JP6181742B2

JP6181742B2 - Ｈｅｖアッセイ

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Publication number: JP6181742B2
Application number: JP2015506198A
Authority: JP
Inventors: ライイング，ヘルマン; マイヤーズ，トーマス・ダブリュー; ニュートン，ニコラス; ルスマン，エーバーハルト; サン・フィリッポ，ジョセフ; シェーンブラナー，ナンシー; ヴィルツ，ハイケ; ウー，シヤオニーン; ヤング，カレン・クオック・イーン; ツィンマーマン，ディルク
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2013-04-15
Publication date: 2017-08-16
Anticipated expiration: 2033-04-15
Also published as: US20170268074A1; CN108588279A; CA2862373A1; US10689718B2; WO2013156432A1; CA2862373C; US9702017B2; EP2839039B1; EP2839039A1; ES2637489T3; US20130280697A1; JP2015517810A; CN104321443A

Description

本発明は、ＨＥＶ感染を検出するための診断検査、プライマーセット、オリゴヌクレオチドセットおよびキットに関する。

ＨＥＶ感染は結果として急性疾患であるＥ型肝炎をもたらす。ＨＥＶはヘペウイルス科（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）に分類される非エンベロープ型、一本鎖、プラス鎖（ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｅｎｓｅ）ＲＮＡウイルスである。ヒトにおいて感染症を引き起こすＨＥＶの４つの主な遺伝子型：遺伝子型１、２、３および４が存在する。ＨＥＶに関する診断検査は、急性肝炎の他の原因が排除されている人々にとって重要である。

ＨＥＶの異なる領域がＨＥＶに関する核酸に基づく検査の設計のために用いられてきた。ＨＥＶのＯＲＦ２およびＯＲＦ３が核酸増幅によりＨＥＶを検出するために主に用いられてきた。特許第０４０８０９９５号および特許第０４１２７７２２号は、ＨＥＶの５’ＵＴＲ中に部分的に位置するプライマーに基づくネステッドプライマー増幅アプローチのための多数の縮重位置（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）を有する縮重プライマーの使用を提案している。

特許第０４０８０９９５号特許第０４１２７７２２号

本発明は、以下の工程を含む、生物学的試料中に存在する場合にＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４を同時に増幅するための方法に関する：
（ａ）その生物学的試料中に存在する核酸を単離し；
（ｂ）工程（ａ）において単離された核酸を１種類の非縮重順方向プライマーおよび少なくとも１種類の非縮重逆方向プライマーを用いて増幅し、ここでその順方向および逆方向プライマーはＨＥＶの遺伝子型１、２、３、および４を増幅することができ、
ここでその順方向プライマーの核酸配列はＳｅｑＩＤＮＯ：６を含み、かつ１種類以上の逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７〜１４から選択される配列を含む。

１観点において、本発明は順方向プライマーおよび少なくとも１種類の逆方向プライマーを含むプライマーのセットに関し、ここでその順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６を含み、かつここでその少なくとも１種類の逆方向プライマーの核酸配列またはその逆方向プライマーはＳＥＱＩＤＮＯ：７〜１４からなる群から選択される。

１観点において、本発明はオリゴヌクレオチドのセットに関し、ここで前記のセットは本明細書で記載されるようなプライマーのセットおよび１つのプローブからなり、ここで前記のプローブは核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９またはそれらの相補配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む。

１観点において、本発明は、生物学的試料中のＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４を同時に検出するための本明細書で記載されるようなプライマーまたはオリゴヌクレオチドのセットの使用に関する。

１観点において、本発明は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび本明細書で記載されるようなプライマーまたはオリゴヌクレオチドのセットを含むキットに関する。

図１は液体試料からの核酸の単離のための作業の流れを示す。

１つの特定の態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６を含み、かつその少なくとも１種類の逆方向プライマーの核酸配列（単数または複数）はＳＥＱＩＤＮＯ：７〜１４からなる群から選択される。別の特定の態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６を含み、かつ２種類の逆方向プライマーの混合物の核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３およびＳＥＱＩＤＮＯ：１４を含む。別の特定の態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなり、かつその逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７を含む。別の特定の態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなり、かつその逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３を含む。別の特定の態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなり、かつその逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１を含む。

その方法は、ＨＥＶの遺伝子型１、２、３および４を単一反応で同時かつ効率的に増幅することができる利点を有する。
１つの特定の態様において、その核酸は固相への結合により単離される。

１つの特定の態様において、その方法はさらに、その増幅された核酸をプローブと、そのプローブのその増幅された核酸への結合に十分な条件下で接触させることを含む。その１つの特定の態様において、そのプローブは核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９もしくは２５またはそれらの相補配列の少なくとも２２〜３５個の連続したヌクレオチドを含む。１つの特定の態様において、そのプローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９もしくは２５またはそれらの相補配列から選択される配列からなる。その１つの特定の態様において、そのプローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１８もしくは２５またはそれらの相補配列から選択される配列からなる。１つの特定の態様において、前記のプローブはそのプローブの５’末端に連結された蛍光体およびクエンチャーを含み、ここで蛍光体およびクエンチャーの間の間隔は少なくとも９ヌクレオチドを含む。

その方法のさらなる特定の態様を下記に記載する。
本発明は、以下の工程を含む、生物学的試料中に存在する場合にＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４を同時に検出する方法にも関する：
（ａ）その試料中に存在する核酸を単離し；
（ｂ）工程（ａ）において単離された核酸を１種類の非縮重順方向プライマーおよび少なくとも１種類の非縮重逆方向プライマーを用いて増幅し、ここでその順方向および逆方向プライマーはＨＥＶの遺伝子型１、２、３、および４を増幅することができ、
ここでその順方向プライマーの核酸配列はＳｅｑＩＤＮＯ：６を含み、１種類以上の逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７〜１４から選択される配列を含み、
そして
（ｃ）工程（ｂ）において得られた増幅された核酸を、その生物学的試料中のＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４の少なくとも１つの存在の指標として検出する。

用語“検出すること”は、本明細書で用いられる際、増幅された核酸の存在と相関するシグナルの検出に関する。検出は定量的または定性的であってよい。その増幅された核酸の検出は、その生物学的試料中のＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４の少なくとも１つの存在の指標を提供する。

用語“同時検出”は、本明細書で用いられる際、単一反応混合物中のＨＥＶの異なる遺伝子型を検出するための方法の設計に関する。これは、その方法において用いられるプライマーおよびプローブの配列が、その試料中に存在する場合に同時に検出されるべき遺伝子型の全てに関して適度な検出シグナルを生成することができることを必要とする。当然、１つの遺伝子型のみが試料中に存在する場合、その方法は、たとえそれが単一反応でＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３および／またはＧＴ４の１つより多くを検出することができるとしても、その１つの遺伝子型のみを検出するであろう。

いくつかの遺伝子型（以下ＧＴと略す）の同時検出は、全ての遺伝子型の検出を可能とする増幅のための非縮重プライマーおよびプローブを設計するのに適した高度に保存された領域が利用可能でない限り、しばしばその必要とされる遺伝子型のすべてが検出されることを確実にするために縮重プライマーおよびプローブの使用を必要とする。そのような領域を常に同定することができるとは限らない。先行技術は、５’ＵＴＲ以外の領域、例えばカプシド領域を、ＨＥＶを検出するためのアッセイを設計するために適したものとして同定した。上記で引用した先行技術の参考文献は縮重プライマーの使用を提案し、その一部は３個より多くの縮重位置を含み、従ってそれはネステッドプライマーアプローチに関して５’ＵＴＲ領域から高度に縮重している。高度に縮重したプライマーに関する要求およびネステッドＰＣＲを実施する必要性は、５’ＵＴＲの検出に基づく先行技術で開示された方法がＯＲＦ２またはＯＲＦ３の保存された領域からのプライマー配列を用いる方法ほど高感度ではないことを示唆している。用語（ｔｅｒ）“５’ＵＴＲ”は、本明細書においてＨＥＶの５’ＵＴＲ配列と少なくとも部分的に重複している標的配列、プライマーおよびアンプリコンに関して用いられている。

用語“生物学的試料”は、それに対して核酸を標的とする診断アッセイを行うことができ、通常生物学的な源に由来する物質に関する。一部の態様において、前記の生物学的試料はヒトに由来し、体液である。本発明の１態様において、その生物学的試料はヒトの血液、血漿、血清、尿、痰、汗、スワブ、ピペットで扱える便、または髄液である。その生物学的試料は、それから標的核酸を抽出することができる組織であることもできる。

用語“非縮重”は、本明細書で用いられる際、全ての位置が単一のヌクレオチドにより定められる、すなわちＡ、Ｇ、ＴまたはＣのどれかであるプライマーまたはプローブ核酸に関する。非縮重プライマーまたはプローブは当該技術で周知の方法を用いて化学合成され、精製することができる。

用語“縮重”は、本明細書で用いられる際、特定の位置が単一の特定のヌクレオチドにより定められないプライマーまたはプローブ核酸に関する。従って、そのような縮重位置において、そのプライマーまたはプローブ配列は少なくとも２種類の異なるヌクレオチドのどれか１つであることができる。そのような位置はしばしばその標的核酸の遺伝子型における違いを表す。縮重配列は、この発明の目的のために少なくとも２つの位置において異なる多数の非縮重の個々の配列を混合したものとして表されてもよい。

非縮重プライマーおよびプローブの使用はいくつかの利点を有する。１つの利点は、非縮重プライマーを用いて４つの遺伝子型を検出することにより、ミスプライミングの、縮重プライマー組成物中の異なる配列間の競合の危険性、およびその増幅の感度が改善されることである。従って、多数の遺伝子型を検出するために少なくとも単一の非縮重の順方向または逆方向プライマーを用いることが望ましい。相補プライマー（順方向プライマーが非縮重である場合は逆方向プライマー、または逆方向プライマーが非縮重である場合は順方向プライマー）は少なくとも１種類の非縮重プライマーを含んでいてよい。

用語“プライマー”または“プローブ”は、本明細書で用いられる際、オリゴヌクレオチド配列に関する。この発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”は、それらの単量体単位としての複数のヌクレオチドから形成された構成要素を指す。用語“オリゴヌクレオチド”には修飾オリゴヌクレオチドも含まれ、すなわちそのプライマーおよび／またはそのプローブは修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチド化合物を含む。用語“プライマー”はさらに、増幅反応において用いられ、標的配列にアニールするようなオリゴヌクレオチドに関する。用語“プローブ”はさらに、定性的または定量的検出のどちらかの目的のために標的核酸またはアンプリコンにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列に関する。

プローブの場合、修飾には色素、例えばＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、ＣＹ５、ＣＹ５．５、クマリン等および／またはクエンチャー分子が含まれ得る。色素分子はリンカーに連結することができる。しかし、そのような色素はプライマー中に存在していてもよい。他の典型的な修飾には、３’末端のホスフェート基が含まれる。そのような色素分子および／またはクエンチャー分子は、標的とされる核酸の検出のために用いることができる。

プライマーの一般的な修飾には、非特異的増幅産物、例えばプライマーダイマーを防ぐための３’ヌクレオチドの修飾が含まれる。そのような修飾は当該技術では周知であり、それには、限定的でない例として、ｔ−ブチルベンジル−ｄＡまたは−ブチルベンジル−ｄＣが含まれる。そのような修飾も用語“プライマー”に含まれる。

従って、用語“順方向プライマー”は、本明細書で用いられる際、核酸のセンス鎖をプライミングしてポリメラーゼがその標的核酸の１つの鎖に沿って１方向に伸長することを可能にする１つのプライマーを意味することが理解されており、用語“逆方向プライマー”は、核酸のアンチセンス鎖をプライミングしてポリメラーゼがその標的核酸の相補鎖に沿って１方向に伸長することを可能にするプライマーを意味することが理解されており、その結果１つの末端において順方向プライマー配列およびその相補配列を有し、反対側の末端において逆方向プライマー配列およびその相補配列を有する二本鎖アンプリコンが得られる。逆転写（ＲＴ）工程が最初に実施される反応では、その逆方向プライマーは逆転写のためのＲＴプライマーの役目も果たす。ＲＴ−ＰＣＲは当該技術で周知の技術である。１態様において、ＲＴ工程が実施される。

１つの特定の態様において、１種類の非縮重順方向プライマーおよび少なくとも１種類の非縮重逆方向プライマーが用いられる。あるいは、１種類の非縮重逆方向プライマーおよび少なくとも１種類の非縮重順方向プライマーが用いられる。さらなる特定の態様において、１種類の非縮重順方向プライマーおよび２種類の非縮重逆方向プライマーの混合物が用いられる。あるいは、２種類の非縮重順方向プライマーおよび１種類の非縮重逆方向プライマーの混合物が用いられる。特定の態様において、その２種類の非縮重プライマーは単一のヌクレオチド位置においてのみ異なる。これは、異なる遺伝子型のヌクレオチド配列における違いを埋め合わせる（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）ことができ、その遺伝子型を単一反応で検出する一方で１個より多くの縮重の位置を有するプライマーを用いる不都合を避けることができる利点を有する。

従って、１種類の順方向プライマーおよび少なくとも１種類の逆方向プライマーを用いる場合、単一の順方向プライマー配列を用いる一方で１種類以上の逆方向プライマー配列を用いることができることが理解されている。２種類の逆方向プライマーを用いる場合、２種類の逆方向プライマー配列の混合物が用いられる。あるいは、１種類の逆方向プライマーおよび少なくとも１種類の順方向プライマーを用いる場合、単一の逆方向プライマー配列を用いる一方で１種類以上の順方向プライマー配列を用いることができる。２種類の逆方向プライマーを用いる場合、２種類の逆方向プライマー配列の混合物が用いられる。

用語“増幅すること”は標的核酸からの複数の核酸分子の生成に関し、ここでプライマーはポリメラーゼによる伸長のための開始部位を提供するためにその標的核酸分子上の特定の部位にハイブリダイズする。増幅は当該技術で一般的に知られているあらゆる方法により実施することができ、それは例えば標準的なＰＣＲ、ロングＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、ｑＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲおよび等温増幅法であるが、それらに限定されない。ＰＣＲの１つの態様はリアルタイムＰＣＲであり、それは当該技術で周知であり、それは増幅および検出を組み合わせる。

その方法の１観点において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１〜６からなる群から選択され、少なくとも１種類の逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７〜１４からなる群から選択される。これらの順方向および逆方向プライマーの異なる組み合わせを用いて得られるヒット率を表３において示す。表５および表８は、本明細書で記載されるようなプライマーおよびプローブ配列がＨＥＶ遺伝子型ＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３およびＧＴ４を検出することを示している。１つの具体的な態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１、２、３、４または６である。より具体的な態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：２、３、４または６である。より具体的な態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３、４または６である。具体的な態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６である。

具体的な態様において、その逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７、８、９、１０、１１、１３または１４からなる。より具体的な態様において、その逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：８、９、１０、１１、１３または１４である。より具体的な態様において、その逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：９、１０、１１、１３または１４である。具体的な態様において、その２種類の逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３およびＳＥＱＩＤＮＯ：１４からなり、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなる。別の具体的な態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなり、その逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１からなる。別の具体的な態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなり、その逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３からなる。別の具体的な態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなり、その逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７からなる。

１観点において、存在する場合にＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３および／またはＧＴ４の少なくとも２つを単一反応で同時に検出することができる。１つの具体的な態様において、存在する場合に少なくともＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３およびＧＴ４を単一反応で同時に検出することができる。さらなる具体的な態様において、存在する場合にＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３およびＧＴ４を単一反応で同時に検出することができる。

１観点において、その方法はさらに核酸を単離することを含み、ここで前記の核酸の単離は工程（ｂ）に先行し、かつここで前記の単離された核酸が工程（ｂ）で増幅される。
用語“核酸を単離すること”は、溶解として知られる核酸の細胞またはウイルス粒子からの放出の後その核酸の濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を行うことに関する。そのような単離は増幅に関するその標的核酸のプライマーへの利用可能性を増大させ、その試料中に存在し得るその後の増幅反応の可能性のある阻害物質も除去する。１つの具体的な態様において、前記の核酸は固相への結合により単離される。核酸を結合させるための１つの有用な手順は、カオトロピック塩溶液中での核酸の例えば磁性粒子のような結合粒子のガラス表面への選択的結合およびその核酸の混入物質、例えばアガロース、タンパク質または細胞破壊片からの分離を伴う。一部の態様において、その粒子のガラスは国際公開第９６／４１８１１号において記載されているゲルゾルプロセスを用いて形成され、次いで乾燥および圧縮される。

１つの具体的な態様において、その方法はさらに、工程（ｂ）および（ｃ）の間に（ｂ１）その増幅された核酸をプローブのその増幅された核酸への結合に十分な条件下でプローブと接触させる工程を含み、
ここで前記の工程（ｃ）における接触は以下の工程を含む：
その増幅された標的核酸およびそのプローブの間の結合生成物を、その生物学的試料中のＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４の少なくとも１つの存在の指標として検出する。

１つの具体的な態様において、そのプローブは非縮重核酸配列を有する。これは、再び、ハイブリダイゼーションの間のミスプライミングまたは縮重プローブのプローブ分子間の干渉が回避され、検出の感度が向上する利点を有する。そのプローブは、順方向および逆方向プライマー（単数または複数）を用いる増幅により生成されるアンプリコンの配列にハイブリダイズすることができなければならない。具体的な態様において、そのプローブはそのプライマーの配列と重複しないアンプリコンの配列にハイブリダイズすることができる。そのアンプリコンはその順方向および逆方向プライマー（単数または複数）を用いる増幅の少なくとも１つの工程の産物に関連することが理解されている。

１観点において、そのプローブは核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９もしくは２５またはそれらの相補配列の少なくとも２２〜３５個の連続したヌクレオチドを含む。
１つの具体的な観点において、そのプローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９もしくは２５またはそれらの相補配列から選択される核酸配列を有する。これらのプローブのＨＥＶ遺伝子型の検出における性能を表４において示す。１つの具体的な態様において、そのプローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１８から選択される核酸配列を有する。さらなる具体的な態様において、そのプローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１５および１８から選択される核酸配列を有する。

本明細書で記載される方法、プライマーのセット、オリゴヌクレオチドのセットおよびキットの具体的な態様は、以下のプライマー核酸配列の組み合わせを含む：ＳＥＱＩＤＮＯ：８、１０、１１、１３または１４と混合した１３と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：１；ＳＥＱＩＤＮＯ：８、９、１０、１１、１３または１４と混合した１３と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：２；ＳＥＱＩＤＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４と混合した１３と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：３；ＳＥＱＩＤＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４と混合した１３と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：４；ＳＥＱＩＤＮＯ：１０、１１、１３または１４と混合した１３と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：５；ＳＥＱＩＤＮＯ：７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４と混合した１３と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：６；ＳＥＱＩＤＮＯ：３または４または６と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：７；ＳＥＱＩＤＮＯ：２、３または４または６と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：８；ＳＥＱＩＤＮＯ：２、３、４、５または６と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：９；ＳＥＱＩＤＮＯ：１、２、３、４、５または６と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：１０；ＳＥＱＩＤＮＯ：１、２、３、４、５または６と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：１１；ＳＥＱＩＤＮＯ：３または４と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：１２。順方向および逆方向プライマーの組み合わせの核酸配列のさらなる具体的な態様は、ＳＥＱＩＤＮＯ：７と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：６、ＳＥＱＩＤＮＯ：１３およびＳＥＱＩＤＮＯ：１４と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：６、ならびにＳＥＱＩＤＮＯ：１１と組み合わせたＳＥＱＩＤＮＯ：６である。１つの具体的な態様において、その順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６からなる。１つの具体的な態様において、その核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：６からなる順方向プライマーを逆方向プライマーと組み合わせ、ここでその逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７からなる。別の具体的な態様において、その核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：６からなる順方向プライマーを逆方向プライマーと組み合わせ、ここでその逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３からなる。別の具体的な態様において、その核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：６からなる順方向プライマーを逆方向プライマーと組み合わせ、ここでその逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１１からなる。別の具体的な態様において、その核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：６からなる順方向プライマーを２種類の逆方向プライマーの混合物と組み合わせ、ここでその逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３およびＳＥＱＩＤＮＯ：１４からなる。

これらのプライマーのセット、これらのプライマーのセットが用いられる方法、およびこれらのプライマーのセットを含むキットの利点は、ＨＥＶの全ての４つの遺伝子型１、２、３、および４を単一反応で無関係な微生物との交差反応性なしで効率的に増幅および検出することができることである。さらなる利点は、その試験は、特定の非縮重配列を有する全てのオリゴヌクレオチドが合成され得るため、単純化されていることである。これはそのオリゴヌクレオチドの質ならびにその方法の感度および特異性を著しく向上させる。さらに、内部対照のオリゴヌクレオチドの他に、（プローブを含めて）３〜４種類のＨＥＶ特異的オリゴヌクレオチドしかＨＥＶの全ての４つの遺伝子型を同時に検出するために用いられないため、異なるオリゴヌクレオチド間の交差反応性の危険性が最小限になっている。ＨＥＶの異なる遺伝子型を別々に同定する必要がないため、本発明の方法、プライマー、オリゴヌクレオチドのセット、およびキットは、ＨＥＶの４つの遺伝子型のいずれかが試料中に存在するかどうかを決定するために単一の検査のみを行うことができるため、対費用効果も高い。

上記のプライマーの組み合わせの特定の態様は、さらにＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９および２１からなる群から選択される核酸配列を有する１種類のプローブと組み合わせることができる。１つの具体的な態様において、そのプローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１８からなる群から選択される。さらに具体的な態様において、そのプローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１５または１８から選択される。１つの具体的な態様において、そのプローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１５からなる。１つの具体的な態様において、そのプローブの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１８からなる。

表１Ａ〜Ｃは、本方法、プライマー、プローブ、使用およびキットにより、５’ＵＴＲにおいて、カプシド（ＯＲＦ２）領域における非縮重プライマーおよびプローブの使用と比較して、５００ｃｐ／ｍｌの標的を用いてＧＴ３またはＧＴ１、ＧＴ３およびＧＴ４（ＧＴは遺伝子型を意味する）を検出した場合により優れたヒット率が得られることを示している。

ＨＥＶのＧＴ１の５’ＵＴＲに関する代表的な配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３８であり、ＨＥＶのＧＴ２の５’ＵＴＲに関する代表的な配列はＳＥＱＩＤＮＯ：３９であり、ＨＥＶのＧＴ３の５’ＵＴＲに関する代表的な配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４０であり、ＨＥＶのＧＴ４の５’ＵＴＲに関する代表的な配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４１である。ＨＥＶのＧＴ１のカプシドに関する代表的な配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４２であり、ＨＥＶのＧＴ２のカプシドに関する代表的な配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４３であり、ＨＥＶのＧＴ３のカプシドに関する代表的な配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４４であり、ＨＥＶのＧＴ４のカプシドに関する代表的な配列はＳＥＱＩＤＮＯ：４５である。

１つの具体的な観点において、そのプローブはプローブの５’末端に連結された蛍光体およびクエンチャーを含み、ここで蛍光体およびクエンチャーの間の間隔は少なくとも９ヌクレオチドを含む。用語“間隔”は、蛍光体およびクエンチャーの間のヌクレオチドの数に関する。他の具体的な観点において、そのプローブは蛍光体およびクエンチャーの間に少なくとも１０または少なくとも１１または少なくとも１２ヌクレオチドを含む。１つの具体的な態様において、そのプローブは蛍光体およびクエンチャーの間に１２ヌクレオチドを含む。

プローブに連結された蛍光体およびクエンチャーを用いる検出は、核酸のリアルタイム増幅に関する周知の検出法である。プローブの未結合状態における蛍光体およびクエンチャーの間のエネルギー移動は励起した蛍光体による蛍光の放射の消失をもたらす。ハイブリダイズした状態では、蛍光体およびクエンチャーが分離し、エネルギー移動が阻害され、結果として励起した蛍光体からの光の放射がもたらされる。蛍光体は、励起後に特定の波長の蛍光を放射する色素である。これらの色素は検出のために用いられている。蛍光体の例には、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、ＣＹ５、ＣＹ５．５、クマリン等が含まれる。蛍光体は５’核酸にリンカー分子を介して連結することができる。そのようなリンカー分子は当該技術で周知である。限定的でない例は、ｔｈｒｅｏ−ＨＥＸ、ｔｈｒｅｏ−ＦＡＭ、ｔｈｒｅｏ−ＪＡ２７０等である。クエンチャーはダーククエンチャー（ＤａｒｋＱｕｅｎｃｈｅｒ）の群に属していてよい。そのようなクエンチャーの限定的でない例は、Ｄａｂｃｙｌ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＢＱ６５０、ＴＡＭＲＡである。１つの具体的な態様において、その蛍光体はＦＡＭまたはｔｈｒｅｏ−ＦＡＭであり、そのクエンチャーはＢＨＱ２である。

表４および６は、蛍光体およびクエンチャーの間の間隔を大きくすることにより、非縮重プローブ配列を用いたＧＴ４の検出に関するより優れたヒット率が得られることを示している。従って、１つの具体的な態様において、そのプローブはＳｅｑＩＤＮＯ：１５〜ＳｅｑＩＤＮＯ：１８およびＳＥＱＩＤＮＯ：２５からなる群から選択される核酸配列からなる核酸配列を含む。

１つの具体的な態様において、そのプローブは８６位においてＴを含む。表４〜６は、そのプローブのこの位置におけるＣは３つの遺伝子型全ての検出を妨げることを示している。従って、１つの具体的な態様において、そのプローブはＳｅｑＩＤＮＯ：１５〜ＳｅｑＩＤＮＯ：１８およびＳＥＱＩＤＮＯ：２５からなる群から選択される核酸配列からなる核酸配列を含む。

１つの具体的な態様において、７５位のヌクレオチドはＡである。表４、６および７は、この位置にＡを有するプローブはこの位置にＧを有するプローブよりも優れたヒット率をもたらすことを示している。従って、１つの具体的な態様において、そのプローブはＳＥＱＩＤＮＯ：１５またはＳＥＱＩＤＮＯ：１８からなる核酸配列を含む。

上記の方法の１観点において、その方法はさらに、並行して、第２標的核酸を含有することが疑われる試料中の第２標的核酸の検出を含み、ここで前記の第２核酸はＨＥＶが増幅および検出されない容器中で増幅および検出され、ＨＥＶは第２標的核酸が増幅および検出されない容器中で増幅および検出され、かつここで前記のＨＥＶが増幅および検出される容器ならびに前記の第２標的核酸が増幅および検出される容器は同じ熱ブロック中に保持され、同一条件下でサイクルを適用される（ｃｙｃｌｅｄ）。これは、異なる検査を同じバッチプロセスにおいて同時に運転することができるため、核酸検査システムのスループットの最適化を可能にする。

１観点において、本発明は順方向および少なくとも１種類の逆方向プライマー、または少なくとも１種類の順方向プライマーおよび１種類の逆方向プライマーを含むプライマーのセットに関し、ここでその順方向プライマーまたは少なくとも１種類の順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１〜６からなる群から選択され、かつここでその逆方向プライマーまたは少なくとも１種類の逆方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：７〜１４からなる群から選択される。そのプライマーの具体的な態様およびそれらの利点は本明細書で開示されている通りである。

１観点において、本発明はオリゴヌクレオチドのセットに関し、ここで前記のセットは本明細書で記載されるようなプライマーのセットおよび１種類のプローブからなり、ここで前記のプローブは核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９またはそれらの相補配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む。そのプライマーおよびプローブの具体的な態様ならびにそれらの利点は本明細書で開示されている通りである。

１観点において、本発明は、生物学的試料中のＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４を同時に検出するための本明細書で記載されるようなプライマーのセットまたはオリゴヌクレオチドのセットの使用に関する。プライマーのセットまたはオリゴヌクレオチドのセットの使用の具体的な態様は本明細書で開示されている通りである。

１観点において、本発明は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび本明細書で記載されるようなプライマーのセットまたはオリゴヌクレオチドのセットを含むキットに関する。そのプライマーまたはオリゴヌクレオチドの具体的な態様は本明細書で記載されている通りである。

本明細書で記載される方法に従ってＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４を増幅する工程を含む、試料がＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４の１つ以上を含んでいるかどうかを決定するための方法も開示される。本明細書で記載されるように試料中に存在する場合にＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４を同時に検出する工程を含む、試料がＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４の１つ以上を含むかどうかを決定するための方法も開示される。

試料の調製
ＡｒｍｏｒｅｄＲＮＡをＨＥＶのＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３およびＧＴ４に関して当該技術で既知の方法により調製し、鋳型として用いた。

５０ｃｐ／ｍｌまたは５００ｃｐ／ｍｌのＨＥＶ遺伝子型を予め調製し、一夜保管した（−６０〜−９０℃における血漿希釈液）：
それぞれの試料（８５０ｕｌ）を３重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）の分析のためにピペットでディープウェルプレート中に入れた。試料を含有するそれぞれのウェルに、５０ｕｌの内部対照核酸を添加した。定性的対照の役目を果たす対照ＲＮＡ（ＩＣ／ＱＳ）を添加した（３００個のａｒｍｏｒｅｄ粒子／試料）。

前記の対照核酸の配列は全ての場合で同一であり、ＳＥＱＩＤＮＯ：４６〜４９の群から選択された。
それぞれの対照核酸を以下の緩衝液中で保管した：

試料の調製は、図１で示されるスキームに従う作業の流れに従って、以下の試薬を用いて自動的に実施された：

最後の工程の後、増幅試薬を含有するそれぞれのマスター混合物（ＭＭｘ）をそれぞれのウェルに添加し、単離された核酸を含有する溶離液をそのＭＭｘと混合し、それぞれの結果として得られた混合物をマイクロウェルプレートの対応するウェルに移し、そこで増幅を実施した。

増幅および検出
増幅に関して、５０ｕｌの総体積での以下の濃度の２種類の溶液Ｒ１およびＲ２を用いた：
Ｒ１：１６．７３ｍＭＭｎＯＡｃ、ｐＨ６．１、および０．０９％アジ化ナトリウムｐＨ７．０。

Ｒ２：０．０９％アジ化ナトリウムｐＨ７．０、１８％ＤＭＳＯ、４００ｍＭＫＯＡｃｐＨ７．０、１０％グリセロール、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、２００ｍＭトリシンｐＨ８．０、０．７ｕＭアプタマー、１０ＵＵＮＧ、１．３３３ｍＭｄＧＴＰ、１．３３３ｍＭｄＡＴＰ、１．３３３ｍＭｄＣＴＰ、２．６６７ｍＭｄＵＴＰ、４５ＵＺ０５Ｄポリメラーゼ（反応あたり）、０．６６７ｕＭＨＥＶ順方向プライマー、０．４１７ｕＭＨＥＶセンスプローブ、０．３３３ｕＭＨＥＶ逆方向プライマー；０．４１７ｕＭ対照順方向プライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：５０）、０．４１７ｕＭ対照逆方向プライマー（ＳＥＱＩＤＮＯ：５１）、０．３３３ｕＭ対照プローブ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５２）。

２種類の逆方向プライマーを用いる場合、それぞれを０．３３３ｕＭの濃度で用いた。
以下のＰＣＲプロフィールを用いた：

そのプレ−ＰＣＲプログラムは、最初の変性およびＲＮＡ鋳型の逆転写のための５５℃、６０℃および６５℃での保温を含む。３つの温度での保温は、より低い温度ではわずかにミスマッチした標的配列（例えばある生物の遺伝子変異体）も転写され、一方でより高い温度ではＲＮＡ二次構造の形成が抑制され、従ってより効率的な転写につながるという好都合な作用を組み合わせている。

ＰＣＲサイクルは２つの測定に分かれており、ここで両方の測定が（アニーリングおよび伸長を組み合わせた）１工程設定を適用する。最初の５５℃における５サイクルはわずかにミスマッチした標的配列を予め増幅することにより増大した包括性を可能にし、一方で第２測定の４５サイクルは５８℃のアニーリング／伸長温度を用いることにより増大した特異性を提供する。

５００ｃｐ／ｍｌＨＥＶまたは５０ｃｐ／ｍｌＨＥＶのどちらかを用いて、ＨＥＶ遺伝子型１、２、３および４の増幅をプライマーおよびプローブの異なる組み合わせを用いて試験し、ヒット率を決定した。結果を下記の表において示す。

５’ＵＴＲプライマーおよびプローブは、５００ｃｐ／ｍｌＨＥＶにおいて、全ての遺伝子型の検出に関して、特にＧＴ３およびＧＴ４の検出に関して、一貫してカプシドプライマーおよびプローブよりも優れたヒット率を提供した（表１Ａ〜１Ｃ）。

表１Ｄは、カプシドプライマー／プローブの組み合わせが５００ｃｐ／ｍｌＨＥＶを用いて９０％のヒット率を与え、そのヒット率は標的核酸を５０ｃｐ／ｍｌに減少させた場合著しく低いことを示している。５’ＵＴＲ領域からのプライマー／プローブの組み合わせを用いると、そのヒット率は標的を５０ｃｐ／ｍｌに減少させた場合でさえも高いままである。

表２は、５００ｃｐ／ｍｌＨＥＶを用いたＨＥＶのＧＴ３の検出に関する異なる順方向および逆方向プライマーの組み合わせのヒット率を示す。表２を見て分かるように、いくつかの順方向および逆方向プライマー対が１００％のヒット率を与え、一方で他の組み合わせもなお優れたヒット率を提供した。

表３は５’ＵＴＲ領域からの異なる順方向および逆方向プライマーの組み合わせを用いた増幅の結果を示し、いくつかの組み合わせに関してたとえ５０ｃｐ／ｍｌのＨＥＶしか用いなかった場合でもＧＴ３の検出に関して７７〜１００％の高いヒット率がもたらされた。

表４は、特定の順方向プライマーおよび２種類の逆方向プライマーの混合物と組み合わせた異なるプローブを用いた試験の結果を示す。１種類のプローブはうまく働かなかった。その他のプローブの全てがＧＴ１の検出に関して高いヒット率を与え、ＧＴ３の検出に関しては５０ｃｐ／ｍｌしか用いなかった場合にいくらか低いヒット率を与えた。違いは５０ｃｐ／ｍｌＨＥＶでのＧＴ４の検出に関して見られ、いくつかのプローブ配列はＧＴ４の検出に関して５０％より大きい妥当なヒット率を与え、２種類のプローブは、ＧＴ３の検出に関する９０％より大きいヒット率およびＧＴ１の検出に関する１００％のヒット率と組み合わせられた、７０％より大きいヒット率での優れたＧＴ４の検出を与えた。

表５は、そのプライマーおよびプローブの配列が４つのＨＥＶの遺伝子型ＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３およびＧＴ４全てを検出することを示している。

表６は異なるプローブ配列の配列比較を示す。見て分かるように、異なるプローブの配列はほとんど同一である。一方でその違いはそのプローブ内のクエンチャーＱの異なる位置に関する。その他の違いは、異なる遺伝子型における非保存ヌクレオチドに相当する。その異なる位置は表７においても示されている。その配列の違いおよび表４において示されるような得られたヒット率の比較は、これらの位置の全てがプローブ配列の性能に関連しているわけではないことを示している。８６位のＴはプローブ配列の性能に役立っている。７５位のＡもＧＴ４の検出に関するプローブの性能に有益な作用を有する。さらに、蛍光体およびクエンチャーの間の９個以上のヌクレオチドの間隔はＨＥＶ５’ＵＴＲプローブの性能を向上させる。

表８Ａは、ＳＥＱＩＤＮＯ：６のＳＥＱＩＤＮＯ：１３およびＳＥＱＩＤＮＯ：１４の混合物とのプライマーの組み合わせ、ならびにＳＥＱＩＤＮＯ：６のＳＥＱＩＤＮＯ：１１とのプライマーの組み合わせを用いた４つの遺伝子型ＧＴ１、ＧＴ２、ＧＴ３およびＧＴ４全ての検出を示す。その表を見て分かるように、それぞれの遺伝子型に関してヒット率が１００％であるため、５００ｃｐ／ｍｌのＨＥＶにおいて４つの遺伝子型全てがそのプライマーの組み合わせにより効率的に増幅される。より低い濃度である５０ｃｐ／ｍｌＨＥＶにおいて、ヒット率はまだ高く、その４つのＨＥＶ遺伝子型は全て７５〜１００％のヒット率で増幅される。対照的に、表８Ｂにおいて示されるように、ＨＥＶの同じ領域からの他のプライマーの組み合わせを用いると、５００ｃｐ／ｍｌのＨＥＶを用いた場合にｇｔ２、ｇｔ３およびｇｔ４のみが効率的に増幅される。５０ｃｐ／ｍｌＨＥＶでは、全ての遺伝子型を増幅することができるわけではない。対応する内部対照のヒット率はそれぞれの実験に関して１００％であった。

表８Ｂは、プライマーの組み合わせＳＥＱＩＤＮＯ：４および８、ＳＥＱＩＤＮＯ：３および９を用いて遺伝子型３に関して高いＨＥＶ力価においてシグナルを生成した異なる遺伝子型に関する検出パターンを示す。５００ｃｐ／ｍｌおよび５０ｃｐ／ｍｌＨＥＶでのＨＥＶ遺伝子型１、２、３、４の検出が示されている。遺伝子型２の認識は一般に遺伝子型１および３の認識よりも良好である。対応する内部対照のヒット率はそれぞれの実験に関して１００％であった。

表９は、プライマーおよびプローブの組み合わせＳＥＱＩＤＮＯ：６、１３、１４、１５（表９Ａ）およびＳＥＱＩＤＮＯ：６、１１、１５（表９Ｂ）に関する交差反応性試験の結果を示す。

交差反応性は上記で記載した条件下で試験した。以下の微生物の濃度を用いた：ストレプトコッカス・ビリダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｖｉｒｉｄｉａｎｓ）（オラーリス（ｏｒａｌｉｓ））：１．００Ｅ＋０６ｃｆｕ／ｍｌ；ＨＡＶ：１．００Ｅ＋０６ｃｐ／ｍｌ；ＨＢＶ：１．００Ｅ＋０６ＩＵ／ｍｌ；ＨＣＶ：１．００Ｅ＋０６ＩＵ／ｍｌ；ＮＳＣ：陰性スパイク（ｓｐｉｋｅ）対照：微生物の添加なし；ＰＳＣ：陽性スパイク対照：１５０ｃｐ／ｍｌＨＥＶの添加。

ＩＣは内部対照を意味する。

Claims

生物学的試料中に存在する場合にＨＥＶの遺伝子型１、２、３および／または４を同時に増幅するための方法であって、以下の工程：
（ａ）該生物学的試料中に存在する核酸を単離し；
（ｂ）工程（ａ）において単離された核酸を１種類の非縮重順方向プライマーおよび２種類の非縮重逆方向プライマーの混合物を用いて増幅し、ここで該順方向および逆方向プライマーはＨＥＶの遺伝子型１、２、３、および４を増幅することができる；
を含み、ここで該順方向プライマーの核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：６を含み、そして該逆方向プライマーの混合物の核酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ：１３およびＳＥＱＩＤＮＯ：１４を含む、前記方法。
順方向プライマーの核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：６からなり、２種類の逆方向プライマーの混合物の核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１３およびＳＥＱＩＤＮＯ：１４からなる、請求項１に記載の方法。
前記の核酸が固相への結合により単離される、請求項１または２に記載の方法。
さらに増幅された核酸をプローブと該プローブの該増幅された核酸への結合に十分な条件下で接触させることを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
プローブが核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９もしくは２５またはそれらの相補配列の少なくとも２２〜３５個の連続したヌクレオチドを含む、請求項４に記載の方法。
プローブの核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９もしくは２５またはそれらの相補配列から選択される配列からなる、請求項４または５に記載の方法。
プローブの核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１８または２５から選択される配列からなる、請求項６に記載の方法。
前記のプローブが該プローブの５’末端に連結された蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体およびクエンチャーの間の間隔が少なくとも９ヌクレオチドを含む、請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法。
順方向プライマーおよび２種類の逆方向プライマーの混合物を含むプライマーのセットであって、該順方向プライマーの核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：６を含み、該逆方向プライマーの混合物の核酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ：１３およびＳＥＱＩＤＮＯ：１４を含む、前記プライマーのセット。
オリゴヌクレオチドのセットであって、前記のセットが請求項９に記載のプライマーのセットおよび１種類のプローブからなり、前記のプローブが核酸配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１５〜１９もしくは２５またはそれらの相補配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む、前記オリゴヌクレオチドのセット。
前記のプローブが該プローブの５’末端に連結された蛍光体およびクエンチャーを含み、蛍光体およびクエンチャーの間の間隔が少なくとも９ヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のオリゴヌクレオチドのセット。
生物学的試料中に存在する場合に遺伝子型１、２、３および／または４を同時に検出するための、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のプライマーまたはオリゴヌクレオチドのセットの使用。
鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチドおよび請求項９〜１１のいずれか１項に記載のプライマーまたはオリゴヌクレオチドのセットを含むキット。