治療及び／又は投与計画、又は予後の設計のためのこのようなバイオマーカーの使用方法を提供する。
外部物質に対し体を保護するために、免疫系の細胞は末梢血を介して体内を循環し、リンパ節及び抗原が濃縮されている組織に移行する。概して、２つの異なるホーミング系、末梢ホーミングと粘膜ホーミングがあり、浸透性又は粘膜性の抗原に免疫を与える。消化管部位で最初に活性化される細胞は好ましくは粘膜組織と節に移行し得る。これに対して、末梢リンパ節において活性化された細胞は好ましくは末梢部位に移行する。(Butcher等, Adv Immunol (1999)) 循環している細胞は腸のリンパ節及び組織に高内皮細静脈（ＨＥＶ）を越えて浸出することによって入る。これはリンパ球の表面上の接着分子とＨＥＶ上のレセプター（アドレシン）の間の相互作用を介して起きる。(Butcher等, Adv Immunol (1999)
インテグリンは細胞接着から遺伝子調節までの多くの細胞プロセスに関与するα／βヘテロ二量体細胞表面レセプターである（Hynes, R.O., Cell 1992, 69, 11-25；Hemler, M.E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8, 365-368）。免疫系において、インテグリンは炎症プロセス中における白血球の輸送、接着及び浸潤に関連している（Nakajima, H等, J. Exp. Med. 1994, 179, 1145-1154）。インテグリンの差次的発現により、細胞の接着特性が調節され、異なるインテグリンが異なる炎症反応に関与する（Butcher, E.C.等, Science 1996, 272, 60-66）。ベータ７含有インテグリン（つまり、アルファ４ベータ７及びアルファＥベータ７）は、主として単球、リンパ球、好酸球、好塩基球及びマクロファージで発現するが、好中球では発現しない（Elices, M.J.等, Cell 1990, 60, 577-584）。アルファ４Ｅベータ７インテグリンの主要なリガンドは、内皮表面タンパク質粘膜アドレシン細胞接着分子(ＭＡｄＣＡＭ−１)及び血管細胞接着分子(ＶＣＡＭ−１)である（Makarem, R.等, J. Biol. Chem. 1994, 269, 4005-4011）。高内皮小静脈（ＨＥＶｓ）の炎症部位に発現しているＭＡｄＣＡＭ−１及び／又はＶＣＡＭ−１にアルファ４ベータ７が結合すると、白血球が内皮に強固に付着することが報告されており；この強固な結合過程の後に、細胞が炎症組織内に溢出する（Chuluyan, H.E.等, Springer Semin. Immunopathology 1995, 16, 391-404）。（上皮内リンパ球（ＩＥＬ）で発現する）アルファＥベータ７インテグリンの主要なリガンドは、Ｅカドヘリンであり、アルファＥベータ７含有細胞の上皮細胞への結合を容易にすることが報告されている。Ｅカドヘリンは腸へのホーミングにおいて機能しないことが報告されている一方、ＥカドヘリンとアルファＥベータ７の相互作用はリンパ球を腸上皮に結合させる役割を果たす。
ＩＢＤは大腸の炎症、自己免疫症状、及び幾つかの場合、小腸のグループである。ＩＢＤの主要な形態はクローン病（ＣＤ）と潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。自己免疫疾患として、ＩＢＤは腸の肥厚と細胞破壊につながる、消化管へのリンパ球への浸潤の増加によって特徴付けられる。リンパ球のホーミングを阻害することによってこの浸潤を阻害することで疾患に関連する炎症と細胞破壊を下方調整することができる。循環粘膜ホーミングリンパ球は腸管炎症の患者中で変化することが報告されている。（Meenan等Gut 1997; 40:241-246）アルファ４ベータ７、ＭＡｄＣＡＭ−１、又はＶＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体は結腸炎のような（Viney等, J. Immunol., 1996, 157: 2488-2497）腸管炎症性疾患及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ；Podalski, D. K., N. Eng. J. Med., 1991, 325:928-937; Powrie, F. 等, Ther. Immunol., 1995, 2:115-123）の動物モデルにおいて有効なモジュレーターであることが報告されている。
アルファＥベータ７に対するモノクローナル抗体の投与は、ＩＬ-２−／−マウス中の免疫誘導大腸炎を阻害し、改善することが報告されており、アルファＥベータ７（Ludviksson等, J Immunol. 1999, 162(8):4975-82）を発現する粘膜固有層のＣＤ４＋リンパ球の大腸局在に依存する炎症性腸疾患の開始と維持を示唆する。抗α４抗体（ナタリズマブ）は、ＣＤ（Sandborn等, N Engl J Med 2005;353:1912 25）の患者の治療に有効であることが報告されており、抗α４β７（ＭＬＮ−０２）はＵＣの患者に有効であることが報告されている（Feagan等, N Engl J Med 2005;352:2499-507）。これらの見解は治療標的としてα４β７を確認し、４αβ７とＭＡｄＣＡＭ−１の相互作用がＩＢＤの発症を媒介することを支持する。このように、ベータ７インテグリンのアンタゴニストは、ＩＢＤの治療における治療薬として非常に可能性がある。
所望の効果、安全性、及び／又は効能を有する治療を設計するために、ベータ７インテグリンアンタゴニストのような、治療薬を用いた治療への患者の応答性と予後を評価することは重要である。したがって、治療薬を用いた治療に対する患者の応答性を正確に予測し、及び／又は追跡し得るバイオマーカーの開発は望ましい。このような予測は、臨床試験と疾患治療における患者の有効な治療法の設計に不可欠である。
本発明は、消化管炎症性障害の患者の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストのような、治療剤（又は医薬）の効果、効能、安全性、及び／又は投与量の評価方法に関する。特に、本発明は、消化管炎症性障害の治療のためのベータ７インテグリンアンタゴニストのような治療薬の効果、効能、安全性、及び／又は投与量の指標（又はバイオマーカー）として、患者の末梢血中の腸ホーミングリンパ球のレベル、腸ホーミングリンパ球における医薬の占有率のレベル、及び／又は腸ホーミングリンパ球におけるベータ７インテグリンレセプターのレベルの使用方法に関する。このような方法は、例えば、一又は複数のこれらのバイオマーカーを用いた、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた消化管炎症性障害の治療に対する患者の応答性の評価を含む。さらに、本発明は、医薬治療及び／又は投与計画、又は予後の設計のためのこのようなバイオマーカーの使用方法を提供する。
幾つかの態様では、治療薬を用いた患者の治療前のバイオマーカーのレベルを、患者の治療の間及び／又は後の同じバイオマーカーのレベルと比較し、患者のこのバイオマーカーのレベルの変化（例えば、増加又は減少）が、患者の消化管炎症性障害の治療のための、例えば、ベータ７インテグリンアンタゴニストのような、治療剤の効果、効能、安全性、及び／又は予後を示す。さらに、このような本発明の方法は、患者の消化管炎症性障害の治療のための医薬治療又は投与計画を設計するために使用し得る。
一態様では、本発明は、患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの効能を決定する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が、患者の消化管炎症性障害の治療のためのアンタゴニストの効能を示す方法に関する。
別の態様では、本発明は、消化管炎症性障害を有する患者のインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する応答性を予測する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が前記アンタゴニストを用いた治療への前記患者の応答性を示す方法に関する。
更に別の態様では、本発明は、患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの投与量を決定する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与又は投与計画を用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することに基づいて、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与量を調節することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が、患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの投与又は投与計画に対する効能又は応答性を示す方法に関する。
別の態様では、本発明は、患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの投与計画を決定する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与又は投与計画を用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することに基づいて、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与計画を調節することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が、患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの投与又は投与計画に対する効能又は応答性を示す方法に関する。
一実施態様では、バイオマーカーの量の変化は増加である。
別の実施態様では、バイオマーカーの量の変化は減少である。
更に別の実施態様では、サンプルは患者の末梢血サンプルである。
一実施態様では、インテグリンベータ７アンタゴニストを受容した後に前記患者の血液サンプル中のバイオマーカーの量は、第一のインテグリンベータ７アンタゴニストの投与の１００日以内に測定される。
別の実施態様では、インテグリンベータ７アンタゴニストを受容した後に前記患者の血液サンプル中のバイオマーカーの量は、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与の約５０日以内に測定される。
更に別の実施態様では、インテグリンベータ７アンタゴニストを受容した後に前記患者の血液サンプル中のバイオマーカーの量は、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与の約２４時間以内に測定される。
一実施態様では、消化管炎症性障害は、炎症性腸疾患である。
更なる実施態様では、炎症性腸疾患は、クローン病（ＣＤ）「又は」潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。
別の実施態様では、インテグリンベータ７アンタゴニストは、抗ベータ７インテグリン抗体である。
別の実施態様では、前記患者はヒトである。
一実施態様では、前記変化した量は、前記バイオマーカーの量の、少なくとも約３０％、約５０％、約１倍、又は約３倍の増加である。
一実施態様では、抗ベータ７インテグリン抗体は、約１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの量で投与される。
更なる実施態様では、前記量は、５ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇである。
一実施態様では、治療は更に一又は複数の更なる医薬の有効量の投与を更に含む。
更なる実施態様では、更なる医薬は、免疫抑制剤、疼痛制御剤、止瀉剤、抗生物質、又は一又は複数の前記薬剤の組み合わせである。
より更なる実施態様では、前記免疫抑制剤は、スルファサラジン、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、メトロダゾ−ル、シプロフロキサシン、アザチオプリン又は６−メルカプトプリンである。
別の実施態様では、前記更なる医薬は、別の抗ベータ７インテグリン抗体である。
一実施態様では、抗ベータ７インテグリン抗体は前記患者に非経口投与する。
更なる実施態様では、抗ベータ７インテグリン抗体は、前記患者に静脈内及び／又は皮下投与する。
一実施態様では、前記抗ベータ７インテグリン抗体は、少なくとも毎１、２、３、４、５、６、８、又は１２週毎に１回の頻度で投与する。
更なる実施態様では、前記ベータ７インテグリン抗体は週毎に投与する。
別の実施態様では、前記抗ベータ７抗体は、少なくとも１、２、４、６、８、１２、２４、３６、又は５２週間投与する。
一実施態様では、抗体はモノクローナルである。
別の実施態様では、前記抗体は、キメラ、ヒト又はヒト化抗体である。
別の実施態様では、前記抗体は抗体断片である。
一実施態様では、前記抗体はヒトベータ７インテグリンサブユニットと二次インテグリンサブユニット及び／又はインテグリンリガンドの相互作用を阻害する。
一実施態様では、二次インテグリンサブユニットは、アルファ４インテグリンサブユニットであり、ここで、リガンドはＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ又はフィブロネクチンである。
一実施態様では、アルファ４インテグリンサブユニットはヒト由来である。
一実施態様では、二次インテグリンサブユニットは、アルファＥインテグリンサブユニットであり、ここでリガンドはＥカドヘリンである。
一実施態様では、リガンドはヒト由来である。
一実施態様では、アルファＥインテグリンサブユニットはヒト由来である。
別の実施態様では、抗ベータ７インテグリン抗体は３個の重鎖高頻度領域（ＨＶＲ−Ｈ１−Ｈ３）配列及び３個の軽鎖高頻度領域（ＨＶＲ−Ｌ１−Ｌ３）配列を含み、ここで１、２、３、４、５又は６個の高頻度領域（ＨＶＲ）は
（ｉ）Ａ１−Ａ１１がＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号：１）である、配列Ａ１−Ａ１１を含むＨＶＲ−Ｌ１；
（ｉｉ）Ｂ１−Ｂ８がＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２）である、配列Ｂ１−Ｂ８を含むＨＶＲ−Ｌ２；
（ｉｉｉ）Ｃ１−Ｃ９がＱＱＧＮＳＬＬＰＮＴ（配列番号：３）である配列Ｃ１−Ｃ９を含むＨＶＲ−Ｌ３；
（ｉｖ）Ｄ１−Ｄ１０がＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号：４）である配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１；
（ｖ）Ｅ１−Ｅ１７がＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：５）である配列Ｅ１−Ｅ１７を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び
（ｖｉ）Ｆ１−Ｆ１１がＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：６）である配列Ｆ１−Ｆ１１であるＨＶＲ−Ｈ３
からなる群から選択される。
更に別の実施態様では、抗体がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群から選択される６個の高頻度領域（ＨＶＲ）を含み、ここで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここで、Ａ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号：１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号：７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号：８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号：９）又は配列番号：１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、及びＲからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ５はＳ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、及びＱからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ、及びＳからなる群から選択され；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここで、Ｂ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２）；ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２０、又はＸａａＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２１、ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）、又は配列番号：２、２０又は２１の変異体であり、アミン酸Ｂ１がＫ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｒ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ及びＸａａ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）、及び／又はアミノ酸Ｂ４がＳ及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ、及びＲからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ７はＩ、Ｖ、Ｅ及びＫからなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここで、Ｃ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号：３）又は配列番号：３の変異体であり、ここで、アミノ酸Ｃ８がＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、及びＹからなる群から選択され；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号：４）であり；
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここで、Ｅ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：５）であるか、又は配列番号：５の変異体であり、ここで、アミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ、及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１３はＰ、Ｈ、Ｄ、及びＡからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１７はＳ及びＧからなる群から選択され；
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここで、Ｆ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１９）であるか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここで、Ｆ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１６）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１７）、又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１８）、又は配列番号：６、１６、１７、１８、又は１９の変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２がＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、及び／又はアミン酸Ｆ１１がＦ及びＹからなる群から選択される。
別の実施態様では、抗体は更にフレームワークを含み、ここで、フレームワーク位置７１のアミノ酸はＲ又はＡであり、フレームワーク位置７３のアミノ酸はＮ又はＴであり、フレームワーク位置７８のアミノ酸はＦ又はＡ又はＬである。
別の実施態様では、抗体は更に位置７１、７３及び／又は７８の置換を含む重鎖ヒトサブグループＩＩＩ重鎖コンセンサスフレームワーク配列を更に含む。
一実施態様では、置換はＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ、Ｌ７８Ａ又はＬ７８Ｆである。
別の実施態様では、配列ＨＶＲ−Ｈ２位置Ｅ１−Ｅ１及びＨＶＲ−Ｈ３位置Ｆ１−Ｆ１１の間のフレームワーク配列は、ＨＦＲ３−１−ＨＦＲ３−３１であり、ここで、ＨＦＲ３−６はＡ又はＲであり、ＨＦＲ−３−８はＮ又はＴであり、ＨＦＲ３−１３はＬ又はＡ又はＦである。
更に別の実施態様では、重鎖フレームワーク位置７１はアミノ酸Ｒ又はＡを含み、及び／又は重鎖フレームワーク位置７３はＴ又はＮを含み、及び／又は重鎖フレームワーク位置７８はＦ又はＡ又はＬを含む。
例示的な実施態様では、抗体は３個の重鎖高頻度領域（ＨＶＲ−Ｈ１−Ｈ３）配列と３個の軽鎖高頻度領域（ＨＶＲ−Ｌ１−Ｌ３）配列を含み、ここで、
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：９を含み；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号：２を含み；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号：３を含み；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号：４を含み；
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号：５を含み；及び
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号：６又は配列番号：１６又は配列番号：１７又は配列番号：１９を含む。
更に例示的な実施態様では、前記ヒト化抗体は配列番号：２４の軽鎖可変領域配列、及び配列番号：２５の重鎖可変領域配列を含む。
一実施態様では、それぞれ、前記抗体は軽鎖及び重鎖可変配列配列番号：１０及び配列番号：１１に結合する。
一態様では、本発明は前記候補医薬を用いた治療に応答して非ヒト検体の末梢血におけるバイオマーカーの量が効果的に増加する投与量に基づく患者の有効な投与量の決定を含む、消化管炎症性障害と診断された患者の候補医薬を用いた治療の設計方法に関する。
一実施態様では、前記非ヒト検体はサルである。
一態様では、本発明は健康な個体と比較した場合、前記患者の減少した割合が、疾患の予後を示す、前記患者の血液サンプル中の腸ホーミングリンパ球の量と末梢ホーミングリンパ球の量の割合と健康な個体の血液サンプル中の腸ホーミングリンパ球の量と末梢ホーミングリンパ球の量の割合を比較することを含む患者の炎症性腸疾患の予後を予測する方法に関する。
別の態様では、本発明は前記リンパ球を、配列番号：１０の軽鎖可変領域配列と配列番号：１１の重鎖可変配列を含む抗体と同じエピトープに結合する、単離抗体に結合させることを含む、アルファＥベータ７インテグリンを発現するリンパ球及びアルファ４ベータ７インテグリンを発現するリンパ球及びアルファＥベータ７及びアルファ４ベータ７の両者を発現するリンパ球を含むリンパ球の個体群の同定方法に関する。
一実施態様では、前記リンパ球は消化管炎症性障害と診断された患者の末梢血にある。
別の実施態様では、前記リンパ球は消化管炎症性障害と診断された患者のリンパ節及び腸組織にある。
【００２４】
【図１】図１はカニクイザル末梢血中のＣＤ４＋リンパ球サブユニットを示す。
【図２】図２はカニクイザルに対する５、１５、又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の静脈内投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後の末梢血中のグループ平均（±ＳＤ）ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図３】図３はカニクイザルに対する５、１５、又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の皮下投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後の末梢血中のグループ平均（±ＳＤ）ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図４】図４はカニクイザルに対する５、１５、又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の静脈内投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後の末梢血中のグループ平均（±ＳＤ）ＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図５】図５はカニクイザルに対する５、１５、又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の皮下投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後の末梢血中のグループ平均（±ＳＤ）ＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図６】図６はカニクイザルに対する５、１５、又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の静脈内投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後の末梢血中のグループ平均（±ＳＤ）ＣＤ４５ＲＡ−β７中間体ＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図７】図７はカニクイザルに対する５、１５、又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の皮下投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後の末梢血中のグループ平均（±ＳＤ）ＣＤ４５ＲＡ−β７中間体ＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図８】図８はｒｈｕＭＡｂ ベータ７−４の週毎の２５ｍｇ／ｋｇ ｒｈｕＭＡｂ ベータ７又はビヒクルのＩＶ投与後の末梢血メモリー／エフェクター「腸ホーミング」ＣＤ４５ＲＡ−ベータ７高ＣＤ４＋リンパ球カウントの一時的な増加を示す。
【図９】図９はＣＤ４５Ｒ−ベータ７高メモリー／エフェクターＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４＋末梢血リンパ球上の血清ｒｈｕＭＡｂ ベータ７濃度（マイクログラム／マイクロリッター）とβレセプターの占有率を示す。
【図１０】図１０（Ａ−Ｄ）は末梢血の「腸ホーミング」ＣＤ４５ＲＡ−β７高メモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球の一時的な増加がＣＤ４５ＲＡ−β７高メモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球上のβ７レセプターの占有率と関係があることを示す。
【図１１】図１１はｒｈｕＭＡｂベータ７がリンパ球の炎症大腸へのインビボホーミングを阻害するが、ＣＤ４５ＲＢ高−示す。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは以下：軽鎖ヒトサブグループカッパＩコンセンサス配列（図１２Ａ、配列番号：１２）、重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサス配列（図１２Ｂ、配列番号：１３）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変軽鎖（図１２Ａ、配列番号：１０）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変重鎖（図１２Ｂ、配列番号：１１）、及びヒト化抗体変異体：ヒト化ｈｕ５０４グラフト可変軽鎖（図１２Ａ、配列番号：１４）、ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変重鎖（図１２Ｂ、配列番号：１５）、変異体ｈｕ５０４．５、ｈｕ５０４−１６、及びｈｕ５０４−３２ （ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフトからのアミノ酸変異）は、変異体ｈｕ５０４．５、ｈｕ５０４．１６、及びｈｕ５０４．３２（配列番号：２５）について、図１２Ａ（軽鎖）（登場の順にそれぞれ配列番号２２から２４）及び図１２Ｂ（重鎖）で示される、の可変軽鎖及び重鎖の配列アラインメントを示す。
【図１３】図１３は１２のビヒクルの静脈内又は皮下投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−ベータ７高メモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図１４】図１４は１２の５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７の静脈内投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−ベータ７高メモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図１５】図１５は１２の１５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７の静脈内投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−ベータ７高メモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図１６】図１６は１２の５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７の静脈内投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−ベータ７高メモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図１７】図１７は１２の１５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７の皮下投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−ベータ７高メモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図１８】図１８は１２の５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７の皮下投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−ベータ７高メモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球（絶対カウント、％ＢＬ）を示す。
【図１９】図１９は５、１５、又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の静脈内投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球（ＭＯＥＦ［％ベースライン］、グループ平均±ＳＤ）を示す；ＭＯＥＦ＝等しい蛍光の分子。
【図２０】図２０は１５又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の皮下投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球（ＭＯＥＦ［％ベースライン］、グループ平均±ＳＤ）を示す；ＭＯＥＦ＝等しい蛍光の分子。
【図２１】図２１は５、１５、又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の静脈内投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−β７中間体ＣＤ４＋リンパ球（ＭＯＥＦ［％ベースライン］、グループ平均±ＳＤ）を示す；ＭＯＥＦ＝等しい蛍光の分子。
【図２２】図２２は１５又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ ベータ７の１２の皮下投与又はビヒクルの１２の静脈内及び皮下投与後のカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ−β７中間体ＣＤ４＋リンパ球（ＭＯＥＦ［％ベースライン］、グループ平均±ＳＤ）を示す；ＭＯＥＦ＝等しい蛍光の分子。
【図２３】図２３はカニクイザルへの５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７の４の週毎のＩＶボーラス投与後のｒｈｕＭＡｂ β７の平均（±ＳＤ）血清濃度を示す。
【図２４】図２４はカニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７の４の週毎のＩＶボーラス投与後の回収動物からの実際の平均（±ＳＤ）血清濃度及びｒｈｕＭＡｂ β７のモデル予測血清濃度を示す。
【図２５】図２５はカニクイザル末梢血中のＣＤ４ Ｔ細胞サブセットを示す。
【図２６】図２６はカニクイザルへのビヒクル又は５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７の４の週毎のＩＶボーラス投与後の平均（±ＳＤ）絶対末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋Ｔ細胞カウント（プレ投与ベースラインのパーセンテージとして表される）を示す。
【図２７】図２７はカニクイザルへのビヒクル又は５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７の４の週毎のＩＶボーラス投与後の平均（±ＳＤ）絶対末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７中間体ＣＤ４＋Ｔ細胞カウント（プレ投与ベースラインのパーセンテージとして表される）を示す。
【図２８】図２８はカニクイザルへのビヒクル又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７の４の週毎のＩＶボーラス投与後の個別の絶対末梢血ＣＤ４５ＲＡ-β７高ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントを示す。
【図２９】図２９はカニクイザルへのビヒクル又は５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７の４の週毎のＩＶボーラス投与後の平均（±ＳＤ）絶対末梢血リンパ球カウント（プレ投与ベースラインのパーセンテージとして表される）を示す。
【図３０】図３０はカニクイザルへの各グループへの５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７の４の週毎のＩＶボーラス投与後の平均（±ＳＤ）絶対末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞カウント（プレ投与ベースラインのパーセンテージとして表される）を示す。
【図３１】図３１はカニクイザルへの各グループへの５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７の４の週毎のＩＶボーラス投与後の平均（±ＳＤ）絶対末梢血ＣＤ２０＋Ｂ細胞カウント（プレ投与ベースラインのパーセンテージとして表される）を示す。
【図３２】図３２Ａは４の週毎に投与される２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７のＩＶボーラス投与後の個別のカニクイザル中の時間に対するｒｈｕＭＡｂ β７の血清濃度と非占有末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係（動物２３）を示す。
図３２Ｂ は４の週毎に投与される２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７のＩＶボーラス投与後の個別のカニクイザル中の時間に対するｒｈｕＭＡｂ β７の血清濃度と非占有末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係（動物２４）を示す。
図３２Ｃは４の週毎に投与される２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７のＩＶボーラス投与後の個別のカニクイザル中の時間に対するｒｈｕＭＡｂ β７の血清濃度と非占有末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係（動物２５）を示す。
図３２Ｄは４の週毎に投与される２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７のＩＶボーラス投与後の個別のカニクイザル中の時間に対するｒｈｕＭＡｂ β７の血清濃度と非占有末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係（動物２６）を示す。
【図３３】図３３は４の週毎に投与される２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７のＩＶボーラス投与後の個別のカニクイザル中の時間に対するｒｈｕＭＡｂ β７の血清濃度と非占有末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係を示す。
【図３４】図３４Ａは４の週毎に投与される２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７のＩＶボーラス投与後の個別のカニクイザル中の時間に対する絶対β７高−発現メモリー／エフェクター（ＣＤ４５ＲＡ−）ＣＤ４＋Ｔ細胞と非占有末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係（動物２３）を示す。
図３４Ｂは４の週毎に投与される２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７のＩＶボーラス投与後の個別のカニクイザル中の時間に対する絶対β７高−発現メモリー／エフェクター（ＣＤ４５ＲＡ−）ＣＤ４＋Ｔ細胞と非占有末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係（動物２４）を示す。
図３４Ｃは４の週毎に投与される２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７のＩＶボーラス投与後の個別のカニクイザル中の時間に対する絶対β７高−発現メモリー／エフェクター（ＣＤ４５ＲＡ−）ＣＤ４＋Ｔ細胞と非占有末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係（動物２５）を示す。
図３４Ｄは４の週毎に投与される２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂ β７のＩＶボーラス投与後の個別のカニクイザル中の時間に対する絶対β７高−発現メモリー／エフェクター（ＣＤ４５ＲＡ−）ＣＤ４＋Ｔ細胞と非占有末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係（動物２６）を示す。
【図３５】図３５は平均絶対末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントを示す。
【図３６】図３６は平均絶対末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ８＋Ｔ細胞カウントを示す。
【図３７】図３７は平均絶対末梢血ＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントを示す。
【図３８】図３８は平均絶対末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７中間体ＣＤ８＋Ｔ細胞カウントを示す。
【図３９】図３９はｒｈｕＭＡｂ β７の血清濃度と利用可能なβ７−発現末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係を示す。
【図４０】図４０はｒｈｕＭＡｂ β７の血清濃度と利用可能なβ７−発現末梢血ＣＤ８＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係を示す。
【発明を実施するための形態】
Ｉ．定義
ここで使用する場合、患者の応答又は患者の応答性に関して、「予測」又は「予測する」なる用語は、患者が薬剤又は一連の薬剤に対して有利又は不利に応答する可能性を意味する。一実施態様では、予測はその応答の程度に関する。一実施態様では、予測は、例えば特定の治療的薬剤、例えば抗ベータ７インテグリン抗体による疾患の再発を伴わない一定期間の治療の後に患者が生存しているか又は改善しているかどうか、及び／又はその可能性に関する。例えば、本発明の予測方法は、任意の特定の患者のために最も好適な治療様式を選択することによって、治療決定を臨床的に行うことができる。本発明の予測方法は、患者が、治療投薬計画、例えば特定の治療剤や組み合わせの投与、外科的介入、化学療法などを含む特定の治療投薬計画に有利に応答するかどうか、又は治療投薬計画の後に患者が長期に生存しているかどうかを予測する際の有用なツールである。
ここで使用される「治療」とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。治療の所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。一部の実施態様では、本発明の抗体は、疾病又は疾患の進行を遅延化させるために使用される。
「治療法」は、第２の医薬の添加を伴うか又は伴わない、投与量、投与の頻度、又は治療の持続を意味する。
「有効な治療法」は、患者を受ける患者に有利な応答を与える治療法を意味する。
「治療の修正」は、投与量の変化、投与頻度、又は治療の持続、及び／又は第２の医薬を含む治療法の変化を意味する。
「患者応答」は、限定するものではないが以下のものを含む患者に利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価できる。（１）緩徐化及び完全な増殖停止を含む、ある程度の腫瘍増殖の阻害、（２）腫瘍細胞数の減少、（３）腫瘍サイズの減少、（４）近接する末梢器官及び／又は組織への腫瘍細胞浸潤の阻害（すなわち減少、緩徐化又は完全な停止）、（５）転移の阻害（すなわち減少、緩徐化又は完全な停止）、（６）必ずではないが腫瘍の退縮又は拒絶が生じ得る抗腫瘍免疫応答の亢進、（７）腫瘍と関連する一又は複数の症状の、ある程度の軽減、（８）治療後の生存期間の増加、及び／又は（９）治療後の特定の時点での死亡率の減少。「応答性」なる用語は完全寛解（ＣＲ）及び一部寛解（ＰＲ）を含む、測定可能な応答を意味する。
「完全寛解」又は「ＣＲ」は、治療に応答した癌のすべての徴候の消滅を意味する。これは、癌が治癒したことを常に意味するものではない。
「一部寛解」又は「ＰＲ」は、治療に応答して、炎症の重傷度の少なくとも５０％の減少を意味する。
患者のインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する「有益な応答」及び類似の表現は臨床又は抗ベータ７インテグリン抗体のようなアンタゴニストを用いた治療の結果から又は結果としての胃腸炎に罹患するリスクがあるか又は罹患した患者に与えた治療の利点を意味する。このような利点は細胞又は生物学的応答、完全応答、部分応答、安定疾患（進行又は再発がない）、又はアンタゴニストを用いた治療の結果から又は結果としての患者の後の再発を伴う応答を含む。
患者の応答性が治療の過程において減少しない場合、「患者は治療に対する応答性を維持する。」
「診断」なる用語は、分子又は病的状態、疾患又は状態の同定又は分類を指すために用いられる。例えば、「診断」は特定のタイプの消化管炎症性障害、及びより具体的には、組織／臓器環境によるか、又は他の特徴（例えば、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対するような、治療への応答性によって特徴付けられる患者の亜集団）による、消化管炎症性障害の特定のサブタイプの分類の同定を意味してもよい。
本明細書中で用いる「予後」なる用語は、例えば、消化管炎症性障害の再発、再燃、及び薬剤耐性を含む疾患症状の可能性の予測を意味する。
本明細書中で用いる「試料」なる用語は、例えば物理的、生化学的、化学的及び／又は生理学的特徴に基づいて特性を示す又は同定される、細胞実体及び／又は他の分子実体を含有する対象とする被検体から得られる、又は対象とする被検体由来の組成物を指す。例えば、「疾患試料」なる表現及びこの変形は、特徴付けられている細胞実体及び／又は分子実体を含むことが予測される、又はそうであることが知られている対象の被検体から得た任意の試料を指す。試料は関心のある対象のための組織又は対象の末梢血管から得てもよい。
「ベータ７インテグリンアンタゴニスト」又は「ベータ７アンタゴニスト」は一又は複数の生物学的活性を阻害する任意の分子又はベータ７インテグリンに関連する一又は複数のベータ７インテグリンの結合の阻害を意図する。本発明のアンタゴニストはベータ７関連効果の一又は複数の態様を調節するために使用してもよく、限定されるものではないが、アルファ４インテグリンサブユニットとの関連、アルファＥインテグリンサブユニットとの関連、アルファ４ベータ７インテグリンのＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１又はフィブロネクチンへの結合、アルファＥベータ７インテグリンのＥ-カドヘリンへの結合を含む。これらの効果は、ベータ７サブユニット又はアルファ４ベータ７又はアルファＥベータ二量体インテグリンへのリガンドの結合阻害を含む任意の生物学的に関連する機構によるか、及び／又は二量体のインテグリンの形成が阻害されるようにアルファとベータインテグリンサブユニットとの結合を阻害することによって調節され得る。本発明の一実施態様では、ベータ７インテグリン抗体は、ヒト化抗ベータ７インテグリン抗体、及びより具体的には組換えヒト化モノクローナル抗ベータ７抗体（又はｒｈｕＭＡｂベータ７）である。幾つかの実施態様では、本発明の抗ベータ７抗体は、アルファＥインテグリンサブユニットと関連するアルファ４インテグリンサブユニットへのベータ７サブユニットの結合、アルファ４ベータ７インテグリンのＭＡｄＣＡＭ、ＶＣＡＭ-１又はフィブロネクチンへの結合及びアルファＥベータ７インテグリンのＥ-カドヘリンへの結合を阻害又は阻止する抗インテグリンベータ７拮抗抗体である。
「ベータ７サブユニット」又は「．ベータ．７サブユニット」とはヒトβ７インテグリンサブユニットを意味する（Ｅｒｌｅら、（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１１００９−１１０１６）。ベータ７サブユニットはアルファ４インテグリンサブユニット、例えばヒトα４サブユニットと会合する（Ｋｉｌｇｅｒ ａｎｄ Ｈｏｌｚｍａｎｎ（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３：３４７−３５４）。アルファ４ベータ７インテグリンは成熟リンパ球の大部分、並びに、一部集団の胸腺細胞、骨髄細胞及び肥満細胞において発現される。（Ｋｉｌｓｈａｗ ａｎｄ Ｍｕｒａｎｔ（１９９１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２５９１−２５９７；Ｇｕｒｉｓｈら、（１９９２）１４９：１９６４−１９７２；及びＳｈａｗ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３５）。ベータ７サブユニットはまたアルファＥサブユニット、例えばヒトアルファＥインテグリンサブユニットとも会合する（Ｃｅｐｅｋ，Ｋ．Ｌ．，ら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３４５９）。アルファＥベータ７インテグリンは腸上皮内リンパ球（ｉＩＥＬ）上に発現される（Ｃｅｐｅｋ，Ｋ．Ｌ．（１９９３）上掲）。
「アルファＥサブユニット」又は「アルファＥインテグリンサブユニット」又は「．アルファＥ．サブユニット」又は「．アルファ．Ｅインテグリンサブユニット」又は「ＣＤ１０３」とは上皮内リンパ球上のベータ７インテグリンに会合することがわかっているインテグリンサブユニットを意味し、このアルファＥベータ７インテグリンはＥ−カドヘリンを発現する腸上皮へのｉＥＬの結合を媒介する（Ｃｅｐｅｋ，Ｋ．Ｌ．ら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：３４５９；Ｓｈａｗ，Ｓ．Ｋ．ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．（１９９５）Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３５）。
「ＭＡｄＣＡＭ」又は「ＭＡｄＣＡＭ−１」は本発明の文脈においては互換的に使用され、そして蛋白粘膜アドレシン細胞接着分子１を意味し、これは短い細胞質テール部及び３つの免疫グロブリン様ドメインよりなる細胞外配列を含む１本鎖ポリペプチドである。マウス、ヒト及びマカクのＭＡｄＣＡＭ−１に関するｃＤＮＡがクローニングされている（Ｂｒｉｓｋｉｎ，ら、（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６３；４６１−４６４；Ｓｈｙｊａｎら、（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：２８５１−２８５７）。
「ＶＣＡＭ−１」又は「血管細胞接着分子−１」、「ＣＤ１０６」とは、活性化された内皮上に発現されるアルファ４ベータ７及びアルファ４ベータ１のリガンドを意味し、炎症中の白血球の結合及び遊出のような内皮白血球相互作用において重要である。
「ＣＤ４５」はタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのタンパク質を意味する。ＰＴＰは細胞増殖、分化、分裂周期、及び癌化を含む種々の細胞過程を制御するシグナル分子として知られている。このＰＴＰは細胞外ドメイン、１つの膜透過ドメインセグメント及び２つのタンデムな細胞室内触媒ドメインを含み、したがってレセプタータイプのＰＴＰに属する。この遺伝子は造血細胞において特異的に発現している。それは抗原レセプター複合体の構成要素との直接相互作用によるか又は抗原レセプターシグナルのために必要な種々のＳｒｃファミリーキナーゼを活性化することによって機能する。このＰＴＰはまたＪＡＫキナーゼを抑制し、したがってサイトカインレセプターシグナルのレギュレーターとして機能する。４つのオルタナティブスプライスされた、別のアイソフォームをコードするこの遺伝子の翻訳異性体が報告されている。（Tchilian EZ, Beverley PC (2002). "CD45 in memory and disease." Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 50 (2): 85-93. Ishikawa H, Tsuyama N, Abroun S, 等(2004)。 "Interleukin-6, CD45 and the src-kinases in myeloma cell proliferation." Leuk. Lymphoma 44 (9):1477-81.）。
種々のＣＤ４５のアイソフォームが存在している：ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＡＢ、ＣＤ４５ＲＡＣ、ＣＤ４５ＲＢＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５Ｒ（ＡＢＣ）。ＣＤ４５はまた高度に糖化されている。ＣＤ４５Ｒは最長のタンパク質であり、Ｔ細胞から単離された場合、２００ｋＤａに移動する。Ｂ細胞はまたより重い糖化を伴うＣＤ４５Ｒを発現し、分子量２２０ｋＤａの分子量になり、したがってＢ２２０と名付けられている；２２０ｋＤａのＢ細胞アイソフォーム。Ｂ２２０発現はＢ細胞に限らず、活性化Ｔ細胞上、樹状細胞のサブユニット上及び他の抗原提示細胞でもまた発現され得る。Stanton T, Boxall S, Bennett A,等 (2004)。"CD45 variant alleles: possibly increased frequency of a novel exon 4 CD45 polymorphism in HIV seropositive Ugandans." Immunogenetics 56 (2): 107-10。
「腸ホーミングリンパ球」は腸リンパ節及び組織に選択的にホーミングするが、末梢リンパ節及び組織にホーミングしないことを特徴とするリンパ球のサブグループを意味する。このリンパ球のサブグループは限定されるものではないが、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ及びベータ７の組み合わせを含む複数の細胞表面分子の組み合わせのユニークな発現パターンとして特徴付けられる。典型的には、少なくとも末梢血ＣＤ４５リンパ球の２つのサブセットはＣＤ４５Ｒ及びベータ７、ＣＤ４５ＲＡ−β７高、及びＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋細胞のマーカーに基づいて細分される。ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋細胞は腸リンパ節及び組織に選択的にホーミングする（Rott 等1996; Rott 等 1997; Williams 等1998; Rose 等1998; Williams and Butcher 1997; Butcher 等1999）。腸ホーミングリンパ球はしたがってフローサイトメトリーアッセイにおいてＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋として同定される明確なリンパ球のサブグループである。このリンパ球の集団を同定する方法は当該分野でよく知られており本出願の実施例においても詳細に開示される。
ここで表面マーカーに関して使用される場合、記号「＋」は細胞表面マーカーのポジティブの発現を示す。例えば、ＣＤ４＋リンパ球はその細胞の表面上に発現するＣＤ４を有するリンパ球の集団を示す。
ここで表面マーカーに関して使用される場合、記号「−」は細胞表面マーカーのネガティブの発現を示す。例えば、ＣＤ４５ＲＡ−リンパ球はその細胞の表面上に発現するＣＤ４５ＲＡを有さないリンパ球の集団を示す。
ここで細胞表面マーカーの発現に関して使用される場合、記号「低」はリンパ球上の細胞表面マーカーの比較的低レベルの発現を示し、一方で「高」はリンパ球上の細胞表面マーカーの比較的高レベルの発現を示す。フローサイトメトリーにおいて、β７高の強度はβ７低の少なくとも約１０又は１００倍である。したがって、例示的な実施態様でここに提供されるように、ＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋及びＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球はＸ軸がＣＤ４５ＡＲの発現強度でありＹ軸がベータ７の発現強度であるフローサイトメトリー解析のドットプロット又はヒストグラムの離れた部位に位置する。
「末梢ホーミングリンパ球」は末梢リンパ節及び組織にホーミングするが、腸リンパ節及び組織にホーミングしない特徴を有するリンパ球のサブグループを意味する。例示的な実施態様では、上で説明した通り、末梢ホーミングリンパ球はフローサイトメトリーアッセイにおいてＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋細胞として同定されるリンパ球の明確なグループである。リンパ球のこのグループを同定する方法は当該分野で知られており本出願において詳細に開示されている。
バイオマーカーの「量」又は「レベル」は当該分野で知られる方法を用いて決定することができる。例えば、例示的な実施態様では、腸ホーミングリンパ球の「量」又は「レベル」は、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する患者の応答性に関連するが、生物学的サンプル中、好ましくは末梢血サンプル中で検出できるレベルである。腸ホーミングリンパ球の量はフローサイトメトリー解析のような当業者に知られている方法によって定量でき、本発明に開示され得る。
いくつかの実施態様では、バイオマーカーの「上昇した」又は「増加した」量又はレベルはバイオマーカーの参照／比較量と比較したものである。増加は参照又は比較量の値の関数として、好ましくは約１０％より大きく、好ましくは約３０％より大きく、好ましくは約５０％より大きく、好ましくは約１００％より大きく、好ましくは約３００％より大きい。例えば、参照又は比較量は治療前のバイオマーカーの量でもよく、より好ましくはベースライン又は投与前の量でもよい。
例えば、一実施態様では、腸ホーミングリンパ球の「量」又は「レベル」は、当業者が前記量によって測定される生物学的に特徴のある文脈において統計的に有意な増加と考えるようなリンパ球数の有意な増加を示す。増加は好ましくは、リンパ球の参照／比較量の値の関数として、約１０％よりも大きく、好ましくは約３０％より大きく、好ましくは約５０％より大きく、好ましくは約１００％より大きく、好ましくは約３００％より大きい。
いくつかの実施態様では、バイオマーカーの「減少した」量又はレベルはバイオマーカーの参照／比較量と比較したものである。減少は参照又は比較量の値の関数として、好ましくは約１０％より小さく、好ましくは約３０％より小さく、好ましくは約５０％より小さく、好ましくは約１００％より小さく、好ましくは約３００％より小さい。例えば、参照又は比較量は治療前のバイオマーカーの量でもよく、より好ましくはベースライン又は投与前の量でもよい。.
例えば、「腸ホーミングリンパ球の量を効果的に増加する治療」は、当業者が前記量によって測定される生物学的に特徴のある文脈において統計的に有意な増加と考えるようなリンパ球数の有意な増加を示す。増加は好ましくは、リンパ球の参照／比較量の値の関数として、約１０％よりも大きく、好ましくは約３０％より大きく、好ましくは約５０％より大きく、好ましくは約１００％より大きく、好ましくは約３００％より大きい。
ここで使用される「実質的に変らない」なる語句は、当業者が前記量（例えば、リンパ球の量）によって測定される生物学的に特徴のある文脈において統計的に有意な変化と考えないような変化の有意でない程度を示す。該変化は、好ましくは約１０％より小さく、好ましくは約５％より小さく、好ましくは約１％より小さい。
「消化管炎症性障害」は粘膜における炎症及び／又は潰瘍を引き起こす慢性疾患のグループである。これらの障害は例えば炎症性腸疾患（例えばクローン病、潰瘍性結腸炎、非決定性結腸炎及び感染性結腸炎）、粘膜炎（例えば口腔粘膜炎、胃腸粘膜炎、鼻粘膜炎及び直腸炎）、壊死性腸炎及び食道炎を包含する。好ましい実施態様では、消化管炎症性障害は炎症性腸疾患である。
「炎症性腸疾患」又は「ＩＢＤ」は本明細書においては互換的に使用し、炎症及び／又は潰瘍を誘発する腸の疾患を指し、そしてクローン病及び潰瘍性結腸炎を包含する。
「クローン病（ＣＤ）」又は「潰瘍性結腸炎（ＵＣ）」は病因道の慢性の炎症性の腸の疾患である。クローン病は、潰瘍性結腸炎とは異なり、腸の如何なる部分にも生じ得るものである。最も顕著な特徴としてのクローン病は腸壁の顆粒状の赤紫色の浮腫性の肥厚である。炎症の発生に従い、これらの肉芽腫からその外周境界が消失し、周囲の組織と一体化する場合が多い。下痢及び腸閉塞が主要な臨床特徴である。潰瘍性結腸炎と同様、クローン病の過程は持続性又は回帰性、軽度又は重度となるが、ただし結腸炎とは異なり、クローン病は腸の罹患区分の切除によって治癒されない。クローン病の患者の大部分はある時点において手術を必要とするが、その後の回帰は一般的であり、継続的な医療処置が通常となる。
クローン病は口腔から肛門に至る消化管の何れかの部分が関与するものであるが、典型的には回結腸、小腸及び結腸−肛門直腸の領域に生じる。組織病理学的には、疾患は断続的な肉芽腫、陰窩膿瘍、索裂及びアフタ性潰瘍により顕在化する。炎症の浸潤は混在性であり、リンパ球（Ｔ及びＢ細胞の両方）、プラズマ細胞、マクロファージ及び好中球よりなる。ＩｇＭ及びＩｇＧ分泌プラズマ細胞、マクロファージ及び好中球の不均衡な増大を伴う。
抗炎症剤スルファサラジン及び５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）は軽度に活動性の結腸のクローン病を治療するために有用であり、そして疾患の退行を維持するために一般的に処方されている。メトロイダゾール及びシプロフロキサシンはスルファサラジンと薬効において同様であり、そして肛門周囲疾患を治療するために特に有用であると考えられる。さらに深刻な場合では、コルチコステロイドは活動性の再燃の治療に効果があり、さらに退行を維持することが可能である。アザチオプリン及び６−メルカプトプリンもまたコルチコステロイドの長期投与を必要とする患者において良好な結果をもたらしている。これらの薬剤は長期の予防においても役割を果たすことが可能である。残念なことに、一部の患者においては作用が開始される前に極めて長期の遅延（６ヶ月まで）がある場合がある。下痢止め薬もまた一部の患者において兆候的緩解をもたらす。栄養療法又は単元的食餌が患者の栄養状態を改善し、そして急性の疾患の兆候的改善を誘導する場合があるが、持続性の臨床的退行を誘導するわけではない。抗生物質は二次的な小規模の腸内細菌の過剰増殖を治療する場合、及び、化膿性の合併症を治療する場合に使用されている。
「潰瘍性結腸炎（ＵＣ）」は大腸に生じる。疾患の過程は持続性又は回帰性、軽度又は重度となる。最早期の幹部はリーベルキューン陰窩の基底部における膿瘍の形成を伴った炎症性の浸潤である。これらの膨張し崩壊した陰窩の癒着状態は積層する粘膜をその血液供給から分断し、潰瘍をもたらす。疾患の症状は、痙攣、下腹部痛、直腸出血及び糞粒子の乏しい血液、膿汁及び粘膜より主になる頻繁な軟便を包含する。急性、重度又は慢性、非退行性の潰瘍性結腸炎では全結腸摘出が必要となる場合がある。
ＵＣの臨床特徴は極めて変動的であり、そして発症は潜行性又は突然であり、そして下痢、テネスムス及び回帰性の直腸出血を包含する場合がある。全結腸に急激な発症があれば、中毒性巨大結腸、致命的な緊急事態が起こる場合がある。腸外の顕在的特長は関節炎、膿皮壊疽、ブドウ膜炎及び結節性紅斑を包含する。
ＵＣの治療は軽度の症例ではスルファラジン及び関連のサリシレート含有薬剤、そして重度の症例ではコルチコステロイド剤を使用する。サリシレート又はコルチコステロイドの局所投与は場合によっては、特に疾患が遠位の腸に限局されている場合は有効であり、そして全身使用と比較して低減された副作用を有する。鉄及び抗下痢剤の投与のような補助的処置が場合により適応される。アザチオプリン、６−メルカプトプリン及びメトトレキセートは場合により、難治性のコルチコステロイド依存症例において処方される場合がある。
「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。
本明細書中の「患者」なる用語は任意の単一動物を指すものであり、処置が所望される場合には、好ましくは哺乳動物(ヒト及びヒト以外の動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヒト以外の霊長類を含む)である。最も好ましくは、ここでの患者はヒトである。
「非ヒト動物」という用語は、任意の単一非ヒト動物、より好ましくは（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園の動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びヒト以外の霊長類のような非ヒト動物を含む）動物を意図している。
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)及び（本明細書でさらに詳細に記載される）抗体断片が含まれてもよい。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、及び多ければその殆ど又は全てを保持する。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む一般的な（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。
ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、以下の概説文献及びここに挙げる引用文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を含むもの、及び／又はここに開示されたヒト抗体を作製する任意の技術を使用して製造されたものである。そのような技術には、ファージディスプレイのようなヒト由来組み合わせライブラリーのスクリーニング（Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)及びHoogenboom et al., Nucl. Acids Res., 19: 4133-4137 (1991)参照）；ヒトモノクローナル抗体産生のためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株の使用(Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)及びBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)参照)；及び内因性の免疫グロブリンを産生しない、ヒト抗体の完全なレパートリーを産生可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）におけるモノクローナル抗体の生成(Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)参照)が含まれる。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト動物由来の抗原結合残基を含むヒト化抗体を除く。
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及びタンパク質様又は他の非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(１) ローリー(Lowry)法によって決定した場合９５重量％以上の、最も好ましくは９９重量％の抗体まで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた還元又は非還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれるが、これは抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
本願明細書において、用いられる「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列中の高頻度に可変している及び／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。通常、抗体は、ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)の３つと、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)の３つの計６つの高頻度可変領域を含んでなる。多くの高頻度可変領域が描写されており、本願明細書において、包含される。Kabat相補性決定領域(ＣＤＲ)は、配列多様性に基づいており、最も一般的に用いられるものである(Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置を指す(Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、KabatＣＤＲとChothia構造ループとが組み合わさったものであり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである。これら高頻度可変領域の残基を以下に示す。
カバットループ ＡｂＭ Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B
(カバット番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35
(Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
高頻度可変領域は、次のような「拡大高頻度可変領域」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
本願明細書において、定められるように、「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は高頻度可変領域残基以外のその可変ドメイン残基である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。通常、Kabat等によると、配列のサブグループはサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループIIIである。
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の改変を有する抗体であって、そのような改変を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が向上している。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks等は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
ここで用いる「実質的に類似」又は「実質的に同じ」なる句は、当業者が２つの数値(一般的には、本発明の抗体に関連するものと参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が十分に高く類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体の値の好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般的に抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般的に抗原により早くより長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体(免疫グロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。免疫グロブリンには５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、更にこれらの幾つかは、例えばＩｇＧ１(非Ａ及びＡアロタイプを含む)、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般に、例えばAbbas等 Cellular and Mol. Immunology, 4版 (W.B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有的又は非共有的結合によって形成される大きな融合分子の一部であってもよい。
「全長抗体」、「無傷抗体」及び「全抗体」なる用語は、以下に定義する抗体断片ではなく、その実質的に無傷の形態の抗体を意味するためにここでは交換可能に使用される。該用語は特にＦｃ領域を含む重鎖を持つ抗体を意味する。
「裸の抗体」は、異種性の分子、例えば細胞障害性成分又は放射標識にコンジュゲートされない抗体である。
本明細書中の「Ｆｃ領域」なる用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異形Ｆｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はＣｙｓ２２６の位置又はＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。
特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用されるKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号を指す。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター； ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、例えば本明細書中に開示される様々なアッセイを使用して評価される。
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。
「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾、好ましくは一又は複数のアミノ酸置換により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、少なくともおよそ８０％の同一性を有する、最も好ましくは少なくともおよそ９０％の同一性を、より好ましくは少なくともおよそ９５％の同一性を有するものであろう。
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、無傷抗体を様々な「クラス」にあてがうことができる。無傷抗体の５種の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは更に「サブクラス」（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に分けることができる。抗体の異なったクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なったクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
「抗体依存性細胞媒介細胞障害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)を発現する非特異性細胞障害性細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介反応に関する。ＡＤＣＣを媒介する第１の細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＩ、ＦｃγII及びＦｃγIIIを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現はRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991)の464ページの表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、例えば米国特許第5,500,362号又は5,821,337号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。このアッセイで使用できるエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞を含む。他に、又はさらに対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)に記載されている様な哺乳動物のモデルでインビボの評価がされうる。
「ヒトエフェクター細胞」は、一つ以上のＦｃＲを発現する白血球であり、エフェクター機能を果たす。好ましくは、細胞は、少なくともＦＣγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞及び好中球を含む；ＰＢＭＣ類及びＮＫ細胞が好まれる。エフェクター細胞は、その天然ソースより単離されてもよい；例えばここにおいて記載の血液又はＰＢＭＣ類である。
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記述するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲIIレセプターは、ＦｃγＲIIＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲIIＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化ＦｃγＲIIＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲIIＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)に概説されている)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994);及びde Has等, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。また、この用語は胎児への母性ＩｇＧｓの移動の原因であり(Guyer等, J. Immumol. 117:587 (1976)及びKim等, J. Immunol. 24:249 (1994))、また免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児レセプターであるＦｃＲｎも含む。新生児のＦｃレセプター(ＦｃＲｎ)への結合が向上し、半減期が増加している抗体は、国際公開第００／４２０７２号(Presta, L.)及び米国公開特許第２００５／００１４９３４号Ａ1(Hinton等)において、記述される。これらの抗体は、その中にＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上させる一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含んでなる。例えば、Ｆｃ領域は、一又は複数の位置２３８、２５０、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１４、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、４２８又は４３４(残基のＥｕ番号付け)に置換を有してもよい。向上したＦｃＲｎ結合を有する好適なＦｃ領域-含有抗体変異体は、そのＦｃ領域の位置３０７、３８０及び４３４(残基のＥｕ番号付け)のうちの１、２又は３にアミノ酸置換を含んでなる。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖのレビューに関しては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖ断片は、国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号に記載されている。
「ダイアボディ(diabody)」なる用語は、抗原結合部位を２つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖(ＶＨ及びＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に連結した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディについては、例えば欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger他, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448(1993)でさらに詳しく記載されている。
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の改変を有する抗体であって、そのような改変を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性が向上している。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks等は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
本明細書において、「アミノ酸配列変異形」抗体は、主要種の抗体と異なるアミノ酸配列を有する抗体である。通常、アミノ酸配列変異体は、主要種の抗体と少なくともおよそ７０％の相同性を有し、好ましくは、それらは主要種の抗体と少なくともおよそ８０％、好ましくは少なくともおよそ９０％の相同性である。アミノ酸配列変異体は、主要種の抗体のアミノ酸配列内の、又は主な種類の抗体のアミノ酸配列に隣接した、特定の位置で置換、欠失及び／又は付加を有する。本明細書中のアミノ酸配列変異体の例には、酸性の変異体(例えば脱アミド化された抗体変異体)、基本的な変異体、抗体の１又は２つの軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展(例えばＶＨＳ−)を有する抗体、抗体の１又は２つの重鎖上にＣ末端リジン残基を有する抗体などが含まれ、重鎖及び／又は軽鎖のアミノ酸配列に対する変異体の組合せが含まれる。ここで特に関心のある抗体変異体はその一又は二の軽鎖上にアミノ末端リーダー伸展を含み、更に主要な種の抗体に関連する他のアミノ酸配列及び／又はグリコシル化の差異を含んでもよい抗体である。
本明細書中の「グリコシル化変異形」抗体は、主要種の抗体に付着した一又は複数の炭水化物部分と異なる一又は複数の接着した炭水化物部分を有する抗体である。本明細書において、グリコシル化変異体の例には、抗体のＦｃ領域に付着した、Ｇ０オリゴ糖構造の代わりに、Ｇ１又はＧ２オリゴ糖構造を有する抗体、抗体の１又は２つの軽鎖に接着した１又は２の炭水化物部分を有する抗体、抗体の１又は２つの重鎖に接着する炭水化物のない抗体など、及びグリコシル化変更の組合せを有する抗体が含まれる。抗体がＦｃ領域を有する場合、オリゴ糖構造は、一又は二の抗体の重鎖、例えば、残基２９９において（２９８、残基のＥｕ番号付け）に結合してもよい。
ここで使用される「細胞障害剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を意味する。この用語は、放射性同位体(例えばＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２ 及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び小分子毒素又は細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素などの毒素で、それらの断片及び／又は変異体を含むものを含むことを意図する。
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、副甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；ＮＧＦ-β等の神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロンα、β、γのようなインターフェロン；マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球マクロファージＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)及び顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；腫瘍壊死因子、例えばＴＮＦ-α又はＴＮＦ-β；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
ここで補助治療として用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書中で治療される被検体の免疫系を抑制する又は遮断するように働く物質を表す。これは、サイトカイン産生を抑制する、自己抗原の発現を下方制御又は抑制する、あるいはＭＨＣ抗原を遮断する物質を含む。そのような薬剤の例として、２-アミノ-６-アリル-５-代替ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号参照)；非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤ)；ガンシクロビル、タクロリムス、糖質ステロイド、例としてコルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例としてシクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例えばアザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；アルキル化剤、例えばシクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド (米国特許第４１２０６４９号に記載のように、ＭＨＣ抗原を遮断する)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣフラグメントに対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリン；６メルカプトプリン；副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質ステロイド類似体などのステロイド、例としてプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、例えばSOLU-MEDROL(登録商標)メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム、及びデキサメタゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例としてメトトレキサート(経口又は皮下)；クロロキン及びヒドロキシクロロキンなどの抗マラリア剤；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカインレセプター抗体又はアンタゴニスト、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体(インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子β抗体、抗インターロイキン２(ＩＬ-２)抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体、抗インターロイキン６(ＩＬ-６)レセプター抗体及びアンタゴニスト；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗-Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ-Ｔ抗体、好ましくは、抗-ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日公開の国際公開第９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；トランスフォーミング成長因子-β(ＴＧＦ-β)；ストレプトドルナーゼ(streptodornase)；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；クロランブシル；デオキシスペルグアニン(deoxyspergualin)；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター (Cohen等, 米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプターフラグメント(Offner等, Science 251:430-432 (1991)；国際公開第９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第９１／０１１３３号)；ＢＡＦＦないしＢＲ３抗体ないしイムノアドヘシンなどのＢＡＦＦアンタゴニスト及びｚＴＮＦ４アンタゴニスト(参考までにMackay及びMackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002)と以下の定義を参照のこと)；Ｔ細胞ヘルパーシグナルを阻害する生物学的な薬剤、例として抗ＣＤ４０レセプター又は抗ＣＤ４０リガンド(ＣＤ１５４)、例えばＣＤ４０-ＣＤ４０リガンドに対する阻止抗体(例えば、Durie等, Science, 261: 1328-30 (1993)；Mohan等, J. Immunol., 154: 1470-80 (1995))及びＣＴＬＡ４-Ｉｇ(Finck等, Science, 265: 1225-7 (1994))；及びＴ１０Ｂ９などのＴ細胞レセプター抗体 (欧州特許第３４０１０９号)を含む。
ＩＩ．詳細な記述
Ａ．ベータ７インテグリンアンタゴニスト
本発明はベータ７インテグリンアンタゴニストの治療に対する患者の応答性を予測する方法に関する。潜在的なアンタゴニストの例には、ベータ７インテグリンに結合する免疫グロブリンの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、及び特に、限定されるものではないが、ポリ及びモノクローナル抗体とその抗体断片、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びキメラ又はそのような抗体又は断片のヒト化したもの並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体が含まれる。その代わりに、潜在的なアンタゴニストは密接に関連するタンパク質、例えば、リガンドを認識するが、影響は与えず、したがってベータ７インテグリンの活動を競合的に阻害するベータ７インテグリンの変異形態であってもよい。
別のベータ７インテグリンアンタゴニストとなり得るものは、アンチセンス技術により調製されたアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡコンストラクトであり、例えば、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、蛋白質の翻訳を阻害することにより直接ｍＲＮＡの翻訳を妨げるように働く。三本鎖形成、または、アンチセンスＤＮＡ若しくはＲＮＡによって、アンチセンス技術は遺伝子発現を調製するのに用いることができ、どちらの方法もポリヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでは成熟ベータ７インテグリンをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、長さが約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するのに用いられる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、遺伝子の転写に関る領域に相補的に設計され（三本鎖―Leeet al., Nucleic Acids Res., 6:3073(1979）；Cooney et al., Science, 241:456(1988)；Dervan et al., Science, 251:1360(1991)参照）、それによりベータ７インテグリンの転写、および、産生を阻害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはイン・ビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のベータ７インテグリンへの転写を妨げる（アンチセンス―Okano, Neurochem., 56:560(1991)；「Origodeoxynulcleotide as Antisense Inhibitors of Gene Expression」(CRC Press:Boca Raton, FL, 1988))。また、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがイン・ビボでＰＲＯポリペプチドの産生を阻害するように発現されるように、上記オリゴヌクレオチドは細胞へ届けられ得る。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０および＋１０位の間である翻訳開始部位由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
他のアンタゴニストとなり得るものには、活性部位、リガンド又は結合分子結合部位に結合する小分子が含まれ、それによりベータ７インテグリンの通常の生物学的活性を阻害する。小分子の例には、これらに限定されるわけではないが、小型のペプチド、またはペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、および、合成非ペプチド有機、若しくは、無機化合物が含まれる。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒することができる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーションに続く、内ヌクレオチド結合分解性開裂により機能する。標的ＲＮＡとなり得るもの内部の特異的リボザイム開裂部位は、公知の技術により同定され得る。詳細については、例えば、Rossi(Current Biology, 4:469-471(1994))、および、ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３３５５１号（１９９７年９月１８日公開）参照。
転写を阻害するのに用いられる三本鎖ヘリックス形成における核酸分子は、一本鎖で、デオキシヌクレオチドにより構成されているべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、一般的に二本鎖のうちの一本の上に相当な長さのプリン、または、ピリミジンを必要とするフーグスティーン型塩基対則をにより三本鎖ヘリックス形成を促進するように設計される。さらなる、詳細については、例えば前述のＰＣＴ公開第ＷＯ９７／３３５５１号参照。これらの小分子は、上述のスクリーニング分析のいずれか１つ、若しくは、それ以上により、および／または、当業者に公知のその他のいずれかのスクリーニング技術により同定され得る。
アンタゴニストのスクリーニングアッセイはここで同定される遺伝子によってコードされるベータ７インテグリンと結合するか又はそれと複合化するか、又はそうでなければ、他の細胞性タンパク質とコードされたポリペプチドの相互作用を妨害等する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは化学的なライブラリーのハイスループットスクリーニングに適したアッセイを含み、それらを小分子の医薬候補を同定するために特に適したものにする。
アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、及び細胞ベースアッセイを含む種々の形態によって行うことができ、当該分野でよく知られている。
Ｂ．抗ベータ７インテグリン抗体
一実施態様では、本発明のベータ７インテグリンアンタゴニストは抗ベータ７抗体である。抗体の例としては、上記の通り、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体等が含まれる。
１．ポリークローナル抗体
ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回の皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生されることが好ましい。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介するコンジュゲーション)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲ及びＲ１が異なるアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
２．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞（融合のパートナーとも呼ばれる）の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい融合のパートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、融合しない親細胞に対して選択する選択培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１およびＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。<BR>
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、例えばマウスへの細胞の腹腔内注射によって、インビボで増殖させることができる。サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ-セファロースを用いる）又はイオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析等のような常套的な抗体精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
更なる実施態様では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン（ＣＨ及びＣＬ）の配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）のコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾してキメラ又は融合抗体ポリペプチドを生成することができる。非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
例示的な抗ベータ７抗体は、Ｆｉｂ５０４、Ｆｉｂ２１、２２、２７、３０（Tidswell, M. J Immunol. 1997 Aug 1;159(3):1497-505）又はそのヒト化誘導体である。Ｆｉｂ５０４のヒト化抗体は、米国特許第２００６００９３６０１号に詳細に開示されており、参照によりその内容全体が組み込まれる（下の議論もまた参照されたい）。
３．ヒト及びヒト化抗体
抗ベータ７インテグリン抗体は、更にヒト化抗体又はヒト抗体を含みうる。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントのＣＤＲ由来の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは殆ど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは殆ど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインの実質的に全てを含む。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそこに導入された一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(Winter)及び共同研究者（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより本質的に実施することができる。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４８１６５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基と場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗体がヒトの治療用に用いられる場合、抗原性及びＨＡＭＡ応答(ヒト抗マウス抗体)を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。ＨＡＭＡ応答の低減又は除去は、適切な治療薬の臨床上の発達の有意な態様である。例として、Khaxzaeli et al., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937；Jaffers et al., Transplantation (1986), 41:572；Shawler et al., J. Immunol. (1985), 135:1530；Sears et al., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138；Miller et al., Blood (1983), 62:988；Hakimi et al., J. Immunol. (1991), 147:1352；Reichmann et al., Nature (1988), 332:323；Junghans et al., Cancer Res. (1990), 50:1495を参照のこと。本明細書において記述されるように、本発明は、ＨＡＭＡ応答が低減されるか又は取り除かれるように、ヒト化される抗体を提供する。さらに、これらの抗体の変異体は、当分野で公知の慣例的な方法を用いて得られる。その方法のいくつかは以降に記載される。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒトＶドメイン配列を同定し、その中のヒトフレームワーク(ＦＲ)をヒト化抗体に受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗ベータ７インテグリン抗体の様々な形態が考慮される。例えば、ヒト化抗体は、Ｆａｂなどの、任意で一又は複数の細胞障害性剤とコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを生成する抗体断片とすることができる。或いは、ヒト化抗体は、インタクトＩｇＧ１抗体などのインタクト抗体でもよい。
例示的なヒト化抗ベータ７抗体は、限定するものではないが、インテグリンサブユニットβ７に対するヒト化モノクローナル抗体であり、ラット抗マウス／ヒトモノクローナル抗体ＦＩＢ５０４（Andrew等, 1994 J Immunol 1994;153:3847 61）から誘導される、ｒｈｕＭＡｂベータ７を含む。それは、ヒトイムノグロブリン（Ｉｇ）Ｇ１重鎖及びκ１軽鎖フレームワークを含むように改変され、チャイニーズハムスター卵巣細胞によって産生される。この抗体は、消化管のリンパ球サブユニットの輸送と滞留を制御し、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）やクローン病（ＣＤ）のような腸管炎症性疾患（ＩＢＤ）に関連する、２つのインテグリン、α４β７とαＥβ７に結合する。ｒｈｕＭＡｂベータ７はα４β７とそのリガンド（蛋白粘膜アドレシン細胞接着分子−１［ＭＡｄＣＡＭ］−１、血管細胞接着分子［ＶＣＡＭ］−１、及びフィブロネクチン）の細胞相互作用並びにαＥβ７とそのリガンド（Ｅカドヘリン）の相互作用の強力なインビトロ阻害剤である。ｒｈｕＭＡｂベータ７は可逆的に類似の高い親和性でウサギ、カニクイザル、及びヒトからのリンパ球上のβ７に結合する。それはまたサルのβ７にも高い親和性で結合する。ｒｈｕＭＡｂベータ７とその変異体のアミノ酸配列と調製及び使用については米国特許第２００６００９３６０１号に詳細が開示されており、その内容の全体が組み込まれる。
図１２Ａ及び１２Ｂは以下の可変軽鎖及び重鎖の配列アラインメントを示す：軽鎖ヒトサブグループカッパＩコンセンサス配列（図１２Ａ、配列番号：１２）、重鎖ヒトサブグループＩＩＩコンセンサス配列（図１２Ｂ、配列番号：１３）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変軽鎖（図１２Ａ、配列番号：１０）、ラット抗マウスベータ７抗体（Ｆｉｂ５０４）可変重鎖（図１２Ｂ、配列番号：１１）、及びヒト化抗体変異体：ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変軽鎖（図１２、配列番号：１４）、ヒト化抗体変異体：ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフト可変重鎖（図１２Ｂ、配列番号：１５）、変異体ｈｕ５０４．５、ｈｕ５０４−１６、及びｈｕ５０４−３２（ヒト化ｈｕ５０４Ｋグラフトからのアミノ酸変異体は変異体ｈｕ５０４．１６、ｈｕ５０４．１６、及びｈｕ５０４．３２（配列番号：２５）について、図１２Ａ（軽鎖）（登場の順にそれぞれ配列番号：２２から２４）及び図１２Ｂ（重鎖）に示す）。
４．ヒト化抗体
ヒト化の別法として、ヒト抗体を生成することができる。例えば、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生が起こる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第５５４５８０６号、同５５６９８２５号、同５５９１６６９号（全てジェンファーム(GenPharm)）；同５５４５８０７号；及び国際公開第９７／１７８５２号を参照。
あるいは、ファージディスプレイ技術（McCafferty等, Nature 348：552-553 (1990)）を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。当該技術では、抗体Ｖドメイン配列は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄのメジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子の何れかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として示される。また、繊維状の粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的性質に基づくセレクションはこれらの性質を提示する抗体をコードする遺伝子を選択する結果となる。このように、ファージはＢ細胞の幾つかの性質を模倣する。ファージディスプレイは、例えば、Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)に総説されたように、多様な形式で行うことができる。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築し、抗原（自己抗原を含む）の異なった配列に対する抗体を、Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12:725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。
上記の通り、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞によって発生し得る（米国特許第５５６７６１０及び５２２９２７５号を参照されたい）。
５．抗体断片
特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開93/16185；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
６．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ここに記載した通りベータ７インテグリンの２つの異なるエピトープに結合し得る。他のこのような抗体は、ＴＡＴ結合部位と、他のタンパク質に対する結合部位とを結合することができる。或いは、抗ベータ７インテグリンアームは、細胞防護の機序をＴＡＴ発現細胞に集中し局在化させるために、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ３）のような白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のような、ＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）に結合するアームと結合し得る。二重特異性抗体は、ＴＡＴを発現する細胞に細胞障害性剤を局在化させるために使用することもできる。このような抗体は、ＴＡＴ結合アームと、細胞障害性剤（例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサート又は放射性同位元素ハプテン）とに結合するアームとを有している。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。
二重特異性抗体を作製する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
米国特許第５７３１１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公報第９１／００３６０号、国際公報第９２／２００３７３号及び欧州特許第０３０８９号)等の用途が提案されてる。ヘテロコンジュゲートは適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ’−ＳＨ断片を直接回収できるようになり、これを化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子を記載している。各Ｆａｂ’断片は別個に大腸菌から分泌され、インビトロでの定方向化学カップリングによって二重特異性抗体を形成した。このようにして形成された二重特異性抗体はＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合することができ、またヒト乳房腫瘍標的に対してヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を惹起させた。組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法はまた抗体ホモ二量体の生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作製する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)二量体の使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。
７．ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４６７６９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［国際公開第９１／００３６０；国際公開第９２／２００３７３；欧州特許第０３０８９号］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することによって、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダート、及び例えば米国特許第４６７６９８０号に開示されたものが含まれる。
８．多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも一つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
９．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば抗体の抗原-依存細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を向上させることは望ましい。これは、抗体のＦｃ領域で一又は複数のアミノ酸置換を誘導することによりなされうる。あるいは又はさらに、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
１０．免疫複合体
ここの方法で使用されるアンタゴニスト又は抗体は細胞毒性剤、又はサイトカインのような別の医薬とコンジュゲートさせてもよい。一般的に、非ペプチド性剤は、化学的な修飾によって、抗体又はイムノアドヘシンに導入された反応基、糖鎖又はアミノ酸側鎖によって、抗体又はイムノアドヘシンへのコンジュゲートを可能にするリンカーの負荷により修飾される。例えば、薬剤は、リジン残基のε-アミノ基により、遊離したα-アミノ基により、システイン残基に対するジスルフィド交換にり、又は、シッフ塩基結合により様々な求核基を含有する薬剤の付着を可能にする過ヨウ素酸を有する糖鎖の１,２-ジオールの酸化により付着されてもよい。例として米国特許第４２５６８３３号を参照。タンパク質修飾剤には、アミン反応性の試薬(例えば、反応性エステル、イソチオシアン酸(isothiocyantate)、アルデヒド及びスルホニルハロゲン化物)、チオール反応性の試薬(例えば、ハロアセチル誘導体及びマレイミド)、及びカルボン酸反応性の試薬及びアルデヒド反応性の試薬が含まれる。ＣＤ２０アンタゴニスト又は抗体ポリペプチドは、二官能性架橋試薬の使用によってペプチド薬剤に共有結合してもよい。ヘテロ二官能試薬はより共通して用いられており、２つの異なる反応性分子(例えば、アミン反応性とチオール、ヨードアセトアミド又はマレイミド)の使用によって、２つの異なるタンパク質のカップリングの制御が可能となる。このような連結剤の使用は公知技術である。例として米国特許第４６７１９５８号を参照。ペプチドリンカーもまた使用されてよい。あるいは、抗体又はイムノアドヘシンは、融合ポリペプチドの調製によってペプチド分子に連結されてもよい。
種々の二官能性タンパク質カップリング剤の例は、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を含む。
１１．免疫リポソーム
ここで開示されている抗ベータ７インテグリン抗体は、免疫リポソームとして製剤化することもできる。「リポソーム」は、哺乳動物への薬物輸送に有用な、脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含む種々のタイプの小胞体である。リポソームの成分は、通常は生物膜の脂質配向に類似した２層構造に配列される。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号；及び１９９７年１０月２３日に公開の国際公開９７／３８７３１に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。
本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
１２．抗体産生のためのベクター、宿主細胞及び組換え法
本発明は、抗体産生のための核酸と組換え技術を含む、またここに記載の抗ベータ７抗体又はポリペプチド剤をコードする単離された拡散、ベクター及び宿主細胞を提供する。
抗体の組換え生産のために、抗体をコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター中に挿入される。別の実施態様では、抗体は、例えば、参照によって具体的に取り込まれる米国特許第５２０４２４４号に記載の通り、相同組換えによって産生され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、常套的な手法を用いて(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である（例えば、特に出典明示によりここに援用される米国特許第５５３４６１５号に記載）。
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開された ＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗ベータ７インテグリン抗体をコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ.ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ.ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(ＥＰ４０２２２６)；ピチアパストリス(ＥＰ１８３０７０)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(ＥＰ２４４２３４)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性コウジ菌及びクロカビが使用できる。
グリコシル化抗ベータ７抗体の発現に適切な宿主細胞はまた多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明においてここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞の形質転換に使用できる。綿、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養をまた宿主として利用することができる。
しかしながら、脊椎動物細胞における興味が最もあり、培養(組織培養)中の脊椎細胞の増殖は近年では常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主細胞の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚腎細胞系(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol. 36:59(1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216(1980))；マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251(1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68(1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞は、抗ベータ７インテグリン抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
本発明の抗ベータ７インテグリン抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ),(Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),Ｓｉｇｍａ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、第１工程として、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取り除く。Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順について記載している。簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフロリド(ＰＭＳＦ)の存在下で、３０分以上かけて解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌されている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
細胞から調製される抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製され、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティリガンドとしてのプロテインＡの適合性は抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 [1983])。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 15671575 [1986])。アフィニティリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商標)樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂(ポリアスパラギン酸カラム)上でのヘパリンSEPHAROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他のタンパク質精製技術も、回収される抗体に応じて利用可能である。任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約２．５−４．５のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度(例えば、約０−０．２５Ｍ塩)で実施される。
Ｃ．薬学的製剤
本発明のポリペプチド、抗体又はアンタゴニストの薬学的製剤は、適当な純度を持つ所望の分子を任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.編, (1980)）と、凍結乾燥した製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸炎、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンザルコニウムクロライド；ベンゼトニウムクロライド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
活性成分もまた、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれコロイド薬剤送達システ（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンで、ヒドリキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル、及びポリ-（メチルメタアシレート）マイクロカプセルに封入されうる。このような技術は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなければならない。これは滅菌濾過膜を通して濾過することにより直ぐになされる。
徐放性製剤を調整してもよい。徐放性製剤の適切な例として、抗体を含む固形疎水性ポリマーの半透性基質を上げることができ、この基質は、有形物、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性基質の例には、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリル酸）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌグルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミンの共重合体、非分解性エチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOTTM（乳酸−グリコール酸共重合体及びリュープロリド酢酸塩からなる注射可能な微粒子）のような、分解性の乳酸−グリコール酸の共重合体、並びにポリ−Ｄ−（−）３−ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレンビニルアセテート及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは、１００日に亘る分子の放出を可能にし、一方、特定のハイドロゲルは、それよりも短期間に亘ってタンパク質を放出する。カプセル封入された抗体は、体内に長時間留まるとき、３７℃で水分に曝されることにより、変性又は凝集し、その結果生物学的活性を失い、場合によっては免疫原生が変化する。関与する機序に応じて、安定化のために合理的な戦略を講じることができる。例えば、凝集の機序が、チオ−ジスルフィド交換により分子間Ｓ−Ｓ結合の形成であることが発見された場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液の凍結、水分含有率の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマー基質組成物の開発により、安定化させることができる。
Ｄ．治療方法
本発明の抗ベータ７抗体のような、インテグリンベータ７アンタゴニスト（及び補助治療剤）は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻腔内、および局所的な免疫的抑制治療が望まれる場合には、その病巣内への与薬などを含む、あらゆる適した方法により投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下投与を含む。さらに、抗体は、特に減少させた抗体用量で、パルス注入によって適切に投与される。投与は、例えば、部分的には投与が簡潔か慢性的かに応じた、静脈内又は皮下注射のような注射のような任意の適切な経路によってなされる。
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与される。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。これらは、一般的に、ここに記載されるものと同じ用量及び投与経路で、又はここに記載される用量の１〜９９％で、或いは経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量及任意の投与経路で、用いられる。
疾患の予防又は治療のために、本発明のベータ７アンタゴニストの適切な用量は(単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。ベータ７抗体のような、ベータ７アンタゴニストは一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体を、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量とすることができる。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、通常、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば少なくとも週ごと又は２、３、４、５、６、７、８、１０、１２週ごとに投与してもよい(例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。治療の所望の結果に応じて、患者は少なくとも約１、２、６、１２、２４、３６、又は５２週間治療を受けてもよい。
活性中・重傷活性ＵＣの患者のケアの標準は、アミノサリチレート、経口コルチコステロイド、６−メリカプトプリン（６−ＭＰ）及び／又はアザチオプリンの標準投与量の治療を含む。ここに記載の抗ベータインテグリン抗体のようなインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療は、このような患者の標準的なケアによって達成されたものより優れた、疾患の寛解、及び／又は臨床応答の改善の結果となであろう。
一実施態様では、 ＩＢＤの患者の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のための本発明の治療は抗ベータ７インテグリン抗体のような治療剤の治療的有効量の患者への投与、更には患者への免疫抑制剤、疼痛制御剤、止瀉薬、抗生物質、又はその組み合わせである第二の医薬の有効量の投与を含む。
例示的な実施態様では、前記第二の医薬がアミノサリチレート、経口コルチコステロイド、６−メルカプトプリン（６-ＭＰ）及びアザチオプリンからなる群から選択される。別の実施態様では、前記第二の医薬は別の抗ベータ７インテグリン抗体又はサイトカインに対するアンタゴニストのような別のインテグリンベータ７アンタゴニストである。
これらすべての第二の医薬は、第一の医薬とともに互いにないしはそれら自体で組み合わせて用いてもよく、したがって、本明細書で用いる「第二医薬」なる表現は、それぞれ第一医薬以外の唯一の医薬であることを意味するものではない。したがって、第二の医薬は一つの医薬である必要はないが、一つ以上の薬剤からなるか、一つ以上の薬剤を含有する。
本明細書中に記載の第二の医薬は一般に、ここに示したのと同じ用量および投与経路、またはここで用いられる用量の約１〜９９％量で用いられる。第二の医薬が多少なりとも用いられる場合、起こりうる副作用を除去するか減少するために、特に第一医薬の初回服用以降の後の投与において第一の医薬がない場合よりも少ない量で用いられるのが好ましい。例えば、ここの抗ベータ７インテグリン抗体を用いた治療はステロイドの漸減又は断続的投与を許容する。
ここの併用投与には、別々の製剤又は単一の製剤を用いた共投与(同時投与)、及び好ましくは両(すべての)活性剤が生物学的な活性を同時に示す期間があるような何れかの順番での連続投与が含まれる。
第二の医薬の併用投与には、別々の製剤又は単一の製剤を用いた共投与(同時投与)、及び好ましくは両(すべての)活性剤(医薬)が生物学的な活性を同時に示す期間があるような何れかの順番での連続投与が含まれる。
Ｅ．ベータ７アンタゴニストを用いた炎症性腸疾患の治療の評価のためのバイオマーカーの使用
本発明は炎症性腸疾患の患者の治療のための、インテグリンベータ７アンタゴニストのような、治療剤（又は医薬）の効果、効能、安全性、予後、及び／又は投与の評価方法に関する。特に、本発明は、患者の末梢血中の腸ホーミングリンパ球のレベルの使用、腸ホーミングリンパ球上の薬剤の占有率のレベルの使用、及び／又は炎症性腸疾患の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストのような、治療剤の効果、効能、安全性、予後、及び／又は投与の指標（「バイオマーカー」）としての腸ホーミングリンパ球上のベータ７インテグリンレセプターのレベルの使用に関する。このような方法は、例えば、一又は複数のこれらのバイオマーカーを使用したインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた炎症性腸疾患の治療に対する応答性の評価を含む。さらに、本発明は薬剤治療及び／又は治療計画、又は予後の設計のためのこのようなバイオマーカーの使用方法を提供する。
幾つかの態様では、治療剤を用いた患者の治療の前のバイオマーカーのレベルを患者の治療中及び／又は治療後の同じバイオマーカーのレベルと比較し、患者のこのバイオマーカーのレベルの変化（例えば、増加又は減少）は例えば、患者の炎症性腸疾患の治療のためのベータ７インテグリンアンタゴニストのような治療剤の効果、効能、安全性、及び／又は予後を示す。さらに、本発明のこのような方法は、患者の炎症性腸疾患の治療のための薬剤治療又は投与計画を設計するために使用し得る。
１．応答性の予測及び／又は監視
一態様では、本発明は、患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの効能を決定する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が、患者の消化管炎症性障害の治療のためのアンタゴニストの効能を示す方法に関する。
別の態様では、本発明は、消化管炎症性障害を有する患者のインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する応答性を予測する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が前記アンタゴニストを用いた治療への前記患者の応答性を示す方法に関する。一の特定の実施態様では、本発明は炎症性腸疾患と診断された患者がベータ７の投与を含む血用に対して応答するかどうかを予測するための方法を提供する。本発明は、治療前の腸ホーミングリンパ球の量を用いた治療後の患者の血液サンプル中の腸ホーミングリンパ球の量の比較を含み、ここで、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療後の増加量は、患者が治療に応答することを示す。
患者の末梢血中の腸ホーミングリンパ球、腸ホーミングリンパ球上のインテグリンベータ７アンタゴニストの占有率、及び腸ホーミングリンパ球上のベータ７インテグリンアンタゴニストを含むバイオマーカーの量の測定は、ベータ７アンタゴニストの第一の投与がなされた直ぐ後のような、治療の過程における初期段階におけるベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する患者の応答性の予測に利点をもたらす。したがって、患者と患者の主治医は、なされた治療が患者に何らかの利益をもたらすかどうかを見出すために治療が完了するまで待つ必要がない。
本発明の一実施態様では、ベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する応答性の予測方法は、ａ）治療前の患者からの血液サンプルの獲得；ｂ）血液サンプル中のバイオマーカーの量の測定；ｃ）患者へのインテグリンベータ７アンタゴニストの投与；ｄ）インテグリンベータ７アンタゴニストの投与ごの患者からの血液サンプルの獲得；ｅ）血液サンプル中のバイオマーカーの量の測定；ｆ）ｂ）におけるバイオマーカーの量とｅ）におけるバイオマーカーの量の比較を含む。ｅ）とｂ）の間で量の増加が観察された場合、患者は治療に応答性があるであろう。
バイオマーカーのベースライン治療前のレベルを設定するために、治療前の複数の点、例えば、治療前の少なくとも１、２、５、１０、２０、３０、４０日前におけれうバイオマーカーの量を測定することが好ましい。例示的な実施態様では、患者の血液サンプル中の腸ホーミングリンパ球の量は、治療前の５、１０、２０、３０、６０日前に測定される。各点の測定量の平均値が計算され、腸ホーミングリンパ球の治療前のベースラインレベルとして使用されるであろう。
インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する患者の応答性を予測するために、患者の血液中のバイオマーカーの量を、治療の過程の任意の点及び好ましくは治療の過程の初期の段階、例えば、限定するものではないが、第一の投与を患者が受けた後の約８時間、１２時間、１、２、４、１０、２０、５０、１００、３００又は５００日、好ましくは第一の投与を患者が受けた後の１から５０日で決定することができる。一実施態様では、バイオマーカーの量は治療の過程の関心のある単一の点で測定される。測定した点における得られた値を、異なる点における別の値を得る治療前のベースラインのレベルと比較する。別の実施態様では、バイオマーカーの量は治療の過程において複数の時間点（例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、１６、２０、４０点）において測定される。各点で得られた値は、各測定点の異なる値を得るための治療前のベースラインのレベルと比較することができる。治療に対する応答性は、これらの値の解析に基づいて評価されるであろう。
腸ホーミングリンパ球は、例えば、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）等の当該分野で利用可能な技術を用いて、例えば、限定するものではないが、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ及びベータ７のようなバイオマーカーの組み合わせの発現レベルによって同定される。これらのマーカーの異なる発現パターンのリンパ球のサブセット集団は、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）のような当該分野で使用される標準的な技術を使用して同定される。
蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）は、各細胞の特定の散乱光及び蛍光特性に基づき、生物学的な細胞の異種の混合物を、一度に一つの細胞の、２又はそれより多い容器に分離するための方法を提供する。それは、素早く、客観的及び定量的な、各々の細胞からの蛍光シグナル記録並びに特定の関心ある細胞の物理的な分離を提供するので有用な科学機器である。細胞懸濁液が、狭い、速い液体の流れの中央に取り込まれる。流れは細胞の直径に関連して細胞を大きく分離するために調整される。振動機構は、細胞の流れを各々の液滴に分離させる。システムは液滴に一以上の細胞が存在する可能性が低いように調整される。流れが液滴に分離する直前に、流れは、関心のある各細胞の蛍光特性が測定される蛍光測定部位を通過する。電気的な電荷リングが流れが液滴に分離する点にちょうど位置している。電荷は直前の蛍光強度測定に基づくリングにあり、液滴が流れから分離する際に反対電荷が液滴に補足される。荷電した液滴は、その電荷を基に液滴を容器に分離する電気的な偏向システムを通って落下する。幾つかのシステムでは、電荷は直接流れに適用され、液滴の落下は、流れと同じサインの電荷を保持する。
フローサイトメトリーで得たデータはヒストグラムを得るための一次元、又は二次元ドットプロット又は更に三次元にプロットしてもよい。これらのプロット上の領域は、「ゲート」と呼ばれるサブセット抽出のシリーズを作ることによって、蛍光強度を元に逐次的に分離してもよい。具体的なゲートの方法は診断及び臨床の目的のために存在する。プロットはしばしばログスケールで作成される。異なる蛍光試薬の発光スペクトルは重なるので、検出器は電気的並びに演算的に相殺されるべきである。しばしば、フローサイトメトリーで得たデータは他の人々が使用するための機械を自由にした他の場所で再解析されてもよい(Loken MR. "Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry and Sorting": 341-53. Wiley. (1990)。
典型的には、患者の血液サンプル中、末梢血ＣＤ４＋リンパ球の３個のサブセットを、本発明のバイオマーカーを用いたフローサイトメトリーによって区別することができる：腸リンパ節及び組織に選択的にホーミングする、ＣＤ４５ＲＡ−β７高細胞、末梢リンパ節及び組織に選択的にホーミングする、ＣＤ４５ＲＡ−β７低細胞、及び腸及び末梢リンパ節及び組織に選択的に局在化しないＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体細胞。このように、腸ホーミングリンパ球は少なくともＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−β７高によるか、又はフローサイトメトリーにおけるＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ−β７高のような他の細胞表面マーカー又はその組み合わせによって同定することができる。これらのリンパ球の３個のサブセットは、ＦＡＣＳ解析のドットプロット又はヒストグラムの離れた部位に位置し、したがって、当業者によって区別することができる。
腸ホーミングリンパ球の量は、当該分野の種々の方法で定量することができる。プレ投与時のベースラインのレベルのパーセントとしての絶対カウントは、患者から回収したサンプル中の各時間点における腸ホーミングＣＤ４＋リンパ球サブセットについて計算することができる。絶対リンパ球カウント（末梢血のマイクロリットル毎のリンパ球として表される血液学的測定から得られた値）、時間、各サブセットのゲートしたリンパ球のパーセント（フローサイトメトリー解析から得られた）と等しいリンパ球の各サブセットの絶対カウントも、計算することができる。また、腸ホーミングリンパ球は、投与前に得られたベースライン抗体カウントのパーセントとしての絶対カウントであり；プレ投与絶対カウントで割った抗体カウントとして計算される、抗体カウントによって定量することができる。コントロールとして、末梢血ホーミングリンパ球のようなリンパ球の他のサブセットの量を各時間点における同じサンプルについて定量することができる。
腸ホーミングリンパ球上のベータ７インテグリンアンタゴニスト占有率の量及び腸ホーミングリンパ球上のベータ７インテグリンレセプターの量は、当該分野で知られ、本出願の実施例で開示される技術を使用して測定することができる。
患者に対する有益な応答を提供するであろう治療は、患者の血液サンプル中の末梢ホーミングリンパ球の有意な増加なしに患者の血液中の腸ホーミングリンパ球の量を有意に増加すべきである。好ましくは、治療は、治療前の基底レベルと比較して、治療後の１、２、４、６、８、２０、３０、５０、１００日において、少なくとも約３０％、５０％又は１、２、３、４、又は５倍バイオマーカーの量を増加させる。
別の態様では、本発明は、インテグリンベータ７アンタゴニストを投与した後の前記患者の血液サンプル中のバイオマーカーの量を治療前と比較することを含み、前記患者へのインテグリンベータ７アンタゴニストの投与を含む、炎症性腸疾患と診断された患者の治療への有益な応答の見込みを予測するための方法を提供し、ここで、インテグリンベータ７アンタゴニストを投与した後の血液サンプル中の増加したバイオマーカーの量は、有益な応答の見込みを示す。
治療への応答を予測する際のように、末梢血中のバイオマーカーの量は、長期間の有益な応答の見込みを予測するために使用することができる。有益な応答は、限定するものではないが、腹痛、嘔気、嘔吐、下痢、頻繁なボウル運動、熱、疲労及び体重減少のような、炎症性腸疾患に典型的な一又は複数の兆候の減少又は除去、又は疾患の部分又は完全寛解を含む。患者の血液サンプル中の腸ホーミングリンパ球の量は、ここに記載の同じ方法によって定量される。患者への長期間の有益な応答を提供する見込みがあるであろう治療は、末梢ホーミングリンパ球の量を有意に増加することなく末梢血中のバイオマーカーの量を有意に増加させるべきである。好ましくは、治療は治療前の基底レベルと比較して、比較するインテグリンベータ７アンタゴニストが患者に投与された後の１、２、４、６、８、２０、３０、５０、１００日後に、少なくとも約１、３、５、８、１０倍バイオマーカーの量を増加する。
更に別の実施態様では、本発明は、前記治療における前記患者の末梢血中のバイオマーカーの量の監視を含むインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する炎症性腸疾患と診断された患者の応答性を監視する方法を提供し、ここで、治療前と比較して維持され増加した量は、前記治療に対する応答性が維持されることを示す。特に、試験した患者のバイオマーカーの量の治療前のベースラインのレベルは、ここに記載の通り計算される。インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する患者の応答性を監視するために、患者の末梢血サンプル中のバイオマーカーの量は、治療の過程の任意の点、好ましくは、治療の過程を通して複数の点、において測定され得る。例えば、バイオマーカーの量は、治療の期間又は治療の所望の効能に応じて、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０日毎に測定される。中間のイベントに対する反応における治療に対する応答性は、この方法を用いてまた監視することができる。例えば、患者の血液サンプル中のバイオマーカーの量は、第二の医薬の投与又は変更した投与量の開始、又は患者の肉体的又は精神的状態などの任意の変化の直後に測定することができる。理想的には、腸ホーミングリンパ球の維持され増加したレベルが、治療に対する維持された応答性のために観察されるはずである。バイオマーカーのレベルが治療の過程の幾つかの点において又は特定の中間のイベントに対する反応中に減少した場合、患者の治療に対する応答性が減少したことを示す。
本発明はしたがって、ａ）前記患者の上記の方法を用いた前記治療に対する応答性の監視；及びｂ）増加した前記リンパ球の量が維持されるための前記治療の変更を含む、炎症性腸疾患と診断された患者のベータ７アンタゴニストを用いた治療を修正する方法をまた含む。
本発明は患者の炎症性腸疾患の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの投与量又は投与計画を決定する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与又は投与計画を用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することに基づいて、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与量を調節することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が、患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの投与又は投与計画に対する効能又は応答性を示す方法を含む。
２．治療計画の設計
薬剤の開発は複雑で高価な過程である。新薬を上市する費用は８億ドルから１０億ドルと推察される。フェーズＩの臨床試験の１０％未満が承認される。後期の段階で医薬が失敗する２つの鍵である理由は投与−濃度応答と予期しない安全性の問題との関係の理解の不足である。この筋を考慮すると、どのように薬剤がインビボで機能し、臨床治療の候補の成功を支援するのかについての予測を補助することを可能にするツールを持つことは決定的である（Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)）。
薬物動態（ＰＫ）は、薬剤の吸収、分配、代謝、及び排泄の性質を調べる。薬力学（ＰＤ）は投与された薬剤に対する物理学的及び生物学的応答を定義する。ＰＫ／ＰＤモデリングは、これら２つのプロセスの数学的及び理論的に連結し、薬剤の動態のより良い予測を補助する。統合ＰＫ／ＰＤモデリングとシミュレーションを介した演算支援試験設計は、多くの薬剤開発プログラムに組み込まれ、影響が大きくなっている（Lakshmi Kamath, Drug Discovery and Development; Modeling Success in PK/PD Testing Drug Discovery & Development (2006)）。
ＰＫ／ＰＤ試験は、典型的には薬剤開発プロセスの全ての段階で実施される。開発は益々複雑、時間がかかり、コスト集約的になっているので、企業は、初期の段階で欠陥のある候補を除き、臨床上の成功の最良の機会を同定するために、ＰＫ／ＰＤデータをより良い使用に注目している。（Lakshmi Kamath、上掲）。
ＰＫ／ＰＤモデリングアプローチは、バイオマーカー応答、薬剤レベル、及び投与計画の関係を決定する際に有用である。薬剤候補のＰＫ／ＰＤプロファイルとそれに対する患者の応答を予測する能力は、臨床試験の成功のために決定的である。分子生物学的技術における近年の進歩と種々の疾患に対する標的のより良い理解は、薬剤治療効果の良い臨床指標としてのバイオマーカーを有効にした。バイオマーカーアッセイは、薬剤候補に対する生物学的応答の同定を補助する。バイオマーカーが臨床的に有効であると確認されると、試験シミュレーションは、効果的にモデル化され得る。バイオマーカーは薬剤開発の臨床結果のためにいつか代用され得る代理状態に達成する可能性がある（Lakshmi Kamath、上掲）。
その末梢血中のバイオマーカーの量は、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する生物学的応答を同定するさいに使用され得、したがって、候補治療の治療的な効能の良い臨床上の指標として機能し得る。
本発明は、前記候補剤を用いた治療に応答する非ヒト検体の末梢血中のバイオマーカーの量を効果的に増加する投与量に基づく患者のための効果的な投与量の決定を含む、炎症性腸疾患と診断された患者に対する候補薬剤を用いた治療の設計方法を含み、ここで、バイオマーカーは、患者の末梢血中の腸ホーミングリンパ球、腸ホーミングリンパ球上の前記治療剤の占有率、及び腸ホーミングリンパ球上のベータ７インテグリンレセプターからなる群から選択される。
例示的な実施態様では、ａ）前記非ヒト検体へのインテグリンベータ７アンタゴニストの候補投与量の投与を含む候補治療に応答した非ヒト検体の血液サンプル中のバイオマーカーの量の測定；ｂ）候補投与量が、前記非ヒト検体の末梢血中のバイオマーカーの量を効果的に増加することができるかどうかの決定；ｃ）前記非ヒト検体の末梢血中のバイオマーカーの量を効果的に増加する投与量の同定；ｄ）同定した投与量に基づく患者に対する効果的な投与量の決定を含む、炎症性腸疾患と診断された患者に対するインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の設計方法。
一実施態様では、本発明の方法はフェーズＩＩ及び／又はフェーズＩＩＩの臨床試験における所望の有益な応答を潜在的に提供する候補の投与量を同定するために使用される。
非ヒト検体の血液サンプルをフェーズＩ臨床試験における候補治療を受ける前に回収し、検体の末梢血中のバイオマーカーのベースラインレベルは、出願のセクションＥ１に記載された通りに確立される。試験した非ヒト検体は、次いで、試験した検体に対するインテグリンベータ７アンタゴニストの候補投与量の投与を含む候補治療を受ける。血液サンプルは、セクションＥ１に記載の通り治療の過程又は治療の終了後の任意の所望の時間点において検体から再び回収される。候補治療に対するバイオマーカーの量は、候補治療に対する治療前のベースラインと比較した量の違いを決定するために治療前のベースラインと最初に比較されるであろう。候補治療が、バイオマーカーの量の、例えば、少なくとも５０％、１、２、３、５、８、又は１０倍のような顕著な増加を引き起こす場合、該投与量は、フェーズＩＩ又はフェーズＩＩＩ臨床試験における治療設計のための候補投与量として選択されるであろう。腸ホーミングリンパ球は、本出願のＥ１に定義され、当該分野の標準的な技術を用いて、特に、ＣＤ４５ＡＲ、ＣＤ４（ＣＤ８）及びベータ７のような、細胞表面マーカー同定され得る。バイオマーカーの量は、当該分野で利用可能であり、セクションＥ１に記載されるアプローチを介して定量され得る。
上記の工程は、候補治療の純度、特に候補投与量の純度の試験のために複数回使用され得る。試験した候補投与量中のリンパ球の量の最適な増加を引き起こす候補投与量が、フェーズＩＩ又はＩＩＩ臨床試験における治療設計のために選択されるであろう。一実施態様では、同じ非ヒト検体が、候補投与量の純度の各々について試験され得る。候補治療の終了後、治療の残留効果は、本出願の方法を用いて、例えば、バイオマーカーの量が治療前の基底レベルに戻るかどうかを試験することによって、調べるであろう。バイオマーカーの量が、治療前の基底レベルに戻った後、別の候補治療が、腸ホーミングリンパ球に対するその影響を調べるために同様の検体に送達され得る。別の実施態様では、各検体に対するそれぞれの候補治療に伴う、候補治療の純度は、同時に複数の検体について試験されてもよい。複数の検体が同じ治療に応答する検体における個々の差異を除くために同じ候補計画に対して試験される必要があり得る。
フェーズＩ臨床試験から選択された候補投与量は、限定されるものではないが、ＰＫ／ＰＤモデリングを含む当該分野の標準的なアプローチを用いたフェーズＩＩ及びＩＩＩ臨床試験のための最良の投与量の設計のために仕様されるであろう。薬剤開発における伝統的なＰＫ／ＰＤモデリングは、薬剤投与濃度、薬剤暴露効果、薬剤半減期、時間に対する薬剤濃度、及び時間に対する薬剤効果のようなパラメーターを定義する。より広義に使用する場合、薬剤モデリング、疾患モデリング、試験モデリング、及びマーケットモデリングのような定量技術は、全開発過程を支援し得、リスクの明確な考慮と知識のよりよい使用を通じたより良い決定の結果となる。
Ｆ．他の候補試薬の治療への応答に対するバイオマーカー
バイオマーカーの量は、インテグリンベータ７アンタゴニスト以外の候補治療剤を用いた治療に対する応答性を予測するために使用され得る。特に、ここに記載のインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の結果を予想する方法は、１）患者に対する候補薬剤の投与を含む治療に対し、患者が応答性があるかどうかの予測；２）治療の有効性の見込みの予測；３）治療に対する患者の応答性の監視；及び４）候補治療剤を用いた治療の修正、に対し同様の方法で使用され得る。バイオマーカーの量は、上記の方法を用いたインテグリンベータ７アンタゴニスト以外の候補治療剤を用いた治療を設計するために使用され得る。
好ましくは、候補薬剤は、炎症性腸疾患の患者に、ここに記載の免疫抑制剤のような有益な効果を提供する。より好ましくは、薬剤は、直接又は間接的に、患者の腸への腸ホーミングリンパ球の浸入を阻害する。
Ｇ．予後の予測
治療に対する応答性の予測に加え、バイオマーカーの量もまた炎症性腸疾患の予後の予測に有用である。
本発明はしたがって、ａ）腸ホーミングリンパ球の量と前記患者の血液サンプル中の末梢ホーミングリンパ球の量の比率の測定；及びｂ）腸ホーミングリンパ球の量と健常者の血液サンプル中の末梢ホーミングリンパ球の量の比率の測定を含む、患者の炎症性腸疾患の予後の予測方法を含み、ここで、健常者と比較して前記患者の変化した比率は疾患の予後を指示する。
予後を予測するために、健常者の幾つかの血液サンプルを得る。腸ホーミングリンパ球、具体的にはＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋細胞の量は、本発明の方法で測定される。末梢ホーミングリンパ球（ＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋）の量はまた血液サンプル中で測定される。腸ホーミングリンパ球の量と末梢ホーミングリンパ球の量の比は次いで各血液サンプルについて計算される。健常者の平均ベースライン比は、各健常者の比に基づいて決定される。ベースライン比は、調べた患者の減少した比が観察されるかどうかを推測するためのコントロールとして使用されるであろう。血液サンプルは次いで試験した患者から得られ、腸ホーミングリンパ球の量と末梢ホーミングリンパ球の量の比が計算される。ベースラインコントロールと比較して、患者の比において有意な変化（増加又は減少）、例えば、少なくとも約３０％、５０％、１００％、２００％の変化が観察された場合、患者は例えば、寛解の可能性が低く、再発、増強、又は薬剤耐性の可能性が高いといった、悪性の予後であろう。
Ｈ．リンパ球集団の同定方法
ヒト化抗ベータ７インテグリン抗体、ｒｈｕＭＡｂベータ７は、その結合パートナーに関係なくベータ７インテグリンサブユニットに結合する。したがって、ｒｈｕＭＡｂベータ７は、それが単独の場合、又はアルファ４又はアルファＥと結合している場合、ベータ７に結合する。したがって、抗体とその変異体は、アルファＥベータ７インテグリン及び／又はアルファ４ベータ７インテグリンを発現するリンパ球を含むリンパ球の集団を同定するために良いマーカーである。好ましい実施態様では、同定したリンパ球の集団は、アルファＥベータ７インテグリンを発現するリンパ球、アルファ４ベータ７インテグリンを発現するリンパ球、アルファ４ベータ７インテグリンとアルファＥベータ７の両者を発現するリンパ球を含む。これは当該分野の既知の抗ベータ７抗体、例えば、アルファ４に連結した際、ベータ７だけに結合する、ａｃｔ１（Meenan等、上掲）とは異なる。
本発明は、アルファＥベータ７インテグリン及び／又はアルファ４ベータ７を発現するリンパ球を含み、前記リンパ球の、配列番号：１０の軽鎖可変領域、及び配列番号：１１の重鎖可変領域を含む抗体の、同じエピトープに結合する単離された抗体への結合を含むリンパ球の集団を同定する方法に関する。
一実施態様では、本発明の方法は、患者の末梢血中のベータ７を発現するリンパ球を同定するために使用される。特に、患者の末梢血サンプルを回収し、アルファＥベータ７インテグリンを発現する細胞、アルファ４ベータ７インテグリンを発現する細胞及び両者を発現する細胞を含むリンパ球集団を、ベータ７、ＣＤ４５及びＣＤ４５ＡＲを細胞表面マーカーとして用いたフローサイトメトリーを使用して同定し、単離することができる。
別の実施態様では、本発明の方法は、患者の腸のリンパ節及び組織の、アルファＥベータ７インテグリンを発現する細胞及びアルファ４ベータ７インテグリンを発現する細胞を含むリンパ球集団を当該分野で使用される定法、例えば、ｒｈｕＭＡｂベータ７を用いた免疫組織染色によって可視化するために使用される。
ここに記載の方法は、炎症性腸疾患の発生と進行に密接に関連するリンパ球集団を検出するために特に有用である。同定された集団、特に患者の末梢血から得た集団を、治療に対する患者の応答性を予測する際にバイオマーカーとしてだけでなく、セクションＥ及びＦにおいて記載した通り治療計画を設計する際にも使用することができる。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した実施物は、本発明のある側面の一つの例示として意図されており、機能的に等価なあらゆるコンストラクトがこの発明の範囲内にあるため、寄託されたコンストラクトにより、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の特許請求の範囲内に入るものである。
具体的な問題又は状況に対する本発明の教示の出願は、ここに含まれる教示に照らし当該分野の一般的な技術を有する者の能力の範疇であろう。
また、一実施形態として、以下の発明を含み得る。
（１）患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの効 能を決定する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の後又は 間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中 のバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間 のバイオマーカーの量の変化が、患者の消化管障害の治療のためのアンタゴニストの効能 を示し、バイオマーカーが、患者の末梢血中の腸ホーミングリンパ球、腸ホーミングリン パ球上のインテグリンベータ７アンタゴニスト占有率、及び腸ホーミングリンパ球上のベ ータ７インテグリンレセプターからなる群から選択される方法。
（２）消化管炎症性障害を有する患者のインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治 療に対する応答性を予測する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストを用い た治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から 得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで、治療前と比較して 、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が前記アンタゴニストを用いた治療への前記 患者の応答性を示し、バイオマーカーが、患者の末梢血中の腸ホーミングリンパ球、腸ホ ーミングリンパ球上のインテグリンベータ７アンタゴニスト占有率、及び腸ホーミングリ ンパ球上のベータ７インテグリンレセプターからなる群から選択される方法。
（３）患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの投 与量を決定する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与又は投与計画 を用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患 者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することに基づいて、インテグリンベ ータ７アンタゴニストの投与量を調節することを含み、ここで、治療前と比較して、治療 後又は間のバイオマーカーの量の変化が、患者の消化管障害の治療のためのインテグリン ベータ７アンタゴニストの投与又は投与計画に対する効能又は応答性を示し、バイオマー カーが、患者の末梢血中の腸ホーミングリンパ球、腸ホーミングリンパ球上のインテグリ ンベータ７アンタゴニスト占有率、及び腸ホーミングリンパ球上のベータ７インテグリン レセプターからなる群から選択される方法。
（４）患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの投 与計画を決定する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストの投与又は投与計 画を用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の 患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することに基づいて、インテグリン ベータ７アンタゴニストの投与計画を調節することを含み、ここで、治療前と比較して、 治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が、患者の消化管障害の治療のためのインテグ リンベータ７アンタゴニストの投与又は投与計画に対する効能又は応答性を示し、バイオ マーカーが、患者の末梢血中の腸ホーミングリンパ球、腸ホーミングリンパ球上のインテ グリンベータ７アンタゴニスト占有率、及び腸ホーミングリンパ球上のベータ７インテグ リンレセプターからなる群から選択される方法。
（５）バイオマーカーの量の前記変化が増加又は減少である、（１）又は（２）の方法。 （６）前記変化が前記バイオマーカーの量における増加である、（２）の方法。
（７）前記バイオマーカーの量を、医薬の第一の投与の１００日以内に測定する、（５） の方法。
（８）前記バイオマーカーの量を医薬の投与の少なくとも約２４時間後に測定する、（５ ）の方法。
（９）前記消化管炎症性障害が炎症性腸疾患である、（１）から（８）の何れか一項に記 載の方法。
（１０）前記炎症性腸疾患がクローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、（９ ）の方法。
（１１）前記患者がヒトである、（１０）の方法。
（１２）前記インテグリンベータ７アンタゴニストが抗ベータ７抗体である、（９）の方 法。
（１３）前記抗体がモノクローナル抗体である、（１２）の方法。
（１４）前記抗体がキメラ、ヒト又はヒト化抗体である、（１３）の方法。
（１５）前記抗体が抗体断片である、（１２）の方法。
（１６）抗体がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ ２、及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群から選択される６個の高頻度領域（ＨＶＲ）を含み、こ こで：
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここで、Ａ１−Ａ１１はＲＡ ＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号：１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号：７）、ＲＡ ＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号：８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号：９）又 は配列番号：１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ 、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、 Ｑ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ 、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、及びＲからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ５は Ｓ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、及 び／又はアミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、及びＱからなる群から選択さ れ、及び／又はアミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及 びＴからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳ からなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群から選 択され、及び／又はアミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ、及びＶからなる群から選択され、 及び／又はアミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ、及びＳからなる群から選択され；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここで、Ｂ１−Ｂ８はＫＹＡ ＳＱＳＩＳ（配列番号：２）；ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：６７、又はＸａａＹＡＳＱ ＳＩＳ（配列番号：６８、ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）、及び／又はアミノ酸 Ｂ４がＳ及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群 から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ、及びＲからなる群から選択され、 及び／又はアミノ酸Ｂ７はＩ、Ｖ、Ｅ及びＫからなる群から選択され；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここで、Ｃ１−Ｃ９はＱＱ ＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号：３）又は配列番号：３の変異体であり、ここで、アミノ酸Ｃ ８がＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、及びＹからなる群から選択 され；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦ ＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号：４）であり；
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここで、Ｅ１−Ｅ１７はＧＹ ＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：５）であるか、又は配列番号：５の変異体 であり、ここで、アミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群から選択され、及び／又は アミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹ からなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ、及びＤからなる群か ら選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１３はＰ、Ｈ、Ｄ、及びＡからなる群から選択され、 及び／又はアミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１ ７はＳ及びＧからなる群から選択され；
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここで、Ｆ２−Ｆ１１はＭ ＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：６６）であ るか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここで、Ｆ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹ ＦＤＦ（配列番号：６３）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：６４）、又はＡＱＴＧ ＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：６５）、又は配列番号：６、６３、６４、６５、又は６６の 変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２がＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、及び／又はア ミン酸Ｆ１１がＦ及びＹからなる群から選択される、（１３）。
（１７）前記抗体が３個の重鎖高頻度領域（ＨＶＲ−Ｈ１−Ｈ３）配列と３個の軽鎖高頻 度領域（ＨＶＲ−Ｌ１−Ｌ３）配列を含み、ここで、
（ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：９を含み；
（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号：２を含み；
（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号：３を含み；
（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号：４を含み；
（ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号：５を含み；及び
（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号：６又は配列番号：６３又は配列番号：６４又は配列番 号：６６を含む、（１６）の方法。
（１８）前記サンプルが前記患者の末梢血サンプルである、（１）、（２）又は（３）の 方法。
（１９）健康な個体と比較した場合、患者の減少した割合が、疾患の予後を示す、前記患 者の血液サンプル中の腸ホーミングリンパ球の量と末梢ホーミングリンパ球の量の割合と 健康な個体の血液サンプル中の腸ホーミングリンパ球の量と末梢ホーミングリンパ球の量 の割合を比較することを含む患者の炎症性腸疾患の予後を予測する方法。
（２０）バイオマーカーが患者の末梢血の腸ホーミングリンパ球、腸ホーミングリンパ球 における治療剤の占有率、及び腸ホーミングリンパ球上のベータ７インテグリンレセプタ ーからなる群から選択される、候補医薬を用いた治療に応答して非ヒト検体の末梢血にお けるバイオマーカーの量が効果的に増加する投与量に基づく患者の有効な投与量の決定を 含む、消化管炎症性障害と診断された患者の候補医薬を用いた治療の設計方法。
（２１）非ヒト検体がサルである、（２０）の方法。
（２２）前記医薬が抗ベータ７インテグリン抗体である、（２０）の何れか一に記載の方 法。
（２３）前記リンパ球を、配列番号：２５の軽鎖可変領域配列と配列番号：２６の重鎖可 変配列を含む抗体と同じエピトープに結合する、単離抗体に結合させることを含む、アル ファＥベータ７インテグリンを発現するリンパ球及びアルファ４ベータ７インテグリンを 発現するリンパ球及びアルファＥベータ７及びアルファ４ベータ７の両者を発現するリン パ球を含むリンパ球の個体群の同定方法。
（２４）前記リンパ球を炎症性腸疾患と診断された患者の末梢血から得る、（２３）の方 法。
（２５）前記リンパ球を炎症性腸疾患と診断された患者のリンパ節及び腸の組織から得る 、（２３）の方法。
本発明の更なる詳細は、以下の非限定の実施例によって示される。明細書の全ての引用文献の開示は、参照によりここに明確に取り込まれる。
実施例１
薬物動態学的効果の逆転の評価のための１５週回復段階と伸展段階のカニクイザルにおける静脈内及び皮下注射によって週毎にｒｈｕＭＡｂベータ７を投与した１２週安全性と毒物動態学試験
１．概要
ｒｈｕＭＡｂベータ７は、インテグリンαＥβ７とα４β７に結合するヒト化抗ヒトインテグリンベータ７モノクローナル抗体である。これらのインテグリンを発現する細胞は、潰瘍性大腸炎及びクローン病（Feagan等2005; Sandborn et al. 2005）のような腸の炎症性疾患に関連する。ｒｈｕＭＡｂベータ７は、炎症性腸疾患のような疾患を介した免疫系の潜在的な治療として調べられている。この試験の目的は、カニクイザル（Macaca fascicularis）に少なくとも１２週間、静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）投与によって週毎に投与した際の、ｒｈｕＭＡｂベータ７の安全性、毒物動態、及び薬物動態を評価し、１５週の回復の後の任意の薬剤関連効果の可逆性、耐性、及び発生の遅延を評価することである。さらに、コントロール、中間、及び高投与のグループの動物のサブセットを、薬物動態効果の逆転を評価するために解剖前（伸展段階）の付加的な期間に観察した。
ナイーブのカニクイザルは、６個のグループ（グループ１、３、４、５中の７の動物／性／グループ、グループ２中の６及び５の動物／性）に指定される。グループ１の動物は、ＩＶ及びＳＣ投与によってビヒクルを合計１２回、週毎に投与した。グループ２から６中の動物に、合計１２回、週毎にｒｈｕＭＡｂベータ７を、それぞれ、５ｍｇ／ｋｇのＩＶ（グループ２）、１５ｍｇ／ｋｇのＩＶ（グループ３）、５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ（グループ４）、１５ｍｇ／ｋｇのＳＣ（グループ５）、又は５０ｍｇ／ｋｇのＳＣ（グループ６）のＩＶ投与した。１２週の投与段階のに続いて、各投与グループから３匹の雄及び３匹の雌を、最終投与の２日後の実験８０日目に解剖した。残りの動物は、回復段階中の更なる１５週において観察した。回復段階の終わりにおいて（実験１８４日）、２匹の性／グループを解剖した。１５週の回復解剖の後、残りの動物（グループ１及び３のそれぞれの２匹の雄及び１匹の雌並びにグループ４、５、及び６のそれぞれの２匹の雄及び２匹の雌）を、ＰＤ効果の逆転を評価するために観察した。ＰＤの終点は、この伸展段階において監視し、結果を実験の生存段階の終点を決定するために使用した。
ホーミングの特性によって分割される末梢血ＣＤ４＋の３個のサブセットは、診査のＰＤマーカーとしてフローサイトメトリーによって監視された：ＣＤ４５ＲＡ−β７高、
ＣＤ４５ＲＡ−β７低、及びＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体ＣＤ４＋細胞（図１を参照）。ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋細胞は末梢リンパ節及び組織に選択的にホーミングするヒト及びマウスメモリー／エフェクターリンパ球にフェノタイプが類似している（Rott等1996; Rott等1997; Williams等1998; Rose等1998; Williams and Butcher 1997; Butcher等199）。
ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均値は、５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７のＩＶ投与後の投与段階中、ベースラインレベルの約４から５倍増加した。１５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７（ＩＶ又はＳＣ）の投与は、ベースラインと比較して、投与段階において、ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均数のわずかに大きい増加（約５から６倍）の結果となった。一般的に、１５又は５０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ又はＳＣ）を投与した動物の多数は、５ｍｇ／ｋｇの投与量のグループ中の動物の多数と異なり、投与過程においてＰＤ効果を維持した。ビヒクルを与えた動物は、末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均数の有意な変化を示さなかった。ＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体ＣＤ４＋リンパ球とＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均数は、ビヒクル又はｒｈｕＭＡｂベータ７を投与したカニクイザル中ので有意な差はなかった。これらの結果は、ｒｈｕＭＡｂベータ７の提案された作用機序、すなわち、α４β７のそのリガンドへの結合を阻害することを介した、腸へのβ７ポジティブリンパ球のホーミングの阻害に一致する。この提案された機序は、末梢循環中のＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の蓄積の結果になると予測される。
１５週の回復段階（試験１８４日目）の終わりまでに、 ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の数は、５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７のグループＩＶの投与量における全ての（１０中１０）のベースラインレベルに回帰した。１５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７をＩＶ投与したグループでは、ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の数は、それぞれ、１３匹の動物中の７匹及び１４匹の動物中の２匹がベースラインレベルまで回帰した。１５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７をＳＣ投与したグループでは、ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の数は、それぞれ、１４匹の動物中の６匹及び１４匹の動物中の１匹がベースラインレベルまで回帰した。このように、ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の絶対数のベースラインレベルへの回帰速度は、投与量に依存しているようだ。ＰＤ伸展段階（試験２８８日目）の終わりまでに、ｒｈｕＭＡｂベータ７の投与し試験中生存した全てのカニクイザル（１５ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与したグループでｎ＝３及び５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ、１５ｍｇ／ｋｇのＳＣ、又は５０ｍｇ／ｋｇのＳＣ投与したグループの各々でｎ＝４）、はＰＤ効果の逆転（ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のベースラインへの回帰）を示した。
さらに、観察された可逆性及びＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のベースラインレベルへの回帰が、ｒｈｕＭＡｂベータ７のクリアランスと関係し、可逆性が投与依存的であったようなので、ＰＤ効果は薬物動態と関連するようであった。
プレ投与レベルへのＰＤ効果の回帰速度について同じ投与グループの動物間の変動性は、ｒｈｕＭＡｂベータ７のクリアランスの変化に関係した。
２．安全性、毒物動態及び薬力学
カニクイザル（Macaca fascicularis）に少なくとも１２週間、静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）投与によって週毎に投与した際の、ｒｈｕＭＡｂベータ７の安全性、毒物動態、及び薬物動態を評価し、１５週の回復の後の任意の薬剤関連効果の可逆性、耐性、及び発生の遅延を評価した。さらに、コントロール、中間、及び高投与のグループの動物のサブセットを、薬物動態効果の逆転を評価するために解剖前（伸展段階）の付加的な期間に観察した。
２．１ 実験材料
１５０ｍｇ／ｍＬ（バイアル毎の１．３ｍＬ）の濃度の透明液体として、ｒｈｕＭＡｂベータ７、ＬｏｔＭ３ＴＯＸ１６５はジェネンテックから提供された。実験に使用する前に、試験薬剤は２℃から８℃の範囲の温度を維持するように設定された冷蔵庫に保存した。
２５ｍＬのバイアル中の透明液体として、ｒｈｕＭＡｂベータ７ビヒクル、ＬｏｔＭ３ＴＯＸ１６６はジェネンテックから提供された。実験に使用する前に、試験薬剤は２℃から８℃の範囲の温度を維持するように設定された冷蔵庫に保存した。
２．２ 種
モーリシャス起源の雄と雌のナイーブのカニクイザル（Macaca fascicularis）は、Covance Research Products, Inc. (Harrisburg, PA)から取得した。動物は投与前約４週間順応させた。
７匹の雄と４７匹の雌の動物は、この実験において使用する可能性があるために最初に順応させた。順応中（投与前段階）において収集したデータを、最小の変動にするために、実験選択の考慮から動物を取り除くために使用した。４０匹の雄と４０匹の雌のカニクイザルをグループに関して体重バランスを達成するために設計したコンピュータ化された処理を用いて実験のために指定した。
２．３ 実験設計
この実験は３段階を含む：１２週の投与段階、１５週の回復段階、及び伸展段階。１２週の投与段階は、ｒｈｕＭＡｂベータ７を最終投与いた２日後の、実験８０日目の解剖において終了した。１５週の回復段階は、１２週の投与段階に続き、実験１８４日目の解剖で終了した。１５週の回復段階に続き、ＰＤ効果の逆転を評価するために付加的な期間（実験２８８日目を通じた伸展段階）があった。完全な実験設計は、表１に要約した。
Figure 0006219556
ＩＶ＝静脈内；ＳＣ＝皮下。
ａ１２週の投与段階（最終投与の２日後）に続き、３匹の動物／性／グループを安楽死させた。グループ４、５、及び６からの２匹の動物／性／グループとグループ１と３からの２匹の雄及び１匹の雌の動物／グループをＰＤ効果の逆転を評価するための解剖の前の付加的な期間に観察した。ＰＤ終点は伸展段階の間に監視し、結果を終了のタイミングを決定するために使用した。
ｂ実験日１、８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、６４、７１、及び７８日目に動物に投与した。
ｃグループ１の動物はＩＶ及びＳＣ投与によってビヒクル（コントロール）を投与した。
ｄグループ５及び６はＭＡｂベータ７のＳＣ注射のみ行った。
２．５ 投与
動物は、実験日１、８、１５、２２、２９、３６、４３、５０、６４、７１、及び７８日目に伏在静脈又はＳＣ注射で１２回の週毎ＩＶ注射を行った。ＳＣ投与の注射部位は記録した。投与量は直近に記録した体重を基に決定した。動物は体重のｋｇ毎に０．３３ｍＬの用量で投与した。ＩＶ投与の後に約１ｍＬの食塩水でフラッシュした。
これらの偏差は記録して、ＰＤ結果の解釈に影響を与えなかった。
２．６ ＰＤ血液サンプル回収
実験１日目、実験２日目（第一の投与の２４時間後）の投与前、実験１５、２９、４３、５７、７１、及び７８、及び８０日目の投与前、解剖前のＰＤ解析のための血液サンプル（約１ｍＬ）を静脈穿刺によってそれぞれの動物の大腿静脈からプレ投与段階で１度回収した（投与開始の約６日前）。１５週の逆転段階（Ｒ）の間、サンプルは実験の９２（Ｒ１３）、１０６（Ｒ２７）、１２０（Ｒ４１）、１３４（Ｒ５５）、１４８（Ｒ８３）、及び１８４（Ｒ１０５）日目に回収した。伸展段階において、ＰＤ効果の逆転を評価するために、実験の１９０日目（Ｒ１１１）から開始し、最後の解剖の日（実験２８８日目）まで、血液サンプルを、隔週で、生存している全ての動物から回収した。
２．７ 血液サンプル加工
ＰＤ解析のサンプルは少なくとも７２時間、約２℃から１５℃の温度範囲に維持し、回収した日にジェネンテックに輸送するために、冷蔵ゲルパックにパックした。
２．８ ＰＤフローサイトメトリー
末梢血ＣＤ４＋リンパ球のサブセットは、診査のＰＤバイオマーカーとしてフローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ４５ＲＡ−β７高細胞（腸リンパ節及び組織に選択的にホーミングするヒトメモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球にフェノタイプが類似）、ＣＤ４５ＲＡ−β７低細胞（末梢リンパ節及び組織に選択的にホーミングするヒトメモリー／エフェクターＣＤ４＋リンパ球にフェノタイプが類似）(Rott et al. 1996; Rott et al. 1997; Williams et al. 1998; Ros? et al. 1998; Williams and Butcher 1997; Butcher et al. 1999)。ＣＤ４＋リンパ球サブセットの代表的なフローサイトメトリープロットを図１に示す。末梢血ＣＤ８＋リンパ球（ＣＤ４５ＲＡ−β７高、ＣＤ４５ＲＡ−β７低、ＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体ＣＤ８＋リンパ球）のサブセットを類似の方法で調べたが、ＰＤ評価には用いなかった。
２．８．１ 発現アッセイ： 末梢血中のβ７発現リンパ球の評価
ＣＤ４５ＲＡ−β７高、ＣＤ４５ＲＡ−β７低、及びＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体ＣＤ４＋またはＣＤ８＋リンパ球をｒｈｕＭＡｂベータ７の存在下β７に結合する非ブロッキング抗７抗体（９Ｄ８）を用いてフローサイトメトリーによって評価した。全血サンプルの解析のためのパネル配置を表２に示した。 Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)から購入した、ストレプトアビジンアロフィコシアニン（ＳＡ ＡＰＣ）及びジェネンテックから提供された９Ｄ８ビオチンを除く、全ての抗体はBD Biosciences (BD; San Jose, CA)から購入した。
Figure 0006219556
ＡＰＣ＝アロフィコシアニン；ＦＩＴＣ＝蛍光イソチオシアネート；ＦＳＣ＝前方散乱；ＩｇＧ＝イムノグロブリンＧ；ＰＥ＝フィコエリセリン；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５＝ペリジニンクロロフィルタンパク質−シアニン−５．５；ＳＡ＝ストレプトアビジン；ＳＳＣ＝側方散乱。
ａ９Ｄ８−ビオチンは、ＳＡ−ＡＰＣを添加する前に最初にインキュベートした。
全ての全血液サンプルについて、５５６５６−４３の手順に従ってフローサイトメトリーを行った。それぞれのサンプルについて、試験管２及び３を飽和濃度の９Ｄ８ビオチンと伴に最初にインキュベートした。機器のセットアップコントロールチューブ（アイソタイプコントロールと単一株）及びアッセイチューブ（試験管１、２、及び３）を手動で準備した。最初のインキュベーションの後、２ｍＬの溶解溶液を赤血球細胞を溶解するために添加し、細胞洗浄を１サイクル行った。第２のインキュベーションについて、サンプル（試験管２及び３）を、ＣＤ４５ＲＡ（クローン５Ｈ９）及びＣＤ４９ｄ（クローン９Ｆ１０）と伴に、飽和濃度のＣＤ４（クローンＬ２００）（試験管２）またはＣＤ８（クローンＳＫ１）（試験管３）に対する蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体とインキュベートした。アイソタイプコントロール抗体を除き、上記で述べた抗体のそれぞれは、カニクイザル白血球と交差反応する。ＳＡ ＡＰＣは、またビオチン化した抗体を検出するために試験管１、２、及び３に添加した。インキュベーションは３０から３０３３３３０分間氷上暗室で行った。洗浄ステップを連続して行い、次いで細胞を固定バッファーに再懸濁させた。サンプルは、２℃から４℃で最小３０分間保持し、同日に得た。
フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳCalibur（登録商標）(BD、シリアル番号E2020)で行った。２５０００リンパ球イベントを、前方散乱（ＦＳＣ）／側方散乱（ＳＳＣ）プロットを用いて得た。データ解析は、CellQuest Proソフトウェア(PD CellQuest Pro、バージョン５．２．１)を用いて、ＦＳＣ／ＳＳＣでゲートしたリンパ球及びＣＤ４＋／ＳＳＣ低でゲートしたリンパ球又はＣＤ８＋／ＳＳＣ低でゲートしたリンパ球に基づいた。フローサイトグラムは、それぞれの細胞表面マーカーに陽性の細胞の画分を確立するために得た。
β７亜集団は、幾何学平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として、個別に、ゲートしたＣＤ４＋細胞又はゲートしたＣＤ８＋細胞のパーセンテージとして解析した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の細胞表面上のβ７の相対レベルを解析するために、可溶性蛍光分子数（ＭＯＥＦ）をSpheroTechビーズ（Spherotech, Inc.; Lake Forest, IL）を用いて得た標準曲線を用いて各集団のＧＭＦＩを積算することによって計算した。ＧＭＦＩとゲートした細胞のパーセンテージは、３つのＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球サブセットのそれぞれの被験物質の効果を調べるための実験を通じて監視した。絶対細胞カウントはそれぞれの時間点においてそれぞれのサンプルについて、末梢血のマイクロリットル毎のリンパ球のカウントに基づいて計算した（Covanceによって提供される）。
２．８．２ 占有率アッセイ：末梢血における利用可能なＣＤ４５ＲＡ-β７高リンパ球
ＣＤ４５ＲＡ-β７高ＣＤ４＋リンパ球とＣＤ４５ＲＡ-β７高ＣＤ８＋リンパ球上の占有率は、ｒｈｕＭＡｂベータ７の飽和濃度の存在下で結合しないブロッキング抗β７抗体（蛍光ラベルした被験物質、ｒｈｕＭＡｂベータ７）を用いて測定した。蛍光コンジュゲートしたハーセプチン、ヒト化ＩｇＧ１抗体をｒｈｕＭＡｂベータ７のアイソタイプのコントロールとして使用した。
全血サンプルの解析のためのパネル配置は表３に示した。ジェネンテックから提供される、ハーセプチンアレクサ６４７及びｒｈｕＭＡｂベータ７アレクサ６４７を除いて、全ての抗体はＢＤから購入した。
Figure 0006219556
Alx647＝アレクサ６４７；ＦＩＴＣ＝蛍光イソチオシアネート；Ｈｅｒ＝ハーセプチン；ＰＥ＝フィコエリテリン；ＰｅｒＣＰ＝ペリジニンクロロフィルタンパク質。
以下の抗体コンジュゲートの飽和濃度を用いて、処理５５６５６−５０にしたがって血液サンプルを染色した：蛍光イソチオシアネートにコンジュゲートしたＣＤ４（ＦＩＴＣ；クローンＭ−Ｔ４７７）、フィコエリテリンにコンジュゲートしたＣＤ４５ＲＡ（ＰＥ；クローン５Ｈ９）、ＰｅｒＣＰにコンジュゲートしたＣＤ８、及びアレクサ６４７にコンジュゲートしたハーセプチン又はアレクサ６４７にコンジュゲートしたｒｈｕＭＡｂベータ７。試験管３中、ｒｈｕＭＡｂベータ７を飽和濃度（１０μｇ／ｍＬ）において末梢血サンプルに添加した。
全てのインキュベーションは３０から３５分間暗室氷上で実施した。染色後、赤血球細胞を溶解し、サンプルを洗浄し、細胞をLyse Wash Assistant (BD)固定液に再懸濁した。２５０００のゲートしたリンパ球イベントをＦＳＣ／ＳＳＣゲートを用いてBD ＦＡＣＳCaliburで得た。
リンパ球は、ＳＳＣ／ＦＳＣ散布図から同定した。ＣＤ４及びＣＤ８細胞は次いでそれぞれＳＳＣ／ＣＤ４ＦＩＴＣ又はＳＳＣ／ＣＤ８ＰｅｒＣＰプロットを使用して同定した。試験管１はゲートのためのネガティブコントロールとして使用した。ＣＤ４５ＲＡ−β７高、ＣＤ４５ＲＡ−β７低、及びＣＤ４５ＲＡ−β７中間体ＣＤ４細胞又はＣＤ８細胞は、飽和濃度のｒｈｕＭＡｂベータ７の存在下及び非存在下の試験管を用いて同定した。図１はカニクイザル末梢血中のＣＤ４リンパ球サブセットを示す。
２．９ＰＤデータ解析
プレ投与時のベースラインレベルのパーセンテージとしての絶対カウント（絶対カウント、％ＢＬ）を、ビヒクル又はｒｈｕＭＡｂベータ７を与えた動物から得たサンプル中の各時間点における、ＣＤ４＋リンパ球（ＣＤ４５ＲＡ−β７高、ＣＤ４５ＲＡ−β７低、及びＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体）及びＣＤ８＋リンパ球サブセット（ＣＤ４５ＲＡ−β７高、ＣＤ４５ＲＡ−β７低、及びＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体）のそれぞれについて計算した。ベースラインのパーセンテージとしての、各絶対カウントの平均値は、それぞれのグループについて決定した。雌については、２個のプレ投与値は、全てのフローサイトメトリー評価についてベースライン値を計算するために使用した。雄について、技術的な困難（機器の欠陥）のため、一のプレ投与値のみ（試験１日目）を９Ｄ８非ブロッキング抗体を用いた発現アッセイのベースライン値を計算するために使用した。表３に表示される血液パネル位置を用いたフローサイトメトリー解析から（パーセンテージとして）得た全ＣＤ４＋リンパ球と全ＣＤ８＋リンパ球についてのゲートした値は、占有率と発現アッセイの両者において、それぞれ、全ＣＤ４＋リンパ球と全ＣＤ８＋リンパ球の絶対カウントを計算するために使用した。図１はカニクイザル末梢血中のＣＤ＋リンパ球サブセットを示す。フローサイトメトリーによって決定される値の定義は以下の通りである：
絶対カウント：リンパ球のそれぞれのサブセットの絶対カウント；絶対リンパ球のカウント（末梢血のマイクロリットル毎のリンパ球として表される血液学測定から得た値）に等しくそれぞれのサブセットのゲートしたリンパ球のパーセンテージをかける（フローサイトメトリーから得た）。
絶対カウント（％ＢＬ）：投与前に得たベースラインＡｂｓカウントのパーセンテージとしての絶対カウント；プレ投与絶対カウントで割るＡｂｓカウントとして計算される。
ＭＯＥＧ：等しい蛍光の分子；ＦＬ４チャンネルの傾きを幾何学平均蛍光強度にかけて計算される
ＭＯＥＦ（％プレ投与）：投与前のＭＯＥＦのパーセンテージとしてのＭＯＥＦ；投与前の平均ＭＯＥＦで割った投与後のそれぞれの時間点におけるＭＯＥＦとして計算される。
３．結果と考察
非ブロッキング９Ｄ８抗体と伴に評価した末梢血ＣＤ４＋リンパ球のサブセットのグループ平均（±ＳＤ）と各々のカニクイザル絶対カウント（％ＢＬ）は、図２−７に示した。
ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均数は５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７（図２を参照されたい）のＩＶ投与後のベースラインレベルより約４から５倍増加した。１５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７（ＩＶ又はＳＣ）の投与は、ベースラインレベル（図２及び３を参照されたい）と比較して、ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均数のわずかに大きな増加の結果となった。一般的に、１５又は５０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ又はＳＣ）を投与した動物の多数は、５ｍｇ／ｋｇの投与量のグループ（、図１４から１８）中の動物の多数と異なり、投与過程においてＰＤ効果を維持した。ビヒクルを与えた動物は、ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均数の有意な変化を示さなかった（図２及び３を参照されたい）。ＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均数は、２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７をＩＶ投与した後のベースラインレベルの約４から６倍増加した（図８を参照されたい）。
これらの結果は、ｒｈｕＭＡｂベータ７の提案された作用機序、すなわち、腸へのＣＤ４５ＲＡ−β７高リンパ球の移行の阻害による、末梢循環中のこれらの細胞の蓄積に一致する（図１１）。提案された作用機序を支持する通り、ｒｈｕＭＡｂベータ７（図４から８）を投与した動物と比較し、ビヒクルを投与した動物中のＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体ＣＤ４＋リンパ球又はＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均レベルの有意な差はなかった（図４から８を参照されたい）。
１５週の回復段階（試験１８４日目）の終わりまでに、末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の数は、５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７のＩＶ投与したグループの１０中１０の動物がベースラインレベルに回帰した（図１４を参照されたい）。１５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇをＩＶ投与したグループでは、末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の数は、それぞれ、１３匹の動物中の７匹及び１４匹の動物中の２匹がベースラインレベルまで回帰した（図１５から１６を参照されたい）。１５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇをＳＣ投与したグループでは、末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の数は、それぞれ、１４匹の動物中の６匹及び１４匹の動物中の１匹がベースラインレベルまで回帰した（図１７から１８を参照されたい）。このように、観察されたＰＤ効果のベースラインへの回帰は投与依存的なようであった。わずかな変動性を示した（図１３を参照されたい）１匹の動物を除いて、ビヒクルを投与した末梢血中のＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球数の有意な変化はなかった（図１３を参照）。
ＰＤ伸展段階（試験２８８日目）の終わりまでに、ｒｈｕＭＡｂベータ７を投与し試験中生存した全てのカニクイザル（１５ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与したグループでｎ＝３及び５０ｍｇ／ｋｇのＩＶ、１５ｍｇ／ｋｇのＳＣ、又は５０ｍｇ／ｋｇのＳＣ投与したグループの各々でｎ＝４）、はＰＤ効果の逆転（ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のベースラインへの回帰；図１５から１８を参照）を示した。また、末梢血ＣＤ８＋リンパ球（ＣＤ４５ＲＡ−β７高、ＣＤ４５ＲＡ＋β７低、ＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体ＣＤ８＋リンパ球）のサブセットも調べ、類似の結果を得た。
末梢血ＣＤ４＋リンパ球上のβ７発現の相対レベルは、ＭＯＥＦとして調べた。５、１５、若しくは５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７のＩＶ投与又は１５若しくは５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７のＳＣ投与後のカニクイザル中の末梢血ＣＤ４＋リンパ球上のβ７の下方修正の証拠がなかった。
結論として、末梢血のＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のベースラインのレベルへの回帰速度は、ｒｈｕＭＡｂベータ７を与えたカニクイザル中で投与量依存的のようだ。また、１５又は５０ｍｇ／ｋｇ（ＩＶ又はＳＣ）を投与した動物の多数は、５ｍｇ／ｋｇの投与量のグループ中の動物の多数と異なり、投与過程においてＰＤ効果を維持した。さらに、観察した可逆性とＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のベースラインのレベルへの回帰は、ｒｈｕＭＡｂベータ７のクリアランスに関連し、投与依存的のようであるため、ＰＤ効果は、薬物動態学に関連するようだ。同じ投与グループの動物間のプレ投与レベルのＰＤ効果の回帰速度の変動率は、ｒｈｕＭＡｂベータ７のクリアランスの変化に関連した。これらのｒｈｕＭＡｂベータ７クリアランスの変化は、一般的に幾つかの動物中の抗治療的抗体（ＡＴＡ）の存在と関連していた（図１４−１８参照；）。
７．結論
ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球（フェノタイプが腸ホーミング細胞に類似）のグループ平均数は、カニクイザル中の５、１５、又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７のＩＶ又はＳＣ投与後の、プレ投与レベルと比較して約４から６倍増加した。対照的に、ビヒクルを投与した動物は、試験第１８４日目を通じて末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のグループ平均数の有意な変化を示さなかった。
これらの結果は、α４β７のそのリガンドへの結合阻害を介した、腸へのβ７ポジティブリンパ球のホーミングのｒｈｕＭＡｂベータ７阻害の作用機序に一致する。この提案された機序は、末梢循環中のＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の蓄積の結果となり、これは、実験で観察された。提案された作用機序を支持する通り、ｒｈｕＭＡｂベータ７を投与した動物と比較し、ビヒクルを投与したカニクイザル中のＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体ＣＤ４＋リンパ球（フェノタイプがナイーブのＣＤ４＋細胞に類似）又はＣＤ４５ＲＡ−β７低ＣＤ４＋リンパ球（フェノタイプが末梢血ホーミングＣＤ４＋細胞に類似）のグループ平均レベルの有意な差はなかった。
１５週の回復段階（試験１８４日目）の終わりまでに、末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の数は、５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７のグループＩＶの投与量における全ての（１０中１０）のプレ投与レベルに回帰した。１５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂベータ７を投与した動物では、末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の数は、ＩＶの投与グループの（それぞれ）１３匹の動物中の７匹及び１４匹の動物中の２匹及びＳＣグループの（それぞれ）１４匹中６匹及び１４匹中の１匹がプレ投与レベルまで回帰した。ＰＤ伸展段階（試験２８８日目）の終わりまでに、ｒｈｕＭＡｂベータ７を投与し試験中生存した全てのカニクイザルはＰＤ効果の逆転を示した。
これらの見解は、末梢血中のＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球のベースラインレベルに戻る際の見かけの投与依存性を示す。さらに、ｒｈｕＭＡｂベータ７のクリアランスに関連する観察された可逆性とＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋リンパ球の数のベースラインへの回帰ＰＤ効果は薬物動態学に関連するようであった。同じ投与量のグループにおける動物中のプレ投与レベルへのＰＤ効果の回帰速度における変動率は、幾つかの動物中のＡＴＡの存在に関連する、ｒｈｕＭＡｂベータ７のクリアランスの変化に関連した。
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実施例２
２３週で回収したカニクイザルに対する静脈内注射によって週毎に投与したｒｈｕＭＡｂβ７（ＰＲＯ１４５２２３）の４週間の試験的安全及び薬物動態学的評価
要約
ｒｈｕＭＡｂβ７（ＰＲＯ１４５２２３とも呼ぶ）は、ヒト及びカニクイザル（Macaca fascicularis）中のリンパ球上のαＥβ７及びα４β７に結合するヒト化イムノグロブリンＧ１（ＩｇＧ１）抗ヒトβ７抗体である。αＥβ７及びα４β７インテグリンを発現する細胞は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）のような、腸の炎症性疾患において重要な役割を有すると考えられている。ｒｈｕＭＡｂβ７はＣＤ及びＵＣのような炎症性腸疾患の患者の潜在的な治療法として調べられている。本実験の目的は、カニクイザルに４週間、週毎に静脈内（ＩＶ）投与した後のｒｈｕＭＡｂβ７の安全性、薬物動態学（ＰＫ）、及び薬力学（ＰＤ）効果を評価し、２３週間の回復期間における任意の薬剤関連の副作用効果の可逆性を特徴付けることである。カニクイザルのグループは、５又は２５ｍｇ／ｋｇにおけるビヒクル又はｒｈｕＭＡｂβ７の４回の週毎のＩＶ投与を行った。それぞれのグループからの３匹の雄と３匹の雌の動物を最終投与後の７日目に剖検した；ビヒクル及び２５ｍｇ／ｋｇの投与グループからの残りの動物（２／性／グループ）を剖検の前の最後の投与後の２３週間観察した。
全体として、４週間のＩＶ投与後のｒｈｕＭＡｂβ７の血液濃度−時間プロフィールは、緩やかな除去段階の後の速い初期分配段階を伴う二相変化であった。カニクイザルへの５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂの４週間のＩＶボーラス投与後、抗治療抗体（ＡＴＡ）が検知された場合を除いて、容器の血清濃度は第二の投与後に増加した。最初の投与後の０日目から７日目までの（ＡＵＣ０−７／投与）の血清濃度−時間プロフィールの投与平均化領域は５ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇ投与のグループについて類似しており、ｒｈｕＭＡｂβ７は、調べた投与領域におけるカニクイザル中の投与比例的な薬物動態を示すことを示唆した。２５ｍｇ／ｋｇ投与グループについて、第一の投与と比較して、ＡＵＣ０−７及び最大血清濃度（Ｃｍａｘ）は、最後の投与後に約２倍増加した。これらの見解は両者ともに、カニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇの４週間のＩＶ投与後にｒｈｕＭＡｂβ７の蓄積があったことを示唆した；しかし、このような蓄積は、これらの投与量における長い半減期を有する抗体について期待されたものである。２５ｍｇ／ｋｇの回収動物からのデータの比較解析は２．９３ｍＬ／日／ｋｇのクリアランスと比較的長い１４．５日の終末半減期が見積もられた。しかし、４匹中３のサルは、ｒｈｕＭＡｂβ７のより早いクリアランスに役立つであろうＡＴＡを有する。
末梢血Ｔ細胞の飽和と循環β７＋Ｔ細胞のレベルの増加が、ＰＤマーカーとして探索された。インテグリンβ７レセプター占有率アッセイは、末梢血Ｔ細胞サブセット上のβ７レセプターが、カニクイザルへの５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７の４週間の投与の第一回目の後、完全に飽和したことを示唆した。末梢血Ｔ細胞上のβ７レセプターの占有率は、血清濃度が約１から１０μｇ／ｍＬより大きく、利用可能なβ７検出が、ｒｈｕＭＡｂβ７の血清濃度の減少に関連した場合維持された。ＣＤ４５ＲＡ−β７高Ｔ細胞（ヒトとマウスにおける腸ホーミングＴ細胞にフェノタイプが類似）は、カニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇの４週間の投与の後、ベースラインレベルより約５倍増加した。同様に、ＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞にフェノタイプが類似）４週間の２５ｍｇ／ｋｇの投与（ベースラインよりも約２．５倍）の後にまた増加した。対照的に、ＣＤ４５ＲＡ−β７低Ｔ細胞は、実験を通じて安定のままだった。これらの結果は、ｒｈｕＭＡｂβ７の作用機序、すなわち、リガンドへのα４β７結合の阻害を介した腸へのβ７陽性リンパ球の輸送の阻害、次いで、末梢循環中のこれらの細胞の蓄積、と一致している。これらの現象は、カニクイザルにおける将来の実験においてさらに調べられるであろう。
導入
ｒｈｕＭＡｂβ７（ＰＲＯ１４５２２３とも呼ぶ）は、ヒト及び非ヒト霊長類中のリンパ球上のαＥβ７及びα４β７インテグリンに結合するヒト化イムノグロブリンＧ１（ＩｇＧ１）抗ヒトβ７抗体である。ｒｈｕＭＡｂβ７は、α４β７のＭａｄＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、及びフィブロネクチンとの相互作用を０．０７−０．１ｎＭの親和性（５０％最小阻害濃度［ＩＣ５０］）で阻害し、ＥカドヘリンのαＥβ７への結合をまた５ｎＭのＩＣ５０で阻害する。αＥβ７及びα４β７インテグリンを発現する細胞は、クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）のような、腸の炎症性疾患において重要な役割を有すると考えられている。ｒｈｕＭＡｂβ７はＣＤ及びＵＣのような炎症性腸疾患の患者の潜在的な治療として調べられている。
目的
この実験の目的は、カニクイザル(Macaca fascicularis)への４週間の週に一度の静脈内（ＩＶ）投与後のｒｈｕＭＡｂβ７の安全性、薬物動態（ＰＫ）、及び薬力学（ＰＤ）効果を評価し、２３週間の回復期間中の任意の被検物質関連の副作用の可逆性を特徴付けることである。本実験の目的は、ＰＫとフローサイトメトリー解析の結果を報告することである。
材料と方法
被検物質
ｒｈｕＭＡｂβ７（ＰＲＯ１４５２２３）、ロットＭ３ＴＯＸ１３２は、２０ｍｇ／ｍＬ（４．５ｍＬ／バイアル）の濃度で、透明からわずかにオパール色、無色から淡黄色液体としてジェネンテックから提供された。ｒｈｕＭＡｂβ７ビヒクル、ロットＭ３ＴＯＸ１３３は、また透明からオパール色、無色から淡黄色の液体（１０．５ｍＬ／バイアル）として提供された。本実験で使用される前に、被験物質は、２℃から８℃の温度範囲で維持されるように設定された冷蔵庫に保存された。
種
２６匹の被験物質−ナイーブのカニクイザルはＳＮＢＬ ＵＳＡストックコロニーから得られた。治療の開始時、動物は、２−６ｋｇで、２−５年齢であった。治療の開始前の少なくとも１週間順応させた。健康に見え、明らかな以上がない動物に限り本実験に使用した。
実験設計
動物は３つのグループのうちの一つにランダム化され、試験物質の４週間のＩＶ投与を行った。グループ１（５匹の雄と５匹の雌）の動物はｒｈｕＭＡｂβ７ビヒクルを投与した。グループ２（３匹の雄と３匹の雌）とグループ３（５匹の雄と５匹の雌）の動物はそれぞれ、５及び２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７を投与した。それぞれのグループの３匹の雄及び３匹の雌は、最終投与の７日後に終末剖検した。ビヒクル又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７を投与したグループからの２匹の雄及び２匹の雌は、回復剖検の前の約２３週間の回復期間追跡した。本実験は表２＿１にまとめた。
Figure 0006219556
Ｃｏｎｃ．＝濃度；ＩＶ＝静脈内。
注意：それぞれのグループの３匹の雄と３匹の雌は、検死動物として設計した。グループ１及び３からの残りの動物は回収した検死動物から設計した。
ａ投与体積は直近の体重に基づいて計算した。
投与準備
各グループの被験物質は、適切な濃度でジェネンテックより提供された。
投与
それぞれの投与体積は、投与の日に記録した体重に基づいて計算した。動物は伏在静脈をかいして被験物質を投与した。投与の直後、針が動物から除かれる前、投与装置は、約１ｍＬの０．９％のＮａＣｌでフラッシュした。
血液サンプル回収
全ての血液サンプルは、伏在、大腿骨、又は橈側皮静脈を介してニードル及びシリンジを用いて回収した。
ＰＫ解析
血液（約１．２ｍＬ）を、それぞれの動物から回収し、血清をＰＫ解析の次の時間点で回収した：
・試験一日目のプレ投与及び１５分及び６、２４、及び７２時間の投与後
・試験８及び１５日目のプレ投与
・試験２２日目のプレ投与及び最終投与の１５分及び６、２４、７２時間後。
・試験３６、４３、５０、５７、６４、７１、７８、８５、９２、９９、１０６、１１３、１２０、１２７、１３４、１４１、１４８、１５５、１６２、１６９、１７６、及び１８３日目。
・終末及び回収剖検の日（試験２９及び１９１日目）
しかし、ＰＫ解析については、時間点は、０日目において開始するように変更され、この報告では、０、０．０１０４、０．２５、１、３、７、１４、２１、２１．０１０４、２１．２５、２２、２４、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８４、９１、９８、１０５、１１２、１１９、１２６、１３３、１４０、１４７、１５４、１６１、１６８、１７５、１８２、及び１９０日目と呼ぶ。
抗治療抗体解析
ＰＫ解析に用いた同じ血清サンプルを抗治療抗体（ＡＴＡ）解析に使用した。ＡＴＡ応答は、以下の時間点で解析した：
・試験第１、８、１５及び２２日目のプレ投与
・試験５０、７１、９２、１１３、１３４、１５５、及び１７６日目。
・終末及び回収剖検（試験２９及び１９１日目）
しかし、ＡＴＡ解析については、時間点は、０日目において開始するように変更され、この報告では、０、７、１４、２１、２８、４９、７０、９１、１１２、１３３、１５４、１７５、及び１９０日目と呼ぶ。
フローサイトメトリー解析
血液（約１．５ｍＬ）をそれぞれの動物から回収し、次の時間点で、全リンパ球（Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びナチュラルキラー［ＮＫ］細胞）フローサイトメトリーアッセイ：
・８日目（プレ投与）
・一日目のプレ投与及び第一の投与後の２４時間
・１５日目のプレ投与及び第二の投与後の２４時間
・２２日目のプレ投与及び第三の投与後の２４時間
・４３、５７、７１、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、及び１８３日目
・終末及び回収剖検の日（試験２９及び１９１日目）
血液（約１．５ｍＬ）を占有率フローサイトメトリーの次の時間点においてそれぞれの動物から回収した：
・一日目のプレ投与及び第一の投与後の２４時間
・１５日目のプレ投与及び第二の投与後の２４時間
・２２日目のプレ投与及び第三の投与後の２４時間
・５７、８５、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、及び１８３日目
・終末及び回収剖検の日（試験２９及び１９１日目）
全ての占有及び非占有のβ７発現ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞解析のために、血液を次の時間点において、それぞれの動物から回収した。
・一日目のプレ投与及び第一の投与後の２４時間
・１５日目のプレ投与及び第二の投与後の２４時間
・２２日目のプレ投与及び第三の投与後の２４時間
・５７、９９、１１３、１２７、１４１、１５５、１６９、及び１８３日目
・終末及び回収剖検の日（試験２９及び１９１日目）
血液サンプル加工
ＰＫ及びＡＴＡ解析
回収の直後、サンプルは、血清分離試験管に移し、３０から８０分間室温で塊とした。サンプルを室温で１５分間２０００μｇで遠心した。血清を回収し、ラベルした１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。
フローサイトメトリー解析
回収の直後、フローサイトメトリー解析のための全血サンプルを実験プロトコルに記載のＳＮＢＬでヘパリンナトリウム化した試験管に移し、解析のためにジェネンテックに輸送した。サンプルを直ぐに氷上に置き、フローサイトメトリーによる解析まで２℃から８℃の温度範囲で保存した。
アッセイ
血清濃度
血清サンプルを合計のｒｈｕＭＡｂβ７レベルを定量的ＥＬＩＳＡで解析した。このアッセイは全てのサンプルについて、ノートブック４７８８６２７ドラフトアッセイ開発要約及びノートブック４７８８６２２ドラフト標準操作手順（ＳＯＰ）にしたがって行った。最初に、９６ウェルのマイクロリットルプレートは、ヤギの抗ヒトＩｇＧ重鎖及び軽鎖（Ｈ＆Ｌ）で被覆し、カニクイザル血清で前吸収した。この抗体は、結合部位（Birmingham, UK; カタログ AU003.CUS01; ロット 086001）から得、０．０５Ｍの炭酸ナトリウムで、１ｇ／ｍＬに希釈した。組換えヒトｒｈｕＭＡｂβ７（ロット４６９９４８、ジェネンテックが生産した）は、標準として使用した。標準曲線は、０．７８１から５０．０ｎｇ／ｍＬの範囲だった。標準曲線を決定するために使用する抗体、マトリックスコントロール、及びサンプルは、アッセイ希釈溶液（リン酸緩衝食塩水［ＰＢＳ］、０．５％、ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］、０．０５％のポリソルベート２０、０．０５％のプロクリン３００、０．２５％のＣＨＡＰＳ緩衝液、５ｍＭのエチレンジアミン４酢酸［ＥＤＴＡ］、０．３５ＭのＮａＣｌ）中で希釈した。サンプルは、１／２０の最小に希釈した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）でタグ化したヒツジ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ、サル血清でプレ吸収した）は、The Binding Site (カタログ CUS1684.H; ロット11245)から得、コンジュゲートとして使用した。シグナルはＨＲＰの基質としてテトラメチルベンジジンペルオキシダーゼを使用して得た。コントロールとサンプルからのデータは、希釈のために校正し；それぞれの希釈のための値は平均化した。ニートのカニクイザル血清のための最小定量化濃度は、アッセイ限界の１ｎｇ／ｍＬと１／２０の最小希釈に基づき２０ｎｇ／ｍＬであると決定された。
ＡＴＡ応答の決定
カニクイザルからの血清サンプルは、ｒｈｕＭＡｂβ７に対する抗体応答のレベルを決定するための架橋電気化学発光アッセイによって解析した。このアッセイは、ｒｈｕＭＡｂβ７に対する抗体についてのノートブック４７８８６−４８ドラフトアッセイ開発要約にしたがって実施された。ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ、サル血清をプレ吸収させた）に対するポリクローナル抗体は、The Binding Siteから得、代理ポジティブコントロールとして使用した。コントロールとサンプルは、サンプル希釈液（ＨＥＰＥＳ緩衝液、２％魚ゼラチン、０．０５％ポリソルベート２０、０．０５プロクリン３００、０．１５ＭのＮａＣｌ、０％のウシ胎児血清）中で希釈し、９６ウェルの丸底ポリプロピレンプレートに添加した。サンプルは最小の１／１０に希釈した。ビオチン化したｒｈｕＭＡｂβ７とＢＶタグしたｒｈｕＭＡｂβ７は、コンジュゲートとして使用した。翌日、ストレプトアビジンで被覆したダイナビーズＭ２８０（インビトロジェンCorp.; Carlsbad, CA）を、アッセイ希釈液（ＨＥＰＥＳ緩衝液、２％魚ゼラチン、０．５％ポリソルベート２０、０．０５％プロクリン３００、０．１５ＭのＮａＣｌ）中で希釈し、プレートに添加した。アッセイ応答は、電気化学発光ユニット中で測定した。切断点は、ネガティブコントロールの値に基づいて設定した。ｒｈｕＭａｂβ７抗体アッセイの最小の報告された力価は、１．０である。
フローサイトメトリー解析
末梢血中の全β７発現ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を発現する全β７は、ｒｈｕＭＡｂβ７よりも異なるエピトープを標的とした抗β７抗体、９Ｄ８を使用して測定した。全血サンプルの解析のためのパネル配置は、表２−２に提示した。
Figure 0006219556
ＦＳＣ＝前方散乱；ＳＡ＝ストレプトアビジン；ＳＳＣ＝側方散乱。
ａ９Ｄ８−ビオチンをＳＡ−ＡＰＣを添加する前に最初にインキュベートした。
全ての全血液サンプルについて、４８０３８−２９及び４８０３８−８４の手順に従ってフローサイトメトリーを行った。それぞれのサンプルについて、試験管２及び３を飽和濃度の、ｒｈｕＭＡｂβ７の存在下β７に結合する抗β７抗体である、９Ｄ８ビオチンと伴に最初にインキュベートした。機器のセットアップコントロールチューブ（アイソタイプコントロールと単一株）及びアッセイチューブ（試験管１、２、及び３）を手動で準備した。最初のインキュベーションの後、２ｍＬの溶解溶液を赤血球細胞を溶解するために添加し、細胞洗浄を１サイクル行った。第２のインキュベーションについて、サンプル（試験管２及び３）を、カニクイザルの白血球と交差反応すると知られている、ＣＤ４（クローンＭ-Ｔ４７７）、ＣＤ８（クローンＳＫ１）、ＣＤ４５ＲＡ（クローン５Ｈ９）、及びＣＤ４９ｄ（クローン９Ｆ１０）、に対する蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体、又はアイソタイプのコントロール抗体（試験管１）と伴にインキュベートした。ストレプトアビジン−ＡＰＣ（ＳＡ ＡＰＣ）を、またビオチン化した抗体を検出するために試験管１、２、及び３に添加した。両者のインキュベーションは６０から５分間氷上暗室で行った。固定化バッファー中で細胞を再懸濁する最終ステップを伴う洗浄ステップを連続して行った。サンプルは、２℃から４℃で最小３０分間保持し、同日に得た。
フローサイトメトリーは、シリアル番号Ｅ３９８２のＦＡＣＳCalibur（商標）(BD Biosciences; San Jose, CA)で行った。２５０００リンパ球イベントを、前方散乱（ＦＳＣ）／側方散乱（ＳＳＣ）プロットを用いて得た。データ解析は、CellQuest Proソフトウェア(PD CellQuest Pro、バージョン５．２．１)を用いて、ＦＳＣ／ＳＳＣでゲートしたリンパ球及び、併用する組み合わせに応じて、ＣＤ４＋／ＳＳＣ低又はＣＤ８＋／ＳＳＣ低でゲートしたＴ細胞の両者に基づいた。フローサイトグラムは、それぞれの細胞表面マーカーに陽性の細胞の画分を確立するために得た。
β７亜集団は、幾何学平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として、個別に、ゲートしたＴ細胞のパーセンテージとして解析した。それぞれの時間点における各サンプルについて、可溶性蛍光分子数（ＭＯＥＦ）をSpheroTechビーズによって得た標準曲線を用いて各集団のＧＭＦＩを積算することによって計算した。ＧＭＦＩとＣＤ４９＋９Ｄ８ｉｎｆ、ＣＤ４５ＲＡ−９Ｄ８高、ＣＤ４５ＲＡ−９Ｄ８低、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＡ−を発現する、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球のゲートした細胞のパーセンテージは、それぞれのサブセットの医薬の効果を調べるための実験を通じて監視した。各リンパ球サブセットについてのそれぞれの時間点においてそれぞれのサンプルについて、絶対細胞カウントはＳＮＢＬによって提供される末梢血のマイクロリットル毎のリンパ球のカウントに基づいて計算した。
β７亜集団は、幾何学平均蛍光強度（ＧＭＦＩ）として、個別に、ゲートしたＴ細胞のパーセンテージとして解析した。それぞれの時間点における各サンプルについて、可溶性蛍光分子数（ＭＯＥＦ）をSpheroTechビーズによって得た標準曲線を用いて各集団のＧＭＦＩを積算することによって計算した。ＧＭＦＩとＣＤ４９＋９Ｄ８ｉｎｆ、ＣＤ４５ＲＡ−９Ｄ８高、ＣＤ４５ＲＡ−９Ｄ８低、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＡ−を発現する、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔリンパ球のゲートした細胞のパーセンテージは、それぞれのサブセットの医薬の効果を調べるための実験を通じて監視した。各リンパ球サブセットについてのそれぞれの時間点においてそれぞれのサンプルについて、絶対細胞カウントはＳＮＢＬによって提供される末梢血のマイクロリットル毎のリンパ球のカウントに基づいて計算した。
末梢血中のＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上の占有率
全血サンプルの解析のためのパネル配置は、表２−３に提示する。
Figure 0006219556
Ｈｅｒ＝ハーセプチン。
以下の抗体コンジュゲートの飽和濃度を用いて、Laboratoryノートブック４７２３７、４０頁にしたがって血液サンプルを染色した：ＦＩＴＣにコンジュゲートしたＣＤ４（クローンＭ−Ｔ４７７）、フィコエリテリン（ＰＥ）にコンジュゲートしたＣＤ４５ＲＡ（クローン５Ｈ９）、ＰｅｒＣＰにコンジュゲートしたＣＤ８（クローンＳＫ１）、及びアレクサ６４７にコンジュゲートしたハーセプチン（登録商標）又はアレクサ６４７にコンジュゲートしたｒｈｕＭＡｂベータ７。試験管３について、試験物質ｒｈｕＭＡｂβ７（ＰＲＯ１４５２２３）は、飽和濃度（１０μｇ／ｍＬ）に希釈し、血液サンプルに添加した。
全てのインキュベーションは３０から３５分間暗室氷上で実施した。染色後、赤血球細胞を溶解し、サンプルを洗浄し、細胞をLyse Wash Assistant (BD)固定液に再懸濁した。２５０００のゲートしたリンパ球イベントを前方散乱／側方散乱ゲートを用いてBD ＦＡＣＳCalibur (BD Biosciences)で得た。
リンパ球は、ＳＳＣ／ＦＳＣ散布図から同定した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞は次いでそれぞれＳＳＣ／ＣＤ４ＦＩＴＣ又はＳＳＣ／ＣＤ８ＰｅｒＣＰプロットを使用して同定した。試験管１はゲートのためのネガティブコントロールとして使用した。β７高／ＣＤ４５ＲＡ−β７低／ＣＤ４５ＲＡ−、及びβ７中間体／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を示すリンパ球は、飽和濃度のｒｈｕＭＡｂベータ７の存在下及び非存在下の試験管を用いて同定した。ＧＭＦＩとゲートした細胞のパーセンテージに注目し、ＧＭＦＩは次いで、ＭＯＥＦがＦＬ４チャンネルのＧＭＦＩ（登録商標）の傾きであるＡＰＣのチャンネルの傾きを使用したＭＯＥＦとして表された。
全てのインキュベーションは３０から３５分間暗室氷上で実施した。染色後、赤血球細胞を溶解し、サンプルを洗浄し、細胞をLyse Wash Assistant (BD)固定液に再懸濁した。２５０００のゲートしたリンパ球イベントを前方散乱／側方散乱ゲートを用いてBD ＦＡＣＳCalibur (BD Biosciences)で得た。
リンパ球は、ＳＳＣ／ＦＳＣ散布図から同定した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞は次いでそれぞれＳＳＣ／ＣＤ４ＦＩＴＣ及びＳＳＣ／ＣＤ８ＰｅｒＣＰプロットを使用して同定した。試験管１はゲートのためのネガティブコントロールとして使用した。β７高／ＣＤ４５ＲＡ−β７低／ＣＤ４５ＲＡ−、及びβ７中間体／ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を示すリンパ球は、飽和濃度のｒｈｕＭＡｂベータ７の存在下及び非存在下の試験管を用いて同定した。ＧＭＦＩとゲートした細胞のパーセンテージに注目し、ＧＭＦＩは次いで、ＭＯＥＦ（登録商標）がＦＬ４チャンネルのＧＭＦＩの傾きであるＡＰＣのチャンネルの傾きを使用したＭＯＥＦとして表された。
末梢血リンパ球サブセットのフローサイトメトリー解析（全Ｂ細胞、Ｔ細胞、及びＮＫ細胞）
全血サンプルの解析のためのパネル配置は、表２−４に提示する。
Figure 0006219556
ＦＳＣ＝前方散乱；ＳＳＣ＝側方散乱。
全ての血液サンプルについて、フローサイトメトリーアッセイは、手順４８０３８−３６にしたがって実施した。サンプルは、適切なアイソタイプコントロールと伴に、カニクイザルリンパ球と交差反応することが知られている、蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体ＣＤ４（クローンＭ−Ｔ４７７）、ＣＤ４５（クローンＴＵ−１１６）、ＣＤ３（クローンＳＰ３４−２）、及びＣＤ２０（クローンＬ２７）飽和濃度と伴にインキュベートした。機器設定コントロール試験管とアッセイチューブは、手動で準備した。全てのインキュベーションは、暗室で、室温において３０から３５分間実施した。
ＰＫデータ解析
スケジュールからの最小の逸脱を伴う、名目上のサンプル回収時間をデータ解析に用いた。ｒｈｕＭＡβ７の平均（±ＳＤ）濃度を、ＭＳエクセル（Microsoft Corp.; Redmond, WA）ソフトウェアを使用してそれぞれの血清サンプルについて計算し、データ点はKaleidaGraph (Synergy Software; Reading, PA)を使用してプロットした。プレ投与の時間点を除いて、報告できるよりも小さい（ＬＴＲ）と決定された血清濃度は失ったとして処理され、ＰＫデータの提示又は解析には使用しなかった。ＰＫデータ計算について、実験一日目は、投与開始を示すためにＰＫ０日目と変更した（血液サンプル回収を参照されたい）。
非分画ＰＫ解析
第一の投与後の７日目までの５ｍｇ／ｋｇの投与グループの各動物からの血清濃度−時間データは、ＩＶボーラスインプットモデルを用いて解析した（モデル２０１、WinNonlin Pro, version 5.0.1; Pharsight Corporation; Mountain View, CA）。血清濃度が、第２又は第３の投与の後のＡＴＡによって影響を受けるので、５ｍｇ／ｋｇの投与グループの最後の投与の後のデータは、解析しなかった。第一及び最後の投与の７日間の２５ｍｇ／ｋｇの投与グループの各動物からの血清濃度−時間データは、ＩＶボーラスインプットモデル（モデル２０１）を使用してまた解析した。以下の方法は特定のＰＫパラメーターを見積もるために使用された：
Ｃｍａｘ：ＩＶ投与後の最大血清濃度
ＡＵＣ０−７：０からＰＫ７日目の血清−時間曲線の下の面積は、線形台形規則を使用して計算した。
ＡＵＣ２１−２８：ＰＫ２１日目からＰＫ２８日目の血清−時間曲線の下の面積は、線形台形規則を使用して計算した。
ＡＵＣａｌｌ：０から回収動物からのデータのＰＫ日の血清−時間曲線の下の面積は、線形台形規則を使用して計算した。
Ｖ１：中央分画への体積分布（投与／Ｃｍａｘ）
２分画ＰＫ解析。
ＩＶボーラスインプット、一次排泄、及びマイクロ速度定数を伴う２分画モデル(モデル 7, WinNonlin Pro, バージョン5.0.1) を２５ｍｇ／ｋｇ投与グループ中の４匹の回収動物からの平均濃度−時間データを解析するために使用した。以下のモデリングオプションと方法は、特定のＰＫパラメーターを見積もるために使用した：
Ａ、Ｂ、α、及びβの初期見積もりはＷｉｎＮｏｎｌｉｎによって視覚的に決定した。
WEIGHT＝−２を用いた加重分析
Nelder-Mead最小化アルゴリズムを使用した。
モデル選択は視覚検査とAkike's Information Criterion(AIC)のモデル比較によるフィットが良好であることに基づいた。
ＣＬ：クリアランス（投与／ＡＵＣ）
ｔ１／２，β：ベータ段階の半減期；終末半減期（ｌｎ［２］／β）
Ｖｓｓ：定常状態における体積分布（ＭＲＴｉｎｆ・ＣＬ）
アルファ及びベータ段階（それぞれ、Ａ及びＢ）、マクロ速度定数（α、β）、及び分画間ミクロ速度定数（ｋ１０、ｋ１２、及びｋ２１）に関連する０時間切片は表７に提示した。
フローサイトメトリー解析
ベースラインレベルのパーセンテージとしての絶対カウントを、ビヒクル又はｒｈｕＭＡｂベータ７で処理した動物についての実験の各時間点における、ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞サブセット（ＣＤ４５ＲＡ−β７高、ＣＤ４５ＲＡ−β７低、及びＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体）及びＣＤ４−ＣＤ３＋（ＣＤ８）Ｔ細胞、ＣＤ３−ＣＤ２０−（ＮＫ）細胞、及びＣＤ２０＋Ｂ細胞のそれぞれについて計算した。ベースラインのパーセンテージとしての、各絶対カウントは、グループ平均を計算するために、それぞれの治療グループ（ビヒクル、５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭａｂβ７、及び２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７）について平均化した。フローサイトメトリーによって決定される値の定義は以下の通りである：
絶対カウント：リンパ球のそれぞれのサブセットの絶対カウント；絶対リンパ球のカウント（末梢血のマイクロリットル毎のリンパ球として表される血液学測定から得た値）に等しくそれぞれのサブセットのゲートしたリンパ球のパーセンテージをかける（フローサイトメトリーから得た）。
絶対カウント（％ＢＬ）：投与前に得たベースラインＡｂｓカウントのパーセンテージとしての絶対カウント；プレ投与絶対カウントで割るＡｂｓカウントとして計算される。
ＭＯＥＧ：等しい蛍光の分子；ＦＬ４チャンネルの傾きを幾何学平均蛍光強度にかけて計算される
ＭＯＥＦ（％プレ投与）：投与前のＭＯＥＦのパーセンテージとしてのＭＯＥＦ；投与前の平均ＭＯＥＦで割った投与後のそれぞれの時間点におけるＭＯＥＦとして計算される。
結果と考察
ＰＫデータ解析
カニクイザルへの５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７の４週間のＩＶボーラス投与後、第一の投与後の１５分間の平均血清濃度は、１９６μｇ／ｍＬ（範囲：７０．９から３２６μｇ／ｍＬ）であった最終投与後の１５分間と比較して、１７３μｇ／ｍＬ（範囲：１２５から２０７μｇ／ｍＬ）であった。第２、３、及び４の投与前の平均の容器の血清濃度は、それぞれ、５６．５μｇ／ｍＬ（範囲：２８．７から７７．１μｇ／ｍＬ）、３５．１μｇ／ｍＬ（範囲：０．０４０１から９７．１μｇ／ｍＬ）、及び６０．２μｇ／ｍＬ（範囲：４．２９から１３７μｇ／ｍＬ）であった。この５ｍｇ／ｋｇ投与グループの全ての６匹のサルが、第二の投与後に検出されるＡＴＡ応答したので第二の投与後の容器の血清濃度の変動性は、ＡＴＡの存在によって説明され得る；１匹のサルは、第一のｒｈｕＭＡｂβ７の投与前に、陽性のヒト抗体離力価を有した。最小の容器の濃度である４匹のサルは、最高のＡＴＡ力価を有した。
カニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７の４週間のＩＶボーラス投与後、第一の投与後の１５分間の平均血清濃度は、１６９０μｇ／ｍＬ（範囲：１１３０から２２５０μｇ／ｍＬ）であった最終投与後の１５分間と比較して、９１７μｇ／ｍＬ（範囲：７４０から１０７０μｇ／ｍＬ）であった。第２、３、及び４の投与前の平均の容器の血清濃度は、それぞれ、３２５μｇ／ｍＬ（範囲：２４３から６７７μｇ／ｍＬ）、５３５μｇ／ｍＬ（範囲：２４０から７０９μｇ／ｍＬ）、及び５９４μｇ／ｍＬ（範囲：１９４から７７６μｇ／ｍＬ）であった。ｒｈｕＭＡｂβ７の減少した血清濃度と関連するＡＴＡ応答を示すこの投与グループの１０匹のサルのうち５匹（４匹の回収したサルのうち３匹）において、２５ｍｇ／ｋｇの投与レベルにおいてＡＴＡ応答もまたあった。ＡＴＡは、幾つかのサルにおいて第二の投与後に検出された；このグループの１匹のサルは、ｒｈｕＭＡｂβ７の第一の投与前にまた陽性のヒト抗体力価を有した。
５又は２５ｍｇ／ｋｇの４週間のＩＶ投与後の生存期間の２８日よりを越える血清濃度は図２３に提示する。比較のための５ｍｇ／ｋｇ投与グループにおける回収コホートがなかったので、生存期間（最終投与後の７日目まで）を越える血清濃度は、非分画解析によって比較した。結果は、第一の投与後の（ＡＵＣ０−７／投与）０日目から７日目からの血清濃度時間プロフィールの投与規格化領域が、５ｍｇ／ｋｇと２５ｍｇ／ｋｇの投与グループについて類似していることを示した（それぞれ、１１３±１７．０及び１１９±１５．８日・ｕｇ／ｍＬ／ｍｇ／ｋｇ；表５を参照されたい）。これは、ｒｈｕＭＡｂβ７が、実験の投与範囲においてカニクイザル中で投与比例薬物動態を示すことを示唆する。中央分画く（Ｖ１）への体積分布は、第一の５又は２５ｍｇ／ｋｇの投与後にまた類似した（それぞれ、２９．０±４．３０及び２７．７±３．５４ｍＬ／ｋｇ；表５を参照されたい）。これらの結果は両者ともカニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇの４週間のＩＶ投与後のｒｈｕＭＡｂβ７の蓄積があったことを示唆するが、このような蓄積は、これらの投与量において長い寿命を持つ抗体において期待される。５ｍｇ／ｋｇの投与グループの最終投与後のデータは、ＡＴＡが第二の投与後のｒｈｕＭＡｂβ７のＣＬに影響するので比較できなかった。
２５ｍｇ／ｋｇの４週間の投与後の２３週の回収期間からの４匹のサルからの平均データは、２分画モデルにフィットした（図２４を参照されたい）。最終投与後の血清濃度−時間プロファイルは、緩やかな排泄段階に続く速い一次分布を伴う二段階であった。分画分析は、２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７の４週間のＩＶ投与後の遅い２．９３ｍＬ／日／ｋｇのＣＬ及び比較的長い１４．５日のｔ１／２，βを見積もった（表２−６を参照されたい）。しかし、４匹のサルのうち３匹がＡＴＡを有し、おそらく、ｒｈｕＭＡｂβ７のクリアランスに寄与した。Ｖｓｓは、５６．９ｍＬ／ｋｇと見積もられ、ｒｈｕＭＡｂβ７が、末梢分画に殆ど残っていることを示唆した（表２−６を参照されたい。）２５ｍｇ／ｋｇの４週間のＩＶ投与後の全露出（ＡＵＣａｌｌ）は、回収動物からのデータの非分画解析から３３４００日・μｇ／ｍＬと見積もられた（表２−６を参照されたい）。
Figure 0006219556
ＡＵＣ０−７＝０からＰＫ７日目までの血清濃度−時間曲線の領域；
ＡＵＣ２１−２８＝ＰＫ２１日目からＰＫ２８日目までの血清濃度−時間曲線の領域；
Ｃｍａｘ＝ＩＶボーラス投与後の最大血清濃度；ＩＶ＝静脈内；
ＮＡ＝適用されず；ＰＫ＝薬物動態；Ｖ１＝中央画分への分配体積（投与／Ｃｍａｘ）。
Figure 0006219556
ＡＵＣ＝血清濃度−時間曲線の領域；ＣＬ＝除去；
ＩＶ＝静脈内；ＰＫ＝薬物動態；ｔ１／２，β＝ベータ半減期；ＶＳＳ＝定常状態における分配体積。
Figure 0006219556
Ａ、Ｂ＝それぞれアルファ及びベータ相と関連する０時間切片；α、β＝それぞれ、マクロ速度定数アルファ及びベータ；ｋ１０＝中央分画からの除去速度；ｋ１２、ｋ２１＝分画間速度定数。
フローサイトメトリー解析（免疫フェノタイピング及び薬物動態学）
末梢血ＣＤ４とＣＤ８Ｔ細胞のサブセットのグループ平均（±ＳＤ）カウントは、図３５から３８に提示する。
図３９から４０は、ｒｈｕＭＡｂβ７の血清濃度と個別のカニクイザル中の利用可能なβ７発現末梢血ＣＤ４＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞とＣＤ８＋β７高ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の関係を示す。ＣＤ４とＣＤ８のサブセット上の個別及びグループ平均（±ＳＤ）絶対カウント、β７発現、及び利用可能なβ７発現は、付録Ｅに提示する。
この研究のβ７レセプターの占有率はＣＤ４５＋又はＣＤ４５−として定義される末梢血ＣＤ４又はＣＤ８Ｔ細胞サブセット上の利用可能なβ７としてフローサイトメトリーにより解析した。フェノタイプがヒトのナイーブ及びメモリー／エフェクターＴ細胞と類似しているＣＤ４５ＲＡ＋及びＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞は、β７の中間体体高レベルを発現する（Ｔ細胞サブセットの代表的なＦＡＣＳドットプロットについては図２５を参照されたい）。ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４Ｔ細胞は腸部位に選択的にホーミングする。このアッセイからのデータは、５及び２５ｍｇ／ｋｇの両者の第一投与後のβ７の飽和、及びｒｈｕＭＡｂβ７の血清濃度の減少に関連するフリーのβ７の回帰を示した（上記のＰＫ／ＰＤの関係の節の図３２から３３を参照されたい）。この飽和データは、１から１０μｇ／ｍＬよりも大きいｒｈｕＭＡｂβ７の血清濃度が末梢血Ｔ細胞上のβ７レセプターの完全な飽和を維持するであろうことを示唆した。
末梢血T細胞上の全β７発現レベルは、フローサイトメトリーによってβ７を検出する非競合抗体を使用したｒｈｕＭＡｂβ７の投与後に調べた。５又は２５ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後のカニクイザルにおける末梢血Ｔ細胞上のβ７の下方修正の証拠はなかった（データ示さず）。末梢血の全β７細胞はβ７の検出のための同じ非分画抗体を使用してｒｈｕＭＡｂβ７の投与後にまた調べた。
ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヒトとマウスにおける腸ホーミングＴ細胞にフェノタイプが類似）は、カニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇの４週間の投与の後、ベースラインレベルより約５倍増加した。同様に、ＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体ＣＤ４＋Ｔ細胞（ナイーブＴ細胞にフェノタイプが類似）も４週間の２５ｍｇ／ｋｇの投与（ベースラインよりも約２．５倍）の後にまた増加した（図２７を参照されたい）。ビヒクル−コントロール動物のＣＤ４５ＲＡ−β７低Ｔ細胞又はＴ細胞サブセットにおける有意な変化はなかった（図２６及び２７を参照されたい）。類似の結果は、ＣＤ４５ＲＡ−β７高及びＣＤ４５ＲＡ＋中間体ＣＤ８＋Ｔ細胞に観察された。これらの結果は、この治療抗体の提案された作用機序である、β７を発現するリンパ球の腸への輸送阻害に一致する。
この仮説の裏付けとして、増加した末梢血中のＣＤ４５ＲＡ−β７高Ｔ細胞のパーセンテージは、ｒｈｕＭＡｂβ７による血液Ｔ細胞上のβ７レセプターの占有率と関係する。同様に、ｒｈｕＭＡｂβ７の占有率の損失（利用可能なβ７レセプターの検出）は、末梢血中のＣＤ４５ＲＡ−β７高Ｔ細胞のベースラインへの回帰と関連する。例えば、試験９９日目において、動物２４と２５の血液中のＣＤ４５ＲＡ−β７高Ｔ細胞のパーセンテージは、ベースラインレベルに減少した（図６を参照されたい）。この減少は、これらの特定のサルにおける試験９９日目のｒｈｕＭＡｂβ７によるβ７の占有率の減少と関連した（上記のＰＫ／ＰＤの関係における図３２及び３３を参照されたい）。対照的に、動物２３と２６は、試験９９日目に末梢血Ｔ細胞上の飽和β７レセプターを示し、血液中のＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋Ｔ細胞の絶対数はプレ投与レベルと比較して増加されたままだった（図２８を参照されたい。類似の結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットについても観察された。このように、β７レセプターの占有率は、血液中のＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋Ｔ細胞の増加したパーセンテージと関連し、腸部位への輸送の阻害と一致する。ＣＤ４５ＲＡ−とＣＤ４５ＲＡ＋末梢血Ｔ細胞のサブセットの増加は、下記の循環リンパ球中の観察された増加に寄与した。
２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７の週毎の投与は、第一の投与後に明らかであり、最終の投与後に増加するであろう、循環リンパ球中の穏やかな増加を引き起こす。２５ｍｇ／ｋｇの投与量グループにおけるカニクイザルは、ビヒクルコントロールグループ（図２９を参照されたい）の１．３倍の平均増加と比較してベースラインより約２．２倍の平均増加であった。ｒｈｕＭＡｂβ７の血清濃度が減少したので、プレ投与又はビヒクルのレベルまで２５ｍｇ／ｋｇの投与グループにおける絶対リンパ球カウントは回帰した、ｒｈｕＭＡｂβ７によるリンパ球β７レセプター占有率と関連する効果。したがって、この実験で明らかな循環リンパ球中の穏やかな増加は、一時的であり、ｒｈｕＭＡｂβ７の投与と関連し、上述の通り、リンパ球を発現するβ７の腸への輸送阻害に最も起因するようであった。末梢血リンパ球のカウントの増加は、Ｔ細胞における増加がより大きく、Ｂ細胞と比較して大きな持続性を示すが、Ｔ細胞及びＢ細胞の両者で明らかであった（図３０及び３１を参照されたい）。
ＰＫ／ＰＤの関係
インテグリンβ７レセプターの飽和と循環β７＋Ｔ細胞のレベルは、ＰＤマーカーとして使用した。カニクイザルへの５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７の４週間の投与後、末梢血Ｔ細胞上のβ７発現の下方修正の明らかな証拠は観察されなかった。しかし、末梢血Ｔ細胞上のβ７の飽和は、５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７の第一の投与後に観察され、脱飽和は（利用可能なβ７の検出）は、約１０μｇ／ｍＬよりも小さいｒｈｕＭＡｂβ７レベルにおける減少と関連するようであった（それぞれ、動物２３から２６及び図３３からのプロファイルについての図３２Ａ−Ｄを参照されたい。末梢血ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４Ｔ細胞上のβ７の占有率とこれらの細胞の増加した絶対数の関係は、ｒｈｕＭＡｂβ７の投与後にもまた観察された（図３４ＡからＤを参照されたい）。これらの結果は、１から１０μｇ／ｍＬよりも大きなｒｈｕＭＡｂβ７の血清濃度はが腸ホーミングＣＤ４＋細胞上のβ７の占有率を維持し、これらＴ細胞の腸へのホーミングを阻止し、代わりに末梢へのこれらの細胞の蓄積を起こし得ることを示唆する。
結論
カニクイザルへの５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７の４週間のＩＶボーラス投与後、ＡＴＡが形成した場合を除いて第二の投与後に容器の血清濃度が増加した。第一の投与後のＡＵＣ０−７／投与量は、５ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇの投与に類似し、ｒｈｕＭＡｂβ７が、試験した投与範囲における、カニクイザル中で投与比例薬物動態を示すことを示唆した。２５ｍｇ／ｋｇの投与グループについては、ＡＵＣ０−７とＣｍａｘは、第一投与と比較して最終投与後に約２倍増加した。これらの両者の結果は、予想されたとおり、カニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇの４週間のＩＶ投与後の、ｒｈｕＭＡｂβ７の蓄積を示唆する。２５ｍｇ／ｋｇの回収動物からのデータの比較解析は、２．９３ｍＬ／日／ｋｇの遅いＣＬと比較的長い１４．５日のｔ１／２，βを見積もった。
インテグリンβ７レセプター占有率アッセイは、末梢血Ｔ細胞サブセット上のβ７レセプターは、第一の４週間の５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７のカニクイザルへの投与後に完全に飽和したことを示唆した。利用可能なβ７の検出は、ｒｈｕＭＡｂβ７の血清濃度の減少に関係し、約１０ｇ／ｍＬより大きな血清濃度は、末梢血Ｔ細胞上のβ７レセプターの占有率を維持するであろう。ＣＤ４５ＲＡ−β７高Ｔ細胞（フェノタイプがヒトとマウスの腸ホーミングＴ細胞に類似）は、カニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇの４週間の投与後、ベースラインレベルよりも約５倍増加した。同様に、ＣＤ４５ＲＡ＋β７中 間体Ｔ細胞（フェノタイプがヒトナイーブＴ細胞に類似）は２５ｍｇ／ｋｇの４週間の投与後にまた増加した（ベースラインよりも約２．５倍大きい）。これらの結果は、ｒｈｕＭＡｂβ７の作用機序、すなわち、末梢循環へのこれらの細胞の蓄積につながる、α４β７のそのリガンドへの結合の阻害を介した、β７陽性リンパ球の腸への輸送の阻害と一致する。これらの現象は、さらにカニクイザルの将来の研究に展開するであろう。
付録２Ｆ
実験要約表
試験物質：ｒｈｕＭＡｂβ７
実験のタイプ：非ＧＬＰ、インビボ、複数回投与、安全性及び薬物動態学
方法：動物は３つのグループのうちの一つにランダム化され、試験物質の４週間のＩＶ投与を行った。グループ１（５匹の雄と５匹の雌）の動物は１．２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７ビヒクルを投与した。グループ２（３匹の雄と３匹の雌）とグループ３（５匹の雄と５匹の雌）の動物はそれぞれ、５及び２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７を投与した。それぞれのグループの３匹の雄及び３匹の雌は、最終投与の１週間後に終末剖検した。ビヒクル又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７を投与したグループからの２匹の雄及び２匹の雌は、回復剖検の前の約２３週間の回復期間追跡した。血清サンプルは合計のｒｈｕＭＡｂβ７レベルを測定するための定量的なＥＬＩＳＡとｒｈｕＭＡｂβ７に対する抗体の応答レベルを決定するための架橋電気化学発光によって解析した。合計の占有及び非占有β７発現ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット上の占有率、及びリンパ球サブセット（全てのＢ細胞、Ｔ細胞、及びナチュラルキラー細胞）をフローサイトメトリーによって解析した。薬物動態学データは、非分画及び２分画解析を行った。
結果：全体として、４週間のＩＶ投与後のｒｈｕＭＡｂβ７の血液濃度−時間プロフィールは、緩やかな除去段階の後の速い初期分配段階を伴う二相変化であった。抗治療抗体（ＡＴＡ）が検知された場合を除いて、容器の血清濃度は第二の投与後に増加した。最初の投与後の０日目から７日目までの（ＡＵＣ０−７／投与）の血清濃度−時間プロフィールの投与平均化領域は５ｍｇ／ｋｇ及び２５ｍｇ／ｋｇ投与のグループについて類似しており、ｒｈｕＭＡｂβ７は、調べた投与領域におけるカニクイザル中の投与比例的な薬物動 態を示すことを示唆した。２５ｍｇ／ｋｇ投与グループについて、第一の投与と比較して、ＡＵＣ０−７及び最大血清濃度（Ｃｍａｘ）は、最後の投与後に約２倍増加した。これらの見解は両者ともに、カニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇの４週間のＩＶ投与後にｒｈｕＭＡｂβ７の蓄積があったことを示唆した；しかし、このような蓄積は、これらの投与量における長い半減期を有する抗体について期待されたものである。２５ｍｇ／ｋｇの回収動物からのデータの比較解析は２．９３ｍＬ／日／ｋｇのクリアランスと比較的長い１４．５日の終末半減期が見積もられた。しかし、４匹中３のサルは、ｒｈｕＭＡｂβ７のクリアランスに役立つであろうＡＴＡを有する。インテグリンβ７レセプター占有率アッセイは、末梢血Ｔ細胞サブセット上のβ７レセプターは、第一の４週間の５又は２５ｍｇ／ｋｇのｒｈｕＭＡｂβ７のカニクイザルへの投与後に完全に飽和したことを示唆した。利用可能なβ７の検出は、ｒｈｕＭＡｂβ７の血清濃度の減少に関係し、約１−１０ｇ／ｍＬより大きな血清濃度は、末梢血Ｔ細胞上のβ７レセプターの占有率を維持するであろう。ＣＤ４５ＲＡ−β７高Ｔ細胞（フェノタイプがヒトとマウスの腸ホーミングＴ細胞に類似）は、カニクイザルへの２５ｍｇ／ｋｇの４週間の投与後、ベースラインレベルよりも約５倍増加した。同様に、ＣＤ４５ＲＡ＋β７中間体Ｔ細胞（フェノタイプがヒトナイーブＴ細胞に類似）は２５ｍｇ／ｋｇの４週間の投与後にまた増加した（ベースラインよりも約２．５倍大きい）。これらの結果は、ｒｈｕＭＡｂβ７の作用機序、すなわち、末梢循環へのこれらの細胞の蓄積につながる、α４β７のそのリガンドへの結合の阻害を介した、β７陽性リンパ球の腸への輸送の阻害と一致する。

Claims (31)

  1. 患者の消化管炎症性障害の治療のためのインテグリンベータ７アンタゴニストの効能を決定する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が、患者の消化管障害の治療のためのアンタゴニストの効能を示し、バイオマーカーが、インテグリンベータ７アンタゴニストによる腸ホーミングリンパ球上のベータ７含有インテグリンの占有率であって、ここで、腸ホーミングリンパ球が、ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋として同定される明確なリンパ球のサブグループである、方法。
  2. 消化管炎症性障害を有する患者のインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する応答性を予測するためのデータを取得する方法において、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の後又は間に患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量を、治療前の患者から得たサンプル中のバイオマーカーの量と比較することを含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が前記アンタゴニストを用いた治療への前記患者の応答性を示し、バイオマーカーが、インテグリンベータ７アンタゴニストによる腸ホーミングリンパ球上のベータ７含有インテグリンの占有率であって、ここで、腸ホーミングリンパ球が、ＣＤ４５ＲＡ−β７高ＣＤ４＋として同定される明確なリンパ球のサブグループである、方法。
  3. バイオマーカーの量の前記変化が増加又は減少である、請求項１又は２の方法。
  4. 前記変化が前記バイオマーカーの量における増加である、請求項２の方法。
  5. 前記バイオマーカーの量を、薬剤の第一の投与後の１００日以内に測定する、請求項３の方法。
  6. 前記バイオマーカーの量を薬剤の投与の少なくとも約２４時間後に測定する、請求項３の方法。
  7. 前記消化管炎症性障害が炎症性腸疾患である、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
  8. 前記炎症性腸疾患がクローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、請求項７の方法。
  9. 前記患者がヒトである、請求項８の方法。
  10. 前記インテグリンベータ７アンタゴニストが抗ベータ７抗体である、請求項７の方法。
  11. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１０の方法。
  12. 前記抗体がキメラ、ヒト又はヒト化抗体である、請求項１１の方法。
  13. 前記抗体が抗体断片である、請求項１０の方法。
  14. 抗体がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群から選択される６個の高頻度可変領域（ＨＶＲ）を含み、ここで：
    （ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸Ａ１ないしＡ１１からなるアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここで、Ａ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号：１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号：７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号：８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号：９）又は配列番号：１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、及びＲからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ５はＳ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、及びＱからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ、及びＳからなる群から選択され；
    （ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸Ｂ１ないしＢ８からなるアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここで、Ｂ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２）；ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２０）、又はＸａａＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２１、ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）又は配列番号：２、２０又は２１の変異体であり、アミノ酸Ｂ１がＫ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ及びＸａａ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）からなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ４がＳ及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ、及びＲからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ７はＩ、Ｖ、Ｅ及びＫからなる群から選択され；
    （ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸Ｃ１ないしＣ９からなるアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここで、Ｃ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号：３）又は配列番号：３の変異体であり、ここで、アミノ酸Ｃ８がＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、及びＹからなる群から選択され；
    （ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸Ｄ１ないしＤ１０からなるアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号：４）であり；
    （ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸Ｅ１ないしＥ１７からなるアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここで、Ｅ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：５）であるか、又は配列番号：５の変異体であり、ここで、アミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ、及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１３はＰ、Ｈ、Ｄ、及びＡからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１７はＳ及びＧからなる群から選択され；
    （ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸Ｆ２ないしＦ１１からなるアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここで、Ｆ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１９）であるか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここで、Ｆ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１６）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１７）、又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１８）、又は配列番号：６、１６、１７、１８、又は１９の変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２がＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、及び／又はアミノ酸Ｆ１１がＦ及びＹからなる群から選択される、請求項１１の方法。
  15. 前記抗体が３個の重鎖高頻度可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１−Ｈ３）配列と３個の軽鎖高頻度可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１−Ｌ３）配列を含み、ここで、
    （ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：９を含み；
    （ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号：２を含み；
    （ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号：３を含み；
    （ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号：４を含み；
    （ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号：５を含み；及び
    （ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３が配列番号：６又は配列番号：１６又は配列番号：１７又は配列番号：１９を含む、請求項１４の方法。
  16. 前記サンプルが前記患者の末梢血サンプルである、請求項１又は２の方法。
  17. 消化管炎症性障害を有する患者のインテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療に対する応答性の予測用キットであって、インテグリンベータ７アンタゴニストを用いた治療の前、後又は間に患者から得られたサンプル中のバイオマーカーの量を測定する手段を含み、ここで、治療前と比較して、治療後又は間のバイオマーカーの量の変化が前記アンタゴニストを用いた治療への前記患者の応答性を示し、バイオマーカーが、インテグリンベータ７アンタゴニストによる腸ホーミングリンパ球上のベータ７含有インテグリンの占有率であって、ここで、腸ホーミングリンパ球が、ＣＤ４５ＲＡ − β７ 高 ＣＤ４ ＋ として同定される明確なリンパ球のサブグループである、キット。
  18. バイオマーカーの量の前記変化が増加又は減少である、請求項１７のキット。
  19. 前記変化が前記バイオマーカーの量における増加である、請求項１８のキット。
  20. 前記バイオマーカーの量が、薬剤の第一の投与後の１００日以内に測定される、請求項１８のキット。
  21. 前記バイオマーカーの量が薬剤の投与の少なくとも約２４時間後に測定される、請求項１８のキット。
  22. 前記消化管炎症性障害が炎症性腸疾患である、請求項１７から２１の何れか一項に記載のキット。
  23. 前記炎症性腸疾患がクローン病（ＣＤ）又は潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である、請求項２２のキット。
  24. 前記患者がヒトである、請求項２３のキット。
  25. 前記インテグリンベータ７アンタゴニストが抗ベータ７抗体である、請求項２２のキット。
  26. 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２５のキット。
  27. 前記抗体がキメラ、ヒト又はヒト化抗体である、請求項２６のキット。
  28. 前記抗体が抗体断片である、請求項２５のキット。
  29. 抗体がＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、ＨＶＲ−Ｌ３、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３からなる群から選択される６個の高頻度可変領域（ＨＶＲ）を含み、ここで：
    （ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１はアミノ酸Ａ１ないしＡ１１からなるアミノ酸配列Ａ１−Ａ１１を含み、ここで、Ａ１−Ａ１１はＲＡＳＥＳＶＤＴＹＬＨ（配列番号：１）；ＲＡＳＥＳＶＤＳＬＬＨ（配列番号：７）、ＲＡＳＥＳＶＤＴＬＬＨ（配列番号：８）、又はＲＡＳＥＳＶＤＤＬＬＨ（配列番号：９）又は配列番号：１、７、８又は９の変異体であり、ここで、アミノ酸Ａ２はＡ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ３はＳ、Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、及びＴからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ４はＥ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、及びＲからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ５はＳ、Ｙ、Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｎ、Ｐ、Ｒ、Ｔ、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ６はＶ、Ｒ、Ｉ、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、及びＱからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ７はＤ、Ｖ、Ｓ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＴからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ８はＤ、Ｇ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、Ｐ及びＳからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ９はＬ、Ｙ、Ｉ及びＭからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１０はＬ、Ａ、Ｉ、Ｍ、及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ａ１１はＨ、Ｙ、Ｆ、及びＳからなる群から選択され；
    （ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２はアミノ酸Ｂ１ないしＢ８からなるアミノ酸配列Ｂ１−Ｂ８を含み、ここで、Ｂ１−Ｂ８はＫＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２）；ＲＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２０）からなる群から選択され、又はＸａａＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号：２１、ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）又は配列番号：２、２０又は２１の変異体であり、アミノ酸Ｂ１がＫ、Ｒ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｑ、Ｈ、Ｐ、Ｉ、Ｌ、Ｙ及びＸａａ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）、及び／又はアミノ酸Ｂ４がＳ及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ５はＱ及びＳからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ６はＳ、Ｄ、Ｌ、及びＲからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｂ７はＩ、Ｖ、Ｅ及びＫからなる群から選択され；
    （ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３はアミノ酸Ｃ１ないしＣ９からなるアミノ酸配列Ｃ１−Ｃ９を含み、ここで、Ｃ１−Ｃ９はＱＱＧＮＳＬＰＮＴ（配列番号：３）又は配列番号：３の変異体であり、ここで、アミノ酸Ｃ８がＮ、Ｖ、Ｗ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、及びＹからなる群から選択され；
    （ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１はアミノ酸Ｄ１ないしＤ１０からなるアミノ酸配列Ｄ１−Ｄ１０を含み、ここでＤ１−Ｄ１０はＧＦＦＩＴＮＮＹＷＧ（配列番号：４）であり；
    （ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２はアミノ酸Ｅ１ないしＥ１７からなるアミノ酸配列Ｅ１−Ｅ１７を含み、ここで、Ｅ１−Ｅ１７はＧＹＩＳＹＳＧＳＴＳＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：５）であるか、又は配列番号：５の変異体であり、ここで、アミノ酸Ｅ２はＹ、Ｆ、Ｖ及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ６はＳ及びＧからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１０はＳ及びＹからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１２はＮ、Ｔ、Ａ、及びＤからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１３はＰ、Ｈ、Ｄ、及びＡからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１５はＬ及びＶからなる群から選択され、及び／又はアミノ酸Ｅ１７はＳ及びＧからなる群から選択され；
    （ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３はアミノ酸Ｆ２ないしＦ１１からなるアミノ酸配列Ｆ２−Ｆ１１を含み、ここで、Ｆ２−Ｆ１１はＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：６）又はＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１９）であるか；又はアミノ酸配列Ｆ１−Ｆ１１を含み、ここで、Ｆ１−Ｆ１１はＡＭＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１６）、ＡＲＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１７）、又はＡＱＴＧＳＳＧＹＦＤＦ（配列番号：１８）、又は配列番号：６、１６、１７、１８、又は１９の変異体であり、ここでアミノ酸Ｆ２がＲ、Ｍ、Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｑ、Ｓであり、及び／又はアミノ酸Ｆ１１がＦ及びＹからなる群から選択される、請求項２６のキット。
  30. 前記抗体が３個の重鎖高頻度可変領域（ＨＶＲ−Ｈ１−Ｈ３）配列と３個の軽鎖高頻度可変領域（ＨＶＲ−Ｌ１−Ｌ３）配列を含み、ここで、
    （ｉ）ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号：７、配列番号：８又は配列番号：９を含み；
    （ｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号：２を含み；
    （ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｌ３が配列番号：３を含み；
    （ｉｖ）ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号：４を含み；
    （ｖ）ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号：５を含み；及び
    （ｖｉ）ＨＶＲ−Ｈ３が配列番号：６又は配列番号：１６又は配列番号：１７又は配列番号：１９を含む、請求項２９のキット。
  31. 前記サンプルが前記患者の末梢血サンプルである、請求項１７のキット。
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