JP6214137B2 - 核酸ハイブリダイゼーション用溶液 - Google Patents

Description

この発明は、遺伝子工学の分野において、核酸をハイブリダイゼーションさせる際の緩衝液として用いる核酸ハイブリダイゼーション用溶液に関するものである。

一般に、細菌類や原虫などの微生物による感染症の有無を検査する場合には、検出対象の微生物の遺伝子配列の特定領域を標的核酸とし、これを一本鎖核酸として増幅し、この増幅産物をクロマトグラフィーにより検出する方法が知られている。

上記核酸検出方法におけるクロマトグラフィーにおける一本鎖核酸プローブによる核酸の検出反応においては、たとえば増幅産物を、この増幅産物と相補的な第１のオリゴヌクレオチドプローブであってメンブレンに結合したもの、および着色高分子担体で標識した相補的な第２のオリゴヌクレオチドプローブに対し、ハイブリダイゼーションさせることによって検出する工程および検出像を目視判定により評価する工程が必要である。

例えば１５〜５０残基の合成オリゴヌクレオチドをＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５等の蛍光色素、３２Ｐ等の放射性同位元素（ラジオアイソトープ）、ビオチン−ＨＲＰ等の酵素にて標識したものをプローブとして、溶液中、または固相上の目的核酸とハイブリダイゼーションさせて二本鎖核酸を形成させ、余分なプローブを除いた後、蛍光スキャナー、蛍光プレートリーダー、吸光度計、オートラジオグラフィー等にて残存プローブを検出する方法が知られている。

このような核酸検出工程などにおいて、プローブと目的の核酸をハイブリダイゼーションさせる際には、非特異的結合を抑制する特性を有するハイブリダイゼーション用緩衝液が用いられる。

複数のハイブリダイゼーションを同一条件で行う場合には、核酸プローブの融解温度（ハイブリダイゼーションした二本鎖核酸の５０％が一本鎖核酸に解離する温度）を一定にしたほうが良いが、各核酸プローブの特異性を失わずにプローブの設計を行うことの困難な場合が生じる。このような場合に、核酸の二本鎖を不安定化し、融解温度を調節する役割を果たす融解温度調整剤としてホルムアルデヒドなどがハイブリダイゼーション用緩衝液に添加されることが知られている（特許文献１）。

特許文献１には、また一般的な核酸緩衝液として、以下の(1)〜(4)が記載されている。
(1) ０．０１〜１０×ＳＳＣ緩衝液（クエン酸ナトリウム緩衝液；１×ＳＳＣ組成：０．１５ＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）
(2) ２〜１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（デンハルト溶液；５０×デンハルト溶液組成：１％Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ、１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、
(3) ＰＢＳ緩衝液（１０ ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，０．５ ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１５ Ｍ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．２）、
(4) ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８））

また、ハイブリダイゼーション用緩衝液には、所要の特性として、非特異的なハイブリダイゼーションを抑制して検出強度が向上するように、標的核酸配列や捕捉用核酸プローブ配列とは非相同的な核酸成分を添加することが知られており、非相同的な核酸成分としては、例えば５０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡが知られている（特許文献２）。

特開２００８−２７８７７９号公報 特開２０１０− ２９１７４号公報

しかしながら、上記した従来のハイブリダイゼーション用緩衝液は、マイクロアレイ用に調整されたものであるため、クロマトグラフィーにおいて速く、かつ強くハイブリダイゼーションを促進するものではなかった。クロマトグラフィーは、発色により検出する方法であり、従来の緩衝液を使用することにより検出感度が低くなり偽陰性が生じてしまう可能性が高くなることも問題である。

例えば、リステリア・モノサイトゲネスなどの有害微生物等を検出する検査などにおいては、有害微生物の核酸の増幅産物と相補的な第１のオリゴヌクレオチドプローブであってメンブレンに結合したもの、および着色高分子担体で標識した相補的な第２のオリゴヌクレオチドプローブに対し、ハイブリダイゼーションさせることによって検出する工程および検出像を目視判定により評価する検査方法などにハイブリダイゼーション用緩衝液が使用されている。

このようなハイブリダイゼーション用緩衝液では、変性一本鎖ＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーションを速く、しかも強く不可逆的に起こるようにする必要性はあるが、そのために多数の緩衝液成分から特定のものの選択とそれらの配合割合を調整することは、容易なことではない。

そこで、この発明の課題は、上記した問題点を解決し、有害微生物等を検出する検査に適用できるハイブリダイゼーション用緩衝液として、優れた検出感度が得られることを課題とし、例えば変性一本鎖ＤＮＡとプローブについてのハイブリダイゼーションを速く、かつ強く不可逆的に起こせるように成分の選択とその配合調整がなされたハイブリダイゼーション用緩衝液とすることを課題としている。

上記の課題を解決するために、この発明においては、ホルムアミドを１５〜３５質量％、ＳＳＣを４〜６×濃度、非イオン界面活性剤を０．０２〜１．５質量％含有すると共に、デンハルト溶液およびポリエチレングリコールを含有する溶液からなり、核酸をハイブリダイゼーションさせる際に用いるハイブリダイゼーション用緩衝液としたのである。

上記したように構成されたハイブリダイゼーション用緩衝液は、ホルムアミドと所定濃度の非イオン界面活性剤と、ＳＳＣ、デンハルト溶液およびポリエチレングリコールを組み合わせて配合したことにより、この配合とは異なる従来のハイブリダイゼーション用緩衝液に比べて、核酸をハイブリダイゼーションさせる際の非特異的結合が、充分に抑制されると共に、標的となる核酸との特異的結合が起こる確率を格段に高めることができる。

これによって、例えば変性一本鎖ＤＮＡを標的核酸とし、プローブとのハイブリダイゼーションを速く、しかも強く不可逆的に起こせるようになるのである。

この作用効果が充分かつ確実に奏されるようにするため、上記ハイブリダイゼーション用緩衝液に含まれるポリエチレングリコールが、分子量１５００〜２００００のポリエチレングリコールであり、かつその含有量は１〜１０質量％であることが好ましい。

また、ハイブリダイゼーション用緩衝液に配合される上記非イオン界面活性剤は、上記同様に核酸の検出効率を高めるため、所定のものから採用することが好ましく、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）、ポリ（オキシエチレン）＝オクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールｐ−オクチルフェニルエーテル、オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノールおよびオクチルフェニル−ポリエチレングリコールから選ばれる１種以上の非イオン界面活性剤を採用することが好ましい。

さらに、上記の作用が確実に奏されるように、添加成分を配合してもよく、例えば上記のハイブリダイゼーション用緩衝液組成物に、ハイブリダイズする核酸とは非相同な核酸配列のブロック核酸を添加成分として配合することが好ましい。

ブロック核酸を添加成分として配合すると、いわゆるバックグラウンドノイズとなる非特異的結合がブロックされるので、標的となる核酸との特異的結合が起こる確率をさらに高める。ブロック核酸としては、鮭精子ＤＮＡなどを用いて好ましい結果が得られる。

上記核酸が、有害微生物の遺伝子であるものを標的として採用すれば、その変性一本鎖ＤＮＡとプローブについてのハイブリダイゼーションを速く、しかも強く不可逆的に起こるようにできるので、有害微生物の検出の感度を高めるためのハイブリダイゼーション用緩衝液として有用である。

この発明は、ホルムアミド、ＳＳＣと共に、デンハルト溶液およびポリエチレングリコールを含有し、さらに非イオン界面活性剤の所定量を配合したハイブリダイゼーション用緩衝液としたので、核酸をハイブリダイゼーションさせる際に、例えば変性一本鎖ＤＮＡとプローブについてのハイブリダイゼーションを速く、かつ強く不可逆的に起こすことができる利点がある。
また、有害微生物などの核酸の検出感度を高めるためのハイブリダイゼーション用緩衝液となるという利点もある。

核酸の検出に用いるテストストリップの斜視図 テストストリップの機能を模式的に示す説明図 テストストリップの機能を模式的に示す説明図 テストストリップの機能を模式的に示す説明図 緩衝液のホルムアミド濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液のＳＳＣ濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液のデンハルト濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液の非イオン界面活性剤（Tween20）濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液の非イオン界面活性剤（Tween80）濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液の非イオン界面活性剤（TritonX-100）濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液の非イオン界面活性剤（TritonX-114）濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液の非イオン界面活性剤（TritonX-405）濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液の非イオン界面活性剤（IGEPAL CA-630）濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液のＰＥＧ１５００の濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液のＰＥＧ４０００の濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液のＰＥＧ６０００の濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液のＰＥＧ１００００の濃度とクロマトグラフにおける吸光度の関係を示す図表 緩衝液のＰＥＧ２００００の濃度とクロマトグラフの吸光度の関係を示す図表

この発明の実施形態として、ハイブリダイゼーション用緩衝液は、核酸をハイブリダイゼーションさせる際に用いられるものであり、必須成分としてホルムアミドを１５〜３５質量％、ＳＳＣを４〜６×濃度、非イオン界面活性剤を０．０２〜１．５質量％含有すると共に、デンハルト溶液およびポリエチレングリコールを含有する溶液である。

この発明において、ハイブリダイゼーションの対象となる核酸は、標的核酸とも呼ばれ、特に限定された生物種や特定の塩基配列に限定されることなく、検出目的の血液細胞などの細胞、培養細胞株、菌株、細菌その他の微生物、ウィルスなどのＤＮＡ，ＲＮＡいずれでもよく、また天然または人工的に得られる核酸であってもよく、人工のものとしては核酸誘導体や修飾塩基を有するものでもよく、一本鎖核酸、二本鎖核酸などであってもよい。例えば、食中毒症状を起こす周知の有害微生物について、その遺伝子を構成する所定の核酸を標的核酸として採用すれば、食品産業や保健衛生などにおけるこの発明の利用価値を高めることができる。

上記有害微生物の例としては、サルモネラ属菌、カンピロバクター、病原性（腸管出血性）大腸菌、セレウス菌、ノロウィルス、ロタウィルス、腸炎ビブリオ菌、エロモナス属菌、ウェルシュ菌またはリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)などが挙げられる。

この発明のハイブリダイゼーション用緩衝液に必須成分のホルムアミドは、核酸融解温度を下げることにより非特異的結合を抑制する作用があり、最終濃度で１５〜３５質量％となるように添加することが好ましい。後述する試験結果からも明らかなように、１５質量％未満のホルムアミド濃度では、ハイブリダイゼーションの際に非特異的結合も多くなるので、クロマトグラフによって検出されるラインと背景の区別がつき難くなり、明確なラインとして検出感度を上げることができなくなるので好ましくない。また、３５質量％を超えるホルムアミド濃度では、それ以上の検出感度の向上効果が得られないので、好ましくない。

また、この発明に用いる必須成分のＳＳＣは、一般的に核酸のハイブリダイゼーションに用いられる緩衝剤（緩衝液）であるが、それを最終濃度で４〜６×濃度に調整して用いる。

因みに、１倍濃度のＳＳＣは１５０ｍＭのＮａＣｌ，１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含有するｐＨ７．０の緩衝液である。所定濃度のＳＳＣを調製するには、予め、高濃度のＳＳＣを調製しておき、必要に応じて適宜に希釈すればよく、例えば２０×ＳＳＣを１Ｌ調製するには、１７５．３ｇのＮａＣｌ、８８．２ｇのクエン酸三ナトリウム二水和物を９００ｍｌの滅菌水に溶解し、１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ７．０（室温）に調整した後、１Ｌにメスアップ後、オートクレーブすればよい。

この発明に用いる非イオン界面活性剤は、例えば、以下のものから選ばれる１種以上の非イオン界面活性剤を用いて好ましい結果を得ている。なお、［ ］内に商品名を示すと共に、有効濃度および好ましい有効濃度をこの順に示した。

(1) ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート
［Ｔｗｅｅｎ２０、０．０２〜４質量％、０．２〜１．５質量％］
(2) ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート
［Ｔｗｅｅｎ８０、０．２〜１．５質量％、０．２〜０．５質量％］
(3) オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）
［ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０２〜４質量％、０．２〜１．５質量％］
(4) ポリ（オキシエチレン）＝オクチルフェニルエーテル
［ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、０．２〜１．５質量％、０．２〜０．５質量％］
(5) ポリエチレングリコールｐ−オクチルフェニルエーテル
［ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５、０．０２〜４質量％、０．２〜１．５質量％］
(6) オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノールおよびオクチルフェニル−ポリエチレングリコール［ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０、０．２〜１．５質量％、０．２〜０．５質量％］

なお、陰イオン性界面活性剤であるＳＤＳやＮ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、両イオン性界面活性剤であるＣＨＡＰＳ［化学名 3-（3-cholamidepropyl）dimethylammonio-1-propanesulphonate］またはＣＨＡＰＳＯ［化学名 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxypropanesulfonate］などを用いると、この発明に有利な効果を得ることが難くなる。

上記した非イオン界面活性剤の最終配合濃度が、上記所定範囲未満では、後述する実験結果からも明らかなように、吸光度が所期した基準値を１００％とした場合に６０％未満にまで低下してしまい、ハイブリダイゼーションを速くかつ強く不可逆的に起こすことが充分にできないために好ましくない。また、上記所定範囲を超える高濃度でも同様に、ハイブリダイゼーションを速く、かつ強く不可逆的に起こすことが充分にできないので好ましくない。
このような傾向から、この発明における非イオン界面活性剤の最終配合濃度は、０．０２〜１．５質量％とすることができ、好ましくは０．２〜１．５質量％である。

この発明に用いるデンハルト溶液は、同商品名（和光純薬社製など）で知られるハイブリダイゼーション用調製液であり、たとえば５０×濃度のものでは、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）１質量％、ポリビニルピロリドン１質量％、フィコール１質量％を含む溶液である。この成分の緩衝液中の濃度は、特に限定されないが、少なくともハイブリダイゼーション用緩衝液中の最終濃度が５×濃度程度以上に調整して好ましい結果を得ている。

また、ポリエチレングリコールについても、緩衝液中の濃度は、特に限定されないが、
後述する実験の結果からも明らかなように、分子量１５００〜２００００のポリエチレングリコールを１〜１０質量％含有させれば、検出感度は充分に向上させることが可能である。また添加効率よく、検出感度を向上させるために、分子量１５００〜６０００のポリエチレングリコールを１〜１０質量％、または分子量１００００のポリエチレングリコールを１〜２質量％、または分子量２００００のポリエチレングリコールを１〜３質量％配合するという条件を採用することもできる。

この発明のハイブリダイゼーション用緩衝液は、以下のような核酸の検出方法に用いることができる。
すなわち、試料中に存在する標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させ、増幅した標的ＤＮＡを一本鎖化し、この一本鎖の標的ＤＮＡにハイブリダイズ可能な相補的オリゴヌクレオチドからなる捕捉用プローブを、予め固相支持媒体に蛋白質を介して結合させておくと共に、標識付きの相補的オリゴヌクレオチドからなる標識用プローブを予め前記固相支持媒体に保持しておき、その後、前記固相支持媒体に、前記一本鎖の標的ＤＮＡの含有液を含浸して、前記標的ＤＮＡを捕捉用プローブおよび標識用プローブにハイブリダイゼーションさせることにより、標的ＤＮＡを前記固相支持媒体上で識別される前記標識によって、検出する核酸の検出方法とする核酸の検出方法に用いることができる。

この発明のハイブリダイゼーション用緩衝液を用いた核酸の検出方法について、以下に添付図面を参照して説明する。
図１に示す核酸の検出方法は、プラスチック製の基板１上に重ねて一体に設けた多孔性のメンブレンからなるクロマトグラフ媒体としての固相支持媒体２に、標識用プローブを展開可能に保持するガラス繊維不織布製の保持部３および捕捉用プローブの結合域４を設けたテストストリップを用いている。図中の符号５は標準核酸の検出部であり、符号６はガラス繊維不織布製の含浸用パッドであり、符号７は把持部用パッド、符号３ａはプラスチック製の展開スタートライン基準板である。

図２以下に模式的に示される標識用プローブ８は、一本鎖の標的ＤＮＡ９にハイブリダイズ可能な相補的オリゴヌクレオチド１０に着色ラテックス１１の標識を一体化したものからなり、テストストリップの展開方向の上流部分の保持部３に含浸されており、さらに乾燥させた状態で保持されている。

また、上記同様に模式的に示す捕捉用プローブ１２は、一本鎖の標的ＤＮＡ９にハイブリダイズ可能な相補的オリゴヌクレオチド１３からなり、クロマトグラフ媒体２の展開方向の下流側の所定位置に蛋白質１４を介して予め結合されている。

このテストストリップに用いるハイブリダイゼーション用緩衝液は、試料中に存在する標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させ、増幅した標的ＤＮＡを加熱処理やアルカリ処理などにより一本鎖化した後に用いることができる。
一本鎖化した標的ＤＮＡにこの緩衝液を加えた後、標識用プローブの保持部３および含浸用パッド６に含浸し、標的ＤＮＡ含有液を固相支持媒体２に展開することによって、標的ＤＮＡの検出を効率よく行う。

図３に示すように、標的ＤＮＡ９を含有するハイブリダイゼーション用緩衝液をテストストリップの端部の保持部３および含浸用パッド６に含浸し、さらに固相支持媒体２の下流側に展開させると、先ず上流側の標識用プローブの保持部３で、標的ＤＮＡ９は標識用プローブ８にハイブリダイズし、さらに展開されて図４に示すように、下流側の所定幅の帯状区域に固定されている捕捉用プローブ１２とハイブリダイズして帯状域に定着する。

展開液中に一本鎖の標的ＤＮＡが存在する場合、捕捉用プローブにハイブリダイズした標的ＤＮＡを前記標識の所定区域における色彩の顕著化、例えば肉眼で識別可能なバンドなどの識別容易化によって検出することができる。

このような核酸の検出方法は、基板１上の固相支持媒体２に標識用プローブおよび捕捉用プローブを保持したテストストリップ、展開に用いられるハイブリダイゼーション用緩衝液および検査用試料の調製に用いられる標的ＤＮＡのＰＣＲ用増幅プライマーを必須構成用品とするキットに構成されている。

また、プローブの選択に当たり、以下のようにして標的核酸の塩基配列から選択し、候補にあげられた相補的オリゴヌクレオチドを評価することができる。
例えば、リステリア・モノサイトゲネスの遺伝子ｈｌｙについての塩基配列を公的データベース（ＮＣＢＩ）からダウンロードし、整列させた上で、保存性の高い領域からプローブを選択し、検出感度を比較してラインの吸光度が高く、他の遺伝子、例えば１６Ｓ ｒＤＮＡの増幅産物でのラインが検出されないものを選択する。

なお、標識としては、特に限定されることなく、金コロイドや顔料で着色された高分子担体（ラテックス）を採用することが好ましく、青や赤色のポリスチレンラテックスは周知な標識であり、さらに官能基としてカルボキシル基を有する標識とすればアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドへの結合性が優れる。

このように標識と相補的オリゴヌクレオチドとの結合は、通常、官能基を用いて結合させることが簡便であり好ましい。また、アビジン・ビオチン、ストレプトアビジン・ビオチン、ハプテン・抗ハプテン抗体などの結合性を利用して標識に利用することができる。

標識の大きさは、多孔性の固相支持媒体に三次元網目状に形成されている孔より小径のもの（通常５００ｎｍ以下）を採用し、標識用プローブが、固相支持媒体内を緩衝液や洗浄液と共に通過することを妨げないようにする。

捕捉用プローブについても所定の相補的オリゴヌクレオチドまたはこれらの相補的塩基配列であって、前記した標識用プローブに使用したものとは異なる相補的オリゴヌクレオチドについて、一端に蛋白質を結合したものを採用できる。このような捕捉用プローブは、固相支持媒体に蛋白質を介して結合させる。

固相支持媒体としては、標的ＤＮＡの含有液である展開液を含浸して展開可能な連続した３次元の網目構造または同様な多孔性を有する繊維製不織布または多孔性メンブレンを採用できるものである。固相支持媒体の材質としては、ニトロセルロースやナイロン製のものが挙げられ、クロマトグラフ媒体として使用可能なものが好ましい。このような固相支持媒体に対し、捕捉用プローブは、蛋白質を介して結合し、固定されている。

この蛋白質としては、例えば牛血清アルブミン（ＢＳＡ）やイムノグロブリンＧを代表例とし、血清アルブミン、リポ蛋白質、糖蛋白質、α，β，γ−グロブリン、オボアルブミン、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）その他の可溶性蛋白質などを採用することができる。

このように蛋白質を用いると、高分子の蛋白質の単位粒子当たり多数の捕捉用プローブが集合して高密度に結合することが可能であるため、捕捉用プローブが固相支持媒体上の特定区域に高い密度で固定され、標識用プローブが高感度に検出できるようになる。

例えば、ビーズ状の多数のニトロセルロース粒子からなる固相支持媒体を使用して核酸を検出する場合には、固相支持媒体に標的ＤＮＡの含有液を含浸して前記標的ＤＮＡを捕捉用プローブおよび標識用プローブにハイブリダイゼーションさせ、ハイブリダイズしなかった標識用プローブを洗浄により除去すれば、標的ＤＮＡが存在する場合にのみ固相支持媒体上で標識の色などによる目視検出が可能である。

また、固相支持媒体が、クロマトグラフ媒体である場合には、展開方向の上流側に前記標識用プローブを配置し、かつ下流側に前記捕捉用プローブを配置しておくことにより、上流側から一本鎖の標的ＤＮＡを前記標識用プローブとハイブリダイズした状態で展開させ、下流側で前記捕捉用プローブにハイブリダイズした標的ＤＮＡを前記標識によって検出することができる。

［実施例１、参考例１、２、実施例４〜２１、比較例１］
標的ＤＮＡをリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のｈｌｙ遺伝子とし、所定の標的ＤＮＡをＰＣＲ法により二本鎖核酸として増幅させる手段として、試料中の標的ＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、増幅した所定の標的ＤＮＡを９５℃で５分間加熱後、急冷し、一本鎖化した。

テストストリップとして、前述の図１に示す形態のものを用い、表１に示す組成の実施例または比較例のハイブリダイゼーション用緩衝液を用いて展開したときに検出されるラインの吸光度を浜松ホトニクス株式会社製イムノクロマトリーダー（型番Ｃ１００６６）を用いて測定することにより、増幅産物の検出感度を相対的に比較した。
なお、実施例１のクロマトグラムのラインの吸光度を基準値の１００％とした。ポリエチレングリコールとしては、分子量６０００のもの（ＰＥＧ６０００と略記される。）を使用した。

また、上記テストストリップに用いた標識用プローブは、標的ＤＮＡの相補的塩基配列をラテックスで標識したものであり、捕捉用プローブは、標識用プローブに使用したものとは異なる所定の相補的オリゴヌクレオチド、またはこれらの相補的塩基配列の一端に、固相支持媒体との結合用の蛋白質を結合したものである。

実施例１のハイブリダイゼーション用緩衝液を基準として、各必須成分ごとに濃度を変化させた場合について、濃度と吸光度の関係を図５〜１３に示した。なお、図中に記載された成分濃度を示す％は、質量％である。

比較例１のハイブリダイゼーション用緩衝液を用いた場合のクロマトグラフ媒体に展開された捕捉用プローブの結合域４に形成されたバンドの吸光度は計測の結果、７．９であったのに対して、実施例１のハイブリダイゼーション用緩衝液を用いた場合の同バンドの吸光度は５８．９であり、実施例１の感度は約７倍程度に改善されることが判明した。

そして、図５の結果から、ハイブリダイゼーション用緩衝液中のホルムアミド濃度と感度（吸光度）は反比例し、実施例１の２５％（実施例４の３０％、実施例５の３５％）以上で実施例１と同等のプラトー（横這い）状態になることがわかる。
また、ホルムアミド濃度２０％以下の低濃度の条件では、低濃度化するほどバンドの識別性が損なわれる傾向がみられたが、その傾向に対する非特異反応との関係を調べるために以下の実験を行い、その結果を以下の表２に示した。
すなわち、核酸クロマトグラムのバンド部分の吸光度の測定試験において、上記の実施例および比較例で使用した所定の標的ＤＮＡに代えて、標識用プローブおよび捕捉用プローブの塩基配列とは相補的でない非対象のＤＮＡからなるＰＣＲ産物を用いたこと以外は、同様にして、展開後１５分後のバンド部分の吸光度を測定する試験を行い、この試験結果として、緩衝液のホルムアミド濃度とクロマトグラフの非特異反応の関係を表２に示した。

表２に示される測定結果からも明らかなように、ハイブリダイゼーション用緩衝液中のホルムアミド濃度が２０質量％以下では、低濃度化するほど吸光度が増加していることから、非特異反応が起こっているものと認められ、同濃度２５質量％では吸光度が０を示すことから、２５質量％以上の高濃度では非特異反応は起こらないことがわかる。
この結果から、ハイブリダイゼーション用緩衝液中のホルムアミド濃度は、２５質量％以上であることが、非特異反応を起こさずに核酸の検出効率を向上させるために好ましく、例えば２５〜３５質量％であることは、より好ましいことがわかる。

また、図６の結果から、ハイブリダイゼーション用緩衝液中のＳＳＣの濃度と感度（吸光度）の関係をみると、４×濃度未満では、濃度依存的に感度（吸光度）は上昇するが、実施例１の４×（実施例６の６×）以上では、実施例１と同程度の感度でプラトー（横這い）状態になった。

次に、図７の結果から、ハイブリダイゼーション用緩衝液中のデンハルトの濃度と感度（吸光度）の関係をみると、５×濃度での感度（１００％）が実施例１であり、これ以上の高濃度のデンハルトを使用しても、吸光度の増加傾向からみて顕著な感度の向上は認められなかった。そのため、デンハルトの濃度による感度の影響はあまりないものと判断される。

図８の結果から、同緩衝液中の非イオン性界面活性剤（Tween20）の濃度と感度の関係をみると、０．０２％以上または０．２％（実施例７）以上（実施例８は０．５％、実施例９は１％）の濃度での感度は実施例１と同等であり、０％の状態に比べて約２倍の感度でプラトー(横這い)となった。

図９の結果から、同緩衝液中の非イオン性界面活性剤（Tween80）の濃度と感度の関係をみると、０．２％（実施例１０）から０．５％（実施例１１）の範囲で感度は実施例１と同等になり、それ以上の高濃度で感度は却って低下することがわかる。

図１０の結果から、同緩衝液中の非イオン性界面活性剤（TritonX-100）の濃度と感度の関係をみると、０．０２％（実施例１２）、０．２（実施例１３）および０．５％(実施例１４)の範囲で感度は実施例１の９０％程度になり、１．５％では実施例１の６０％程度の使用に耐える感度であった。

図１１の結果から、同緩衝液中の非イオン性界面活性剤（TritonX-114）の濃度と感度の関係をみると、０．２％（実施例１５）から０．５％（実施例１６）の範囲での感度は実施例１の８５〜１０５％であった。

図１２の結果から、同緩衝液中の非イオン性界面活性剤（TritonX-405）の濃度と感度の関係をみると、０．５％ (実施例１８)から１．５％(実施例１９)の範囲で感度は実施例1の９５％程度であった。

図１３の結果から、同緩衝液中の非イオン性界面活性剤（IGEPAL CA-630）の濃度と感度の関係をみると、０．２％(実施例２０)で感度は実施例1の約８５％であった。

［実施例２２〜３８］
ハイブリダイゼーション用緩衝液中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の濃度と感度（吸光度）の関係を調べるため、実施例１において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ６０００）に代えて、ＰＥＧ１５００（分子量１５００）、ＰＥＧ４０００（分子量４０００）、ＰＥＧ６０００（分子量６０００）、ＰＥＧ１００００（分子量１００００）、ＰＥＧ２００００（分子量２００００）を用い、１、２、３、５または１０質量％に濃度調整した緩衝液を用い、実施例１と同様にテストストリップに標的核酸（リステリア・モノサイトゲネスのｈｌｙ遺伝子）のＰＣＲ増幅産物を展開し、検出されるラインの吸光度を測定し、増幅産物の検出感度を調べ、結果を図１４〜１８に示した。なお、図中に記載した成分濃度％は、いずれも質量％である。

図１４の結果からも明らかなように、分子量１５００のＰＥＧ濃度が１質量％の実施例２２、２質量％の実施例２３、３質量％の実施例２４、５質量％の実施例２５または同１０質量％の実施例２６の緩衝液を使用したテストストリップの検出感度は、ＰＥＧ無添加のハイブリダイゼーション用緩衝液の場合よりも格段に向上し、１〜１０質量％では、吸光度は１１０〜１５０％程度に向上した。特にＰＥＧ濃度が３〜１０質量％では、吸光度は１２０〜１６０％という著しい上昇が認められた。

図１５の結果からも明らかなように、分子量４０００のＰＥＧ濃度が２質量％の実施例２７、３質量％の実施例２８、５質量％の実施例２９の緩衝液を使用したテストストリップの検出感度は、ＰＥＧ無添加のハイブリダイゼーション用緩衝液の場合よりも１４０〜２３０％まで格段に向上した。

このように分子量４０００のＰＥＧを使用したハイブリダイゼーション用緩衝液は、ＰＥＧ濃度が高いほど吸光度は上昇し、２〜５質量％でこの好ましい傾向が見られた。なお、１０質量％のＰＥＧ濃度では、検出ラインの背景まで吸光度が高くなり、却って検出感度は低下する傾向となった。

図１６の結果からも明らかなように、分子量６０００のＰＥＧを１質量％使用した実施例３０、同２質量％の実施例３１、同３質量％の実施例３２、同５質量％の実施例３３の緩衝液を使用したテストストリップの検出感度は、ＰＥＧ無添加のハイブリダイゼーション用緩衝液の場合よりも１２５〜１８０％まで向上した。このように分子量６０００のＰＥＧを使用したハイブリダイゼーション用緩衝液は、ＰＥＧ濃度が１〜５質量％で吸光度が上昇し検出感度が高められる傾向が見られた。なお、１０質量％のＰＥＧ濃度では、検出ラインの背景（バックグラウンド）まで吸光度が高くなったため、却って検出感度は低下する傾向となった。

図１７の結果からも明らかなように、分子量１００００のＰＥＧを１質量％使用した実施例３４、同２質量％の実施例３５の緩衝液を使用したテストストリップの検出感度は、ＰＥＧ無添加のハイブリダイゼーション用緩衝液の場合よりも１２０〜１４０％まで向上した。このように分子量１００００のＰＥＧを使用したハイブリダイゼーション用緩衝液は、ＰＥＧ濃度が１〜２質量％で吸光度が上昇し、検出感度が高められた。

図１８の結果からも明らかなように、分子量２００００のＰＥＧを１質量％使用した実施例３６、２質量％の実施例３７、３質量％の実施例３８の緩衝液を使用したテストストリップの検出感度は、ＰＥＧ無添加のハイブリダイゼーション用緩衝液の場合よりも１３５〜１６０％まで向上した。このように分子量２００００のＰＥＧを使用したハイブリダイゼーション用緩衝液は、ＰＥＧ濃度が１〜３質量％で吸光度が上昇し検出感度が高められる傾向が見られた。

なお、１０質量％のＰＥＧ濃度では、検出ラインの背景まで吸光度が高くなったため、却って検出感度は低下する傾向となった。また、これ以上に高分子量（例えば３５０００程度）のＰＥＧをハイブリダイゼーション用緩衝液に添加しても、その粘性も高いことから効率良く検出感度を向上できないと考えられる。

１ 基板
２ 固相支持媒体
３ 保持部
３ａ 展開スタートライン基準板
４ 捕捉用プローブの結合域
５ 標準核酸の検出部
６ 含浸用パッド
７ 把持部用パッド
８ 標識用プローブ
９ 一本鎖のＤＮＡ
１０、１３ 相補的オリゴヌクレオチド
１１ 着色ラテックス
１２ 捕捉用プローブ

Claims (6)

1. ホルムアミドを２５〜３５質量％、ＳＳＣを４〜６×濃度、非イオン界面活性剤を０．０２〜１．５質量％含有すると共に、デンハルト溶液およびポリエチレングリコールを含有する溶液からなり、核酸をクロマトグラフでハイブリダイゼーションさせる際に用いるハイブリダイゼーション用緩衝液。
2. 上記ポリエチレングリコールが、分子量１５００〜２００００のポリエチレングリコールであり、かつその含有量は１〜１０質量％である請求項１に記載のハイブリダイゼーション用緩衝液。
3. 上記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）、ポリ（オキシエチレン）＝オクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールｐ−オクチルフェニルエーテル、オクチルフェノキシ−ポリエトキシエタノールおよびオクチルフェニル−ポリエチレングリコールから選ばれる１種以上の非イオン界面活性剤である請求項１または２に記載のハイブリダイゼーション用緩衝液。
4. 請求項１〜３のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用緩衝液に、ハイブリダイズする核酸に対して非相同な核酸配列のブロック核酸を含有するハイブリダイゼーション用緩衝液。
5. ブロック核酸が、鮭精子ＤＮＡである請求項４に記載のハイブリダイゼーション用緩衝液。
6. 上記核酸が、有害微生物の遺伝子である請求項１〜５のいずれかに記載のハイブリダイゼーション用緩衝液。

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