JP6219304B2 - 前立腺癌分析のための組成物及び方法 - Google Patents

前立腺癌分析のための組成物及び方法 Download PDF

Info

Publication number
JP6219304B2
JP6219304B2 JP2014544870A JP2014544870A JP6219304B2 JP 6219304 B2 JP6219304 B2 JP 6219304B2 JP 2014544870 A JP2014544870 A JP 2014544870A JP 2014544870 A JP2014544870 A JP 2014544870A JP 6219304 B2 JP6219304 B2 JP 6219304B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
antibody
steap
prostate
cancer cells
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2014544870A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2015507175A (ja
JP2015507175A5 (ja
Inventor
シミンダー アトウォル，
シミンダー アトウォル，
ジョ−アン ホンゴ，
ジョ−アン ホンゴ，
マーク ラックナー，
マーク ラックナー，
エリザベス パンヌース，
エリザベス パンヌース，
ボニー ルービンフェルド，
ボニー ルービンフェルド，
ラジェッシュ ヴィジ，
ラジェッシュ ヴィジ，
Original Assignee
ジェネンテック， インコーポレイテッド
ジェネンテック， インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ジェネンテック， インコーポレイテッド, ジェネンテック， インコーポレイテッド filed Critical ジェネンテック， インコーポレイテッド
Publication of JP2015507175A publication Critical patent/JP2015507175A/ja
Publication of JP2015507175A5 publication Critical patent/JP2015507175A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6219304B2 publication Critical patent/JP6219304B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y116/00—Oxidoreductases oxidizing metal ions (1.16)
    • C12Y116/01—Oxidoreductases oxidizing metal ions (1.16) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.16.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03048—Protein-tyrosine-phosphatase (3.1.3.48)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4742—Keratin; Cytokeratin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90287—Oxidoreductases (1.) oxidising metal ions (1.16)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/4915—Blood using flow cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)

Description

関連出願
本出願は、その内容全体が本明細書において出典明示により援用される、２０１１年１１月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／６２９８８６号及び２０１２年９月１９日に出願された米国特許仮出願第６１／７０３０９９号の米国特許法第１１９条（ｅ）に基く優先権を主張する。
本発明は、腫瘍学及び癌診断の分野に関し、特に前立腺癌のスクリーニング、ステージング及び治療モニタリングのための組成物及び方法に関する。
前立腺癌は男性において最も高頻度に見られる癌の一つである。大多数の前立腺癌は発症早期において症状がなく増殖が遅い一方で、ある種の前立腺癌はより侵攻性、有痛性、致死性を有する。現在、２つの主要なタイプの非侵襲的スクリーニング検査が男性における前立腺癌発見のために利用可能である。一つは直腸指診（ＤＲＥ）であり、これは医師が手袋で覆われた指を直腸に挿入し前立腺に触れることにより前立腺の異常を発見するものである。もう一つは、前立腺表面抗原検査(ＰＳＡ検査)であり、これは血液試料中のＰＳＡレベルを測定するものである。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、男性における前立腺癌の発見に役立てるためにＤＲＥと併用したＰＳＡ検査の使用を認可したが、ＰＳＡ検査は、実際に人命を救うかどうか明らかでないため、スクリーニングにおいて論争がある。特に、最近、米国予防医学作業部会(ＵＳＰＳＴＦ)は、ＰＳＡスクリーニングは不必要な痛みや副作用を引き起こす治療や検査を招く一方で、前立腺癌死亡率を全く或いほとんど低下させないという調査結果に基づき、健常男性におけるＰＳＡスクリーニングを行わないよう勧告した（例えば、R. Chou等, Ann. Intern. Med., October 7, 2011 E-375; Djulbegovic等, BMJ 2010, 341: c4543を参照）。前立腺癌の最も決定的な診断は生検であり、腫瘍細胞の有無を調べる顕微鏡検査を行うために、疑われる患者から前立腺の小片を切除する。明らかに、そのような処置はむしろ侵襲性が高く、初期のスクリーニング検査では望ましくない。
他のあらゆるタイプの癌と同様に、前立腺癌患者の死亡は原発腫瘍によるのではなく転移による場合がほとんどである。原発腫瘍細胞の中には、原発組織から離れて体内を循環するものもある。これらの細胞は循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）と呼ばれる。一度ＣＴＣが体内の好適な部位に種をまくように広がれば、転移性コロニーを形成する可能性がある。転移性コロニーは発見が難しい上に、二次性腫瘍へと進行するうちに死亡等の重篤な事態が生じるおそれがある。ＣＴＣ検出のためにこれまでさまざまな試みがなされている。しかし、ＣＴＣの原発部位が前立腺なのかを識別し、また、前立腺癌の進行度を判定する方法はこれまで開発されていない。ＰＳＡスクリーニングが死亡率低下に寄与していないという最近の研究結果を考慮すると、前立腺癌の診断及び予後診断において、信頼性のある結果を提供することが可能な薬剤及び方法の開発に対するニーズは依然として非常に高い。
一態様において、本開示は、被検体について前立腺癌を診断するための方法であって、ａ）前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と、被検体より採取した血液試料中の上皮由来の複数の癌細胞を接触させることと、ｂ）癌細胞の何れかが前立腺特異的マーカーを発現しているかどうかを判定することを含み、ここで、前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の存在が、被検体における前立腺癌の存在を予測する、方法を提供する。
ある実施態様において、この方法は、前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の量を測定することを更に含み、この量は被検体における前立腺癌のステージを予測するものである。
ある実施態様において、この方法は、該癌細胞上の前立腺特異的マーカーの発現レベルを測定することを更に含む。
ある実施態様において、この方法は、前立腺特異的マーカーの発現レベルに基づいて該癌細胞をグレード分類し、各グレードにおける該癌細胞のパーセンテージを決定することを更に含む。
ある実施態様において、この方法は、各グレードの癌細胞のパーセンテージに、前立腺特異的マーカーの発現レベルに基づいて割り当てられたそのグレード固有のグレード番号を乗じて各グレードのスコアを算出することと、この全グレードのスコアを合計することによって、被検体における前立腺癌のステージを表す指標であるＨスコアを得る、方法を含む。
ある実施態様において、癌細胞は、上皮由来の癌細胞に特異的に結合するリガンドを含む捕捉組成物によって、血液試料から識別される。ある実施態様において該リガンドは、癌細胞上に優先的に発現する上皮抗原に特異的に結合する抗体である。ある実施態様において、この上皮抗原は上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。
ある実施態様において、識別された癌細胞は、血液試料から分離した細胞画分に濃縮される。ある実施態様において、この細胞画分は、磁場下で分離される。ある実施態様において、捕捉組成物中のリガンドは、磁性粒子に結合する。
ある実施態様において、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体は、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を含む。ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、Ｋｄ値１０００ｎＭ以下でＳＴＥＡＰ−１と結合する。ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、マウスモノクローナル抗体である。ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９として寄託されているハイブリドーマ細胞により産生された１５Ａ５である。
ある実施態様において、癌細胞は、上皮由来の癌細胞の検出を可能にする一つ以上の試薬を用いて識別される。ある実施態様において、この試薬は、サイトケラチンに特異的に結合するリガンドを含み、そのリガンドは検出可能な第２標識と任意選択的にコンジュゲートされる。ある実施態様において、この試薬は、細胞を非細胞成分から識別する色素を更に含む。ある実施態様において、該試薬は、白血球マーカーに特異的に結合するリガンドを更に含む。
ある実施態様において、癌細胞は、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、光ファイバースキャンサイトメトリー、又はレーザースキャンサイトメトリーに基づく方法によって検出される。
別の態様において、本発明は、被検体における前立腺癌治療の効果を予測する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、被検体における前立腺癌治療に対する応答をモニターする方法を提供する。
別の態様において、本発明は、抗体１５Ａ５が結合するエピトープと実質的に同じエピトープに結合する抗体を提供し、ここで、抗体１５Ａ５は微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９として寄託されているハイブリドーマ細胞により産生されるものである。
別の態様において、本発明は、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９として寄託されているハイブリドーマ細胞株を提供する。
別の態様において、本発明は、ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する抗体を含む血液試料中の、ＳＴＥＡＰ−１を発現している前立腺癌細胞を検出するための検査キットを提供する。ある実施態様において、この検査キットは、上皮由来の癌細胞に特異的に結合する第１リガンド、上皮マーカーに特異的に結合する第２リガンド、及び白血球マーカーに特異的に結合する第３リガンドに結合する磁性粒子、並びに、細胞を非細胞成分から識別する色素から成る群より選択される一つ以上の組成物を更に含む。
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体による染色レベルに基づくＣＴＣの代表的なスコアリング基準を示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、マウスモノクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体３７、及びウサギポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、ＬＢ５０細胞上のＳＴＥＡＰ−１発現を示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、及びウサギポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、ＰＣ３細胞上のＳＴＥＡＰ−１発現を示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、マウスモノクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体３７、及びウサギポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、ＬＢ５０細胞のＨスコアを示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、及びウサギポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、ＰＣ３細胞のＨスコアを示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、異なるスパイク試料におけるＳＴＥＡＰ−１発現を示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、異なるスパイク試料におけるＨスコアを示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、１１名の患者の血液試料におけるＨスコアを示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、１０名の患者の血液試料におけるＨスコアを示す。 同じ患者由来の腫瘍組織試料でのＩＨＣ結果と、上記結果との比較を示す。 同じ患者由来の腫瘍組織試料でのＩＨＣ結果と、上記結果との比較を示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、異なるスパイク試料におけるＳＴＥＡＰ−１発現を示す。 ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、異なるスパイク試料におけるＨスコアを示す。 マウスモノクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体１５Ａ５を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、異なるスパイク試料におけるＳＴＥＡＰ−１発現を示す。 マウスモノクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体１５Ａ５を使用してＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで測定された、異なるスパイク試料におけるＨスコアを示す。 同一患者のペア試料におけるＣＴＣ計数の再現性を、患者ごとのＣＴＣ数によって示す。 同一患者のペア試料由来のＣＴＣにおけるＳＴＥＡＰ−１バイオマーカー発現レベルの再現性を、患者ごとのＨスコアによって示す。 ベースライン１及び２で採取された血液試料間でのＣＴＣ数の高い相関性を示す。 投与量１−７の用量漸増療法期間中の患者におけるＣＴＣ数の、投与前後での倍数変化を示す。 投与量１−７の用量漸増療法期間中の患者における投与前及び投与後のＣＴＣ数を示す。 投与量１−７の用量漸増療法期間中の患者における投与前及び投与後のＣＴＣ数を示す。
Ｉ．定義
用語「腫瘍」又は「癌」は、本明細書では互換的に使用され、腫瘍性又は悪性の細胞の成長、増殖もしくは転移によって特徴づけられるいかなる病状も意味し、また、固形癌と、白血病などの非固形癌の両方を含む。
本明細書で用いられる用語「前立腺癌」又は「前立腺腫瘍」は、前立腺組織由来の癌又は腫瘍を指す。
（癌や腫瘍など）疾患の文脈で用いられる用語「ステージ」は、その疾患の進行度（重症度）を指す。
本明細書で用いられる用語「ステージング」は、疾病がどこまで進行しているのか、そのステージを判定することを指す。
本明細書で用いられる用語「診断」（及び「診断する」や「診断の」などの文法的変形）は、癌の識別など、分子状態もしくは病的状態、疾患や病状の識別を指し、又は、特定の治療計画が効果的な癌患者を識別することを指す。
本明細書で用いられる用語「予後」（及び「予後診断する」や「予後の」等の文法的変形）は、癌治療などの療法が効果を発揮する可能性の予測を指す。
本明細書で用いられる用語「予測」又は「予測する」は、患者が特定の抗前立腺癌療法に好ましい応答もしくは好ましくない応答を示す可能性を指す。一実施態様では、予測は、それらの応答の程度に関するものである。一実施態様では、予測は、例えば特定の治療薬による治療の後に、患者が生存もしくは改善していて、ある一定期間疾患の進行がみられないかどうか、及び／又はその可能性に関する。
用語「効果」は、最も広い意味で用いられており、いかなる望ましい効果をも意味し、特に本明細書に定義されているような臨床効果を含む。
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスやラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
用語「前立腺６膜貫通上皮抗原１」（又はＳＴＥＡＰ−１とも称される）は、主に前立腺組織において発現され、複数の癌細胞株において発現上昇することが認められている細胞表面抗原を指す。Hubert等 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(25), 14523-8.典型的ヒトＳＴＥＡＰ−１は、２００７年１０月２６日出願の米国特許出願公開第２００９／０２８００５６号に記載の配列番号：１のアミノ酸配列を持ち、この出願は出典明示によりその全文が本明細書中に明示的に援用される。
用語「抗ＳＴＥＡＰ−１抗体」及び「ＳＴＥＡＰ−１に結合する抗体」は、ＳＴＥＡＰ−１を標的とした診断剤として有用となるように、十分な親和性を有してＳＴＥＡＰ−１と結合することができる抗体を指す。一実施態様では、無関係の、非ＳＴＥＡＰ−１タンパク質への抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定した場合、該抗体のＳＴＥＡＰ−１への結合の約１０％未満である。ある実施態様において、ＳＴＥＡＰ−１へ結合する抗体の解離定数（Ｋｄ）は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、異なる種由来のＳＴＥＡＰ−１間で保持されているＳＴＥＡＰ−１のエピトープに結合する。
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書に用いられる「結合親和性」とは、別段の記載がない限り、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１対１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
用語「抗体」は、本明細書で最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含むがこれらに限定されない。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び、抗体断片から形成される多重特異性抗体などがある。
参照抗体と「同一のエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて５０％以上、参照抗体のその抗原への結合をブロックする抗体を指す。また逆に参照抗体は、競合アッセイにおいて５０％以上、該抗体のその抗原への結合をブロックする。典型的な競合アッセイを本明細書で提供する。
本明細書に用いられる用語「抗体１５Ａ５」は、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９として寄託されているハイブリドーマ細胞株により産生された、マウスモノクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を指す。このハイブリドーマ細胞株の微生物寄託情報は後述の通りである。ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−１２５９９、寄託日：２０１１年１１月１７日、寄託材料：抗体１５Ａ５を産生するハイブリドーマ１５Ａ５．１．１．１（７２８４とも標記）。
抗体の「クラス」は、その重鎖の定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の主要なクラスには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
本明細書で用いられる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、通常少量存在する、起こりうる変異体抗体（例えば自然発生的な突然変異やモノクローナル抗体製剤の製造時に発生する変異体）を除いて同一であり、及び／又は、同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を一般的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。従って、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作製され、モノクローナル抗体を作製するためのこれらの方法及び他の典型的な方法は、本明細書に記載されている。
「天然抗体」は、様々な構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２本の同一の軽鎖と２本の同一の重鎖から成る約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、一つの定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、２つのタイプのいずれかに分けることができる。
本明細書で用いられる用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害もしくは阻止し、及び／又は細胞死もしくは破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害剤は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）、化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）、成長阻害剤、核酸分解酵素などの酵素及びその断片、抗生物質、小分子毒素又は細菌、真菌、植物もしくは動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）などの毒素を含む。本発明に好適な細胞傷害剤の例は、出典明示によりその全文が本明細書中に明示的に援用される、２００７年１０月２６日出願の米国特許出願公開第２００９／０２８００５６号に記載されているが、これに限定されない。例えば、ある実施態様において、細胞傷害剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から分離された抗体である。幾つかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法など）、又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換や逆相ＨＰＬＣ）により決定して９５％又は９９％より大きい純度まで精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman等, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
「単離された」核酸は、その天然の環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又は染色体上の本来の位置とは異なる染色体位置に存在している。
「抗ＳＴＥＡＰ−１抗体をコードする単離された核酸」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする一つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は個々のベクター内のそのような核酸分子、及び、宿主細胞内の１以上の位置に存在するそのような核酸分子を含む。
本明細書に用いられる用語「ベクター」は、それが結合される別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及び、それが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが作動的に結合されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫も含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、一次形質転換細胞、及び継代数に関係なくその細胞に由来する子孫を含む。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではない場合があり、変異体が含まれることがある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能もしくは生物活性を有する変異型子孫が本明細書に含まれる。
用語「添付文書」は、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている注意書きを指し、それには、適応症、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又は該治療用製品の使用についての警告が含まれている。
ＩＩ．方法
一態様において、本発明は、被検体より採取した血液試料を用いて被検体における前立腺癌の診断又はステージングを行うための方法を提供する。特に、本発明は、ＣＴＣが一つ又はそれ以上の前立腺特異的マーカーを発現しているかどうかを判定することにより、被検体における前立腺癌の診断又はステージングを行うための方法を提供する。
本明細書で提供される方法において、ＣＴＣは、一つ又はそれ以上の前立腺特異的マーカーを発現しているかどうかを調べるために解析される。ＣＴＣ上の前立腺特異的マーカーの検出は、前立腺癌の診断及びステージングに関する更なる情報を提供する。
ある実施態様において、本発明は被検体に前立腺癌の診断又はステージングを行うための方法であり、ａ）前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と、被検体より採取した血液試料中の上皮由来の複数の癌細胞を接触させることと、ｂ）これらの癌細胞の何れかが前立腺特異的マーカーを発現しているかどうかを判定することを含む方法を提供する。また、この前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の存在は、被検体における前立腺癌の存在を予測するものである。
用語「上皮由来の癌細胞」は、少なくとも一つの上皮性マーカーを発現する癌細胞を指す。本明細書で使用される用語「マーカー」は、特定のタイプの細胞に選択的に発現し、それらの細胞を他のタイプの細胞から識別するのを助ける抗原分子を指す。例えば、上皮性マーカーは、すべての上皮細胞表面に発現するが白血球表面には通常見られない抗原分子である。上皮由来の癌細胞は、例えば、腫瘍マーカー（腫瘍細胞上に選択的に見られるが正常細胞表面にはあまり見られない抗原分子）も発現することがある。ある実施態様において、上皮由来の癌細胞はＣＴＣを含む。
ある実施態様において、上皮由来の癌細胞は、癌細胞中にも選択的に見られる上皮性マーカーを少なくとも一つ発現する。このような上皮性マーカーの検出は、上皮由来の癌細胞を示唆する。ある実施態様において、このような上皮性マーカーは上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である。
この上皮由来の癌細胞は、被検体より採取した血液試料から得たものである。この血液試料はヒト由来の血液で、例えば、血漿試料、血清試料、全血又は抗凝固剤等特定の薬剤で処理した血液など、任意の試料であってもよい。血液試料は、直接被検体より得るか、又は、被検体より血液サンブルを収集する組織から得ることができる。
ある実施態様において、癌細胞は捕捉組成物を用いて血液試料から識別される。ある実施態様において、この捕捉組成物は、上皮由来の癌細胞に特異的に結合するリガンドを含む。ある実施態様において該リガンドは、癌細胞表面に選択的に発現する上皮抗原に特異的に結合する抗体である。ある実施態様において、この上皮抗原はＥｐＣＡＭである。
本明細書に用いられる用語「識別（する）」は、上皮由来の癌細胞を血液試料中の他の成分から実質上区別することを指す。例えば、上皮由来の癌細胞は捕捉組成物により結合されるか又は捕捉され、一方、他の成分は結合又は捕捉されない。
識別された癌細胞は、血液試料中の他の成分から分離される場合とされない場合がある。ある実施態様において、識別された癌細胞は試料中の他の成分から分離又は濃縮されていない。例えば、血清試料などの血液試料は、スライドに載せられ、捕捉組成物によって識別され、分離又は濃縮操作なしで他の試薬と更に接触させられる。
ある実施態様において、識別された癌細胞は血液試料から分離した細胞画分に濃縮される。本明細書で用いられる用語「濃縮」は、細胞画分中の識別された癌細胞の濃度が、血液試料中よりも高いことを指す。任意の好適な技術が細胞画分を分離するために使用されてよい。癌細胞の分離を可能にする捕捉組成物と癌細胞との複合体形成後に用いられる、当該技術分野において一般的な技術は、限定されないが、例えば、重力分離、磁気分離、アフィニティー分離を含む。重力分離に関して捕捉組成物は、識別された癌細胞の濃縮を可能にするために沈降することができる粒子又はビーズに結合する。磁気分離に 関して捕捉組成物は、好適な磁場で分離することができる磁気粒子に結合する。アフィニティー分離に関して捕捉組成物は、スライドなどの装置上で固定され、識別された細胞の捕捉を可能にする。
ある実施態様において、この細胞画分は磁場下で分離される。ある実施態様において、捕捉組成物中のリガンドは磁性粒子に結合する。
本明細書に記載の方法に適した磁性粒子は、当該技術分野で公知の方法を用いて調製することができる。例えば、米国特許第５５９７５３１号、第５６９８２７１号、及び第６３６５３６２号を参照のこと。また、手順はLiberti等, In Fine Particles Science and Technology、777-90, E. Pelizzetti （編）（1996）にも記載されている。簡単には、磁性粒子はポリマー又はタンパク質（例：ウシ血清アルブミン、カゼイン）でコーティングされた磁気コア（例：酸化鉄）を含む。磁性粒子の質量及び大きさは、磁性粒子が磁気応答性をもつが免疫蛍光検出のような分析技術ではほぼ検出されないように制御することができる。磁性粒子の好適なサイズは２００ｎｍ未満であり、例えば９０から１５０ｎｍの粒度分布範囲が望ましい。磁性粒子の質量は７０から９０％の範囲である。
ある実施態様において、磁性粒子はコロイド状である。かかるコロイド状磁性粒子は溶液中で長時間にわたりほぼ定常状態を保ち、また、重力下もしくは印加磁場が存在しない状態で凝集する傾向がない。ある実施態様において、磁性粒子はコロイド状ナノ粒子である。
捕捉組成物中のリガンドは、当該技術分野で公知の任意の好適な方法を用いて磁性粒子に結合することができる。例えば、捕捉組成物は、スクシンイミジル-プロピオノ-ジチオピリジチオピリジン（ＳＰＤＰ）やスルホスクシンイミジル-４-（マレイミドメチル）シクロヘキサン-１-カルボキシレート（ＳＭＣＣ）などのヘテロ二官能性リンカーを用いて磁性粒子に直接結合することができる。他の例としては、ビオチン化抗体を含む捕捉組成物は、ストレプトアビジンに結合された磁性粒子に結合する。また、捕捉組成物及び磁性粒子は、アビジン-ビオチン、プロテインＡ-抗体Ｆｃ、受容体リガンド、及びレクチン-炭水化物など、結合をもたらす他の接合対と共に導入される。
ある実施態様において、捕捉組成物はコロイド状磁性ナノ粒子に結合するＥｐＣＡＭ抗体を含む。ある実施態様において、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システム（ニュージャージー州ヴェリデックス社）が、識別された細胞で濃縮した細胞画分を分離するために用いられる。
上皮由来の癌細胞を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と接触させる。本明細書で用いられる用語「前立腺特異的」は、前立腺組織に選択的に見られるマーカーで、実質的に他の組織や細胞から前立腺の組織や細胞を識別する。ある実施態様において、この前立腺特異的マーカーは、前立腺細胞の表面マーカー又は細胞膜マーカーである。ある実施態様において、この前立腺特異的マーカーは、前立腺６膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ−１）（例えば、Hubert等, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14523-14528参照）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭ）（例えば、Israeli, R. S.等, (1993) Cancer Res. 53,227-230 参照）、前立腺癌腫瘍抗原（ＰＣＴＡ−１）（例えば、Su, Z. Z.et al, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7252-7257 参照）及び前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）（例えば、Reiter, R. E.等, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95, 1735-1740参照) から成る群より選択される。典型的ヒトＳＴＥＡＰ−１は、出典明示によりその全文が本明細書中に明示的に援用される、２００７年１０月２６日出願の米国特許出願公開第２００９／０２８００５６号に記載の配列番号：１のアミノ酸配列を有する。
ある実施態様において、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体は、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を含む。ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体はＫｄ値１０００ｎＭ以下でＳＴＥＡＰ−１と結合する。抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよく、例えば、ヒツジ抗体、ウサギ抗体又はマウス抗体など、好適ないかなる種のものでもよい。
ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、マウスモノクローナル抗体である。ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９として寄託されているハイブリドーマ細胞により産生された１５Ａ５である。ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、抗体１５Ａ５が結合するエピトープと実質的に同じエピトープに結合する抗体である。
ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、検出可能な第１標識とコンジュゲートされる。任意の検出可能で好適な標識が使用されうる。ある実施態様において、検出可能な標識は、フルオロフォアＡＦ−４８８、シアン色素誘導体、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、フィコエリトリン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識である。抗体を検出可能な標識とコンジュゲートさせる方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、Hermanson, G..T.,Bioconjugate techniques、Academic Press 2008を参照のこと。
ある実施態様において、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体はコンジュゲートされていない。非コンジュゲート抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、検出可能な標識（例：検出可能な第１標識）とコンジュゲートされた二次抗体を用いて検出される。このような二次抗体は、当該技術分野で一般に用いられているように、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体と異なる種において産生される任意の抗体であり得、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の定常領域を認識する。
ある実施態様において、癌細胞は、上皮由来の癌細胞の検出を可能にする一つ以上の試薬を用いて識別される。
ある実施態様において、該試薬は、上皮マーカーに特異的に結合するリガンドを含む。ある実施態様において、該上皮マーカーはＥｐＣＡＭではない。ある実施態様において、該上皮マーカーはサイトケラチンである。サイトケラチンはほぼ全ての上皮細胞に発現するタンパク質群の一つであり、上皮組織の細胞骨格でケラチン含有繊維を形成する。
ある実施態様において、上皮マーカーに特異的に結合するリガンドは、抗サイトケラチン抗体で、検出可能な第２標識と任意に結合する。例えば、フィコエリトリン等の蛍光標識など、任意の好適な検出可能な標識が使用される。
ある実施態様において該試薬は、細胞を非細胞成分から識別する、細胞特異的な色素を更に含む。例えば、細胞核を染色する色素が使用される。ある実施態様において、該色素は４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である。
ある実施態様において、該試薬は更に、白血球マーカーに特異的に結合するリガンドを含む。白血球マーカーは、すべての白血球表面に発現するが、非白血球表面には通常発現しないことから選択される。例えば、ＣＤ４５は好適な白血球マーカーである。ある実施態様において、白血球マーカーに特異的に結合するリガンドは、検出可能な第３標識とコンジュゲートされる。例えば、該リガンドは、アロフィコシアニンと結合する抗ＣＤ４５抗体であってもよい。抗ＣＤ４５抗体によって識別された細胞の染色は、白血球を上皮由来のＣＴＣから取り除くのに役立つ。
一つの検査に一つ以上の検出可能な標識（色素を含む）が使用される場合、この検出可能な標識は、それぞれが試料中に存在する他のいかなる検出可能なシグナルを実質的に妨害することなく、単独で検出されるように選択されることが望ましい。例えば、検出可能な標識（色素を含む）は、検出条件下で異なる色を示す異なる蛍光分子であってもよい。
検出は、例えば免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、光ファイバースキャンサイトメトリー又はレーザースキャンサイトメトリー等、任意の好適な方法を用いて行ってもよい。
ある実施態様において、癌細胞は、細胞特異的な色素並びに、上皮マーカー、前立腺特異的マーカー及び白血球マーカーにそれぞれ結合する標識化された抗体やリガンドを用いて染色された後に、免疫蛍光顕微鏡検査のもと可視化される。細胞特異的色素、上皮マーカー、及び前立腺特異的マーカーに対して陽性だが白血球マーカーに対して陰性の細胞は、前立腺特異的マーカーを発現する上皮由来の癌細胞に分類される。このような細胞は、フローサイトメトリーを用いても解析することができる。例えば、Cruz, I.等, Am J Clin Pathol, Vol. 123: 66-74 (2005)を参照のこと。
もう一つの方法として、癌細胞をガラススライド表面に付着させ、スキャンして細胞特異的色素、上皮マーカー、及び前立腺特異的マーカーに対して陽性だが白血球マーカーに対して陰性の細胞を探すこともできる（例えば、Marrinucci, D等, Human Pathology, Vol. 38, No. 3, 514-519(2007)参照）。同様に、ガラススライド表面に付着した識別された該細胞は、レーザースキャン技術で解析することもできる（例えば、Pachmann, K.等, Breast Cancer Research, Vol. 7, No. 6, R975-R979 (2005)参照）。
ある実施態様において、これらの方法は更に、前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の量を測定することを含み、この量は被検体における前立腺癌のステージを予測するものである。末梢血中の腫瘍細胞の数と、腫瘍のサイズ及び／又は悪性度との相関関係が成立するための仮定がいくつかなされている。例えば、直径１ｍｍの腫瘍をもつ患者は抹消血液１００ｍｌあたり約６個の腫瘍細胞をもつ頻度が高いことが報告されている（例えば、米国特許第６３６５３６２号参照）。腫瘍のサイズの増大はこの頻度に比例するものと仮定すると、被検体の癌のステージを示す基準の策定が可能になる。ある実施態様において、初期又は転移性の前立腺癌と診断された複数の患者から採取した臨床血液試料が、これらの患者のために抹消血中の癌細胞の統計的レベルを測定するために使用され、また、それにより将来の検査や解析の基準を提供する。
ある実施態様において、これらの方法は更に、この癌細胞上の前立腺特異的マーカーの発現レベルを測定することを含む。幾つかの前立腺特異的マーカーは、腫瘍の成長、転移及び／又は癌のステージの進行の結果として、その発現レベルが亢進される抗原である。このような前立腺特異的マーカーは、限定されないが、ＳＴＥＡＰ−１、ＰＳＭＡ、ＰＣＴＡ−１及びＰＳＣＡを含む。癌細胞上の前立腺特異的マーカーの発現レベルは、例えば前立腺特異的マーカーに対応する蛍光シグナルの強度によって測定するなど、任意の好適な方法によって測定することができる。
ある実施態様において、これらの方法は更に、前立腺特異的マーカーの発現レベルに基づいて癌細胞をグレード分類し、各グレードにおける癌細胞のパーセンテージを決定する方法を含む。ある実施態様において、癌細胞は、前立腺特異的マーカーの発現レベルに応じて、高レベル群、中レベル群及び低レベル群にそれぞれ分類される。「高レベル」、「中レベル」及び「低レベル」の分類基準は、例えば、該マーカーの公知の発現レベルをもつ樹立した細胞株を用いて決定することができる。例えば、ＬＢ５０細胞株は、ＳＴＥＡＰ−１を高いレベルに発現することが知られており、ＬｎＣＡＰｎｅｒ細胞株は、ＳＴＥＡＰ−１を中レベルに発現することが知られており、また、ＰＣ３細胞株は、ＳＴＥＡＰ−１を低レベルに発現することが知られている。従って、ＬＢ５０細胞株と同等かそれ以上のＳＴＥＡＰ−１発現レベルが検出された癌細胞は、「高レベル」にグレード分類される。同様に、ＳＴＥＡＰ−１の発現レベルがＬｎＣＡＰｎｅｒ細胞株のそれと同等かそれ以上だがＬＢ５０の示すレベルより低い癌細胞は、「中レベル」に分類される。ＳＴＥＡＰ−１の発現レベルがＰＣ３細胞株のそれと同等かそれ以下のものは、「低レベル」に分類される。
更に、各グレードにおける癌細胞の数が測定される。ある実施態様において、グレード毎に癌細胞のパーセンテージが算出される。高レベル群の癌細胞のパーセンテージが高い場合、前立腺癌のステージが進行していることを示す。同様に、初期の前立腺癌は、高レベル群の癌細胞のパーセンテージが低く、及び／又は低レベル群の癌細胞のパーセンテージが高い。
ある実施態様において、これらの方法は更に、各グレードの癌細胞のパーセンテージに、前立腺特異的マーカーの発現レベルに基づいて割り当てられたそのグレード固有のグレード番号を乗じて各グレードのスコアを算出することと、この全グレードのスコアを合計することによって、被検体の前立腺癌のステージを表す指標であるＨスコアを得る方法を含む。例えば、グレード番号３は高レベル群に、２は中レベル群に、及び１は低レベル群に割り当てられ、これは、０から３００のＨスコアの範囲を規定するものである。高いＨスコアは、高レベル群においてより細胞数が多いこと、すなわち、前立腺癌のステージがより進んでいることを示し、低いＨスコアは、低レベル群においてより細胞数が多いこと、すなわち、前立腺癌が比較的初期のステージであることを示す。
幾つかの実施態様では、これらの方法は更に、マーカーの存在及び／又はマーカーの存在頻度を判定することを含む。幾つかの実施態様において、マーカーの存在は、免疫組織化学的検査（「ＩＨＣ」）、ウエスタンブロット解析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化細胞分類（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、定量的な血液に基づくアッセイ（例えば血清ＥＬＩＳＡ）、生化学酵素活性アッセイ、インサイツハイブリダイゼーション、ノーザン解析、定量的リアルタイムＰＣＲ（「ｑＲＴ-ＰＣＲ」）や他の増幅型検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）を含むポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、ＲＮＡ-Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ法、マイクロアレイ解析、遺伝子発現プロファイリング及び／又は遺伝子発現の連続分析（「ＳＡＧＥ」）、並びに、タンパク質、遺伝子及び／又は組織アレイ解析によって行われる多種多様なアッセイの何れか一つによっても判定される。ある実施態様において、マーカーの存在は、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ法）によって判定される。幾つかの実施態様では、該マーカーは、ＰＴＥＮである。幾つかの実施態様では、ＣＴＣは、３倍体である。幾つかの実施態様では、ＣＴＣは、ＰＴＥＮ欠損型３倍体である。幾つかの実施態様では、ＣＴＣは、ＣＥＰ１０ ＦＩＳＨ法によって３倍体と判定される。幾つかの実施態様では、ＣＴＣは、ＰＴＥＮ ＦＩＳＨ法によってＰＴＥＮ欠損を含むと判定される。
別の態様において、本発明は、被検体に対する前立腺癌治療の効果を予測する方法であり、ａ）前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と、被検体より採取した血液試料中の上皮由来の複数の癌細胞を接触させることと、ｂ）これらの癌細胞の何れかが前立腺特異的マーカーを発現しているかどうかを判定することを含む方法も提供する。また、この前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の存在は、被検体に対する前立腺癌治療の効果を予測するものである。
ある種の前立腺特異的マーカーは、前立腺癌治療の治療標的でもある。従って、ＣＴＣ表面の該マーカーの発現レベル及びその変化は、該マーカーを標的とする治療の効果予測になる。
ある実施態様において、これらの方法は更に、前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の量を測定すること、及び／又は癌細胞上の前立腺特異的マーカーの発現レベルを測定することを含む。例えば、臨床試験初期段階の投与前ベースライン試料由来の癌細胞上の前立腺特異的マーカー（例：ＳＴＥＡＰ−１）の発現レベルを、ある閾値を超える前立腺特異的マーカーの発現が前立腺癌治療（例：ＳＴＥＡＰ−１抗体-薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に基づく治療）の臨床活性を予測するのか否かを判定するために、臨床的エンドポイント（無進行生存率、ＰＳＡ値の変化、患者が訴える骨痛、全生存率など）と相関させることができる。癌細胞における前立腺特異的マーカー（例：ＳＴＥＡＰ−１）の発現レベルの動的変化（すなわち、投与後試料における低下）を臨床転帰評価尺度と相関させ、このような変化が治療活性を予測するのか否かを判定することができる。これらの手法は、前立腺癌治療（例：ＳＴＥＡＰ−１ ＡＤＣに基づく治療）を行う患者の選定のために使用可能な予測バイオマーカー候補としてのアッセイをクオリフィケーションする際の最初のステップとして用いることができ、次に検証的第ＩＩＩ相試験でのプロスぺクティブな検証へと続く。
別の態様において、本発明は、被検体における前立腺癌治療への反応をモニターするための方法であり、ａ）被検体より採取した第１の血液試料から得た上皮由来の癌細胞の第１群を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と接触させること、ｂ）前立腺特異的マーカーを発現している第１群の癌細胞の量及び／又はこれらの癌細胞中の前立腺特異的マーカーの発現レベルを測定すること、ｃ）前立腺癌治療の試験期間後に被検体より採取した第２の血液試料から得た上皮由来の癌細胞の第２群を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗体と接触させること、ｄ）前立腺特異的マーカーを発現している第２群の癌細胞の量及び／又はこれらの癌細胞中の前立腺特異的マーカーの発現レベルを測定すること、並びに、ｅ）ステップｂ）で測定した前立腺特異的マーカーを発現している癌細胞の量及び／又は前立腺特異的マーカーの発現レベルと、ステップｄ）で測定したそれらの値を比較することを含む方法を提供し、この前立腺特異的マーカーを発現している癌細胞の量の変化及び／又はこれら癌細胞中の前立腺特異的マーカーの発現レベルの上昇は、被検体における前立腺癌治療への反応を予測するものである。ある実施態様において、この前立腺癌特異的マーカーはＳＴＥＡＰ−１である。
ＩＩＩ．抗体
別の態様において、本発明は、抗体１５Ａ５が結合するエピトープと実質的に同じエピトープに結合する抗体を提供し、この抗体１５Ａ５は微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９として寄託されているハイブリドーマ細胞により産生されるものである。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ＳＴＥＡＰ−１への結合に関して１５Ａ５抗体と競合する。競合アッセイは、ＳＴＥＡＰ−１への結合について、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体１５Ａ５と競合する抗体を識別するために使用されてもよい。
典型的な競合アッセイにおいて、固定化したＳＴＥＡＰ−１が、ＳＴＥＡＰ−１に結合する第１の標識化された抗体（例えば１５Ａ５）、及びＳＴＥＡＰ−１への結合に関して第１の抗体と競合する能力について試験された未標識の第２の抗体を含む溶液中で培養される。この第２抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。対照として、固定化したＳＴＥＡＰ−１が、第２の未標識の抗体でなく、第１の標識された抗体を含む溶液中で培養される。第１の抗体のＳＴＥＡＰ−１への結合を許容する条件下で培養した後、未結合の過剰な抗体を取り除き、固定化したＳＴＥＡＰ−１に結合した標識の量が測定される。もし、固定化ＳＴＥＡＰ−１に結合した標識の量が、対照試料と比較して検査試料中で実質的に減少している場合、それは、ＳＴＥＡＰ−１への結合に関して、第２の抗体が第１の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、ＳＴＥＡＰ−１に対する解離定数（Ｋｄ）が、≦１０００ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）である。
一実施態様では、以下のアッセイにより説明されるように、Ｋｄは、目的の抗体のＦａｂ型とその抗原を用いて実施される放射標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）により測定される。非標識抗原の滴定系列の存在下でＦａｂを最小濃度のヨウ素１２５標識抗原と平衡させ、次に結合した抗原を抗Ｆａｂ抗体でコーティングしたプレートに捕捉することによって、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する(例としてChen等 J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)を参照のこと)。アッセイの条件を決めるために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ(登録商標)マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を５μｇ／ｍｌの捕捉抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）にて一晩コートして、その後２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間ブロックする。非吸着プレート（Ｎｕｎｃ＃２６９６２０）において、１００ｐＭ、又は、２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を、段階希釈した目的のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, Cancer Res. 57: 4593-4599(1997)の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致)。次に、目的のＦａｂを一晩培養する。ただし、培養は平衡状態に達したことを確認するまで長時間(例えばおよそ６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕捉プレートに移し、室温で培養する(例えば１時間)。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ-２０（登録商標））を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ-２０（商標）、Ｐａｃｋａｒｄ社製)を加え、プレートをＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ社製）で１０分間計測する。それぞれ最大結合の２０％以下の濃度のＦａｂを選択して競合結合アッセイに用いる。
他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定化した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)-２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標)-３０００(ニュージャージー州ピスケイタウェイ、ＢＩＡｃｏｒｅ社製)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄを測定する。簡単には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ社製）を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ’-（３-ジメチルアミノプロピル) -カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)、及び、Ｎ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、未反応群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。反応速度論的測定のために、２倍段階希釈したＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ-２０(商標））界面活性剤(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入する。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数(Ｋｄ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen等, J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)を参照のこと。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計（Aviv Instruments社製）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ-ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、２５℃のＰＢＳ(ｐＨ７．２)中の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)の増加又は減少を測定する蛍光消光法を用いて会合速度を測定することができる。
結合反応速度測定は、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄインストルメント（米国カリフォルニア州メンロパーク、ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いても実施することができる。例えば、全ての洗浄、希釈及び測定は、１０００ｒｐｍでプレートを振動させながら、Ｏｃｔｅｔ緩衝液（０．２％ドデシルマルトシド、すなわちＤＤＭ、-ＰＢＳ）においても実施することができる。ストレプトアビジンバイオセンサーをＯｃｔｅｔ緩衝液中で１０分間平衡化し、次にビオチン化ＳＴＥＡＰ−１（１％ＤＤＭ中のウィルス溶解物由来、Ｏｃｔｅｔ緩衝液中に１：８で希釈）を５分間充填した後、１０分間洗浄する。会合段階では、リガンド被覆ストレプトアビジンチップが抗ＳＴＥＡＰ−１抗体断片中に１０分間浸漬される（８連続２倍希釈、５００又は５０ｎＭから開始）。Ａｂ-ＳＴＥＡＰ−１複合体の解離はＯｃｔｅｔ緩衝液のみが入っているウェル内で６００秒間測定できる。ＫＤ、Ｋａ及びＫｄはＯｃｔｅｔ評価ソフトウェアｖ６．３を用いて１：１結合モデルにグローバルフィッティングすることにより測定できる。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、限定されないが、マウス抗体、ヒツジ抗体及びウサギ抗体を含む。ある実施態様において、抗体は、マウスモノクローナル抗体である。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体１５Ａ５の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの少なくとも一つを含む。抗体のＣＤＲは、当該技術分野で公知の方法を用いて測定できる。典型的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).）重鎖可変領域のＣＤＲ１を例外として、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」すなわち「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、短縮型(abbreviated)ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。典型的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro及びFransson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008)参照）特に断らない限り、可変ドメイン内のＣＤＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、上掲のＫａｂａｔらに従って、本明細書において番号が付けられる。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体１５Ａ５の重鎖可変領域の少なくとも一つ、又は、抗体１５Ａ５の軽鎖可変領域の少なくとも一つを含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖の領域を指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖可変領域（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、それぞれ４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）から成り、一般的に似たような構造を有する(例えば、Kindt等 Kuby Immunology, 6版, W.H. Freeman and Co., p91 (2007)を参照のこと)。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。更に、ある特定の抗原に結合する複数の抗体を、その抗原に特異的に結合するある一つの抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを用いて単離し、相補的なＶＬドメイン又はＶＨドメインそれぞれのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、Portolano等, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson等, Nature 352:624-628 (1991)を参照のこと。
本明細書で提供される抗体の抗体断片もまた、本発明に包含される。ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、及び下記の他の断片を含む。特定の抗体断片の総説については、Hudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)を参照のこと。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)、並びに、国際公開第９３／１６１８５号、米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、かつ生体内半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。
ダイアボディは、２つの抗原結合部位を有する抗体断片で、二価又は二重特異的でありうる。例えば、欧州特許出願公開第４０４０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号、Hudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)、及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:6444-6448(1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディについても、Hudson等, Nat. Med. 9:129-134 (2003)に記載がある。
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全て又は一部、もしくは、軽鎖可変ドメインの全て又は一部を含む抗体断片である。ある実施態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（米国マサチューセッツ州ウォルサム市Ｄｏｍａｎｔｉｓ社：例えば、米国特許第６２４８５１６号を参照）。
抗体断片は様々な技術で作製することができ、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク分解、及び組換え宿主細胞（例えば、大腸菌やファージ）による作製を含むがこれらに限定されない。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体１５Ａ５抗体又はその抗原結合性断片である。
ある実施態様において、本明細書で提供される抗体は、検出可能な標識に更にコンジュゲートされる。好適な標識には、限定されないが、直接検出される標識又は部分（蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識など）、及び、例えば酵素反応や分子間相互作用を介して間接的に検出されるような酵素やリガンドといった部分が含まれる。典型的な標識には、限定されないが、放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体などのフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルセリフェラーゼ（luceriferase）、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、その他、過酸化水素を用いて染料前駆体を酸化する酵素（例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ）、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定フリーラジカル等が含まれる。
ＩＶ．核酸及び宿主細胞
抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号記載の組換え方法及び組成物を用いて作製され得る。一実施態様において、本明細書に記載される抗ＳＴＥＡＰ−１抗体をコードする単離された核酸が提供される。該核酸は、抗体のＶＬを構成するアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを構成するアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、該核酸を含む一つ以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、該核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様において、宿主細胞（例えば、以下により形質転換された宿主細胞）は、（１）抗体のＶＬを構成するアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを構成するアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを構成するアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１ベクター、及び抗体のＶＨを構成するアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２ベクターを含む。一実施態様では、該宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施態様では、抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の作製方法が提供され、その方法は、上記のように抗体の発現に好適な条件下で、上記の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から任意選択的に抗体を回収することを含む。
抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の組換え作製のために、例えば上述したように、抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一つ以上のベクターに挿入される。該核酸は容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、抗体は特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、細菌内で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照のこと（また、大腸菌における抗体断片の発現に関する記述は、Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 参照）。発現の後、抗体は、可溶性画分中の細菌の細胞ペーストから単離でき、更に精製することができる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物も、抗体をコードするベクターの適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす菌や酵母菌株も含む。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)と、Li等, Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)を参照のこと。
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞には、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）由来のものもある。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫の細胞が挙げられる。特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併用することができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号 (トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照。
脊椎動物細胞もまた宿主として利用することができる。例えば、浮遊液中で増殖するように適合されている哺乳類細胞株は有用であり得る。他の有用な哺乳類細胞株としては、例えば、ＳＶ４０（ＣＯＳ-７）で形質転換させたサル腎ＣＶ１株、ヒト胎児腎株（例えば、Graham等, J. Gen Virol. 36:59(1977)に記載の２９３又は２９３細胞）、幼ハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980) 記載ＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ-７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、例えば Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)記載のＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞がある。他の有用な哺乳類宿主細胞株は、ＤＨＦＲ-ＣＨＯ細胞（Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980) を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びに、ＹＯ、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳類宿主細胞株の総説としては、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo編, Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268(2003)を参照のこと。
本明細書では、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９として寄託されているハイブリドーマ細胞株も提供される。このハイブリドーマ細胞株は、抗体１５Ａ５を産生する。
Ｖ．抗体の使用
本明細書で提供される抗体は、前立腺癌の診断試薬の製造に使用可能である。この抗体は更に、診断目的に好適で検出可能な標識に結合し、好適な形態、例えば凍結乾燥された粉末で、又は、好適な液剤の形態で提供される。
ＶＩ．検査キット
本発明の別の態様において、前立腺癌の診断又は予後診断に有用な組成物を含む検査キットが提供される。
本発明は更に、ＳＴＥＡＰ−１に特異的に結合する抗体を含む血液試料中の、ＳＴＥＡＰ−１を発現している前立腺癌細胞を検出するための検査キットを提供する。
ある実施態様において、この抗体は、検出可能な第１標識とコンジュゲートされる。例えば蛍光標識など、任意の好適で検出可能な標識が使用され得る。
ある実施態様において、この抗体は、本明細書で提供される抗ＳＴＥＡＰ−１抗体である。ある実施態様において、この抗体は、抗体１５Ａ５である。
ある実施態様において、この検査キットは更に、上皮由来の癌細胞に特異的に結合する第１リガンド、上皮マーカーに特異的に結合する第２リガンド及び白血球マーカーに特異的に結合する第３リガンドに結合する磁性粒子、並びに、細胞を非細胞成分から識別する色素より成る群から選択された一つ以上の組成物を含む。
ある実施態様において、第２リガンドは検出可能な第２の標識とコンジュゲートされ、及び／又は第３リガンドは検出可能な第３の標識とコンジュゲートされる。ある実施態様において、検査キットに一つ以上の検出可能な標識（色素を含む）が含まれる場合、この検出可能な標識（色素を含む）は、それぞれが試料中に存在する他のいかなる検出可能なシグナルを実質的に妨害することなく、単独で検出されるように選択されることが望ましい。
ある実施態様において、第１リガンド、第２リガンド及び／又は第３リガンドは抗体を含む。ある実施態様において、第１リガンドは、抗ＥｐＣＡＭ抗体を含む。ある実施態様において、第２リガンドは、抗ケラチン抗体を含む。ある実施態様において、第３リガンドは、抗ＣＤ４５抗体を含む。
検査キットは更に、容器及び、ラベルもしくは容器表面又は容器に付属する添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器にはガラス又はプラスチックなど様々な材質のもので良い。この容器には、単独で又は他の組成物との併用で病状の診断に効果のある組成物が入れられる。組成物中の少なくとも一つの試薬は本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択された症状のインビトロ診断のために使用されることを示す。
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上掲の一般的記述を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
実施例１．種々の細胞株表面上のＳＴＥＡＰ−１の検出
免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイを用いて３つの前立腺癌細胞株の表面に発現したＳＴＥＡＰ−１を検出するために、３つの抗ＳＴＥＡＰ−１抗体が使用された。２９３ＬＢ５０はＳＴＥＡＰ−１高発現細胞株として使用され、ＬｎＣＡＰｎｅｒはＳＴＥＡＰ−１中程度発現細胞株として使用され、ＰＣ３はＳＴＥＡＰ−１低発現-陰性細胞株として使用された。検査された抗ＳＴＥＡＰ−１抗体は、抗体３７（マウスモノクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体）、ヒツジポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体、及びｓｃ−２５５１４（ウサギポリクローナル抗ＳＴＥＡＰ−１抗体）である。この３つの抗体がフルオロフォアＡＦ−４８８とコンジュゲートされた。
これらの抗体は、３つの細胞株を使ってそれぞれ培養された。ＡＦ−４８８のシグナルを検出する蛍光顕微鏡検査法を使用して、抗体-抗原結合が可視化された。検査結果は、これら３つの抗体すべてにおいて、３つの細胞株の発現レベルに比例した期待通りの強度のシグナルを得たことを示した。すなわち、抗体は、２９３ＬＢ５０細胞上で最も強く染色され、ＬｎＣＡＰｎｅｒ細胞上で中程度に染色され、及びＰＣ３細胞上では弱い染色から染色なし（陰性）であった。
実施例２．ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用した、前立腺癌細胞におけるＳＴＥＡＰ−１発現の検出
３つの抗体（マウス抗体３７、ヒツジポリクローナル抗体、及びウサギｓｃ−２５５１４）が、ＬＢ５０細胞及びＰＣ３細胞表面のＳＴＥＡＰ−１発現検出の能力について、それぞれＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで検査された。
スパイクイン(Spike-in)アッセイが次の通り実施された。ＬＢ５０細胞及びＰＣ３細胞をＴ７５フラスコの中で増殖させた。細胞が８０％コンフルエンスに達しときに、１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、３ｍｌのトリプシンで処理した。培地７ｍｌを剥離した細胞に加え、浮遊液をすべてファルコンチューブに移した。続いて、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけた。浮遊物は除去され、沈殿物がＰＢＳ１０ｍｌ中に再浮遊した。各細胞浮遊液０．５ｍｌをｖｉｃｅｌｌチューブに移し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて計数した。細胞浮遊液を、１０ｍｌの培地で５０００セル／ｍｌ溶液になるように希釈した。適量の細胞を１０ｍｌの血液に添加した。この血液のうち、７．５ｍｌにはＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ法を使用した。１００個の細胞を添加するために、２６．６μｌの細胞浮遊液を血液１０ｍｌに加えた。細胞を添加したこの血液を２０分間回転させた。
血液へ添加する細胞を確実に約１００個にするため、各細胞浮遊液を５μｌずつ、ポリエルリジン・グリッドスライド（電子顕微鏡法）上に繰り返し５回添加した。細胞浮遊液５μｌは、約２５個の細胞に相当した。各スライド上の細胞数をカウントした。この細胞数は、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈで捕捉された「ＣＴＣ」（すなわち添加された細胞）の数÷スライド上でカウントされた実際の細胞数を算出することにより求められる細胞の回収率の計算に用いた。
細胞を添加した血液が完全に混ざったら、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ ＣＴＣプロトコルに従って、血液試料を３つの抗ＳＴＥＡＰ−１抗体と共にそれぞれＣｅｌｌＳｅａｒｃｈにかけた。簡単には、各試料を、磁性コロイドナノ粒子と結合した抗ＥｐＣＡＭ抗体と混合し、試料中のＥｐＣＡＭ陽性上皮細胞で濃縮された細胞画分の分離を可能にするように磁場にさらした。次に、この細胞画分を、フィコエリスリン結合抗サイトケラチン抗体、アロフィコシアニン結合抗ＣＤ４５抗体、ＤＡＰＩ、及び、第４フィルターで使用のＡＦ−４８８と結合した、３つの抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の何れか一つと混ぜた。これらの結合抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を、ＰＢＳで１：５０に希釈した。これらの試料でＣｅｌｌＳｅａｒｃｈを実施し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓアナライザーでＣＴＣがスコア化された。サイトケラチン及びＤＡＰＩに対して陽性に染まるがＣＤ４５に対して陰性に染まる細胞が、ＣＴＣと判定された。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈオートプレップシステム上でＳＴＥＡＰ−１の染色を示すＣＴＣが選択され、更にＳＴＥＡＰ−１の発現レベルを示す抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の蛍光強度が定量化された。
ＳＴＥＡＰ−１を発現しているＣＴＣを染色強度、すなわちＳＴＥＡＰ−１発現レベルに基づきスコア化した。ＳＴＥＡＰ−１高発現ＣＴＣは染色強度が強く、背景染色は無しから最小であり、これらにはスコア３を与え、中程度の染色強度でやや背景染色されているものにはスコア２を、低い染色強度で比較的強い背景染色が認められるものにはスコア１を与えた。図１に代表例を示す。
図２（ａ）が示すように、検査した３つの抗体はすべて、ダイナミックレンジは異なるが、血液試料中に添加したＳＴＥＡＰ−１高発現体であるＬＢ５０細胞を検出した。図２（ｂ）が示すように、ヒツジポリクローナル抗体及びウサギｓｃ−２５５１４は、血液試料中に添加されたＳＴＥＡＰ−１低発現体であるＰＣ３も検出した。
ＳＴＥＡＰ−１を発現しているＣＴＣを示すＨスコアは、（１×染色強度が弱い細胞のパーセンテージ）＋（２×染色強度が中程度の細胞のパーセンテージ）＋（３×染色強度が強い細胞のパーセンテージ）で算出され、３００が最大スコアとなった。(McCall等, (2008) British Journal of Cancer 98(6):1094-1101)
図２（ｃ）−（ｄ）のように、ヒツジポリクローナル抗体は最も優れたダイナミックレンジを示しており、それ故にヒツジポリクローナル抗体は、臨床試料を用いた更なる検査用に選択された。
実施例３．ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムでヒツジポリクローナル抗体を使用した、スパイク試料におけるＳＴＥＡＰ−１発現細胞の分析
血液試料中に添加した細胞表面のＳＴＥＡＰ−１発現を判定するために、抗ＳＴＥＡＰ−１ヒツジポリクローナル抗体を用いた。このスパイクインアッセイは、実施例２と同様の手順で実施した。３つの細胞株、２９３ＬＢ５０、ＬｎＣＡＰｎｅｒ及びＰＣ３をそれぞれ血液試料に添加し、完全に混ぜた。ヒツジポリクローナル抗体を、ＰＢＳで１：５０に希釈し、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈの第４フィルターで血液試料に添加した。これらの試料でＣｅｌｌＳｅａｒｃｈを実施し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓアナライザーでＣＴＣがスコア化された。サイトケラチン及びＤＡＰＩに対して陽性に染まるがＣＤ４５に対して陰性に染まる細胞が、ＣＴＣと判定された。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈオートプレップシステム上でＳＴＥＡＰ−１の染色を示すＣＴＣが選択され、更にＳＴＥＡＰ−１の発現レベルを示す抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の蛍光強度が定量化された。実施例２と同じ方法でＨスコアが算出された。
図３（ａ）−（ｂ）のように、ヒツジポリクローナル抗体は、検査した３つの細胞株のいずれにもＳＴＥＡＰ−１の発現を検出し、また、優れたダイナミックレンジを示した。ヒツジポリクローナル抗体により検出されたように、２９３ＬＢ５０細胞を添加した試料には（染色）強度が高いＣＴＣが６０％超含まれ、そのＨスコアは２００を上回った。ＬｎＣＡＰｎｅｒ細胞を添加した試料はＨスコアが約１００となり、ＰＣ３細胞を添加した試料のＨスコアは１００を下回った。
実施例４．ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を使用した、前立腺癌患者のＣＴＣにおけるＳＴＥＡＰ−１発現の検出
前立腺患者１１名の血液試料をある１件の診療所から得た。これらの血液試料を、抗ＳＴＥＡＰ−１ヒツジポリクローナル抗体を用いてＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで解析した。ヒツジポリクローナル抗体を、ＰＢＳで１：５０に希釈し、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈの第４フィルターで血液試料に添加した。これらの試料でＣｅｌｌＳｅａｒｃｈを実施し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓアナライザーでＣＴＣがスコア化された。サイトケラチン及びＤＡＰＩに対して陽性に染まるがＣＤ４５に対して陰性に染まる細胞が、ＣＴＣと判定された。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈオートプレップシステム上でＳＴＥＡＰ−１の染色を示すＣＴＣが選択され、更にＳＴＥＡＰ−１の発現レベルを示す抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の蛍光強度が定量化された。各試料のＣＴＣの数がカウントされ、Ｈスコアも実施例２に記載の通り算出された。結果を図４に示す。
実施例５．ＣＴＣアッセイと免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイとの相関性
第Ｉ相試験で１０名の前立腺患者から血液試料及び腫瘍組織試料を採取した。
これらの血液試料を、抗ＳＴＥＡＰ−１ヒツジポリクローナル抗体を用いてＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで解析した。各試料のＣＴＣの数がカウントされ、Ｈスコアも実施例２に記載の通り算出された。結果を図５（ａ）に示す。
腫瘍組織試料は、従来のＩＨＣ法を用いて検査され、組織中のＳＴＥＡＰ−１発現レベルは、総合スコア（１＋、２＋、及び、３＋）で示された。この数字が大きいほどＳＴＥＡＰ−１の発現レベルが高いことを示した。
ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）の結果及びＩＨＣの結果を、図５（ｂ）−（ｃ）で比較する。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）の結果は、ＩＨＣの結果と高い相関を示した。これは、ヒツジポリクローナル抗体を利用したＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）法が、ＳＴＥＡＰ−１を発現している血液試料中のＣＴＣの検出に有効であることを示唆している。
実施例６．ヒツジポリクローナル抗体とマウスモノクローナル抗体１５Ａ５の比較
マウスモノクローナル抗体１５Ａ５が、スパイクインアッセイを用いてＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで検査され、ヒツジポリクローナル抗体と比較された。実施例２に記載の通り、２９３ＬＢ５０細胞（高発現体）、ＬｎＣＡＰｎｅｒ細胞（中発現体）及びＰＣ３細胞（低発現体）がそれぞれ血液試料に添加された。これらの血液試料が、ヒツジポリクローナル抗体及びマウスモノクローナル抗体１５Ａ５をそれぞれ利用して、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで解析された。Ｈスコアもまた算出された。この手順と方法は実施例２記載のものと同様である。
図６（ａ）−（ｄ）に示されるように、いずれの抗体も、各試料における強度レベル及びＨスコアの結果は類似していた。また、マウスモノクローナル抗体１５Ａ５は、本アッセイにおいて優れたダイナミックレンジを示していた。
モノクローナル抗体１５Ａ５の利用は、ポリクローナル抗体の利用に勝る利点がある。例えば、モノクローナル抗体は、ポリクローナル抗体と比較して、バッチ間変動及び背景がより少なく、また、実験の再現性がより高い。
実施例７．ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムによるマウスモノクローナル１５Ａ５抗体を使用した、患者試料におけるＳＴＥＡＰ−１発現細胞の分析
前立腺癌患者から血液試料を採取し、抗ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体１５Ａ５を用いてＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで解析した。抗体１５Ａ５を、例えばＰＢＳで１：５０に希釈し、血液試料に添加した。この試料でＣｅｌｌＳｅａｒｃｈを実行し、ＣｅｌｌＴｒａｃｋｓアナライザーでＣＴＣが数えられる。サイトケラチン及びＤＡＰＩに対して陽性に染まるがＣＤ４５に対して陰性に染まる細胞が、ＣＴＣと判定される。ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈオートプレップシステム上のＣＴＣの内ＳＴＥＡＰ−１の染色を示すＣＴＣが選択され、更にＳＴＥＡＰ−１の発現レベルを示す抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の蛍光強度が定量化される。各試料のＣＴＣの数がカウントされ、Ｈスコアも実施例２に記載の通り算出される。
更に、臨床試験において「ベースライン」（すなわち、投与前）の患者から採取した血液試料中のＣＴＣ表面におけるＳＴＥＡＰ−１発現レベルは、ある閾値を超える前立腺特異的マーカーの発現が前立腺癌治療（例：抗ＳＴＥＡＰ−１抗体-薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に基づく治療）の臨床活動性を予測するのか否かを判定するために、臨床的エンドポイント（無進行生存率、ＰＳＡ値の変化、患者が訴える骨痛、全生存率など）と関連づけられる。癌細胞における前立腺特異的マーカー（例：ＳＴＥＡＰ−１）の発現レベルの動的変化（すなわち、投与後試料における低下）は、これらの変化が治療活性を予測するのか否かを判定するために、臨床転帰評価尺度と関連づけられる。そのような手法は、前立腺癌治療（例：抗ＳＴＥＡＰ−１抗体-薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に基づく治療）を行う患者の選定のために使用可能な予測バイオマーカー候補としてのアッセイをクオリフィケーションする際に最初のステップとして用いることができ、次に検証的第ＩＩＩ相試験でのプロスぺクティブな検証へと続く。
実施例８．患者試料中のＣＴＣの計数
前立腺癌患者の血液を、治療開始前にペアで採取した（ベースライン試料）。試料はＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで解析され、上記のようにＣｅｌｌＴｒａｃｋｓアナライザーでＣＴＣ計数が得られた。簡単には、サイトケラチン及びＤＡＰＩに対して陽性に染まるがＣＤ４５に対しては陰性に染まる細胞が、ＣＴＣとして数えられた。各試料ペアについてＣＴＣ数の平均値及び標準偏差値が計算され、また、誤差（＋―ＳＤＥＶ）がヒストグラム上にプロットされた。図７Ａで見られるように、これらの患者のＣＴＣ数の平均値に大きなダイナミックレンジがあり、また、試料ペア間でもカウントがほぼ一致していた（エラーバーが小さい）。これは、このシステムを使用したＣＴＣ計数の再現性が高いことを示している。
前立腺癌患者の血液を、治療開始前にペアで採取した（ベースライン試料）。試料はＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで、Ａ４８８チャンネル内で２０μｇ／ｍｌの抗ＳＴＥＡＰ−１モノクローナル抗体１５Ａ５を利用して解析された。実施例２の通り、ＣＴＣ計数とＳＴＥＡＰ−１発現がＣｅｌｌＴｒａｃｋｓアナライザーでスコア化された。簡単には、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈオートプレップシステム上のＣＴＣの内ＳＴＥＡＰ−１の染色を示すＣＴＣが選択され、更に抗ＳＴＥＡＰ−１抗体の蛍光強度が、加重スコアリングシステム（Ｈスコア、実施例２参照）を用いて定量化された。各試料ペアについてＨスコアの平均値及び標準偏差値が計算され、また、誤差（＋―ＳＤＥＶ）がプロットされた。図７Ｂに見られるように、患者母集団におけるＳＴＥＡＰ−１発現レベルには大きなダイナミックレンジがある。また、各試料ペア間でＨスコアがほぼ一致しており、これは、ＣｅｌｌＳｅａｒｃｈシステムを使用した標的発現レベルのクオリフィケーションにおける高い再現性を示している。
前立腺癌患者からの試料の採血は、治療開始前の異なる時点で２回、間隔を約２−４週間空けて行った（ベースライン１及びベースライン２）。血液試料はＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで解析され、上記のようにＣｅｌｌＴｒａｃｋｓアナライザーでＣＴＣ計数が得られた。ＣＴＣ計数における生物学的変異性評価のため、各患者につき２つのベースライン試料間のＣＴＣ数を比較した。
図８で、各点は１人の患者を表しており、Ｘ軸がベースライン１でのＣＴＣ数、Ｙ軸がベースライン２でのＣＴＣ数である。このプロットは１４名の患者のデータを含み、異なる時点でのＣＴＣ数に強い相関があることを示している。これは、治療開始前のＣＴＣ数は生物学的変異性が低いことを示唆している。これらのデータはＣＴＣ数における正常な変異を算出するのに用いられ、治療前のＣＴＣ数の分布に関して、９５％信頼区間が得られた。
この信頼区間は、治療中に観察されたＣＴＣ変化の有意性を判断するのに用いられた。算出された信頼区間を超えるＣＴＣ数の減少は、投与効果の評価及び薬物活性のエビデンス評価に使用された。前立腺癌患者からの試料の採血は、抗ＳＴＥＡＰ−１ ＡＤＣによる治療前及び治療後で２回ずつ行った。試料はＣｅｌｌＳｅａｒｃｈ（登録商標）システムで解析され、上記のようにＣｅｌｌＴｒａｃｋｓアナライザーでＣＴＣ計数及びＳＴＥＡＰ−１発現度が得られた。図９−１１に示されるように、治療前と治療後でのＣＴＣ数の倍数変化、及びＣＴＣ数の予後好転ベースで見ると、高用量を投与したケースでＣＴＣ数の有意な減少が認められた。更に、治療において有意なＣＴＣ数の減少を示した患者に、より高いＳＴＥＡＰ−１の標的発現が見られた（データは示さず）。

Claims (26)

  1. 被検体における前立腺癌細胞の存在を検出する方法であって、
    ａ）被検体由来の血液試料から得られた、上皮起源の癌細胞を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体と接触させることであって、前記抗ＳＴＥＡＰ−１抗体がポリクローナル抗体であるか又は微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９のハイブリドーマ細胞により産生されるマウスモノクロール抗体１５Ａ５である、前記接触させること、及び
    ｂ）癌細胞のいずれかが前立腺特異的マーカーを発現するかを判定すること
    を含み、
    前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の存在が被検体における前立腺癌への罹患を予測し、前立腺特異的マーカーがＳＴＥＡＰ−１である、方法。
  2. 前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の量を測定することを更に含み、その量が被検体における前立腺癌のステージを予測するものである、請求項１に記載の方法。
  3. 癌細胞上の前立腺特異的マーカーの発現レベルを測定することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前立腺特異的マーカーの発現レベルに基づいて癌細胞をグレード分類し、各グレードにおける癌細胞のパーセンテージを決定することを更に含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
  5. 各グレードに対するグレードスコアを、該グレードにおける癌細胞のパーセンテージに、該グレードにおける前立腺特異的マーカーの発現レベルを表すグレード固有の番号を乗じることによって、算出することと、グレードスコアを全て合計することによって、被検体における前立腺癌のステージを示す指標であるＨスコアを得ることを更に含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
  6. 癌細胞が、上皮由来の癌細胞に特異的に結合するリガンドを含む捕捉組成物を用いて血液試料から識別される、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  7. リガンドが、癌細胞に優先的に発現される上皮抗原に特異的に結合する抗体である、請求項６に記載の方法。
  8. 上皮抗原が上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）である、請求項７に記載の方法。
  9. 識別された癌細胞が血液試料から分離される細胞画分に濃縮される、請求項６から８の何れか一項に記載の方法。
  10. 細胞画分が磁場下で分離される、請求項９に記載の方法。
  11. 捕捉組成物中のリガンドが磁性粒子（例えばコロイド状磁性粒子、例えばコロイド状磁性ナノ粒子）に結合する、請求項１０に記載の方法。
  12. リガンドがＥｐＣＡＭ抗体を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 抗ＳＴＥＡＰ−１抗体がＫＤ値１０００ｎＭ以下でＳＴＥＡＰ−１と結合する、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
  14. 抗ＳＴＥＡＰ−１抗体が検出可能な第１の標識とコンジュゲートされる、請求項１から１３の何れか一項に記載の方法。
  15. 癌細胞が、上皮由来の癌細胞の検出を可能にする一つ以上の試薬を用いて識別される、請求項１から１４の何れか一項に記載の方法。
  16. 試薬が、サイトケラチンに特異的に結合するリガンドを含み、リガンドが、検出可能な第２の標識と任意選択的にコンジュゲートされる、請求項１５に記載の方法。
  17. 試薬が細胞を非細胞成分から識別する色素を更に含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
  18. 色素が４',６-ジアミジノ-２-フェニルインドール（ＤＡＰＩ）である、請求項１７に記載の方法。
  19. 試薬が白血球マーカーに特異的に結合するリガンドを更に含み、リガンドが検出可能な第３の標識と任意選択的にコンジュゲートされる、請求項１５から１８の何れか一項に記載の方法。
  20. 白血球マーカーに対するリガンドがＣＤ４５抗体である、請求項１９に記載の方法。
  21. 判定が、免疫蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、光ファイバースキャンサイトメトリー、又はレーザースキャンサイトメトリーに基づく方法による、請求項１から２０の何れか一項に記載の方法。
  22. 被検体における前立腺癌治療への応答をモニターする方法であって、
    ａ）被検体由来の第１血液試料から得られた、上皮起源の癌細胞の第１群を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体と接触させること、
    ｂ）前立腺特異的マーカーを発現する第１群の癌細胞の量及び／又は癌細胞中の前立腺特異的マーカーの発現レベルを測定すること、
    ｃ）前立腺癌治療の試験期間後の被検体由来の第２血液試料から得られた、上皮起源の癌細胞の第２群を、前立腺特異的マーカーに特異的に結合する抗ＳＴＥＡＰ−１抗体と接触させること、
    ｄ）前立腺特異的マーカーを発現する第２群の癌細胞の量及び／又は癌細胞中の前立腺特異的マーカーの発現レベルを測定すること、及び
    ｅ）ステップｂ）で測定した前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の量及び／又は前立腺特異的マーカーの発現レベルと、ステップｄ）でのそれらの値を比較すること
    を含み、前立腺特異的マーカーを発現する癌細胞の量の減少及び／又は癌細胞中の前立腺特異的マーカーの発現レベルの低下が、被検体における前立腺癌治療への応答を示し、前記抗ＳＴＥＡＰ−１抗体がポリクローナル抗体であるか又は微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９のハイブリドーマ細胞により産生されるマウスモノクロール抗体１５Ａ５であり、前立腺特異的マーカーがＳＴＥＡＰ−１である、方法。
  23. 前立腺癌治療が前立腺特異的マーカーに結合する抗体又は抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を含む、請求項２２に記載の方法。
  24. ＡＤＣが、細胞傷害剤に共有結合した抗ＳＴＥＡＰ−１抗体を含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 細胞傷害剤が、毒素、化学療法剤、薬剤の構成成分、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、抗生剤、放射性同位体、及び核酸分解酵素から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 請求項１から２５の何れか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、微生物寄託番号ＰＴＡ−１２２５９のハイブリドーマ細胞により産生されるマウスモノクロール抗体１５Ａ５を含む、キット。
JP2014544870A 2011-11-29 2012-11-29 前立腺癌分析のための組成物及び方法 Active JP6219304B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161629886P 2011-11-29 2011-11-29
US61/629,886 2011-11-29
US201261703099P 2012-09-19 2012-09-19
US61/703,099 2012-09-19
PCT/US2012/066998 WO2013082249A2 (en) 2011-11-29 2012-11-29 Compositions and methods for prostate cancer analysis

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2015507175A JP2015507175A (ja) 2015-03-05
JP2015507175A5 JP2015507175A5 (ja) 2016-01-28
JP6219304B2 true JP6219304B2 (ja) 2017-10-25

Family

ID=47324459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014544870A Active JP6219304B2 (ja) 2011-11-29 2012-11-29 前立腺癌分析のための組成物及び方法

Country Status (15)

Country Link
US (2) US20130143237A1 (ja)
EP (1) EP2786151B1 (ja)
JP (1) JP6219304B2 (ja)
KR (1) KR101951514B1 (ja)
CN (1) CN104067127A (ja)
AR (1) AR089028A1 (ja)
AU (1) AU2012345926A1 (ja)
BR (1) BR112014012882A2 (ja)
CA (1) CA2854042A1 (ja)
IL (1) IL232466A (ja)
MX (1) MX350807B (ja)
RU (1) RU2641968C2 (ja)
SG (1) SG11201402711SA (ja)
WO (1) WO2013082249A2 (ja)
ZA (1) ZA201403110B (ja)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105646661A (zh) * 2014-03-24 2016-06-08 朱育盼 特异性结合前列腺癌的短肽pcp2及其应用
EP3286565A1 (en) 2015-04-21 2018-02-28 Genentech, Inc. Compositions and methods for prostate cancer analysis
WO2018184966A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to steap-1
CN108179134B (zh) * 2017-12-27 2020-11-24 武汉大学 基于EpCAM/PSMA双抗体功能化微流控芯片及其制备方法和应用
AU2019299357A1 (en) 2018-07-02 2021-01-14 Amgen Inc. Anti-steap1 antigen-binding protein
KR20220057575A (ko) * 2019-09-05 2022-05-09 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 항-steap1 항체 및 이의 용도
BR102020013625A2 (pt) * 2020-07-02 2022-01-11 Universidade Federal de Uberlândia Aptâmero modificado, sistema aptaimunológico, painel aptaimunológico, kit, método e uso no diagnóstico de câncer de próstata

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US5597531A (en) 1985-10-04 1997-01-28 Immunivest Corporation Resuspendable coated magnetic particles and stable magnetic particle suspensions
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5698271A (en) 1989-08-22 1997-12-16 Immunivest Corporation Methods for the manufacture of magnetically responsive particles
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
CA2372813A1 (en) 1992-02-06 1993-08-19 L.L. Houston Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6046048A (en) * 1996-01-09 2000-04-04 Genetech, Inc. Apo-2 ligand
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
WO1999041613A1 (en) 1998-02-12 1999-08-19 Immunivest Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
US6200765B1 (en) * 1998-05-04 2001-03-13 Pacific Northwest Cancer Foundation Non-invasive methods to detect prostate cancer
DE69941187D1 (de) 1998-06-01 2009-09-10 Agensys Inc Serpentintransmembranantigene exprimiert in menschlichem krebs und deren verwendungen
IL129299A0 (en) * 1999-03-31 2000-02-17 Mor Research Applic Ltd Monoclonal antibodies antigens and diagnosis of malignant diseases
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
NZ517906A (en) 1999-10-04 2003-01-31 Medicago Inc Cloning of genomic sequences encoding nitrite reductase (NiR) for use in regulated expression of foreign genes in host plants
CA2438112A1 (en) * 2001-02-16 2003-08-07 Immunivest Corporation Methods and reagents for the rapid and efficient isolation of circulating cancer cells
US20030190602A1 (en) * 2001-03-12 2003-10-09 Monogen, Inc. Cell-based detection and differentiation of disease states
US7219016B2 (en) 2001-04-20 2007-05-15 Yale University Systems and methods for automated analysis of cells and tissues
US7494646B2 (en) 2001-09-06 2009-02-24 Agensys, Inc. Antibodies and molecules derived therefrom that bind to STEAP-1 proteins
PT1742966E (pt) * 2004-04-22 2014-02-05 Agensys Inc Anticorpos e moléculas derivadas daí que se ligam às proteínas steap-1
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
PL2845866T3 (pl) * 2006-10-27 2017-10-31 Genentech Inc Przeciwciała i immunokoniugaty oraz ich zastosowanie
AU2007317306B2 (en) * 2006-11-08 2012-06-14 The Regents Of The University Of Michigan SPINK1 as a prostate cancer marker and uses thereof
JP5394246B2 (ja) * 2007-03-30 2014-01-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗体及びイムノコンジュゲートとこれらの使用方法
CA2736178A1 (en) 2008-09-05 2010-03-11 Peter Kuhn Methods for the detection of circulating tumor cells
JP5975983B2 (ja) * 2010-04-16 2016-08-23 ベリカム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 固形腫瘍を処置するための方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2854042A1 (en) 2013-06-06
BR112014012882A2 (pt) 2017-06-13
IL232466A (en) 2017-10-31
US20130143237A1 (en) 2013-06-06
RU2014126358A (ru) 2016-01-27
US20160274116A1 (en) 2016-09-22
RU2641968C2 (ru) 2018-01-23
JP2015507175A (ja) 2015-03-05
US9632091B2 (en) 2017-04-25
EP2786151A2 (en) 2014-10-08
AU2012345926A1 (en) 2014-05-29
AR089028A1 (es) 2014-07-23
KR101951514B1 (ko) 2019-02-22
EP2786151B1 (en) 2019-07-03
MX2014006187A (es) 2014-06-23
ZA201403110B (en) 2017-06-28
SG11201402711SA (en) 2014-06-27
WO2013082249A2 (en) 2013-06-06
WO2013082249A3 (en) 2013-10-10
KR20140100544A (ko) 2014-08-14
IL232466A0 (en) 2014-06-30
CN104067127A (zh) 2014-09-24
MX350807B (es) 2017-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7022191B2 (ja) 前立腺がんの分析のための組成物及び方法
JP6219304B2 (ja) 前立腺癌分析のための組成物及び方法
JP2014098706A (ja) 細胞増殖性疾患の検出及び診断に有用なｉｇｆ−１ｒ特異抗体
JP6129956B2 (ja) 抗ｃ−Ｍｅｔ抗体
JP6138780B2 (ja) 癌の検出および診断のための抗体ｉ−３８５９の使用
JP6977105B2 (ja) Ｉｇｆ−１ｒ抗体および癌の診断のためのその使用
TW201927820A (zh) 抗ｐｄ-ｌ１抗體及使用其來偵測ｐｄ-ｌ１之方法
EP2659273A1 (en) Monoclonal antibodies against alpha-actinin-4 antigens, and uses therefor
CN107709362B (zh) Igf-1r抗体及其用于癌症诊断的用途
US20240117042A1 (en) Immunohistochemistry methods and kir3dl2-specific reagents
WO2014079954A1 (en) Methods of diagnosing and therapeutic agents for use in the treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20151130

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20151130

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20160914

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160920

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20161219

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20170220

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170316

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20170829

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20170927

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6219304

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250