JP6166717B2 - コレステロール関連障害を治療または予防する方法 - Google Patents

コレステロール関連障害を治療または予防する方法 Download PDF

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Description

本願は、２０１２年５月３日に出願された米国仮出願第６１／６４２，３６３号、２０１２年３月２２日に出願された米国仮出願第６１／６１４，４１７号、２０１２年２月６日に出願された米国仮出願第６１／５９５，５２６号、２０１１年１１月２１日に出願された米国仮出願第６１／５６２，３０３号、２０１１年５月１０日に出願された米国仮出願第６１／４８４，６１０号の利益を主張し、これらのすべてが、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、電子形式で配列表と共に出願される。配列表は、２０１２年５月１０日に作成された、サイズが３１５ＫＢであるＡ−１６３５−ＷＯ−ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題するファイルとして提供される。配列表の電子形式中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に対する抗体を含む、抗原結合タンパク質を用いて、高コレステロール血症、高脂血症、または脂質異常症等のコレステロール関連障害を治療または予防する方法に関する。薬学的製剤およびその製剤を生成する方法も記載される。
「コレステロール関連障害」（「血清コレステロール関連障害」を含む）には、高コレステロール血症、高脂血症（ｈｐｅｒｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、心臓病、代謝症候群、糖尿病、冠状動脈性心臓病、脳卒中、心臓血管疾患、アルツハイマー病、ならびに例えば、血清総コレステロールの上昇、ＬＤＬの上昇、トリグリセリドの上昇、ＶＬＤＬの上昇、および／または低ＨＤＬが認められ得る一般的な脂質異常症のうちのいずれか１つ以上が含まれる。高コレステロール血症は、実際には、ヒトにおける冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）の確立された危険因子である。低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）の低下は心血管系リスクの低減をもたらし、ＣＨＤの薬物療法における主な目標である。スタチン（ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ［ＨＭＧ ＣｏＡ］還元酵素阻害剤）は、高コレステロール血症のための現在選択される治療である。しかしながら、新しいデータは、高コレステロール血症のより積極的な治療が、ＣＨＤ事象に対するより低いリスクと関連付けられることを示している。加えて、一部の患者はスタチン療法に不耐性であるか、またはそれに十分に奏効しない。したがって、ＬＤＬ−Ｃをさらに効果的に低減させるために、単独でまたは既存の薬剤と組み合わせて使用することができる新規の療法が有用であり得る。
肝細胞表面の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の再利用が、血漿ＬＤＬ−Ｃレベルを調節することによる細胞および全身のコレステロールのバランスの維持において重要な役割を果たすことは確立されている。最近では、前駆タンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）が、ＬＤＬＲの再利用および調節において重要な役割を果たすことが示されている。ＰＣＳＫ９は、セリンプロテアーゼのサブチリシンファミリーの成員であり、肝臓において主に発現される。分泌後、ＬＤＬＲに直接結合することを含む機序によって肝細胞表面ＬＤＬＲの翻訳後下方調節を生じさせる。次いで、肝臓ＬＤＬＲの下方調節が、循環ＬＤＬ−Ｃの値を増加させる。したがって、ＰＣＳＫ９は、高コレステロール血症において新規の治療による阻害の標的を示し得る。このようなアプローチに対する強い理論的根拠は、前臨床モデルにおける研究、およびＰＣＳＫ９機能喪失の突然変異を有するヒトが、正常より低いコレステロールレベルおよび低下したＣＨＤの罹患率を有するとの所見から得られる。
本発明の幾つかの態様では、ＰＣＳＫ９に特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体であって、ＰＣＳＫ９は配列番号１のアミノ酸を含み、約４０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬの量である、モノクローナル抗体と、約０．０５ｍＭ〜約４０ｍＭの量の薬学的に許容される緩衝剤と、約０．０１％ｗ／ｖ〜約２０％ｗ／ｖの量の薬学的に許容される界面活性剤と、約０．５％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖの少なくとも１つの薬学的に許容される安定剤とを含み、約４．０〜約６．０のｐＨを有する、安定な製剤が提供される。幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、グルタメート、ホスフェート、リン酸緩衝生理食塩水、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、およびトリス緩衝剤からなる群から選択される薬学的に許容される緩衝剤を含む。特定の実施形態では、上述の安定な製剤の薬学的に許容される緩衝剤は、１０〜２０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、薬学的に許容される緩衝剤は、１０〜２０ｍＭの量の酢酸ナトリウムである。幾つかの実施形態では、薬学的に許容される界面活性剤は、約０．００４％ｗ／ｖ〜約０．０１％ｗ／ｖの量で存在する。特定の実施形態では、上述の安定な製剤の薬学的に許容される界面活性剤は、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０である。さらなる実施形態では、薬学的に許容される界面活性剤は、約０．００４％ｗ／ｖ〜約０．０１％ｗ／ｖの量で存在するポリソルベート８０またはポリソルベート２０である。
幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤の薬学的に許容される安定剤は、ポリヒドロキシ炭化水素、二糖類、ポリオール、プロリン、アルギニン、リジン、メチオニン、タウリン、およびベンジルアルコールからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、薬学的に許容される安定剤は、ソルビトール、マンニトール、およびグリセロールからなる群から選択されるポリヒドロキシ炭化水素である。特定の実施形態では、上述の安定な製剤のポリヒドロキシ炭化水素は、ソルビトールである。幾つかの実施形態では、薬学的に許容される安定剤は、スクロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、およびトレハロースからなる群から選択される二糖類である。幾つかの実施形態では、二糖類安定剤は、約９％ｗ／ｖの量で存在する。幾つかの実施形態では、当該二糖類は、スクロースである。特定の実施形態では、スクロースは、約９％ｗ／ｖの量で上述の安定な製剤中に存在する。幾つかの実施形態では、安定剤は、プロリン、アルギニン、リジン、メチオニン、およびタウリンからなる群から選択されるアミノ酸である。特定の実施形態では、安定剤は、プロリンである。さらなる実施形態では、プロリンは、約２％〜３％ｗ／ｖの量で上述の安定な製剤中に存在する。幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤のｐＨは、約５．０〜約５．５である。
幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号６７に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４５９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４８５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４８３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、を含む、モノクローナル抗体を含む。
幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４８３のアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体を含む。
幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、モノクローナル抗体２１Ｂ１２、３１Ｈ４、８Ａ３、１１Ｆ１、または８Ａ１を含む。
幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、２５℃で３０ｃＰ以下の粘度を有する。特定の実施形態では、上述の安定な製剤モノクローナル抗体は、約７０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬで存在し、この安定な製剤は、２５℃で１２ｃＰ以下の粘度を有する。幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、約２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜約３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇのオスモル濃度を備える。幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、少なくとも３、６、１２、または２４ヶ月間、安定した状態を保つ。
特定の実施形態では、上述の安定な製剤は、配列番号４６５に対して少なくとも９０％同一である可変領域と配列番号４６３に対して少なくとも９０％同一である重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体を含む。幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体を含み、モノクローナル抗体の量は、約１５０である。
幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、配列番号２３に対して少なくとも９０％同一である軽鎖可変領域と配列番号４９に対して少なくとも９０％同一である重鎖可変領域を含む、抗体を含む。幾つかの実施形態では、上述の安定な製剤は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有するモノクローナル抗体を含み、モノクローナル抗体の量は、約１２０ｍｇ／ｍＬまたは１４０ｍｇ／ｍＬである。
特定の実施形態では、上述の安定な製剤は、（ａ）約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量である、モノクローナル抗体であって、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体と、約１０ｍＭの酢酸ナトリウムと、約９．０％ｗ／ｖのスクロースと、約０．００４％〜約０．０１％ｗ／ｖのポリソルベート２０またはポリソルベート８０と、約５．２のｐＨと、を含む。
本態様では、モノクローナル抗体は、２１Ｂ１２、８Ａ３、１１Ｆ１であり得る。本態様の特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、２１Ｂ１２であり、約１４０ｍｇ／ｍＬの量で上述の安定な製剤中に存在する。本態様のさらなる実施形態では、請求項内の安定な製剤は、約０．００４％のポリソルベート２０を含む。本態様のさらなる特定の実施形態では、上述の安定な製剤は、約１５０ｍｇ／ｍＬの量で存在する、モノクローナル抗体８Ａ３を含む。
本態様のさらなる実施形態では、上述の安定な製剤は、約１４０、１５０、１６０．１７０、１８０、１９０、または２００ｍｇ／ｍＬの量である、モノクローナル抗体１１Ｆ１を含む。特定の実施形態では、１１Ｆ１を含む安定な製剤はまた、約０．０１％のポリソルベート８０も含む。
さらなる実施形態では、上述の安定な製剤は、（ａ）約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量である、モノクローナル抗体であって、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体と、約１０ｍＭの酢酸ナトリウムと、約２．０％〜３．０％ｗ／ｖのプロリンと、約０．０１％ｗ／ｖのポリソルベート２０またはポリソルベート８０と、約５．０のｐＨと、を含む。本態様の幾つかの実施形態では、この安定な製剤は、モノクローナル抗体２１Ｂ１２、８Ａ３、または１１Ｆ１を含む。
本発明の別の態様では、安定な製剤は、約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量である、抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体を含み、そのモノクローナル抗体は、配列番号５７７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５７６の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５８８の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５８９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５８８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体と、（ｂ）約１０ｍＭの酢酸ナトリウムと、（ｃ）約９．０％ｗ／ｖのスクロースと、（ｄ）約０．００４％〜約０．０１％ｗ／ｖのポリソルベート２０またはポリソルベート８０と、（ｅ）約５．２のｐＨと、を含む。
本発明の別の態様では、安定な製剤は、約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの量である、抗ＰＣＳＫ９モノクローナル抗体を含み、そのモノクローナル抗体は、配列番号５７７の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５７６の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５７７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５７６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５８８の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５８９の配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５８８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、モノクローナル抗体と、（ｂ）約１０ｍＭの酢酸ナトリウムと、（ｃ）約２．０％〜３．０％ｗ／ｖのプロリンと、（ｄ）約０．０１％ｗ／ｖのポリソルベート２０またはポリソルベート８０と、（ｅ）約５．０のｐＨと、を含む。
幾つかの態様では、提供される本発明は、患者における血清ＬＤＬコレステロールを低下させる方法を含み、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体を、約１０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で、それを必要とする患者に投与し、それによって、その患者における投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、その血清ＬＤＬコレステロールレベルを少なくとも約１５％低下させることを含む。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルは、その患者における投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％低下する。
本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約３５ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約２８００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約２５００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約１８００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約１４００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約１２００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約７００ｍｇ、約４５ｍｇ〜約７００ｍｇ、約４５ｍｇ〜約６００ｍｇ、約４５ｍｇ〜約４５０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約４５０ｍｇ、約１０５ｍｇ〜約４２０ｍｇ、約１２０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約１８０ｍｇ、もしくは約１４０ｍｇ〜約１７０ｍｇ、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約７００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約１２００〜約３０００ｍｇ、約１４００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約１８００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約２０００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約２４００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、または約２８００ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で投与される。本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約３５ｍｇ、約４５ｍｇ、約７０ｍｇ、約１０５ｍｇ、約１２０ｍｇ約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２５００ｍｇ、約２８００ｍｇ、または約３０００ｍｇの用量で投与される。
本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、（１）週に１回、（２）２週間に１回、（３）月に１回、（４）隔月に１回、（５）３ヶ月に１回、（６）６ヶ月に１回、および（７）１２ヶ月に１回からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗（ａｎｔ）ＰＣＳＫ９抗体は、非経口投与される。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、静脈内投与される。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、皮下投与される。
本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、 および配列番号６７に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４５９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４８５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４８３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５８２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５８３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５８２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、２１Ｂ１２、３１Ｈ４、８Ａ３、１１Ｆ１、および８Ａ１からなる群から選択される。
幾つかの態様では、本発明は、血清ＬＤＬコレステロールレベルを有する患者におけるコレステロール関連障害を治療または予防する方法を含み、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体を、約１０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で、それを必要とする患者に投与し、それによって、その患者におけるコレステロール関連障害を治療または予防することを含む。本実施形態の一態様では、治療または予防されるコレステロール関連障害は、ヘテロ接合型家族性高コレステロール血症およびホモ接合型家族性高コレステロール血症を含む家族性高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、リポタンパク質（ａ）の上昇、心臓病、代謝症候群、糖尿病、冠状動脈性心臓病、脳卒中、心臓血管疾患、アルツハイマー病、末梢動脈疾患、高脂血症、または脂質異常症である。本態様の幾つかの実施形態では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルは、その患者における投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％低下する。
本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約３５ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約２８００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約２５００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約２０００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約１８００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約１４００ｍｇ、約２５ｍｇ〜約１２００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約１０００ｍｇ、約３５ｍｇ〜約７００ｍｇ、約４５ｍｇ〜約７００ｍｇ、約４５ｍｇ〜約６００ｍｇ、約４５ｍｇ〜約４５０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約４５０ｍｇ、約１０５ｍｇ〜約４２０ｍｇ、約１２０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１４０ｍｇ〜約１８０ｍｇ、もしくは約１４０ｍｇ〜約１７０ｍｇ、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約７００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約１２００〜約３０００ｍｇ、約１４００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約１８００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約２０００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、約２４００ｍｇ〜約３０００ｍｇ、または約２８００ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で投与される。本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約３５ｍｇ、約４５ｍｇ、約７０ｍｇ、約１０５ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２５００ｍｇ、約２８００ｍｇ、または約３０００ｍｇの用量で投与される。
本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、（１）週に１回、（２）２週間に１回、（３）月に１回、（４）隔月に１回、（５）３ヶ月に１回、（６）６ヶ月に１回、および（７）１２ヶ月に１回からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗（ａｎｔ）ＰＣＳＫ９抗体は、非経口投与される。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、静脈内投与される。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、皮下投与される。
本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体が、配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、 および配列番号６７に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６１に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４５９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４８５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４８３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５８２に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５８３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号６７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４５９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号４８５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号５８２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号５８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、２１Ｂ１２、３１Ｈ４、８Ａ３、１１Ｆ１、および８Ａ１からなる群から選択される。
本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、（１）週に１回、（２）２週間に１回、（３）月に１回、（４）隔月に１回、（５）３ヶ月に１回、（６）６ヶ月に１回、および（７）１２ヶ月に１回からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗（ａｎｔ）ＰＣＳＫ９抗体は、非経口投与される。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、静脈内投与される。本発明の本態様の幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、皮下投与される。
本発明の特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、２１Ｂ１２および３１Ｈ４である。幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、 配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、２１Ｂ１２である。抗ＰＣＳＫ９抗体が配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と配列番号４９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体が２１Ｂ１２である特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約２１ｍｇ〜約７０ｍｇの用量で週に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３〜１０日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約２１ｍｇの用量で週に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３〜１０日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約３５ｍｇの用量で週に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３〜１０日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約７０ｍｇの用量で週に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３〜１０日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約７０ｍｇ〜約２８０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約７０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１０５ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１２０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１４０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約２１０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約２８０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約２８０ｍｇ〜約４２０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約２８０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約３５０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約４２０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、１５〜５０％低下する。
抗ＰＣＳＫ９抗体が配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と配列番号４９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体が２１Ｂ１２である別の特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３〜１０日間、１５〜５０％低下し、患者に、約７００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３〜１０日間、１５〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３〜１０日間、１５〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇ超〜約３０００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３〜１０日間、１５〜５０％低下し、患者に、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で別の週に静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、１５〜５０％低下し、患者に、約７００ｍｇの用量で隔週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、１５〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇの用量で隔週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、１５〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇ超〜約３０００ｍｇの用量で隔週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、１５〜５０％低下し、患者に、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で４週間静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルは、約２１〜３１日間、１５〜５０％低下し、患者に、約７００ｍｇの用量で４週間ごとに静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、１５〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇの用量で４週間ごとに静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、１５〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇ超〜約３０００ｍｇの用量で４週間ごとに静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、１５〜５０％低下する。
抗ＰＣＳＫ９抗体が配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と配列番号４９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体が２１Ｂ１２である別の特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約２１ｍｇの用量で週に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約３５ｍｇの用量で週に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約７０ｍｇの用量で週に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約７０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１０５ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１２０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１４０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約２１０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約２８０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約２８０ｍｇ〜約４２０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約２８０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約３５０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約４２０ｍｇの用量で４週間ごとに皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、３０〜５０％低下する。
抗ＰＣＳＫ９抗体が配列番号２３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と配列番号４９に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体が２１Ｂ１２である別の特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、３０〜５０％低下し、患者に、約７００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇ超〜約３０００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、３０〜５０％低下し、患者に、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で別の週に静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、３０〜５０％低下し、患者に、約７００ｍｇの用量で隔週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇの用量で隔週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇ超〜約３０００ｍｇの用量で隔週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、３０〜５０％低下し、患者に、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で４週間静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルは、約２４〜２８日間、３０〜５０％低下し、患者に、約７００ｍｇの用量で４週間ごとに静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇの用量で４週間ごとに静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇ超〜約３０００ｍｇの用量で４週間ごとに静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、３０〜５０％低下する。
本発明の特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、８Ａ３、１１Ｆ１、および８Ａ１である。幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号４６５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、１１Ｆ１である。抗ＰＣＳＫ９抗体が配列番号４６５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と配列番号４６３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体が１１Ｆ１である特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約４５ｍｇの用量で週に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３〜１０日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ超〜約２００ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１７０ｍｇ〜約１８０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ〜約１７０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約４５０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２１〜３１日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３１〜４２日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ超〜約２００ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３１〜４２日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１７０ｍｇ〜約１８０ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３１〜４２日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ〜約１７０ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３１〜４２日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約４５０ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３１〜４２日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１４０ｍｇ〜約２００ｍｇの用量で８週間ごとに皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４５〜５６日間、１５〜５０％低下し、患者に、約１７０ｍｇ〜約１８０ｍｇの用量で８週間ごとに皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４５〜５６日間、１５〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ〜約１７０ｍｇの用量で８週間ごとに皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４５〜５６日間、１５〜５０％低下し、患者に、約４５０ｍｇの用量で８週間ごとに皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４５〜５６日間、１５〜５０％低下し、８週間に１回皮下に約６００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４５〜５６日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、８週間に１回皮下に約７００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４５〜５６日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、１２週間に１回皮下に約６００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７４〜８４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、１２週間に１回皮下に約７００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７４〜８４日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、１６週間に１回皮下に約６００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１００〜１１２日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、１６週間に１回皮下に約７００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１００〜１１２日間、少なくとも約１５〜５０％低下する。
抗ＰＣＳＫ９抗体が配列番号４６５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と配列番号４６３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体が１１Ｆ１である本発明の特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約４５ｍｇの用量で週に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇの用量で２週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ超〜約２００ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１７０ｍｇ〜約１８０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ〜約１７０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約４５０ｍｇの用量で４週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４０〜４１日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ超〜約２００ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４０〜４１日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１７０ｍｇ〜約１８０ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４０〜４１日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ〜約１７０ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４０〜４１日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約４５０ｍｇの用量で６週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約４０〜４１日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１４０ｍｇ〜約２００ｍｇの用量で８週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約５０〜５６日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１７０ｍｇ〜約１８０ｍｇの用量で８週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約５０〜５６日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１５０ｍｇ〜約１７０ｍｇの用量で８週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約５０〜５６日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約４５０ｍｇの用量で８週間に１回皮下投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約５０〜５６日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、８週間に１回皮下に約６００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約５０〜５６日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、８週間に１回皮下に約７００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約５０〜５６日間、３０〜５０％低下し、患者に、１２週間に１回皮下に約６００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約８０〜８４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、１２週間に１回皮下に約７００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約８０〜８４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、１６週間に１回皮下に約６００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０５〜１１２日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、１６週間に１回皮下に約７００ｍｇの用量では、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０５〜１１２日間、少なくとも約３０〜５０％低下する。
抗ＰＣＳＫ９抗体が配列番号４６５に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と配列番号４６３に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または配列番号４６５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と配列番号４６３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むか、または抗体が１１Ｆ１である本発明の特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約７００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇ超〜約３０００ｍｇの用量で毎週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約７〜１０日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で別の週に静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約７００ｍｇの用量で隔週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇの用量で隔週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇ超〜約３０００ｍｇの用量で隔週静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１０〜１４日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で４週間静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約７００ｍｇの用量で４週間ごとに静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇの用量で４週間ごとに静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１２００ｍｇ超〜約３０００ｍｇの用量で４週間ごとに静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約２４〜２８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で２４週間に１回静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１５０〜１６８日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で２４週間に１回静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約１６０〜１６８日間、少なくとも約３０〜５０％低下し、患者に、約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で５２週間に１回静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３５０〜３６５日間、少なくとも約１５〜５０％低下し、患者に、約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量で５２週間に１回静脈内投与され、その患者の血清ＬＤＬコレステロールレベルが、約３６０〜３６５日間、少なくとも約３０〜５０％低下する。
本発明の別の態様では、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体は、患者に、少なくとも１つの他のコレステロール低下剤の前、その後、またはそれと共に投与される。コレステロール低下剤には、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチンを含むスタチン類、ニコチン酸（ナイアシン）、徐放（ｓｌｏｗ ｒｅｌｅｓｅ）ナイアシン（ＳＬＯ−ＮＩＡＣＩＮ）、ラロピプラント（ＣＯＲＤＡＰＴＩＶＥ）、フィブリン酸（ＬＯＰＩＤ（ゲムフィブロジル）、ＴＲＩＣＯＲ（フェノフィブラート））、コレスチラミン（ＱＵＥＳＴＲＡＮ）、コレスベラム（ＷＥＬＣＨＯＬ）、ＣＯＬＥＳＴＩＤ（コレスチポール））等の胆汁酸封鎖剤、コレステロール吸収阻害剤（ＺＥＴＩＡ（エゼチミブ））、脂質修飾剤、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト、スクアレンシンターゼ阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、抗高血圧剤、スルホニル尿素、インスリン、ＧＬＰ−１類似体、ＤＤＰＩＶ阻害剤を含む抗糖尿病剤、ＡｐｏＢ調節物質、ＭＴＰ阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｓ）および／または閉塞性動脈硬化症治療、オンコスタチンＭ、エストロゲン、ベルビン、ならびに免疫関連障害の治療剤が含まれる。
幾つかの態様では、本発明は、患者における血清ＬＤＬコレステロールレベルを低下させる方法を含む。本方法は、本明細書に記載される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体からなる約１０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量を、それを必要とする患者に投与することを含む。幾つかの実施形態では、用量は、約１０ｍｇ〜約７０ｍｇの、週に１回（ＱＷ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１４ｍｇ〜約４５ｍｇの、週に１回投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１４ｍｇ〜約３５ｍｇの、週に１回投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約７０ｍｇ〜約４２０ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約７０ｍｇ〜約３５０ｍｇの２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１０５ｍｇ〜約３５０ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１４０ｍｇ〜約２８０ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約２５０ｍｇ〜約４８０ｍｇの、４週間に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約２８０ｍｇ〜約４２０ｍｇの、４週間に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約３５０ｍｇ〜約４２０ｍｇの、４週間に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの、週に１回（ＱＷ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの、週に１回（ＱＷ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約２０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの、週に１回（ＱＷ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約２０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約４２０ｍｇ〜約３０００ｍｇの、月に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの、月に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約２０００ｍｇ〜約３０００ｍｇの、月に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約１５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約９０％減少する。
幾つかの態様では、本発明は、患者における血清ＬＤＬコレステロールレベルを低下させる方法を含み、本方法は、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体の用量を、それを必要とする患者に投与することを含み、抗ＰＣＳＫ９抗体の用量は、（１）少なくとも約１４ｍｇで毎週（ＱＷ）、（２）少なくとも約３５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（３）少なくとも約４５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（４）少なくとも約７０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（５）少なくとも約１０５ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（６）少なくとも約１４０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（７）少なくとも約１５０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（８）少なくとも約２８０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、および（９）少なくとも約１５０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１０）少なくとも約１６０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１１）少なくとも約１７０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１２）少なくとも約１８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１３）少なくとも約１９０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１４）少なくとも約２００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１５）少なくとも約２８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１６）少なくとも約３５０の量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１７）少なくとも約４２０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１８）少なくとも約１０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１９）少なくとも約２０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、および（２０）少なくとも約３０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約１５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約９０％減少する。
幾つかの態様では、本発明は、患者におけるＰＣＳＫ９値を低下させる方法を含み、本方法は、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体の用量を、それを必要とする患者に投与することを含み、抗ＰＣＳＫ９抗体の用量は、（１）少なくとも約１４ｍｇで毎週（ＱＷ）、（２）少なくとも約３５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（３）少なくとも約４５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（４）少なくとも約７０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（５）少なくとも約１０５ｍｇの量で２週間ごと（Ｑ２Ｗ）、（６）少なくとも約１４０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（７）少なくとも約１５０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（８）少なくとも約２８０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（９）少なくとも約１５０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１０）少なくとも約１６０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１１）少なくとも約１７０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１２）少なくとも約１８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１３）少なくとも約１９０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１４）少なくとも約２００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１５）少なくとも約２８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１６）少なくとも約３５０の量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１７）少なくとも約４２０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１８）少なくとも約１０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１９）少なくとも約２０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、および（２０）少なくとも約３０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、投与前の血清ＰＣＳＫ９値と比較して、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約８５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約９０％減少する。
幾つかの態様では、本発明は、患者における総コレステロールレベルを低下させる方法を含み、本方法は、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体のある用量を、それを必要とする患者に投与することを含み、抗ＰＣＳＫ９抗体の用量は、（１）少なくとも約１４ｍｇで毎週（ＱＷ）、（２）少なくとも約３５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（３）少なくとも約４５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（４）少なくとも約７０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（５）少なくとも約１０５ｍｇの量で２週間ごと（Ｑ２Ｗ）、（６）少なくとも約１４０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（７）少なくとも約１５０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（８）少なくとも約２８０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（９）少なくとも約１５０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１０）少なくとも約１６０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１１）少なくとも約１７０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１２）少なくとも約１８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１３）少なくとも約１９０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１４）少なくとも約２００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１５）少なくとも約２８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１６）少なくとも約３５０の量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１７）少なくとも約４２０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１８）少なくとも約１０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１９）少なくとも約２０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、および（２０）少なくとも約３０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、投与前の総コレステロールレベルと比較して、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約６０％減少する。
幾つかの態様では、本発明は、患者における非ＨＤＬコレステロールレベルを低下させる方法を含み、本方法は、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体の用量を、それを必要とする患者に投与することを含み、抗ＰＣＳＫ９抗体の用量は、（１）少なくとも約１４ｍｇで毎週（ＱＷ）、（２）少なくとも約３５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（３）少なくとも約４５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（４）少なくとも約７０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（５）少なくとも約１０５ｍｇの量で２週間ごと（Ｑ２Ｗ）、（６）少なくとも約１４０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（７）少なくとも約１５０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（８）少なくとも約２８０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（９）少なくとも約１５０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１０）少なくとも約１６０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１１）少なくとも約１７０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１２）少なくとも約１８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１３）少なくとも約１９０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１４）少なくとも約２００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１５）少なくとも約２８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１６）少なくとも約３５０の量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１７）少なくとも約４２０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１８）少なくとも約１０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１９）少なくとも約２０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、および（２０）少なくとも約３０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、投与前の非ＨＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８５％減少する。
幾つかの態様では、本発明は、患者におけるＡｐｏＢレベルを低下させる方法を含み、本方法は、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体の用量を、それを必要とする患者に投与することを含み、抗ＰＣＳＫ９抗体の用量は、（１）少なくとも約１４ｍｇで毎週（ＱＷ）、（２）少なくとも約３５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（３）少なくとも約４５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（４）少なくとも約７０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（５）少なくとも約１０５ｍｇの量で２週間ごと（Ｑ２Ｗ）、（６）少なくとも約１４０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（７）少なくとも約１５０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（８）少なくとも約２８０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（９）少なくとも約１５０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１０）少なくとも約１６０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１１）少なくとも約１７０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１２）少なくとも約１８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１３）少なくとも約１９０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１４）少なくとも約２００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１５）少なくとも約２８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１６）少なくとも約３５０の量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１７）少なくとも約４２０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、投与前のＡｐｏＢレベルと比較して、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約７５％減少する。
幾つかの態様では、本発明は、患者におけるリポタンパク質Ａ（「Ｌｐ（ａ）」）レベルを低下させる方法を含み、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体の用量を、それを必要とする患者に投与することを含み、抗ＰＣＳＫ９抗体の用量は、（１）少なくとも約１４ｍｇで毎週（ＱＷ）、（２）少なくとも約３５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（３）少なくとも約４５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（４）少なくとも約７０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（５）少なくとも約１０５ｍｇの量で２週間ごと（Ｑ２Ｗ）、（６）少なくとも約１４０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（７）少なくとも約１５０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（８）少なくとも約２８０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（９）少なくとも約１５０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１０）少なくとも約１６０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１１）少なくとも約１７０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１２）少なくとも約１８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１３）少なくとも約１９０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１４）少なくとも約２００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１５）少なくとも約２８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１６）少なくとも約３５０の量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１７）少なくとも約４２０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１８）少なくとも約１０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１９）少なくとも約２０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、および（２０）少なくとも約３０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、投与前のＬｐ（ａ）レベルと比較して、少なくとも約１０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約１５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約６５％減少する。
幾つかの態様では、本発明は、患者におけるコレステロール関連障害を治療または予防する方法を含み、約１０ｍｇ〜約３０００ｍｇの用量の本明細書に記載される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体を、それを必要とする患者に投与することを含む。幾つかの実施形態では、用量は、約１０ｍｇ〜約７０ｍｇの、週に１回（ＱＷ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１４ｍｇ〜約４５ｍｇの、週に１回投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１４ｍｇ〜約３５ｍｇの、週に１回投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約７０ｍｇ〜約４２０ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約７０ｍｇ〜約３５０ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１０５ｍｇ〜約３５０ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１４０ｍｇ〜約２８０ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１５０ｍｇ〜約２８０ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇの、２週間に１回（Ｑ２Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１５０ｍｇ〜約４８０ｍｇの、４週間に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約１５０ｍｇ〜約２００ｍｇの、４週間に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約２００ｍｇ〜約４８０ｍｇの、４週間に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約２５０ｍｇ〜約４８０ｍｇの、４週間に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約２８０ｍｇ〜約４２０ｍｇの、４週間に１回（Ｑ４Ｗ）投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、約３５０ｍｇ〜約４２０ｍｇの、４週間に１回投与される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体である。幾つかの実施形態では、用量は、４週間ごと（Ｑ４Ｗ）では約１０００ｍｇである。幾つかの実施形態では、用量は、４週間ごと（Ｑ４Ｗ）では約２０００ｍｇである。幾つかの実施形態では、用量は、４週間ごと（Ｑ４Ｗ）では約３０００ｍｇである。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約１５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、週間（Ｑ４Ｗ）、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約９０％減少する。幾つかの実施形態では、コレステロール関連障害は、へテロ接合体家族性高コレステロール血症、ホモ接合型家族性高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、高脂血症、または脂質異常症である。
幾つかの態様では、本発明は、患者におけるコレステロール関連障害を治療または予防する方法を含み、本方法は、少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体の用量を、それを必要とする患者に投与することを含み、抗ＰＣＳＫ９抗体の用量は、（１）少なくとも約１４ｍｇで毎週（ＱＷ）、（２）少なくとも約３５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（３）少なくとも約４５ｍｇの量で毎週（ＱＷ）、（４）少なくとも約７０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（５）少なくとも約１０５ｍｇの量で２週間ごと（Ｑ２Ｗ）、（６）少なくとも約１４０ｍｇの量で隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（７）少なくとも約１５０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（８）少なくとも約２８０ｍｇの量で２週間ごとまたは隔週ごと（Ｑ２Ｗ）、（９）少なくとも約１５０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１０）少なくとも約１６０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１１）少なくとも約１７０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１２）少なくとも約１８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１３）少なくとも約１９０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１４）少なくとも約２００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１５）少なくとも約２８０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１６）少なくとも約３５０の量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１７）少なくとも約４２０ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１８）少なくとも約１０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、（１９）少なくとも約２０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）、および（２０）少なくとも約３０００ｍｇの量で４週間ごと（Ｑ４Ｗ）からなる群から選択されるスケジュールにおいて投与される。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約１５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約９０％減少する。
幾つかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、２１Ｂ１２、２６Ｈ５、３１Ｈ４、８Ａ３、１１Ｆ１、および／または８Ａ１である。
幾つかの実施形態では、コレステロール関連障害は、ヘテロ接合型家族性高コレステロール血症、ホモ接合型家族性高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、高脂血症、または脂質異常症である。
幾つかの態様では、本発明は、２１Ｂ１２、２６Ｈ５、３１Ｈ４、８Ａ３、１１Ｆ１、および８Ａ１からなる群から選択される少なくとも１つの抗ＰＣＳＫ９抗体を含む薬学的製剤を含む。
本発明の他の実施形態は、本明細書で提供される開示から容易に明らかとなろう。
ＰＣＳＫ９の成熟形態のアミノ酸配列を示し、プロドメインには下線が付されている。 ＰＣＳＫ９のアミノ酸および核酸配列を示し、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で示される。 ＰＣＳＫ９のアミノ酸および核酸配列を示し、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で示される。 ＰＣＳＫ９のアミノ酸および核酸配列を示し、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で示される。 ＰＣＳＫ９のアミノ酸および核酸配列を示し、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で示される。 様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図２Ｃは、図２Ａから始まる配列の続きである。図２Ｄは、図２Ｂから始まる配列の続きである。 様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図２Ｃは、図２Ａから始まる配列の続きである。図２Ｄは、図２Ｂから始まる配列の続きである。 様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図２Ｃは、図２Ａから始まる配列の続きである。図２Ｄは、図２Ｂから始まる配列の続きである。 様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図２Ｃは、図２Ａから始まる配列の続きである。図２Ｄは、図２Ｂから始まる配列の続きである。 様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図３Ｃは、図３Ａから始まる配列の続きである。図３Ｄは、図３Ｂから始まる配列の続きである。 様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図３Ｃは、図３Ａから始まる配列の続きである。図３Ｄは、図３Ｂから始まる配列の続きである。 様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図３Ｃは、図３Ａから始まる配列の続きである。図３Ｄは、図３Ｂから始まる配列の続きである。 様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図３Ｃは、図３Ａから始まる配列の続きである。図３Ｄは、図３Ｂから始まる配列の続きである。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 様々な定常ドメインに対するアミノ酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸および核酸配列を示す。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖および軽鎖の配列比較表である。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖および軽鎖の配列比較表である。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖および軽鎖の配列比較表である。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖および軽鎖の配列比較表である。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖および軽鎖の配列比較表である。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖および軽鎖の配列比較表である。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖および軽鎖の配列比較表である。 抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖および軽鎖の配列比較表である。 ヒトＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 ヒトＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 カニクイザルＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 カニクイザルＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 マウスＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 マウスＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質の結合曲線である。 ＰＣＳＫ９および様々な抗原結合タンパク質を含むＳＤＳ ＰＡＧＥ実験の結果を示し、タンパク質の相対的純度および濃度を示す。 ２１Ｂ１２に対するＢｉａｃｏｒｅ溶液平衡アッセイからのグラフを示す。 ２１Ｂ１２に対するＢｉａｃｏｒｅ溶液平衡アッセイからのグラフを示す。 Ｂｉａｃｏｒｅ捕捉アッセイからの動態のグラフを示す。 ３つのＡＢＰに対するビニングの結果を示す棒グラフを示す。 インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質３１Ｈ４ ＩｇＧ２の阻害曲線である。 インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質３１Ｈ４ ＩｇＧ４の阻害曲線である。 インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ ＩｇＧ２の阻害曲線である。 インビトロＰＣＳＫ９：ＬＤＬＲ結合アッセイにおける、ＰＣＳＫ９への抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ ＩｇＧ４の阻害曲線である。 細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質３１Ｈ４ ＩｇＧ２の阻害曲線であり、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を減少させるＡＢＰの効果を示す。 細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質３１Ｈ４ ＩｇＧ４の阻害曲線であり、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を減少させるＡＢＰの効果を示す。 細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ ＩｇＧ２の阻害曲線であり、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を減少させるＡＢＰの効果を示す。 細胞ＬＤＬ取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質２１Ｂ１２ ＩｇＧ４の阻害曲線であり、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ取り込み遮断効果を減少させるＡＢＰの効果を示す。 ＡＢＰ ３１Ｈ４のマウスにおける血清コレステロール低下能力を示すグラフであり、ＩｇＧ対照処理マウスと比較した変化である（＊ｐ＜０．０１）。 ＡＢＰ ３１Ｈ４のマウスにおける血清コレステロール低下能力を示すグラフであり、時間＝ゼロ時間と比較した変化である（＃ｐ，０．０５）。 Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるＨＤＬコレステロールレベルに対するＡＢＰ ３１Ｈ４の効果を示すグラフである（＊ｐ＜０．０１）。 Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるＨＤＬコレステロールレベルに対するＡＢＰ ３１Ｈ４の効果を示すグラフである（＃ｐ＜０．０５）。 様々な時点後に存在する肝臓ＬＤＬＲタンパク質の量を増大させるＡＢＰ ３１Ｈ４の能力のウェスタンブロット分析を示す。 野生型マウスにおける総血清コレステロールを相対的に低下させる抗原結合タンパク質３１Ｈ４の能力を示すグラフである。 野生型マウスにおけるＨＤＬを低下させる抗原結合タンパク質３１Ｈ４の能力を示すグラフである。 様々な抗原結合タンパク質３１Ｈ４および１６Ｆ１２の血清コレステロール低下能力を示すグラフである。 血清コレステロールを低下させる抗原結合タンパク質の持続時間および能力を試験するための注射プロトコルを示す。 図１１Ａのプロトコルの結果を示すグラフである。 スタチンとＡＢＰ ２１Ｂ１２の組み合わせに応答した、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ値を示す。 スタチンとＡＢＰ ３１Ｈ４の組み合わせに応答した、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ値を示す。 スタチンと（中和抗体である「２５Ａ７」とは対照的に）非中和抗体であるＡＢＰ ２５Ａ７．１の組み合わせに応答した、ＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ値を示す。 スタチンとＡＢＰ ２１Ｂ１２の組み合わせに応答した、ＰＣＳＫ９を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ値を示す。 スタチンとＡＢＰ ３１Ｈ４の組み合わせに応答した、ＰＣＳＫ９を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ値を示す。 スタチンと（中和抗体である「２５Ａ７」とは対照的に）非中和抗体であるＡＢＰ ２５Ａ７．１の組み合わせに応答した、ＰＣＳＫ９を過剰発現するＨｅｐＧ２細胞中のＬＤＬＲ値を示す。 ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰの様々な軽鎖アミノ酸配列を示す。点（．）は、アミノ酸が存在しないことを示す。 ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰの軽鎖分岐図を示す。 ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰの重鎖アミノ酸配列を示す。点（．）は、アミノ酸が存在しないことを示す。 ＰＣＳＫ９に対する様々なＡＢＰの重鎖分岐図を示す。 軽および重のＣＤＲの比較およびそこからコンセンサスを得る群の表記を示す。 群１および２に対するコンセンサス配列を示す。 群３および４に対するコンセンサス配列を示す。 群１および２に対するコンセンサス配列を示す。点（．）は、同一の残基を示した。 群２に対するコンセンサス配列を示す。点（．）は、同一の残基を示した。 群３および４に対するコンセンサス配列を示す。点（．）は、同一の残基を示した。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の複数回投与を受けている患者におけるＬＤＬ−ｃレベルの減少を示すグラフである。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の低用量から中等用量および高用量のスタチンの複数回投与を受けている患者におけるＬＤＬ−ｃレベルの減少を示すグラフである。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の複数回投与を受けている患者におけるＡｐｏＢレベルの減少を示すグラフである。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の低用量から中等用量および高用量のスタチンの複数回投与を受けている患者におけるリポタンパク質ａ（「Ｌｐ（ａ）」）レベルの減少を示す棒グラフである。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の複数回投与を受けているヘテロ接合型家族性高コレステロール血症（「ＨｅＦＨ」）を患っている患者におけるＬＤＬ−ｃレベルの減少を示すグラフである。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の複数回投与を受けているヘテロ接合型家族性高コレステロール血症（「ＨｅＦＨ」）を患っている患者におけるＰＣＳＫ９レベルの減少を示すグラフである。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の複数回投与を受けているヘテロ接合型家族性高コレステロール血症（「ＨｅＦＨ」）を患っている患者における総コレステロールレベルの減少を示すグラフである。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の複数回投与を受けているヘテロ接合型家族性高コレステロール血症（「ＨｅＦＨ」）を患っている患者における非ＨＤＬコレステロールレベルの減少を示すグラフである。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の複数回投与を受けているヘテロ接合型家族性高コレステロール血症（「ＨｅＦＨ」）を患っている患者におけるＡｐｏＢレベルの減少を示すグラフである。 抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）の複数回投与を受けているヘテロ接合型家族性高コレステロール血症（「ＨｅＦＨ」）を患っている患者におけるリポタンパク質ａ（「Ｌｐ（ａ）」）の減少を示す棒グラフである。 １２週間の期間にわたって隔週ごと（Ｑ２Ｗ）に様々な用量の抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）を受けた実施例２２〜２５に記載される４つの研究からの患者におけるＬＤＬ−Ｃの減少に関連する集約データを示すグラフである。 １２週間の期間にわたって４週間ごと（Ｑ４Ｗ）に様々な用量の抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）を受けた実施例２２〜２５に記載される４つの研究からの患者におけるＬＤＬ−Ｃの減少に関連する集約データを示すグラフである。 １２週間の期間にわたって隔週ごと（Ｑ２Ｗ）または４週間ごと（Ｑ４Ｗ）のいずれかで様々な用量の抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）を受けた実施例２２〜２５に記載される４つの研究からの患者におけるＬｐ（ａ）の減少に関連する集約データを示す棒グラフである。 １２週間の期間にわたって隔週ごと（Ｑ２Ｗ）または４週間ごと（Ｑ４Ｗ）のいずれかで様々な用量の抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）を受けた実施例２２〜２５に記載される４つの研究からの患者におけるＨＤＬ−Ｃの減少に関連する集約データを示す棒グラフである。 １２週間の期間にわたって隔週ごと（Ｑ２Ｗ）または４週間ごと（Ｑ４Ｗ）のいずれかで様々な用量の抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）を受けた実施例２２〜２５に記載される４つの研究からの患者におけるトリグリセリドの減少に関連する集約データを示す棒グラフである。 １２週間の期間にわたって隔週ごと（Ｑ２Ｗ）または４週間ごと（Ｑ４Ｗ）のいずれかで様々な用量の抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）を受けた実施例２２〜２５に記載される４つの研究からの患者におけるＶＬＤＬ−Ｃの減少に関連する集約データを示す棒グラフである。 様々な安定剤／賦形剤を含有する抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）製剤の粘度を示す棒グラフである。 安定剤／賦形剤であるプロリンが、高いタンパク質濃度を有する抗ＰＣＳＫ９抗体（２１Ｂ１２）製剤の粘度を低下させる能力を有することを示すグラフである。 ｐＨ５．２で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、９％のスクロースを含む製剤中の様々な濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体、２１Ｂ１２の粘度を示すグラフである。 ｐＨ５．０で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１２５ｍＭのアルギニン、および３％のスクロースを含む製剤と比較して、ｐＨ５．２で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび９％のスクロースを含む製剤中の様々な濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体、２１Ｂ１２の粘度を示すグラフである。 ｐＨ５．０で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのメチオニン、および４％のスクロースを含む製剤と比較して、ｐＨ５．２で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび９％のスクロースを含む製剤中の様々な濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体、２１Ｂ１２の粘度を示すグラフである。 ｐＨ５．０で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび２５０ｍＭのプロリンを含む製剤と比較して、ｐＨ５．２で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび９％のスクロースを含む製剤中の様々な濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体、２１Ｂ１２の粘度を示すグラフである。 ６ヶ月の期間にわたって、抗ＰＣＳＫ９抗体（すなわち、２１Ｂ１２）製剤の様々な製剤中の１０μｍ粒子の数を示す棒グラフである。 ６ヶ月の期間にわたって、抗ＰＣＳＫ９抗体（すなわち、２１Ｂ１２）製剤の様々な製剤中の２５μｍ粒子の数を示す棒グラフである。 ４ヶ月の期間にわたって、抗ＰＣＳＫ９抗体（すなわち、１１Ｆ１）製剤の様々な製剤中の１０μｍ粒子の数を示す棒グラフである。 ４ヶ月の期間にわたって、抗ＰＣＳＫ９抗体（すなわち、１１Ｆ１）製剤の様々な製剤中の２５μｍ粒子の数を示す棒グラフである。 ＰＣＳＫＰ、ＰＣＳＫ２、ＰＣＳＫ１ ＰＣＳＫ７、およびフーリンによる競合アッセイにおける１１Ｆ１の結合特異性を示すグラフであり、ＯＤ４５０が縦軸上に表示され、ＰＣＳＫ９（μｇ／ｍＬ）の濃度が横軸上に表示される。 競合アッセイにおける１１Ｆ１によるＬＤＬＲ：Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９結合の阻害に対する用量反応曲線を示すグラフであり、ＯＤ４５０が縦軸上に表示され、Ｌｏｇ［１１Ｆ１］（ｐＭ）が横軸上に表示される。 競合アッセイにおける１１Ｆ１によるＬＤＬＲ：ＷＴ ＰＣＳＫ９結合の阻害に対する用量反応曲線を示すグラフであり、ＯＤ４５０が縦軸上に表示され、Ｌｏｇ［１１ｆ１］（ｐＭ）が横軸上に表示される。 ＨｅｐＧ２細胞中のヒトＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９に媒介されたＬＤＬ取り込みの減少を遮断する１１Ｆ１の能力に対する用量反応曲線を示すグラフであり、相対的蛍光単位（×１０４）が縦軸上に表示され、Ｌｏｇ［１１Ｆ１］（ｎＭ）が横軸上に表示される。 ＨｅｐＧ２細胞中のヒトＷＴ ＰＣＳＫ９に媒介されたＬＤＬ取り込みの減少を遮断する１１Ｆ１の能力に対する用量反応曲線を示すグラフであり、相対的蛍光単位（×１０４）が縦軸上に表示され、Ｌｏｇ［１１Ｆ１］（ｎＭ）が横軸上に表示される。 ＡＡＶによるヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスにおける血清非ＨＤＬコレステロールに対する１１Ｆ１および８Ａ３の効果を示す棒グラフであり、非ＨＤＬ−Ｃ血清濃度（ｍｇ／ｍＬ）が縦軸上に、そして注射後の時間（日）が横軸上に表示される。 ＡＡＶによるヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスにおける血清総コレステロールに対する１１Ｆ１および８Ａ３の効果を示す棒グラフであり、血清総コレステロール（ｍｇ／ｍＬ）が縦軸上に、そして注射後の時間（日）が横軸上に表示される。 ＡＡＶによるヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスにおける血清ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）に対する１１Ｆ１および８Ａ３の効果を示す棒グラフであり、ＨＤＬ−Ｃ（ｍｇ／ｍＬ）が縦軸上に、そして注射後の時間（日）が横軸上に表示される。 ＡＡＶによるヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスにおけるＩｇＧ２、８Ａ３、および１１Ｆ１抗体濃度プロファイルを示すグラフであり、血清抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）が縦軸上に表示され、そして注射後の時間が横軸上に表示される。 ＡＡＶによるヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスにおけるＩｇＧ２、１１Ｆ１、および８Ａ３に対するＰＫパラメータを要約する表である。 カニクイザルにおける血清ＬＤＬ濃度（ＬＤＬ−Ｃ）に対する抗（ａｎｔ−）ＫＬＨ抗体（対照）、２１Ｂ１２、８Ａ３、および１１Ｆ１の単回皮下投与の効果を示すグラフであり、ＬＤＬ−Ｃ（ｍｇ／ｄＬ）が縦軸上に、そして投与後の時間が日数で横軸上に表示される。 カニクイザルにおける総コレステロールに対する抗（ａｎｔ−）ＫＬＨ抗体（対照）、２１Ｂ１２、８Ａ３、および１１Ｆ１の単回皮下投与の効果を示すグラフであり、総コレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）が縦軸上に、そして投与後の時間が日数で横軸上に表示される。 カニクイザルにおける血清ＨＤＬコレステロールに対する抗（ａｎｔ−）ＫＬＨ抗体（対照）、２１Ｂ１２、８Ａ３、および１１Ｆ１の単回皮下投与の効果を示すグラフであり、ＨＤＬ−Ｃ（ｍｇ／ｄＬ）が縦軸上に、そして投与後の時間が日数で横軸上に表示される。 カニクイザルにおける血清トリグリセリドに対する抗（ａｎｔ−）ＫＬＨ抗体（対照）、２１Ｂ１２、８Ａ３、および１１Ｆ１の単回皮下投与の効果を示すグラフであり、血清トリグリセリド濃度（ｍｇ／ｄＬ）が縦軸上に、そして投与後の時間が日数で横軸上に表示される。 カニクイザルにおけるアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）に対する抗（ａｎｔ−）ＫＬＨ抗体（対照）、２１Ｂ１２、８Ａ３、および１１Ｆ１の単回皮下投与の効果を示すグラフであり、ＡＰＯＢ濃度（ｍｇ／ｄＬ）が縦軸上に、そして投与後の時間が日数で横軸上に表示される。 カニクイザルにおける抗ＫＬＨ抗体（対照）、２１Ｂ１２、８Ａ３、および１１Ｆ１の平均薬物動態プロファイルを示すグラフであり、抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）が縦軸上に、そして投与後の時間が日数で横軸上に表示される。 カニクイザルにおける抗ＫＬＨ抗体（対照）、２１Ｂ１２、８Ａ３、および１１Ｆ１のＰＫパラメータを要約する表である。 ８Ａ１、８Ａ３、および１１Ｆ１の軽鎖アミノ酸配列の比較、ならびに比較から導かれるコンセンサス配列を示す。ＣＤＲ配列は下線が付されている。 ８Ａ１、８Ａ３、および１１Ｆ１の重鎖アミノ酸配列の比較、ならびに比較から導かれるコンセンサス配列を示す。ＣＤＲ配列は下線が付されている。
ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質（抗体およびその機能的な結合断片等）が、本明細書に開示される。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９に結合し、様々な方法でＰＣＳＫ９が機能を発揮するのを妨げる。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９が他の物質と相互作用する能力を遮断するまたは減少させる。例えば、幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合する可能性を妨げる、または減少させる様式でＰＣＳＫ９に結合する。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９に結合するが、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用する能力を遮断しない。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体である。
当業者によって理解されるように、本開示を考慮に入れると、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の相互作用を変化させることは、ＬＤＬに結合するのに存在するＬＤＬＲの量を増加させ、続いて、これは、対象における血清ＬＤＬの量を減少させ、対象の血清コレステロールレベルの減少をもたらす。したがって、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、血清コレステロールレベルの上昇を有する対象、血清コレステロールレベルの上昇のリスクがある対象、または血清コレステロールレベルの減少が有益であり得る対象を治療するための様々な方法および製剤において使用することができる。したがって、血清コレステロールの増加を低下させ、維持し、または妨げるための様々な方法および技術も、本明細書に記載される。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の結合を可能とするが、抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の有害な活性を妨げる、または減少させる。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を妨げる、または減少させる。
便宜のため、以下の項は、本明細書に使用される様々な用語の意味を全般的に概観する。この論述の後に、抗原結合タンパク質に関する一般的な態様が論述され、その後に、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の特性およびそれらをどのように使用することができるかを示す具体的な例が続く。
定義および実施形態
前述の概要および次の詳細な説明の両方は、例示および説明にすぎず、特許請求される本発明を制限しないことを理解されたい。本願において、単数形の使用は、具体的に別様に規定されていない限り、複数形を含む。本願において、「または」の使用は、別様に規定されていない限り、「および／または」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語、ならびに「含む」および「含まれた」等の他の形態の使用は、限定的なものではない。また、「要素」または「成分」等の用語は、具体的に別様に規定されていない限り、１つのユニットを含む要素および成分、ならびに１つを超えるサブユニットを含む要素および成分の両方を包含する。また、「部分」という用語の使用は、構成部分の一部または構成成分の全体を含み得る。
本明細書で使用される項の見出しは、構成を目的とするものに過ぎず、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。非限定で特許、特許出願、論文、本、および論説を含む、本願に引用されているすべての文献または文献の一部は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。本開示に従って使用される場合、以下の用語は、別記されない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
「前駆タンパク質転換酵素サブリシンケキシン９型」または「ＰＣＳＫ９」という用語は、配列番号１および／もしくは３に記載されているポリペプチドまたはその断片、ならびに対立遺伝子変異型、スプライス変異型、誘導体変異型、置換変異型、欠失変異型、および／またはＮ末端メチオニンの付加を含む挿入変異型、融合ポリペプチド、および種間相同体が挙げられるが、これらに限定されない、関連ポリペプチドを指す。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９ポリペプチドは、リーダー配列残基、標的残基、アミノ末端メチオニン残基、リシン残基、タグ残基、および／または融合タンパク質残基等であるが、これらに限定されない、末端残基を含む。「ＰＣＳＫ９」はまた、ＦＨ３、ＮＡＲＣ１、ＨＣＨＯＬＡ３、前駆タンパク質転換酵素サブリシン／ケキシン９型、および神経アポトーシス制御転換酵素１とも称されている。ＰＣＳＫ９遺伝子は、分泌性スブチラーゼファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属する前駆タンパク質転換酵素タンパク質をコードする。「ＰＣＳＫ９」という用語は、前駆タンパク質および前駆タンパク質の自己触媒後に生成される産物の両方を表す。（例えば、切断されたＰＣＳＫ９に選択的に結合する抗原結合タンパク質に対して）自己触媒された産物のみが引用される場合には、タンパク質は、「成熟」、「切断された」、「プロセシングされた」、または「活性な」ＰＣＳＫ９と称され得る。不活性形態のみが引用される場合には、タンパク質は、ＰＣＳＫ９の「不活性」、「プロ型」、または「プロセシングされていない」形態と称され得る。本明細書に使用されるＰＣＳＫ９という用語は、突然変異体Ｄ３７４Ｙ、Ｓ１２７Ｒ、およびＦ２１６Ｌ等の天然に存在する対立遺伝子も含む。ＰＣＳＫ９という用語はまた、グリコシル化、ＰＥＧ化されたＰＣＳＫ９配列、そのシグナル配列が切断されたＰＣＳＫ９配列、触媒ドメインからそのプロドメインが切断されているが、触媒ドメインから分離されていないＰＣＳＫ９配列（例えば、図１Ａおよび１Ｂ）等のＰＣＳＫ９アミノ酸配列の翻訳後修飾を組み込んだＰＣＳＫ９分子も包含する。
「ＰＣＳＫ９活性」という用語は、ＰＣＳＫ９のいかなる生物学的効果をも含む。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、基質または受容体と相互作用し、それに結合するＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）に結合するＰＣＳＫ９の能力によって表される。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬＲに結合し、ＬＤＬＲが関与する反応を触媒する。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、ＬＤＬＲの利用可能性を変化させる（例えば、減少させる）ＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、対象におけるＬＤＬの量を増加させるＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９活性は、存在するＬＤＬへ結合できるＬＤＬＲの量を減少させるＰＣＳＫ９の能力を含む。幾つかの実施形態では、「ＰＣＳＫ９活性」は、ＰＣＳＫ９シグナル伝達から得られるあらゆる生物学的活性を含む。例となる活性としては、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合、ＬＤＬＲまたは他のタンパク質を切断するＰＣＳＫ９酵素活性、ＰＣＳＫ９作用を促進するＬＤＬＲ以外のタンパク質へのＰＣＳＫ９の結合、ＡＰＯＢ分泌を変化させるＰＣＳＫ９（Ｓｕｎ Ｘ−Ｍ ｅｔ ａｌ，“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ＰＣＳＫ９ ｏｎ ａｐｏｌｉｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｓ ｔｈｅ ｃａｕｓｅ ｏｆ ｕｎｕｓｕａｌｌｙ ｓｅｖｅｒｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４： １１６１−１１６９，２００５およびＯｕｇｕｅｒｒａｍ Ｋ ｅｔ ａｌ，“Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ１００ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＰＣＳＫ９，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． ２４：１４４８−１４５３，２００４）、肝臓の再生および神経細胞の分化におけるＰＣＳＫ９の役割（Ｓｅｉｄａｈ ＮＧ ｅｔ ａｌ，“Ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ ｎｅｕｒａｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ １（ＮＡＲＣ−１）： Ｌｉｖｅｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ”ＰＮＡＳ １００： ９２８−９３３，２００３）、ならびに肝臓のグルコース代謝におけるＰＣＳＫ９の役割（Ｃｏｓｔｅｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｐａｔｉｃ ＰＣＳＫ９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ｓｔａｔｕｓ ｖｉａ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １ｃ”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８１（１０）：６２１１−１８，２００６）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「高コレステロール血症」という用語は、コレステロールレベルが所望の値を上回って上昇している状態を指す。幾つかの実施形態では、これは、血清コレステロールレベルが上昇していることを表す。幾つかの実施形態では、所望のレベルは、当業者に公知である（および本明細書に記載されるまたは引用されている）様々な「危険因子」を考慮に入れる。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖のヌクレオチドポリマーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾された形態であり得る。当該修飾には、ブロモウリジンおよびイノシン誘導体等の塩基修飾、２′，３′−ジデオキシリボース等のリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、およびホスホロアミデート等のヌクレオチド間連結修飾が含まれる。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００個以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基長である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子の構築に使用するために、一本鎖または二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射標識、蛍光標識、ハプテン、または抗原性標識等の標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲプライマー、クローニングプライマー、またはハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。
「単離された核酸分子」とは、単離されたポリヌクレオチドが本来見出されるポリヌクレオチドの全体または一部分と会合していない、またはそれが本来連結されていないポリヌクレオチドと連結している、ゲノム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成起源のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはその幾つかの組み合わせを意味する。本開示の目的のために、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」には無傷の染色体が包含しないことを理解されるべきである。特定の核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、特定の配列に加えて、最大１０個、またはさらには最大２０個の他のタンパク質またはその一部分のコード配列を含むことができ、または引用されている核酸配列のコード領域の発現を制御する、作用可能に連結されている調節配列を含むことができ、および／またはベクター配列を含むことができる。
特に指定されない限り、本明細書に論述される任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５′末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５′方向と称する。新生ＲＮＡ転写物の５′から３′への付加の方向は転写方向と称され、ＲＮＡ転写物の５′末端の５′側であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写物の３′末端の３′側であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と称される。
「制御配列」という用語は、それらが連結されているコード配列の発現およびプロセシングに影響を与えることができるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態では、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含み得る。例えば、真核生物の制御配列は、転写因子の１つまたは複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、および転写終結配列を含み得る。「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。
「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移すために使用される、任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ、またはウイルス）を意味する。
「発現ベクター」または「発現構築体」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、それに作用可能に連結された１つ以上の異種コード領域の発現を（宿主細胞と共に）指示および／または制御する核酸配列を含有するベクターを指す。発現構築体としては、転写、翻訳に影響を与えるまたはそれを制御する配列、およびイントロンが存在する場合、それに作用可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を与える配列が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「作用可能に連結された」とは、この用語が適用される構成成分が、それらが適切な条件下でその本来の機能を実行することを可能にする関係にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列と「作用可能に連結された」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性に適合する条件下で達成されるように、それに連結されている。
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されている、または形質転換させることができ、それによって対象となる遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語には、対象となる遺伝子が存在する限り、子孫が元の親細胞と形態的に同一であるかどうか、または元の親細胞と遺伝的構成が同一であるかどうかに関わらず、親細胞の子孫が含まれる。
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来または外因性のＤＮＡの取り込みを意味し、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合に、細胞は「トランスフェクトされている」。多くのトランスフェクション技法が当技術分野で周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，上記、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７。このような技術は、適切な宿主細胞に１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を導入するために使用することができる。
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化を指し、新しいＤＮＡまたはＲＮＡを含有するように改変されている場合に、細胞は形質転換されている。例えば、トランスフェクション、形質導入、または他の技術を介して新しい遺伝物質を導入することによってその元の自然の状態から遺伝的に改変されている場合に、細胞は形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換するＤＮＡは、細胞の染色体内に物理的に組み込まれることによって細胞のそれと組み換えられ得るか、または複製されずにエピソーム要素として一過的に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製され得る。形質転換されているＤＮＡが細胞の分裂に伴って複製される場合に、細胞は、「安定に形質転換された」と見なされる。
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、ネイティブタンパク質、すなわち、天然に存在する非組換えの細胞によって生成される、または遺伝子操作されたもしくは組換えの細胞によって生成されるタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を意味し、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはネイティブ配列の１つ以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加、および／もしくはその置換を有する分子を含む。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が、天然に存在する対応するアミノ酸およびポリマーの化学的類似体であるアミノ酸ポリマーも含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、具体的には、抗原結合タンパク質の１つ以上のアミノ酸からの欠失、それへの付加、および／もしくはその置換を有するＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質、抗体、または配列が包含される。「ポリペプチド断片」という用語は、完全長のネイティブタンパク質と比較してアミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失、および／または内部の欠失を有するポリペプチドを指す。また、このような断片は、ネイティブタンパク質と比較して、修飾されたアミノ酸も含有し得る。ある特定の実施形態では、断片は、約５〜５００アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸長である。有用なポリペプチド断片は、結合ドメインを含む免疫学的に機能的な断片を含む。ＰＣＳＫ９結合抗体の場合、有用な断片としては、ＣＤＲ領域、重および／もしくは軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部、または２つのＣＤＲを含むその可変領域のみ等が挙げられるが、これらに限定されない。
引用されている「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（１）それが通常一緒に見出される少なくとも幾つかの他のタンパク質を含まない、（２）同じ供給源、例えば同じ種からの他のタンパク質を本質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現される、（４）それが天然で会合している、少なくとも約５０パーセントのポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質から分離されている、（５）それが天然で会合していないポリペプチドと作動可能に会合している（共有または非共有的な相互作用による）、または（６）天然に存在しないことを意味する。典型的には、「単離されたタンパク質」は、所与のサンプルの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を占める。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは合成起源の他のＲＮＡ、またはその任意の組み合わせがこのような単離されたタンパク質をコードし得る。好ましくは、単離されたタンパク質は、実質的に、その治療的、診断的、予防的、研究用、または他の使用を妨害する可能性のある、その天然環境中で見出されるタンパク質またはポリペプチドまたは他の混入物質を含まない。
「アミノ酸」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を含む。
ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質または抗体）の「変異体」は、別のポリペプチド配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列に挿入され、欠失され、および／または置換されているアミノ酸配列を含む。変異体は、融合タンパク質を含む。
「同一性」という用語は、配列のアラインメントおよび比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」とは、比較した分子中のアミノ酸またはヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較した分子の最小のものの大きさに基づいて計算される。これらの計算のために、アラインメントにおけるギャップ（存在する場合）は、好ましくは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって処理される。アラインメントされた核酸またはポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、およびＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されているものが含まれる。
同一性パーセントを計算する際、比較される配列は、一般的には、配列間の最大の一致を与える方法でアラインメントされる。同一性パーセントを決定するために使用することができるコンピュータプログラムの一例は、ＧＡＰを含む、ＧＣＧプログラムパッケージである（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １２：３８７、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムのＧＡＰを用いて、配列同一性パーセントを決定する２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドをアラインメントする。配列は、そのそれぞれのアミノ酸またはヌクレオチドの最適な一致についてアラインメントされる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開きペナルティー（これは平均対角の３倍として計算され、「平均対角」とは、使用される比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」とは、特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全なアミノ酸一致に割り当てられたスコアまたは数値である）およびギャップ伸長ペナルティー（これは、通常はギャップ開きペナルティーの１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳｕｍ６２等の比較マトリックスがアルゴリズムと併せて使用される。ある特定の実施形態では、標準の比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：３４５−３５２、ＢＬＯＳｕｍ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照）も、アルゴリズムによって使用される。
ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチドまたはヌクレオチド配列に対する同一性パーセントを測定する際に使用することができるパラメータの例は、以下の通りである。
・アルゴリズム： Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３
・比較マトリックス： Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，上記から得られるＢＬＯＳｕｍ６２
・ギャップペナルティー： １２（但し、末端ギャップにはペナルティーはなし）
・ギャップ長ペナルティー：４
・類似性の閾値：０
２つのアミノ酸配列をアラインメントするためのあるアラインメントスキームでは、２つの配列の短い領域のみの一致しかもたらさない場合があり、この小さなアラインメントされた領域は、２つの完全長配列間には有意な関係が存在しないにも関わらず、非常に高い配列同一性を有する場合がある。したがって、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、所望する場合は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個または他の数の連続的なアミノ酸にまたがるアラインメントをもたらすように調整することができる。
本明細書で使用される、２０の慣用（例えば、天然に存在する）アミノ酸およびそれらの略語は、慣用的な用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ ａｎｄ Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたく、これは、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。また、２０の慣用アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、たとえばα−，α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の慣用でないアミノ酸も、本発明のポリペプチドの適切な構成成分であり得る。慣用でないアミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用されるポリペプチドの表記法では、標準の用法および慣習に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシル末端方向である。
同様に、特に指定されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５′末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５′方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５′から３′への付加の方向を転写方向と称され、ＲＮＡ転写物の５′末端の５′側であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写物の３′末端の３′側であるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と称される。
保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物系内の合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の逆転または反転された形態が含まれる。
保存的アミノ酸置換は、典型的には、生物系内の合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含し得る。これらには、ペプチド模倣物およびアミノ酸部分の他の逆転または反転された形態が含まれる。
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分類され得る。
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを含み得る。このような置換された残基は、例えば、非ヒト抗体に相同であるヒト抗体の領域内に、または分子の非相同領域内に導入することができる。
抗原結合タンパク質またはＰＣＳＫ９タンパク質に対して変換を施す上で、ある特定の実施形態によれば、アミノ酸の疎水性親水性指数を検討し得る。それぞれのアミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指数が割り当てられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタメート（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパルテート（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を付与する上での疎水性親水性アミノ酸指数の重要性は、当技術分野において理解されている。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。ある種のアミノ酸は、類似の疎水性親水性アミノ酸指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換でき、それでもなお類似の生物学的活性を保持することが知られている。疎水性親水性アミノ酸指数に基づいて変化させる際には、ある特定の実施形態では、疎水性親水性指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある特定の実施形態では、±１以内であるものが含まれ、ある特定の実施形態では、±０．５以内であるものが含まれる。
また、類似するアミノ酸の置換が、本事例のように、特にそれによって産出される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが、免疫学的実施形態における使用を意図されている場合、親水性に基づいて効率的に行うことができることも当技術分野において理解されている。ある特定の実施形態では、その隣接アミノ酸の親水性によって制御されるタンパク質の局所的な最大平均親和性が、その免疫原性および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性と相関している。
以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパルテート（＋３．０±１）、グルタメート（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変化させる際には、ある特定の実施形態では、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある特定の実施形態では、±１以内であるものが含まれ、ある特定の実施形態では、±０．５以内であるものが含まれる。また、親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも称される。
例となるアミノ酸置換を、表１に示す。
Figure 0006166717
「誘導体」という用語は、アミノ酸（または核酸）の挿入、欠失、または置換以外の化学的改変を含む分子を指す。ある特定の実施形態では、誘導体は、ポリマー、脂質、または他の有機もしくは無機部分との化学的結合等が挙げられるが、それらに限定されない、共有結合改変を含む。ある特定の実施形態では、化学的に改変された抗原結合タンパク質は、化学的に改変されていない抗原結合タンパク質よりも大きな循環半減期を有することができる。ある特定の実施形態では、化学的に改変された抗原結合タンパク質は、所望の細胞、組織、および／または臓器に対する改善された標的誘導能力を有することができる。幾つかの実施形態では、誘導体抗原結合タンパク質は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、またはポリプロピレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上の水溶性ポリマー付着を含むように共有結合的に改変される。例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号、および第４，１７９，３３７号を参照されたい。ある特定の実施形態では、誘導体抗原結合タンパク質は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物をベースとするポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えばグリセロール）、およびポリビニルアルコール、ならびにこのようなポリマーの混合物が挙げられるが、これらに限定されない、１つ以上のポリマーを含む。
ある特定の実施形態では、誘導体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有結合的に改変される。ある特定の実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーが、１つ以上の特定の位置で、例えば、誘導体のアミノ末端で結合されている。ある特定の実施形態では、１つ以上の水溶性ポリマーが、誘導体の１つ以上の側鎖に無作為に付着されている。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質に対して治療能力を向上させるためにＰＥＧが使用される。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体に対して治療能力を向上させるためにＰＥＧが使用される。ある特定のこのような方法は、例えば、米国特許第６，１３３，４２６号に論述されており、これはあらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
ペプチド類似体は、テンプレートペプチドのものと類似の特性を有する非ペプチド薬物として製薬産業において一般的に使用されている。非ペプチド化合物のこれらの種類は、「ペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣薬（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称されている。Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１５：２９（１９８６）、Ｖｅｂｅｒ ＆ Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，ＴＩＮＳ，ｐ．３９２（１９８５）、およびＥｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３０：１２２９（１９８７）を参照、これらはあらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。このような化合物は、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借りて開発されることが多い。治療上有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体は、類似の治療効果または予防効果を生じさせるために使用し得る。一般に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体等の模範ポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、当技術分野で公知の方法によって、−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−−から選択される連結によって任意に置換された１つ以上のペプチド連結を有する。同種のＤ−アミノ酸によるコンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の系統的な置換（例えば、Ｌ−リジンに代えてＤ−リジン）は、ある特定の実施形態では、より安定なペプチドを作製するために使用し得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む拘束されたペプチドは、当技術分野で公知の方法によって、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって作製され得る（Ｒｉｚｏ ａｎｄ Ｇｉｅｒａｓｃｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６１：３８７（１９９２）、あらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる）。
ポリペプチド、核酸、宿主細胞等の生物学的物質に関連して本明細書を通じて使用される「天然に存在する」という用語は、自然界で見出される物質または自然界で見出される物質の形態を指す。
本明細書で使用される「抗原結合タンパク質」（「ＡＢＰ」）は、特定された標的抗原に結合するあらゆるタンパク質を意味する。本出願では、この特定された標的抗原は、ＰＣＳＫ９タンパク質またはその断片である。「抗原結合タンパク質」には、抗体および免疫学的に機能的な断片等のその結合部分が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、抗原結合タンパク質の別の例である。本明細書で使用される、抗体または免疫グロブリン鎖（重もしくは軽鎖）抗原結合タンパク質の「免疫学的に機能的な断片」（もしくは単に「断片」）は、完全長の鎖中に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠如するが、抗原になお特異的に結合することができる抗体の一部（その部分がどのようにして得られ、または合成されるかに関わらず）を含む抗原結合タンパク質の種である。そのような断片は、これらが標的抗原に結合し、所定のエピトープとの結合に関して無傷な抗体を含む他の抗原結合タンパク質と競合し得るという点で生物学的に活性である。幾つかの実施形態では、これらの断片は、中和断片である。幾つかの実施形態では、断片は、ＬＤＬＲとＰＣＳＫ９との間の相互作用の可能性を遮断するか、または減少させ得る。一態様では、このような断片は完全長の軽鎖または重鎖中に存在する少なくとも１つのＣＤＲを保持しており、幾つかの実施形態では、単一の重鎖および／もしくは軽鎖またはその一部を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えＤＮＡ技術によって生成させ得るか、または無傷な抗体を含む抗原結合タンパク質の酵素的または化学的切断によって生成させ得る。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片としては、Ｆａｂ、ダイアボディ（同一の鎖上の２つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎる短いペプチドリンカーを介して接続された、軽鎖可変ドメインと同一のポリペプチド上の重鎖可変ドメイン）、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ、ドメイン抗体、および一本鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科の動物、またはウサギが挙げられるが、これらに限定されない、あらゆる哺乳動物源に由来し得る。本明細書に開示される抗原結合タンパク質の機能的部分は、例えば、１つ以上のＣＤＲは、身体中の特定の標的に向けられ、二機能性の治療特性を保有する、または長期的な血清半減期を有する治療剤を作製するために、第２のタンパク質または小分子と共有結合させるできることがさらに企図される。当業者によって理解されるように、抗原結合タンパク質は、非タンパク質成分を含むことができる。本開示の幾つかの項において、ＡＢＰの例は、「数字／文字／数」（例えば２５Ａ７）の形式で本明細書中に記載されている。これらの場合、正確な名前は、特異的抗体を表す。すなわち、２５Ａ７という名前のＡＢＰは（本明細書中で、同じであることが明示的に教示されていなければ、例えば、２５Ａ７および２５Ａ７．３）、必ずしも２５Ａ７．１という名前の抗体と同じであるとは限らない。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態では、ＬＤＬＲは抗原結合タンパク質ではない。幾つかの実施形態では、ＬＤＬＲの結合サブセクションは、例えばＥＧＦａのように、抗原結合タンパク質ではない。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９がそれを通じてインビボでシグナル伝達する他の分子は、抗原結合タンパク質ではない。したがって、このような実施形態は、明示的に特定されよう。
本明細書に記載されるある特定の抗原結合タンパク質は、抗体であるか、または抗体に由来する。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では、「抗体模倣体」と称される場合がある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書では、「抗体複合体」と称される場合がある）、およびそれぞれ、それらの断片が挙げられるが、これらに限定されない、抗体に基づいている。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、アビマー（強固に結合するペプチド）を含むか、またはそれからなる。これらの様々な抗原結合タンパク質は、本明細書中にさらに記載されている。
「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む２つの重鎖断片を含む。２つの重鎖断片は、２つ以上のジスルフィド結合によって、およびＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一緒に結合される。
「Ｆａｂ断片」は、１つの軽鎖ならびに１つの重鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
「Ｆａｂ′断片」は、１つの軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含有し、ならびに鎖間ジスルフィド結合が２つのＦａｂ′断片の２つの重鎖間に形成され、Ｆ（ａｂ′）２分子を形成することができるように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の領域も含有する１つの重鎖の一部と、を含む。
「Ｆ（ａｂ′）２断片」は、２つの軽鎖と、鎖間ジスルフィド結合が２つの重鎖間に形成されるように、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間の定常領域の一部を含有する２つの重鎖と、を含有する。したがって、Ｆ（ａｂ′）２断片は、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に結合されている２つのＦａｂ′断片からなる。
「Ｆｖ領域」は、重鎖および軽鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域を欠如する。
「一本鎖抗体」は、重および軽鎖可変領域が柔軟なリンカーによって接続されて、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成する、Ｆｖ分子である。一本鎖抗体は、国際特許出願公開第ＷＯ８８／０１６４９号および米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２６０，２０３号詳述されており、これらの開示は、参照により組み込まれる。
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する、免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。場合によっては、２つ以上のＶＨ領域がペプチドリンカーによって共有結合されて、二価ドメイン抗体を作製する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨ領域は、同じまたは異なる抗原を標的とし得る。
「二価抗原結合タンパク質」または「二価抗体」は、２つの抗原結合部位を含む。場合によっては、２つの結合部位は、同じ抗原特異性を有する。二価抗原結合タンパク質および二価抗体は、二重特異的であり得る。下記を参照。「多特異的」または「多機能的」抗体以外の二価抗体は、ある特定の実施形態では、典型的には、同一のそれぞれのその結合部位を有することが理解される。
「多特異的抗原結合タンパク質」または「多特異的抗体」は、１つを超える抗原またはエピトープを標的とするものである。
「二重特異的」、「デュアル特異的」、または「二官能性」抗原結合タンパク質または抗体はそれぞれ、２つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。二重特異的抗原結合タンパク質および抗体は、多特異的抗原結合タンパク質抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ′断片の連結を含むが、これらに限定されない、様々な方法によって生成され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照のこと。二重特異的抗原結合タンパク質または抗体の２つの結合部位は、同一または異なるタンパク質標的上に存在し得る２つの異なるエピトープに結合する。
抗原結合タンパク質は、解離定数（Ｋｄ）が１０−７Ｍ以下である場合に、その標的抗原を「特異的に結合する」と称される。ＡＢＰは、Ｋｄが５×１０−９Ｍ以下である場合に、「高い親和性」を有する抗原を特異的に結合し、Ｋｄが５×１０−１０Ｍ以下である場合に、「極めて高い親和性」を有する抗原を特異的に結合する。一実施形態では、ＡＢＰは、１０−９Ｍ以下のＫｄを有する。一実施形態では、オフ速度は、１×１０−５未満である。他の実施形態では、ＡＢＰは、約１０−９Ｍ〜１０−１３ＭのＫｄを有するヒトＰＣＳＫ９に結合し、さらに別の実施形態では、ＡＢＰは、５×１０−１０以下のＫｄで結合する。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態では、抗原結合断片のいずれかまたはすべてが、ＰＣＳＫ９に特異的に結合し得る。
抗原結合タンパク質が、第２の標的に結合するよりもさらに強固に１つの標的に結合する場合に、「選択的」である。
「抗原結合領域」は、特定された抗原（例えばパラトープ）を特異的に結合するタンパク質またはタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性および親和性を抗原結合タンパク質に対して付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合タンパク質の一部が、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、典型的には、１つ以上の「相補性結合領域」（「ＣＤＲ」）を含む。ある特定の抗原結合領域はまた、１つ以上の「フレームワーク」領域も含む。「ＣＤＲ」は、抗原結合特異性および親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、抗原結合領域と抗原との間の結合を促進させるために、ＣＤＲの適切な立体構造を維持するために役立てることができる。構造的には、フレームワーク領域は、抗体中においてＣＤＲ間に位置することができる。フレームワークおよびＣＤＲ領域の例は、図２Ａ〜３Ｄ、３ＣＣＣ〜３ＪＪＪに示される。幾つかの実施形態では、抗体３Ｂ６の軽鎖に対するＣＤＲの配列は、以下の通りである。ＣＤＲ１ ＴＬＳＳＧＹＳＳＹＥＶＤ（配列番号２７９）、ＣＤＲ２ ＶＤＴＧＧＩＶＧＳＫＧＥ（配列番号２８０）、ＣＤＲ３ ＧＡＤＨＧＳＧＴＮＦＶＶＶ（配列番号２８１）、ＦＲは、以下の通りである。ＦＲ１ ＱＰＶＬＴＱＰＬＦＡＳＡＳＬＧＡＳＶＴＬＴＣ（配列番号２８２）、ＦＲ２ ＷＹＱＱＲＰＧＫＧＰＲＦＶＭＲ（配列番号２８３）、ＦＲ３ ＧＩＰＤＲＦＳＶＬＧＳＧＬＮＲＹＬＴＩＫＮＩＱＥＥＤＥＳＤＹＨＣ（配列番号２８４）、およびＦＲ４ ＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２８５）。
ある特定の態様では、ＰＣＳＫ９、例えばヒトＰＣＳＫ９に結合する組換え抗原結合タンパク質が提供される。この文脈において、「組換え抗原結合タンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち、本明細書に記載される組換え核酸の発現を通じて作製されたタンパク質である。組換えタンパク質の生成のための方法および技術は、当技術分野で公知である。
「抗体」という用語は、あらゆるイソタイプの無傷な免疫グロブリン、または標的抗原への特異的結合のために無傷の抗体と競合することができるその断片を指し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト、および二重特異的抗体を含む。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。無傷の抗体は、一般には、少なくとも２つの完全長の重鎖および２つの完全長の軽鎖を含むが、場合によっては、重鎖のみを含み得るラクダ科の動物において天然に存在する抗体等のより少ない鎖を含み得る。抗体は、単一の源からのみ得ることが可能であるか、または「キメラ」であり得る、すなわち、抗体の異なる部分が、以下にさらに記載される２つの異なる抗体から得られ得る。抗原結合タンパク質、抗体、または結合断片は、組換えＤＮＡ技術によって、または無傷な抗体の酵素的または化学的切断によってハイブリドーマ中で生成され得る。特に指定されない限り、「抗体」という用語には、２つの完全長の重鎖および２つの完全長の軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変異体、断片、および突然変異タンパク質が含まれ、それらの例が以下に記載される。さらに、明示的に除外されていなければ、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では、「抗体模倣体」と称される場合がある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書では、「抗体複合体」と称される場合がある）、およびそれぞれ、それらの断片が含まれる。幾つかの実施形態では、この用語は、ペプチボディも包含する。
天然に存在する抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。それぞれのそのような四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、それぞれの対は、１つの完全長「軽」（ある特定の実施形態では、約２５ｋＤａ）および１つの完全長「重」鎖（ある特定の実施形態では、約５０〜７０ｋＤａ）を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、典型的には、抗原認識に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を典型的には含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能に関与する定常領域を画定する。ヒト軽鎖は、典型的には、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、典型的にはミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはエプシロンとして分類され、これらにより、抗体のイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義される。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が含まれるが、これらに限定されない、幾つかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２が含まれるが、これらに限定されない、サブクラスを有する。ＩｇＡは、同様に、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２が含まれるが、これらに限定されない、サブクラスに細分される。完全長の軽鎖および重鎖内に、典型的には、可変および定常領域は、約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖には、約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含まれる。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））（すべての目的のために、参照によりその全体が組み込まれる）を参照のこと。それぞれの軽／重鎖の対の可変領域は、典型的には抗原結合部位を形成する。
可変領域は、典型的には、相補性決定領域またはＣＤＲとも称される３つの超可変領域によって結合された相対的に保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を呈する。それぞれの対の２つの鎖からのＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列され、これにより、特異的エピトープへの結合が可能となり得る。Ｎ末端からＣ末端に、軽および重鎖可変領域は共に、典型的には、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。それぞれのドメインへのアミノ酸の割り当ては、典型的には、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７および１９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従う。
ある特定の実施形態では、抗体重鎖は、抗体軽鎖の不在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、抗体軽鎖は、抗体重鎖の不在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、抗体結合領域は、抗体軽鎖の不在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、抗体結合領域は、抗体重鎖の不在下で抗原に結合する。ある特定の実施形態では、個々の可変領域は、他の可変領域の不在下で抗原に特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、ＣＤＲの確定的な描写および抗体の結合部位を含む残基の特定は、抗体の構造を解明し、および／または抗体−リガンド複合体の構造を解明することによって達成される。ある特定の実施形態では、それは、Ｘ線結晶学等、当業者に公知の様々な技術のいずれによっても達成することができる。ある特定の実施形態では、様々な分析の方法が、ＣＤＲ領域を特定するまたは概測するために使用することができる。このような方法の例には、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、および接触定義が含まれるが、これらに限定されない。
Ｋａｂａｔ定義は、抗体中の残基に付番するための標準であり、ＣＤＲ領域を特定するために典型的に使用される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｗｕ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２８：２１４−８（２０００）を参照のこと。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、Ｋａｂａｔ定義に類似しているが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、ある特定の構造的ループ領域の位置を考慮に入れている。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−１７（１９８６）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８３（１９８９）を参照のこと。ＡｂＭ定義は、抗体構造をモデル化するＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐによって作成されたコンピュータプログラムの一体化されたパッケージソフトを使用する。例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８６：９２６８−９２７２（１９８９）、“ＡｂＭ（商標），Ａ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．を参照のこと。ＡｂＭ定義は、知識データベースと、ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌ．，３：１９４−１９８（１９９９）中のＳａｍｕｄｒａｌａ ｅｔ ａｌ．，“Ａｂ Ｉｎｉｔｉｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”によって記載されているもの等のアブイニシオ法の組み合わせを用いて、一次配列から抗体の四次構造をモデル化する。接触定義は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づいている。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：７３２−４５（１９９６）を参照のこと。
慣例により、重鎖中のＣＤＲ領域は、通常は、Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に順に付番される。軽鎖中のＣＤＲ領域は、通常は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３と称され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に順に付番される。
「軽鎖」という用語は、完全長の軽鎖および結合特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長の軽鎖は、可変領域ドメインＶＬおよび定常領域ドメインＣＬを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖は、カッパ鎖およびラムダ鎖を含む。
「重鎖」という用語は、完全長の重鎖および結合特異性を与えるのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長の重鎖は、可変領域ドメインＶＨ、ならびに３つの定常領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨドメインは、カルボキシ末端にあり、ＣＨ３がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２サブタイプを含む）ＩｇＭ、およびＩｇＥを含むあらゆるイソタイプのものであり得る。
二重特異的および二官能性抗体は、典型的には、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ′断片の連結が挙げられるが、これらに限定されない、様々な方法によって生成され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：３１５−３２１（１９９０）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照のこと。
哺乳動物の幾つかの種も、単一の重鎖のみを有する抗体を生成する。
それぞれの個々の免疫グロブリン鎖は、典型的には、それぞれが約９０〜１１０個のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを有する、幾つかの「免疫グロブリンドメイン」からなる。これらのドメインが、抗体ポリペプチドが構成される基本単位である。ヒトでは、ＩｇＡおよびＩｇＤイソタイプは、４つの重鎖および４つの軽鎖を含有し、ＩｇＧおよびＩｇＥイソタイプは、２つの重鎖および２つの軽鎖を含有し、ＩｇＭイソタイプは、５つの重鎖および５つの軽鎖を含有する。重鎖Ｃ領域は、典型的には、エフェクター機能を担い得る１つ以上のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、イソタイプに依存する。ＩｇＧ重鎖は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３として知られる３つのＣ領域ドメインを含有する。提供される抗体は、これらのイソタイプおよびサブタイプのうちのいずれかを有することができる。本発明のある特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブタイプからなる。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、典型的には、重鎖中にアミノ末端の約１２０〜１３０個のアミノ酸および軽鎖中に約１００〜１１０個のアミノ末端のアミノ酸を含む、抗体の軽および／または重鎖の一部を指す。ある特定の実施形態では、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体間でさえ、アミノ酸配列が大幅に異なる。抗体の可変領域は、典型的には、特定の抗体の標的に対する特異性を決定する。
「中和抗原結合タンパク質」または「中和抗体」という用語はそれぞれ、リガンドに結合し、そのリガンドの生物学的効果を妨げるまたは減少させる、抗原結合タンパク質または抗体を指す。これは、例えば、リガンド上の結合部位を直接遮断することによって、またはリガンドに結合し、間接的な手段（リガンド中の構造的またはエネルギー的変化等）を通じて結合するリガンドの能力を変化させることによって行うことができる。幾つかの実施形態では、この用語は、それが結合しているタンパク質が生物学的機能を発揮するのを妨げる抗原結合タンパク質も表し得る。抗原結合タンパク質、例えば抗体もしくはその免疫学的に機能的な断片の結合および／または特異性を評価する際に、抗体または断片は、過剰な抗体が、（インビトロ競合結合アッセイにおいて測定される場合に）少なくとも約１〜２０、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、９７〜９８％、９８〜９９％またはそれ以上、リガンドに結合された結合パートナーの量を減少させる場合に、リガンドとその結合パートナーとの結合を実質的に阻害することができる。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の場合は、このような中和分子は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合する能力を低減させることができる。幾つかの実施形態では、中和能力は、競合アッセイを介して特徴付けられ、および／または記載されている。幾つかの実施形態では、中和能力は、ＩＣ５０またはＥＣ５０値で説明される。幾つかの実施形態では、ＡＢＰs２７Ｂ２、１３Ｈ１、１３Ｂ５、および３Ｃ４は、非中和ＡＢＰであり、３Ｂ６、９Ｃ９、および３１Ａ４は、弱い中和物質であり、表２中の残りのＡＢＰは、強い中和物質である。幾つかの実施形態では、抗体または抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９に結合することによって、およびＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げる（またはＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合する能力を減少させる）ことによって中和する。幾つかの実施形態では、抗体またはＡＢＰは、ＰＣＳＫ９に結合することによって、およびＰＣＳＫ９をＬＤＬＲにさらに結合させながら、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９媒介性分解を妨げ、または減少させることによって中和する。したがって、幾つかの実施形態では、中和ＡＢＰまたは抗体は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合をなお可能にさせ得るが、ＰＣＳＫ９が関与するＬＤＬＲのその後の分解を妨げる（または減少させる）。
「標的」という用語は、抗原結合タンパク質によって結合されることができる分子または分子の一部を指す。ある特定の実施形態では、標的は、１つ以上のエピトープを有することができる。ある特定の実施形態では、標的は抗原である。「抗原結合タンパク質」という用語における「抗原」の使用は、抗原を含むタンパク質配列が抗体によって結合され得ることを単に表す。この文脈において、タンパク質が外来であること、または免疫応答を誘導可能であることは必要とされない。
同じエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）の文脈において使用される場合の「競合」という用語は、試験された抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な断片）が、共通抗原（例えば、ＰＣＳＫ９またはその断片）への参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を妨げ、または阻害する（例えば、減少させる）アッセイによって決定される抗原結合タンパク質間の競合を意味する。競合結合アッセイの多くの種類は、ある抗原結合タンパク質が別のものと競合するかどうかを決定するために、例えば、固相の直接または間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相の直接または間接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２−２５３を参照）、固相の直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照） 固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照）、Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７６：５４６−５５２を参照）、ならびに直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）を使用することができる。典型的には、このようなアッセイは、これらのうちのいずれかを保有する固体表面または細胞と結合した精製した抗原、未標識の試験抗原結合タンパク質、および標識した参照抗原結合タンパク質の使用を含む。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固体表面または細胞と結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって特定される抗原結合タンパク質（競合抗原結合タンパク質）は、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質、および立体的妨害が生じるのに参照抗原結合タンパク質によって結合されるエピトープに十分に近接した隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質を含む。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書中の実施例に提供される。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合には、少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％、または７５％もしくはそれ以上、共通抗原への参照抗原結合タンパク質の特異的結合を阻害する（例えば、減少させる）。場合によっては、少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、または９７％もしくはそれ以上、結合が阻害される。
「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的な断片を含む）等の選択的結合剤によって結合することができる分子または分子の一部を指す。幾つかの実施形態では、抗原は、その抗原に結合することが可能な抗体を生成するために、動物において使用することができる。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば抗体と相互作用することができる１つ以上のエピトープを有することができる。
「エピトープ」という用語は、抗体またはＴ細胞受容体等の抗原結合タンパク質によって結合することが可能なあらゆる決定基を含む。エピトープは、その抗原を標的とする抗原結合タンパク質によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合は、抗原結合タンパク質と直接接触する特異的なアミノ酸を含む。ほとんどの場合、エピトープはタンパク質上に存在するが、場合によっては、核酸等の他の種類の分子上に存在し得る。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニル基等の化学活性のある表面の分子の群が含まれる場合があり、特異的な三次元構造的特徴および／または特異的な荷電特徴を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中で標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。
本明細書で使用される「実質的に純粋」とは、記載された分子種が存在する優勢の種である、すなわち、モル濃度に基づいて、これが同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。ある特定の実施形態では、実質的に純粋な分子とは、目的の種が、存在するすべての高分子種の少なくとも５０％（モル濃度に基づいて）を構成する組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を構成する。他の実施形態では、夾雑種が従来の検出方法によって組成物中に検出され得ず、したがって、組成物が単一の検出可能な高分子種からなるように、本質的に均質となるまで目的の種を精製する。
「剤」という用語は、本明細書において、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作製された抽出物を表すために使用される。
本明細書で使用される、「標識する」または「標識された」という用語は、例えば、放射線標識されたアミノ酸の取り込み、または標識されたアビジン（例えば、蛍光マーカーまたは光学的もしくは色素測定法によって検出され得るストレプトアビジン）によって検出され得るビオチン部分のポリペプチドへの付着によって、検出可能なマーカーの取り込みを指す。ある特定の実施形態では、標識またはマーカーはまた、治療用でもあり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が、当技術分野で公知であり、使用することができる。ポリペプチドに対する標識の例としては、放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光性標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニドリン光物質）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、立体障害の可能性を低減するために、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
本明細書で使用される「生物学的試料」という用語には、生物または以前に生物であった物からの物質のあらゆる量が含まれるが、これらに限定されない。このような生物には、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ、および他の動物が含まれるが、これらに限定されない。このような物質には、血液、血清、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ節、および皮膚が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「薬学的薬剤組成物」（または薬剤もしくは薬物）は、患者に適切に投与された場合に、所望の治療効果を誘導することができる、化学的化合物、組成物、薬剤、または薬物を指す。それは、１を超える種類の成分を必ずしも必要としない。
「治療上有効量」という用語は、哺乳動物において治療的応答を生じると決定された抗ＰＣＳＫ９高原結合タンパク質の量を指す。このような治療上有効量は、当業者によって容易に確認される。
本明細書で使用される「調節物質」という用語は、分子の活性または機能を変化または改変させる化合物である。例えば、調節物質は、調節物質の不在下で観察される活性または機能の規模と比較して、分子のある特定の活性または機能の規模の増加または減少を引き起こすことができる。ある特定の実施形態では、調節物質は、分子の少なくとも１つの活性または機能の規模を減少させる阻害剤である。分子のある特定の例となる活性または機能には、結合親和性、酵素活性、およびシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の例となる阻害剤には、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物、または小有機分子が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、例えば、米国特許第６，６６０，８４３号（ＰＣＴ出願第ＷＯ０１／８３５２５号に対応する）に記載されている。
「患者」および「対象」という用語は互換的に使用され、ヒトおよび非ヒト動物対象、ならびに正式に診断された障害を有するもの、正式に認識された障害を持たないもの、医学的な治療を受けているもの、障害を発症するリスクを有するもの等が含まれる。
「治療する」および「治療」という用語は、治療的処置、予防的処置、および対象が障害または他の危険因子を発症する危険を低減する適用が含まれる。治療は、障害の完全な治癒を必要とするものではなく、症候または伏在する危険因子を低減させる実施形態を包含する。
「予防する」という用語は、事象の確率を１００％除去することを必要とするものではない。むしろ、それは、化合物または方法の存在下で、事象の発生の確率が低下されることを表す。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）のための標準的な技術が使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に実施されるように、または本明細書中に記載されているように実施することができる。前記技術および手技は、当技術分野で公知の従来の方法に従って、ならびに本明細書を通じて引用および論述されている様々な一般的な、およびより具体的な参考文献に記載されているように、一般に実施することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたく、これは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。特定の定義が与えられていなければ、本明細書中に記載されている分析化学、合成有機化学、ならびに医学および薬剤化学に関連して使用される命名法ならびにこれらの研究手技および技術は、当技術分野で公知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬学的な調製、製剤化、および送達、ならびに患者の治療のための標準的な技術が使用され得る。
ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質
前駆タンパク質転換酵素サブチリシンケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルの調節に関与しているセリンプロテアーゼである（Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｓｅｉｄａｈ ａｎｄ Ｐｒａｔ，２００７）。ＰＣＳＫ９は、セリンプロテアーゼのサブチリシン（Ｓ８）ファミリーのプロホルモン−前駆タンパク質転換酵素である（Ｓｅｉｄａｈ ｅｔ ａｌ．，２００３）。例となるヒトＰＣＳＫ９アミノ酸配列が、図１Ａ（下線が付されているタンパク質の「プロ」ドメインを示す）および図１Ｂ（太字のシグナル配列および下線が付されたプロドメインを示す）において、配列番号１および３として表される。例となるヒトＰＣＳＫ９のコード配列が、配列番号２として表される（図１Ｂ）。本明細書に記載されるように、ＰＣＳＫ９タンパク質はまた、完全長ＰＣＳＫ９タンパク質の断片も含むことができる。ＰＣＳＫ９タンパク質の構造は、２つのグループによって解決され（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７およびＰｉｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１５：１−８，２００７）、これらの両方の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＣＳＫ９は、シグナル配列、Ｎ末端プロドメイン、サブチリシン様触媒ドメイン、およびＣ末端ドメインを含む。
ヒトＰＣＳＫ９を含むＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）が本明細書に提供される。幾つかの実施形態では、提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載される１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチドである。幾つかの抗原結合タンパク質において、ＣＤＲは、ＣＤＲの適切な抗原結合特性が達成されるようにＣＤＲを方向付ける「フレームワーク」領域中に包埋されている。幾つかの実施形態では、本明細書に提供される抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の相互作用を妨害し、遮断し、減少させ、または調節することができる。このような抗原結合タンパク質は、「中和」と表される。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質が中和し、ＰＣＳＫ９に結合されているにもかかわらず、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の結合は、なお起こり得る。例えば、幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９上のＬＤＬＲ結合部位を遮断することなく、ＬＤＬＲに対するＰＣＳＫ９の悪影響を妨げ、または減少させる。したがって、幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の結合相互作用を抑制する必要なしに、ＬＤＬＲの分解をもたらすＰＣＳＫ９の能力を調節し、または変化させる。このようなＡＢＰは、特定的に、「非競合的に中和する」ＡＢＰとして説明することができる。幾つかの実施形態では、中和ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げる位置および／または様式で、ＰＣＳＫ９に結合する。このようなＡＢＰは、特定的に、「競合的に中和する」ＡＢＰとして説明することができる。上記の中和剤の両方は、大きな量の対象中に存在する遊離ＬＤＬＲのをもたらし得、これにより、より多くのＬＤＬＲがＬＤＬに結合することをもたらす（それにより、対象中のＬＤＬの量を減少させる）。続いて、これは、対象中に存在する血清コレステロールの量の減少をもたらす。
幾つかの実施形態では、本明細書に提供される抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９によって媒介される活性（結合を含む）を阻害することができる。幾つかの実施形態では、これらのエピトープに結合する抗原結合タンパク質は、とりわけ、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の相互作用およびＰＣＳＫ９によって媒介される他の生理学的効果を阻害する。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９に対する完全ヒト抗体等のヒトである。
幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の成熟形態に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のプロドメイン中に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の成熟形態に選択的に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合することができない、または効率的には結合することができない様式で、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのｃ末端に結合しない。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのｎ末端に結合しない。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９タンパク質のｎまたはｃ末端に結合しない。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、本明細書に論述される抗体によって結合されるエピトープのうちのいずれか１つに結合する。幾つかの実施形態では、これは、本明細書に開示される抗体と他の抗体との間の競合アッセイによって決定することができる。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、表２中に記載される抗体のうちの１つによって結合されるエピトープに結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用するのを妨げるように、ＰＣＳＫ９の特異的な立体構造状態に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合し、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合するのを妨げる（または減少させる）。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のＶドメインに結合し、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を妨げずに（または減少させずに）、ＰＣＳＫ９を通じて媒介されるＬＤＬＲに対する有害な活性を妨げ、または減少させる。
本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、様々な用途を有する。抗原結合タンパク質の幾つかは、例えば、特異的結合アッセイ、ＰＣＳＫ９、特に、ヒトＰＣＳＫ９またはそのリガンドの親和性精製において、およびＰＣＳＫ９活性の他のアンタゴニストを特定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。抗原結合タンパク質の幾つかは、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を阻害し、またはＰＣＳＫ９によって媒介される活性を阻害するのに有用である。
抗原結合タンパク質は、本明細書中に説明されているように、様々な治療用途において使用することができる。例えば、幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質は、本明細書にさらに記載されるように、高コレステロール血症等のコレステロール関連障害（または「血清コレステロール関連障害」）等のＰＣＳＫ９と関連する症状を治療するのに有用である。抗原結合タンパク質に対する他の使用には、例えば、ＰＣＳＫ９関連疾患または症状の診断およびＰＣＳＫ９の存在または不存在を決定するためのスクリーニングアッセイが含まれる。本明細書に記載される抗原結合タンパク質の幾つかは、ＰＣＳＫ９活性と関連する結果、症候、および／または病変を治療するのに有用である。
幾つかの実施形態では、提供される抗原結合タンパク質は、１つ以上のＣＤＲ（例えば、１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ）を含む。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）ポリペプチド構造および（ｂ）ポリペプチド構造に挿入および／または連結された１つ以上のＣＤＲを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形態をとることができる。例えば、それは、天然に存在する抗体のフレームワーク、またはその断片もしくは変異体であり得るか、もしくはそれらを含むことができ、または完全に合成の性質であり得る。様々なポリペプチド構造の例は、以下にさらに記載される。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、抗体であるか、またはモノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では、「抗体模倣体」と称される場合がある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（本明細書では、「抗体複合体」と称される場合がある）、およびそれぞれ、それらの一部もしくは断片を含むが、これらに限定されない抗体に由来する。場合によっては、抗原結合タンパク質は、抗体の免疫学的断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、またはｓｃＦｖ）である。これらの様々な構造は、本明細書にさらに記載され、定義される。
本明細書に提供される抗原結合タンパク質の幾つかは、ヒトＰＣＳＫ９に特異的におよび／または選択的に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号３の残基１５３〜６９２を有するおよび／またはそれからなるヒトＰＣＳＫ９に特異的におよび／または選択的に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、配列番号３の残基３１〜１５２を有するおよび／またはそれからなるヒトＰＣＳＫ９に特異的におよび／または選択的に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、図１Ａに示されているヒトＰＣＳＫ９タンパク質（配列番号１）に選択的に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、シグナル配列ありもしくはなしで、ＰＣＳＫ９タンパク質の少なくとも断片および／または完全長ＰＣＳＫ９タンパク質に特異的に結合する。
抗原結合タンパク質が治療用途のために使用される実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９の１つ以上の生物学的活性を阻害し、妨害し、または調節することができる。一実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトＰＣＳＫ９に特異的に結合し、および／または（例えば、インビトロ競合結合アッセイにおいて結合を測定することによって）少なくとも約２０％〜４０％、４０〜６０％、６０〜８０％、８０〜８５％、またはそれ以上、ＬＤＬＲへのヒトＰＣＳＫ９の結合を実質的に阻害する。本明細書に提供される抗原結合タンパク質の幾つかは、抗体である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３Ｍよりも小さいＫｄを有する（より強固に結合する）。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ、高親和性変異体）へのＬＤＬＲの結合を遮断するために、１ミクロＭ未満、１０００ｎＭ〜１００ｎＭ、１００ｎＭ〜１０ｎＭ、１０ｎＭ〜１ｎＭ、１０００ｐＭ〜５００ｐＭ、５００ｐＭ〜２００ｐＭ、２００ｐＭ未満、２００ｐＭ〜１５０ｐＭ、２００ｐＭ〜１００ｐＭ、１００ｐＭ〜１０ｐＭ、１０ｐＭ〜１ｐＭのＩＣ５０を有する。
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体のＩｇＧ２重鎖定常ドメインの一例は、図３ＫＫの配列番号１５４に示されるアミノ酸配列を有する。
本発明の抗ＰＣＳＫ９抗体のＩｇＧ４重鎖定常ドメインの一例は、図３ＫＫの配列番号１５５に示されるアミノ酸配列を有する。
抗ＰＣＳＫ９抗体のカッパ軽鎖定常ドメインの一例は、図３ＫＫの配列番号１５７に示されるアミノ酸配列を有する。
抗ＰＣＳＫ９抗体のラムダ軽鎖定常ドメインの一例は、図３ＫＫの配列番号１５６に示されるアミノ酸配列を有する。
免疫グロブリン鎖の可変領域は、一般に同じ全体的な構造を示し、より頻繁には「相補性決定領域」またはＣＤＲと称される３つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。上述のそれぞれの重鎖／軽鎖の対の２つの鎖からのＣＤＲは、典型的には、フレームワーク領域によって整列されて、標的タンパク質上の特異的エピトープ（例えばＰＣＳＫ９）と特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端に、天然に存在する軽および重鎖可変領域は両方とも、これらの要素、すなわちＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の順序に従う。これらのドメインのそれぞれ中の位置を占めるアミノ酸に数字を割り当てるために、付番方式がが考案されている。この付番方式は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７ ａｎｄ １９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３において定義されている。
様々な重鎖および軽鎖可変領域が本明細書に提供され、図２Ａ〜３ＪＪおよび３ＬＬ〜３ＢＢＢに示される。幾つかの実施形態では、これらの可変領域のそれぞれは、上記の重および軽鎖定常領域に付着させ、それぞれ、完全な抗体重鎖および軽鎖を形成することができる。さらに、このようにして作製された重および軽鎖配列のそれぞれは、完全な抗体構造を形成するために組み合わせることができる。
提供される抗体の軽および重鎖の可変領域の幾つかの具体例およびそれらの対応するアミノ酸配列を、表２中に要約する。
Figure 0006166717
ここでも、表２中に列記される例となる可変重鎖のそれぞれは、抗体を形成するために、表２中に示される例となる可変軽鎖のうちのいずれかと組み合わせることができる。表２は、本明細書に開示される抗体の幾つかの中に見出される軽および重鎖の対を示す。場合によっては、抗体は、表２中に列記されるものからの少なくとも１つの可変重鎖および１つの可変軽鎖を含む。他の例では、抗体は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖を含有する。一例として、抗体または抗原結合タンパク質は、１つの重鎖および１つの軽鎖、２つの重鎖、または２つの軽鎖を含むことができる。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、表２中に列記される配列の少なくとも１つからの１つ、２つ、および／または３つの重および／または軽ＣＤＲ（この配列に対するＣＤＲは、図２Ａ〜３Ｄ中に、ならびに図３ＣＣＣ〜３ＪＪＪおよび１５Ａ〜１５Ｄ中の他の実施形態に概説されている）を含む（および／またはそれからなる）。幾つかの実施形態では、すべて６つのＣＤＲ（軽（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）からのＣＤＲ１〜３および重（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３）からのＣＤＲ１〜３）がＡＢＰの一部である。幾つかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のＣＤＲは、ＡＢＰ中に含まれる。幾つかの実施形態では、表２中の配列中のＣＤＲからの１つの重および１つの軽ＣＤＲは、ＡＢＰ中に含まれる（表２中の配列に対するＣＤＲは、図２Ａ〜３Ｄ中に概説される）。幾つかの実施形態では、さらなる区画（例えば、図２Ａ〜２Ｄ、３Ａ〜３Ｄ中、ならびに３ＣＣＣ〜３ＪＪＪおよび１５Ａ〜１５Ｄ中の他の実施形態に示される）も、ＡＢＰ中に含まれる。表２中に記載される重および軽鎖に対するＣＤＲおよびＦＲの例は、図２Ａ〜３Ｄ中（ならびに図３ＣＣＣ〜３ＪＪＪおよび１５Ａ〜１５Ｄ中の他の実施形態）に概説される。任意の軽鎖可変配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含む）は、５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、４６、４２１、４２５、４２９、４３３、４３７、４４１、４４５、４４９、４５３、４５７、４６１、４６５、４６９、４７３、４７７、４８１、および４８５から選択され得る。任意の重鎖可変配列（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４を含む）は、７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１、６０、４１９、４２３、４２７、４３１、４３５、４３９、４４３、４４７、４５１、４５５、４５９、４６３、４６７、４７１、４７５、４７９、および４８３から選択され得る。図２Ａ〜３Ｄ中の項目の幾つかでは、配列の変形またはＣＤＲおよびＦＲの代替の境界が特定される。これらの代替物は、ＡＢＰ名の後の「ｖ１」によって特定される。これらの代替物のほとんどが自然界では稀であるため、相違を有する区画のみが表中に示される。軽または重鎖の残りの区画は、他のパネル中の基本ＡＢＰに対して示されるものと同じであることが理解される。したがって、相違のみが図２Ｃ中に記載されるため、例えば、図２Ｃ中の１９Ｈ９ｖ１は、図２Ａ中の１９Ｈ９と同じＦＲ１、ＣＤＲ１、およびＦＲ２を有する。核酸配列の３つ（ＡＢＰ２６Ｅ１０、３０Ｂ９、および３１Ｂ１２）に関しては、さらなる別の核酸配列が図中に提供される。当業者によって理解されるように、抗体またはＡＢＰの作製において、実際には、１つのこのような配列を使用する必要がある。実際に、幾つかの実施形態では、特異的な重または軽鎖核酸の１つのみが存在する必要があるか、またはそれらのいずれも存在する必要がない。
幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、表２中のタンパク質配列のいずれかをコードすることができる核酸配列によってコードされる。
幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＬＤＬＲに結合するＰＣＳＫ９の形態（例えば、分子の自己触媒された形態）に選択的に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのｃ末端（例えば、ｃ末端中の５．５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜４０の多くのアミノ酸）に結合しない。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのｎ末端（例えば、ｎ末端中の５．５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜４０の多くのアミノ酸）に結合しない。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９の成熟形態のアミノ酸１〜１００内のアミノ酸に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、アミノ酸３１〜１００、１００〜２００、３１〜１５２、１５３〜６９２、２００〜３００、３００〜４００、４５２〜６８３、４００〜５００、５００〜６００、３１〜６９２、３１〜４４９、および／または６００〜６９２内のアミノ酸（および／またはそれらからなるアミノ酸配列）に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態では、中和および／または非中和ＡＢＰは、プロドメインに結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、触媒およびプロドメインの両方に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、プロドメインと相互作用する触媒ドメイン上の領域を塞ぐように、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｐｉｐｅｒら（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５：１〜８（２００７）、その中の立体表示を含めて、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に概説されるように、プロドメインが相互作用する位置または表面で触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、触媒ドメインに結合し、プロドメインの移動性を制限する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、プロドメインに結合することなく、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９をＬＤＬＲに結合させるようにプロドメインが再配向するのを妨げながら、プロドメインに結合することなく、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｐｉｐｅｒら中のプロドメインの周囲の残基１４９〜１５２と同じエピトープ中に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｖドメイン上の（Ｐｉｐｅｒら中に概説されるような）溝に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｖドメイン上の溝に近いヒスチジンに富むパッチに結合する。幾つかの実施形態では、（Ｖドメインに結合する）このような抗体は、中和でない。幾つかの実施形態では、Ｖドメインに結合する抗体は、中和である。幾つかの実施形態では、中和ＡＢＰは、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を妨げる。幾つかの実施形態では、ＬＤＬＲのＰＣＳＫ９分解を妨げながら、中和ＡＢＰは、ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を妨げない（例えばＡＢＰ３１Ａ４）。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、Ｐｉｐｅｒらの論文の図４に示されるヒスチジンの少なくとも１つに結合するか、または遮断する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＣＳＫ９中の触媒三連構造を遮断する。
幾つかの実施形態では、抗体は、野生型ＰＣＳＫ９を上回って、変異体ＰＣＳＫ９タンパク質、例えば、Ｄ３７４Ｙに選択的に結合する。幾つかの実施形態では、これらの抗体は、（Ｋｄによって測定して）野生型よりも少なくとも２倍強く変異体に結合し、好ましくは、野生型よりも２〜５、５〜１０、１０〜１００、１００〜１０００、１０００〜１０，０００倍またはそれ以上、変異体に強く結合する。幾つかの実施形態では、抗体は、ＬＤＬＲと相互作用する野生型ＰＣＳＫ９の能力を上回って、変異体Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用することを選択的に阻害する。幾つかの実施形態では、これらの抗体は、（ＩＣ５０によって測定して）野生型の能力よりも強く、例えば、野生型よりも少なくとも２倍強く、好ましくは、野生型よりも２〜５、５〜１０、１０〜１００、１００〜１０００倍またはそれ以上、変異体に強く、ＬＤＬＲに結合する変異体の能力を遮断する。幾つかの実施形態では、抗体は、野生型ＰＣＳＫ９およびＤ３７４Ｙ等のＰＣＳＫ９の変異体の形態の両方に同様のレベルで結合し、中和する。幾つかの実施形態では、抗体は、ＰＣＳＫ９に結合して、ＬＤＬＲの変異体がＰＣＳＫ９に結合するのを妨げる。幾つかの実施形態では、ＬＤＬＲの変異体は、ヒトＬＤＬＲと少なくとも５０％同一である。ＬＤＬＲの変異体は、当業者に公知であることを留意する（例えば、Ｂｒｏｗｎ ＭＳ ｅｔ ａｌ，“Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｇｅｓ，ａｃｉｄ ｂａｔｈｓ ａｎｄ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ” Ｎａｔｕｒｅ ３８８：６２９−６３０，１９９７）。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ヘテロ接合型家族性高コレステロール血症（ＬＤＬＲの機能喪失変異体が存在する）中の有効なＬＤＬＲのレベルを上昇させることができる。
幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、図１Ａおよび／または図１Ｂに示されるＰＣＳＫ９の形態に対して少なくとも５０％、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９５、９５〜９９、またはそれ以上の％同一性であるＰＣＳＫ９の変異体に結合する（が、遮断しない）。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、図１Ａおよび／または図１Ｂに示されるＰＣＳＫ９の成熟形態に対して少なくとも５０％、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９５、９５〜９９、またはそれ以上の同一性パーセントであるＰＣＳＫ９の変異体に結合する（が、遮断しない）。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、図１Ａおよび／または図１Ｂに示されるＰＣＳＫ９の形態に対して少なくとも５０％、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９５、９５〜９９、またはそれ以上の同一性パーセントであるＰＣＳＫ９の変異体に結合し、ＬＤＬＲと相互作用するのを妨げる。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、図１Ｂに示されるＰＣＳＫ９の成熟形態に対して少なくとも５０％、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜９５、９５〜９９、またはそれ以上の同一性パーセントであるＰＣＳＫ９の変異体に結合し、ＬＤＬＲと相互作用するのを妨げる。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９の変異体は、４７４位における変異体、Ｅ６２０Ｇ、および／またはＥ６７０Ｇ等のヒト変異体である。幾つかの実施形態では、４７４位のアミノ酸は、バリン（他のヒトの場合）またはスレオニン（カニクイザルおよびマウスの場合）である。本明細書に示される交叉反応性データに鑑みれば、本抗体は、上記の変異体に容易に結合するものと考えられる。
幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、表２中に記載される抗体のうちの１つによって結合されるエピトープに結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲと相互作用するのを妨げるために、ＰＣＳＫ９の特異的な立体構造状態に結合する。
ヒト化抗原結合タンパク質（例えば、抗体）
本明細書に記載されるように、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、ヒト化抗体および／またはその一部を含むことができる。このような戦略の重要な実用的用途は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。
ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、実質的には、ヒトにおいて非免疫原性である。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、実質的には、ヒト化抗体がそこから誘導される別の種からの抗体と、標的に対して同じ親和性を有する。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，５８５，０８９号を参照のこと。
ある特定の実施形態では、その免疫原性を減少させながら、抗原結合ドメインの固有親和性を減弱させずに修飾可能な抗体可変ドメインのアミノ酸が特定される。例えば、米国特許第５，７６６，８８６号および第５，８６９，６１９号を参照のこと。
ある特定の実施形態では、当技術分野で周知の方法による抗体の修飾は、標的に対する増加された結合親和性を達成するように、および／または受容者中での抗体の免疫原性を減少させるように典型的に設計される。ある特定の実施形態では、その同属抗原に対する抗体の親和性を増加させるために、グリコシル化部位を除去するように、ヒト化抗体が修飾される。例えば、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３０：１３６１−１３６７（１９９３）を参照のこと。ある特定の実施形態では、「再形成（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）」、「超キメラ化」、または「ベニアリング／リサーフェシング」等の技術は、ヒト化抗体を作製するために使用される。例えば、Ｖａｓｗａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ，＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８１：１０５（１９９８）、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒ．，９：８９５−９０４（１９９６）、および米国特許第６，０７２，０３５号を参照のこと。ある特定のこのような実施形態では、このような技術は、外来残基の数を減少させることによって、抗体の免疫原性を典型的には減少させるが、抗体の複数回投与後における抗イディオタイプ応答および抗アロタイプ応答を妨げない。免疫原性を減少させるためのある特定の他の方法が、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６２（６）：３６６３−７１（１９９９）に記載されている。
ある特定の事例では、ヒト化抗体は、抗原結合能の低下をもたらす。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、「逆変異」される。ある特定のこのような実施形態では、ヒト化抗体は、ドナー抗体中に見出されるアミノ酸残基の１つ以上を含むように変異される。例えば、Ｓａｌｄａｎｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３６：７０９−１９（１９９９）を参照のこと。
ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗体の軽および重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、同じ、または別の種からのフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗体の軽および重鎖可変領域のＣＤＲは、コンセンサスヒトＦＲに移植することができる。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、ある特定の実施形態では、コンセンサスアミノ酸配列を特定するために、幾つかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列からのＦＲが、アラインメントされる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９重鎖または軽鎖に対する抗体のＦＲは、異なる重鎖または軽鎖からのＦＲと置換される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗体の重および軽鎖のＦＲ中の稀なアミノ酸は置換されないが、ＦＲアミノ酸の残りは置換される。稀なアミノ酸は、ＦＲ中に通常見出されない位置に存在する特定のアミノ酸である。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗体から移植された可変領域は、ＰＣＳＫ９に対する抗体の定常領域とは異なる定常領域とともに使用することができる。ある特定の実施形態では、移植された可変領域は、一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲ移植は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第６，０５４，２９７号、第５，６９３，７６２号、第５，８５９，２０５号、第５，６９３，７６１号、第５，５６５，３３２号、第５，５８５，０８９号、および第５，５３０，１０１号、ならびにＪｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８），Ｗｉｎｔｅｒ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．，４３０：９２−９４（１９９８）において記載されており、これらは、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
ヒト抗原結合タンパク質（例えば、抗体）
本明細書に記載されるように、ＰＣＳＫ９に結合する抗原結合タンパク質は、ヒト（すなわち、完全ヒト）抗体および／またはその一部を含むことができる。ある特定の実施形態では、重および軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、ならびに重および軽鎖免疫グロブリン分子を含むアミノ酸配列、特に、可変領域に対応する配列が提供される。ある特定の実施形態では、相補性決定領域（ＣＤＲ）、特に、ＣＤＲ１からＣＤＲ３に対応する配列が提供される。ある特定の実施形態によれば、このような免疫グロブリン分子を発現するハイブリドーマ細胞株が提供される。ある特定の実施形態によれば、このようなモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞株が提供される。ある特定の実施形態では、ハイブリドーマ細胞株は、表２中に記載される細胞株のうちの少なくとも１つ、例えば、２１Ｂ１２、１６Ｆ１２、および３１Ｈ４から選択される。ある特定の実施形態では、ヒトＰＣＳＫ９に対する精製されたヒトモノクローナル抗体が提供される。
ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を用いて、マウス抗体の生成が欠損するマウス株を、マウス抗体の不存在下でそのようなマウスがヒト抗体を生成することを予想して改変することができる。大きなヒトＩｇ断片は、大きな可変遺伝子多様性ならびに抗体の生成および発現の適切な調節を保存することができる。抗体の多様化および選択ならびにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容性の欠如のためのマウスの機構を活用することによって、これらのマウス系統中のヒト抗体レパートリー再生は、ヒト抗原を含む対象となる任意の抗原に対して、高親和性完全ヒト抗体を与えることができる。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを作製し、選択することができる。ある特定の例となる方法は、第ＷＯ９８／２４８９３号、米国特許第５，５４５，８０７号、欧州特許第５４６０７３号、および欧州特許第５４６０７３号に記載されている。
ある特定の実施形態では、ヒト化可変領域（複数可）とともに、ヒト以外の種から定常領域を使用することができる。
酵母人工染色体（ＹＡＣ）中でメガ塩基サイズのヒト遺伝子座をクローニングおよび再構築する能力、ならびにマウス生殖細胞系列中にそれらを導入する能力によって、極めて大きなまたは大まかにマッピングされた遺伝子座の機能的成分を解明し、およびヒト疾病の有用なモデルを作製するためのアプローチが与えられる。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト均等物で置換するためのこのような技術の使用によって、発達中のヒト遺伝子産物の発現および調節、他の系とのそれらのやり取りならびに疾病の誘導および進行におけるそれらの関与に対する洞察が与えられ得る。
ヒト抗体は、マウスまたはラットの可変および／または定常領域を有する抗体に伴う問題の幾つかを回避する。このようなマウスまたはラット由来のタンパク質の存在は、抗体の迅速な排除をもたらし得、または患者による抗体に対する免疫応答の生成をもたらし得る。マウスまたはラットに由来する抗体の使用を回避するために、げっ歯類、他の哺乳動物、または動物が完全ヒト抗体を生成するように、げっ歯類、他の哺乳動物、または動物中に機能的なヒト抗体遺伝子座の導入を通じて、完全ヒト抗体が作製され得る。
ヒト化抗体は、まずヒトでない抗体アミノ酸配列を含有することから開始しながら、ヒト抗体配列で置換されたこれらの非ヒト抗体アミノ酸配列の少なくとも幾つかを有する抗体である。これは、ヒトを有する遺伝子によって抗体がコードされる（またはコードされることができる）ヒト抗体とは対照的である。
抗原結合タンパク質の変異体
提供される他の抗体は、表２中に示されている可変重鎖および可変軽鎖の組み合わせまたはサブパートによって形成され、表２中の配列（配列全体または配列のサブパート（例えば、１つ以上のＣＤＲ））のアミノ酸配列に対して、それぞれ、少なくとも５０％、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％、９７〜９９％、または９９％超の同一性を有する可変軽鎖および／または可変重鎖を含む上記に掲載されたＡＢＰ変異体である。場合によっては、このような抗体は、少なくとも１つの重鎖および１つの軽鎖を含むが、他の例では、その変異型は、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖（またはそのサブパート）を含有する。幾つかの実施形態では、結合に影響を及ぼす変動および結合に影響を及ぼさないと思われる変動を観察することによって修飾することが可能な抗体の区画を特定するために、図２Ａ〜３Ｄ中（ならびに１３Ａ〜１３Ｊおよび他の実施形態では１５Ａ〜１５Ｄおよび図４８Ａおよび４８Ｂ中）の配列比較を使用することができる。例えば、類似の配列を比較することによって、修飾可能な区画（例えば、特定のアミノ酸）を特定し、ＡＢＰの機能性をなお保持しながら（または改善しながら）、それらをどのようにして修飾することができるかを特定することができる。幾つかの実施形態では、ＡＢＰの変異体は、図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｆ、１３Ｇ、１３Ｈ、１３Ｉ、１３Ｊ、ならびに／または４８Ａおよび４８Ｂに図示されているコンセンサス基および配列を含み、変動は、図中に可変として特定される位置において可能である。図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｆ、１３Ｇ、４８Ａ、および４８Ｂに示されているＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ法（構造ループ領域の位置に基づく、例えば、“Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，” Ｂｉｓｓａｎ Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ａｒｔｈｕｒ Ｍ．Ｌｅｓｋ ａｎｄ Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３（４）：９２７−９４８，７ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ（１９９７）を参照）とＫａｂａｔ法（配列変動性に基づく、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ． ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２，Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）を参照）のハイブリッド組み合わせに基づいて定義された。いずれかの方法によって決定されたそれぞれの残基は、ＣＤＲ残基の最終リスト中に含められた（そして、図１３Ａ、１３Ｃ、１３Ｆ、１３Ｇ、４８Ａ、および４８Ｂに示されている）。図１３Ｈ、１３Ｉ、および１３Ｊ中のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ法のみによって得られた。特に特定されない限り、図１３Ｈ〜１３Ｊ中の定義されたコンセンサス配列、ＣＤＲ、およびＦＲは、図１３中において参照されているＡＢＰに対する表記ＣＤＲおよびＦＲを定義し、制御する。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１、および６０のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１、および６０のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１、および６０のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む重鎖を含む。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１、および６０の配列のうちの少なくとも１つのＣＤＲからの１つ以上のＣＤＲに対して少なくとも９０％、９０〜９５％、および／または９５〜９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（それぞれが、上記の配列に対して少なくとも９０％、９０〜９５％、および／または９５〜９９％同一である）が存在する。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号７４、８５、７１、７２、６７、８７、５８、５２、５１、５３、４８、５４、５５、５６、４９、５７、５０、９１、６４、６２、８９、６５、７９、８０、７６、７７、７８、８３、６９、８１、および６０の配列のうちの少なくとも１つのＦＲからの１つ以上のＦＲに対して少なくとも９０％、９０〜９５％、および／または９５〜９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、または４つのＦＲ（それぞれが、上記の配列に対して少なくとも９０％、９０〜９５％、および／または９５〜９９％同一である）が存在する。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、および４６の配列のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、および４６のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。ある特定の実施形態では、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、および４６の配列のうちの少なくとも１つから選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む可変領域を含む軽鎖を含む。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、および４６の配列のうちの少なくとも１つのＣＤＲからの１つ以上のＣＤＲに対して少なくとも９０％、９０〜９５％、および／または９５〜９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ（それぞれが、上記の配列に対して少なくとも９０％、９０〜９５％、および／または９５〜９９％同一である）が存在する。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号５、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３０、３１、３２、３３、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４２、４４、および４６の配列のうちの少なくとも１つのＦＲからの１つ以上のＦＲに対して少なくとも９０％、９０〜９５％、および／または９５〜９９％同一である配列を含む。幾つかの実施形態では、１つ、２つ、３つ、または４つのＦＲ（それぞれが、上記の配列に対して少なくとも９０％、９０〜９５％、および／または９５〜９９％同一である）が存在する。
本開示に照らして、当業者は、公知の技術を用いて、本明細書中に記載されるように、ＡＢＰの適切な変異体を決定することができる。ある特定の実施形態では、当業者は、活性に重要ではないと考えられる領域を標的とすることにより、活性を破壊することなく変化させ得る分子の適切な領域を特定することができる。ある特定の実施形態では、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を特定することができる。ある特定の実施形態では、生物学的活性にとって、または構造にとって重要であり得る領域でさえも、生物学的活性を破壊することなく、あるいは、ポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。
さらに、当業者は、活性または構造にとって重要である類似のポリペプチドにおける残基を特定する構造−機能研究を検討することができる。このような比較を考慮して、類似のタンパク質における活性または構造にとって重要なアミノ酸残基に対応するタンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似のアミノ酸の置換を選択することができる。
当業者はまた、類似のＡＢＰにおける構造との関連で三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。このような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。ある特定の実施形態では、タンパク質の表面上にあると予想されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関連し得るので、当業者は、このような残基に対して急激な変化を生じさせることがないように選択することができる。さらに、当業者は、それぞれの所望のアミノ酸残基に単一のアミノ酸置換を含有する試験変異体を作製することができる。次いで、変異体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングすることができる。このような変異体は、適切な変異体についての情報を収集するために使用することができる。例えば、特定のアミノ酸残基への変化が、破壊された、望ましくないように低下された活性、または不適切な活性をもたらすことを発見した場合には、このような変化を有する変異体は避けることができる。換言すれば、このような日常の実験から収集された情報に基づいて、当業者は、単独で、または他の突然変異と組み合わせて、さらなる置換を避けるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
多くの科学刊行物が、二次構造の予測に充てられている。Ｍｏｕｌｔ Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）、Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６、およびＣｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）を参照のこと。さらに、二次構造の予測を補助するために、現在、コンピュータプログラムが利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づいている。例えば、３０％超の配列同一性、または４０％超の類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、類似の構造トポロジーを有することが多い。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発展は、ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の可能な折り畳み数を含む二次構造の増大した予測可能性をもたらした。Ｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照のこと。所与のポリペプチドまたはタンパク質における折り畳み数には制限があり、一旦、構造の限界数が決まれば、構造的な予測は、劇的により正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（３）：３６９−３７６（１９９７））。
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）、Ｓｉｐｐｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、および「進化的連結（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，上記参照（１９９９）、およびＢｒｅｎｎｅｒ，上記参照（１９９７）を参照）が含まれる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質変異体には、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、グリコシル化部位の数および／または種類が変化しているグリコシル化変異体が含まれる。ある特定の実施形態では、タンパク質変異体は、天然タンパク質より多数または少数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、Ｘと表記されているアミノ酸残基は、プロリンを除くあらゆるアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型炭水化物鎖の付加のための潜在的な新しい部位を提供する。あるいは、この配列を除去する置換は、既存のＮ結合型炭水化物鎖を除去する。１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するもの）が除去され、１つ以上の新しいＮ結合型部位が作製されるＮ結合型炭水化物鎖の再構成も提供される。さらなる好ましい抗体変異体には、親アミノ酸配列と比較して、１つ以上のシステイン残基が欠失されているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン変異体が含まれる。不溶性封入体の単離後等、抗体が生物学的に活性な立体構造へ再折り畳みされなければならない場合には、システイン変異体は有用であり得る。システイン変異体は、天然タンパク質より少ないシステイン残基を一般に有し、典型的には、対を形成していないシステインから生じる相互作用を最小限に抑えるために、偶数を有する。
ある特定の実施形態によれば、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を減少させる、（２）酸化に対する感受性を減少させる、（３）タンパク質複合体の形成に関する結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および／または（４）このようなポリペプチドに関する他の物理化学的または機能的特性を付与もしくは修飾するものである。ある特定の実施形態によれば、単一または複数のアミノ酸置換（ある特定の実施形態では、保存的なアミノ酸置換）が、天然に存在する配列中に（ある特定の実施形態では、分子間接触を形成するドメイン（複数可）外のポリペプチドの部分中に）作製され得る。ある特定の実施形態では、保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を典型的には実質的に変化させ得ない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に生じるヘリックスを切断する傾向がないはずであり、または親配列を特徴付ける二次構造の他の種類を乱す傾向がないはずである）。当技術分野で認められるポリペプチド二次および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４））、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ ＆ Ｊ．Ｔｏｏｚｅ，ｅｄｓ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１））、およびＴｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：１０５（１９９１）中に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態では、変異体は、本明細書に開示されるＡＢＰの核酸配列の変異体である。当業者は、ＡＢＰタンパク質変異体を特定し、評価し、および／作製するために、また、これらのタンパク質変異体をコードし得る核酸配列に対して、上記考察を使用することができることを理解されよう。したがって、これらのタンパク質変異体をコードする核酸配列（ならびに表２中のＡＢＰをコードするが、本明細書に明示的に開示されるものとは異なる核酸配列）が企図される。例えば、ＡＢＰ変異体は、配列番号１５２、１５３、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１に記載される少なくとも１つの核酸配列、または配列番号１５２、１５３、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、および１５１中の核酸配列によってコードされるＣＤＲ（複数可）のうちの少なくとも１つ〜６つ（およびその様々な組み合わせ）に対して少なくとも８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜９７、９７〜９９、もしくはそれ以上の同一性を有することができる。
幾つかの実施形態では、ストリンジェントな条件下で、特定のＡＢＰをコードする核酸配列（または核酸配列そのもの）が表２中のタンパク質をコードする核酸配列のいずれか（例えば、配列番号１５２、１５３、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、および１５１等であるが、これらに限定されない）に選択的にハイブリダイズすることができるのであれば、抗体（または抗体をコードする核酸配列）は変異体である。一実施形態では、適切な中度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ；０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８：０）の溶液中での事前洗浄、５０℃、−６５℃、５×ＳＳＣ、一晩でのハイブリダイズ、または種間相同性の場合には、０．５×ＳＳＣでの４５℃のハイブリダイズ、次いで、０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いて、２０分間、６５℃で２回の洗浄を含む。このようなハイブリダイズするＤＮＡ配列も、コード縮重のために、ハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされる抗体ポリペプチドおよびこれらの核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と同様に、本発明の範囲に属する。幾つかの実施形態では、ＣＤＲの変異体は、上述の配列内のＣＤＲの１つ以上（図２Ａ〜３Ｄ、ならびに図３ＣＣＣ〜３ＪＪＪおよび１５Ａ〜１５Ｄ中の他の実施形態を考慮すると、個々のＣＤＲは、容易に決定することができる）にハイブリダイズする核酸配列およびこれらの配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。この文脈において参照される「選択的にハイブリダイズする」という用語は、検出可能におよび選択的に結合することを意味する。本発明によるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびその断片は、非特異的な核酸に対する検出可能な結合の認識量を最小限に抑えるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件は、当技術分野で公知であり、そして本明細書に論述される選択的ハイブリダイゼーション条件を達成するために使用することができる。一般に、本発明のポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、および断片と対象となる核酸配列との間の核酸配列の相同性は、少なくとも８０％であり、より典型的には少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％の相同性の増加が好ましい。それらの配列間に部分的または完全な同一性が存在する場合、２つのアミノ酸配列は相同である。例えば、８５％の相同性とは、２つの配列が最大に合致するようにアラインメントされた場合にアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。合致を最大化する上で（合致されている２つの配列のいずれかの中に）ギャップが許容され、５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。あるいはおよび好ましくは、この用語が本明細書で使用される場合には、変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティーを使用してＡＬＩＧＮプログラムを用いて、（標準偏差の単位で）５より多くのアラインメントスコアを有すれば、２つのタンパク質配列（または少なくとも３０アミノ酸長の、それらに由来するポリペプチド配列）は相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｉｎ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｐｐ．１０１−１１０（Ｖｏｌｕｍｅ ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（１９７２））およびこの巻の補遺２、ｐｐ．１−１０を参照のこと。２つの配列またはその一部は、より好ましくは、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適にアラインメントされる場合に、それらのアミノ酸が５０％以上同一であれば、相同である。「と対応する」という用語は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部と相同である（すなわち、同一であり、厳格に進化的に関連していない）、またはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味するために使用される。対照的に、「に対して相補的である」という用語は、本明細書において、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相同であることを意味するために使用される。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の調製
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質（抗体等）は、抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）を用いた免疫化によって生成される。ある特定の実施形態では、抗体は、完全長ＰＣＳＫ９、ＰＣＳＫ９の可溶性形態、触媒ドメインのみ、図１Ａ中に示されているＰＣＳＫ９の成熟形態、ＰＣＳＫ９のスプライス変異形態、またはこれらの断片を用いた免疫化によって作製することができる。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルであり得、および／または組換え抗体であり得る。ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、例えば、ヒト抗体を生成することができるトランスジェニック動物の免疫化によって調製されたヒト抗体である（例えば、ＰＣＴ公開出願第Ｗ０９３／１２２２７号を参照）。
ある特定の実施形態では、ある特定の戦略を、その標的に対する抗体の親和性等の抗体の本来の特性を操作するために使用することができる。そのような戦略には、抗体変異体を生成するために抗体をコードするポリヌクレオチド分子の部位特異的またはランダム変異導入法の使用が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、このような生成の後には、所望の変化、例えば親和性の増加または減少を示す抗体変異体のためのスクリーニングを行う。
ある特定の実施形態では、突然変異導入の戦略中で標的とされるアミノ酸残基は、ＣＤＲ中のものである。ある特定の実施形態では、可変ドメインのフレームワーク領域中のアミノ酸が標的とされる。ある特定の実施形態では、このようなフレームワーク領域は、ある特定の抗体の標的結合特性に寄与することが示されている。例えば、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，９：３９５−４０２（１９９９）およびその中の参考文献を参照のこと。
ある特定の実施形態では、抗体変異体のより小さく、より効果的にスクリーニングされるライブラリーは、無作為のまたは部位特異的突然変異誘発を体細胞親和性成熟プロセス中に突然変異しやすい領域に対応する部位であるＣＤＲ中の高頻度変異部位に制限することによって作製される。例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＆ Ｐａｓｔａｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：５６８−５７２（１９９９）およびその中の参考文献を参照のこと。ある特定の実施形態では、ある種類のＤＮＡ要素が、ある特定の直接および反転反復、ある特定のコンセンサス配列、ある特定の二次構造、およびある特定のパリンドロームが含まれるが、これらに限定されない、高頻度変異部位を特定するために使用することができる。例えば、高頻度変異部位を特定するために使用することができるこのようなＤＮＡ要素には、プリン（ＡまたはＧ）、続いて、グアニン（Ｇ）、続いて、ピリミジン（ＣまたはＴ）、続いて、アデノシンまたはチミジン（ＡまたはＴ）のいずれかを含む四塩基配列（すなわち、Ａ／Ｇ−Ｇ−Ｃ／Ｔ−Ａ／Ｔ）が含まれるが、これらに限定されない。高頻度変異部位を特定するために使用することができるＤＮＡ要素の別の例は、セリンコドン、Ａ−Ｇ−Ｃ／Ｔである。
完全ヒトＡＢＰ（例えば、抗体）の調製
ある特定の実施形態では、ファージディスプレイ技術が、モノクローナル抗体を作製するために使用される。ある特定の実施形態では、このような技術は、完全ヒトモノクローナル抗体を生成する。ある特定の実施形態では、単一のＦａｂまたはＦｖ抗体断片をコードするポリヌクレオチドが、ファージ粒子の表面上に発現される。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：５８１（１９９１）、米国特許第５，８８５，７９３号を参照のこと。ある特定の実施形態では、標的に対する親和性を有する抗体断片を特定するために、ファージが「スクリーニング」される。したがって、ある特定のそのようなプロセスは、糸状バクテリオファージの表面上への抗体断片レパートリーのディスプレイおよび標的へのそれらの結合によってファージのその後の選択を通じて免疫選択を模倣する。ある特定のそのような手法では、高親和性機能的中和抗体断片が単離される。（以下により詳しく論述されている）ある特定のそのような実施形態において、ヒト抗体遺伝子の完全なレパートリーは、末梢血リンパ球から天然に再配置されたヒトＶ遺伝子をクローニングすることによって作製される。例えば、Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ（ＵＳＡ），８７：８０９５−８０９９（１９９０）を参照のこと。
ある特定の実施形態によれば、本発明の抗体は、挿入されたヒト抗体生成ゲノムのかなりの部分を有するが、内在性マウス抗体の生成が欠失しているトランスジェニックマウスの使用を通じて調製される。そこでは、そのようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を生成することができ、マウス免疫グロブリン分子および抗体の生成を欠失している。この結果を達成するために使用される技術は、本明細書中に開示されている特許、出願、および参考文献中に開示されている。ある特定の実施形態では、ＰＣＴ公開出願第ＷＯ９８／２４８９３号またはＭｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）に開示されるもの等の方法を使用することができ、これらは、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる。
一般に、ＰＣＳＫ９に対して特異的な完全ヒトモノクローナルＡＢＰ（例えば、抗体）は、以下の通りに生成することができる。ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するトランスジェニックマウスが、対象となる抗原、例えば、ＰＣＳＫ９で免疫化され、抗体を発現するマウスからのリンパ細胞（Ｂ細胞等）が得られる。そのような回収された細胞は、不死化ハイブリドーマ細胞株を調製するために、骨髄型細胞株と融合され、対象となる抗原に対して特異的な抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を特定するために、このようなハイブリドーマ細胞株が、スクリーニングされ、選択される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対して特異的な抗体を生成するハイブリドーマ細胞株の生成が提供される。
ある特定の実施形態では、完全ヒト抗体は、ヒト脾細胞（ＢまたはＴ細胞）をインビトロで抗原に曝露させ、次いで、免疫不全化されたマウス、例えば、ＳＣＩＤまたはｎｏｄ／ＳＣＩＤ中で曝露された細胞を再構成させることによって生成される。例えば、Ｂｒａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２０５１−２０５８（１９９８）、Ｃａｒｂａｌｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６：１０３−１０６（２０００）を参照のこと。ある特定のそのようなアプローチにおいて、ＳＣＩＤマウス（ＳＣＩＤ−ｈｕ）中へのヒト胎児組織の移植は、長期造血およびヒトＴ細胞の成長をもたらす。例えば、ＭｃＣｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１５３２−１６３９（１９８８）、Ｉｆｖｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８：２４３−２４８（１９９６）を参照のこと。ある特定の事例では、そのようなキメラマウス中での液性免疫応答は、動物内でのヒトＴ細胞の同時成長に依存する。例えば、Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８３：１２７１−１７９（１９９４）を参照のこと。ある特定のアプローチにおいて、ヒト末梢血液リンパ球がＳＣＩＤマウス中に移植される。例えば、Ｍｏｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：２５６−２５９（１９８８）を参照のこと。ある特定のこのような実施形態において、ブドウ球菌のエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）等の刺激剤で、または抗ヒトＣＤ４０モノクローナル抗体のいずれかで、このような移植された細胞が処理されると、より高いレベルのＢ細胞生成が検出される。例えば、Ｍａｒｔｅｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４：２２４−２３０（１９９５）、Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，８６：１９４６−１９５３（１９９５）を参照のこと。
したがって、ある特定の実施形態では、完全ヒト抗体は、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現によって、またはハイブリドーマ細胞中での発現によって生成され得る。他の実施形態では、抗体は、本明細書に記載されるファージディスプレイ技術を用いて生成され得る。
本明細書に記載される抗体は、本明細書に記載されるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術の使用を通じて調製された。そこで、そのようなマウスは、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を生成することができ、マウス免疫グロブリン分子および抗体の生成を欠失している。それを達成するために使用される技術は、本明細書の背景技術の項に開示されている特許、出願、および参考文献中に開示されている。しかしながら、特に、マウスのトランスジェニック生成およびそこから得られる抗体の好ましい実施形態が、１９９６年１２月３日に出願された米国特許出願第０８／７５９，６２０号および１９９８年６月１１日に公開された国際特許公開第ＷＯ９８／２４８９３号および２０００年１２月２１日に公開された第ＷＯ００／７６３１０号に開示されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１５：１４６−１５６（１９９７）も参照されたく、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
そのような技術の使用を通じて、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が生成されている。本質的には、マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株が、対象となる抗原（例えば、ＰＣＳＫ９）で免疫化され、リンパ細胞（Ｂ細胞等）が超免疫化されたマウスから回収され、回収されたリンパ球は、不死化ハイブリドーマ細胞株を調製するために、骨髄型細胞株と融合される。対象となる抗原に対して特異的な抗体を生成したハイブリドーマ細胞株を特定するために、これらのハイブリドーマ細胞株が、スクリーニングされ、選択される。ＰＣＳＫ９に対して特異的な抗体を生成する複数のハイブリドーマ細胞株を生成するための方法が本明細書において提供される。さらに、このような抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含む、このような細胞株によって生成される抗体の特徴付けが本明細書に提供される。
マウスのＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株の生成は、１９９０年１月１２日に出願された米国特許出願第０７／４６６，００８号、１９９０年１１月８日に出願された第０７／６１０，５１５号、１９９２年７月２４日に出願された第０７／９１９，２９７号、１９９２年７月３０日に出願された第０７／９２２，６４９号、１９９３年３月１５日に出願された第０８／０３１，８０１号、１９９３年８月２７日に出願された第０８／１１２，８４８号、１９９４年４月２８日に出願された第０８／２３４，１４５号、１９９５年１月２０日に出願された第０８／３７６，２７９号、１９９５年４月２７日に出願された第０８／４３０，９３８号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６４，５８４号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６４，５８２号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６３，１９１号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，８３７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５３号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５７号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４８６，８５９号、１９９５年６月５日に出願された第０８／４６２，５１３号、１９９６年１０月２日に出願された第０８／７２４，７５２号、１９９６年１２月３に出願された第０８／７５９，６２０号、２００１年１１月３０日に出願された米国公開第２００３／００９３８２０号、ならびに米国特許第６，１６２，９６３号、同第６，１５０，５８４号、同第６，１１４，５９８号、同第６，０７５，１８１号、および同第５，９３９，５９８号、ならびに日本国特許第３ ０６８ １８０ Ｂ２号、同第３ ０６８ ５０６ Ｂ２号、および同第３ ０６８ ５０７ Ｂ２号においてさらに論述され、説明される。１９９６年６月１２日に許諾公表された欧州特許第ＥＰ０ ４６３ １５１ Ｂ１号、１９９４年２月３日に公開された国際特許出願第ＷＯ９４／０２６０２号、１９９６年１０月３１日に公開された国際特許出願第ＷＯ９６／３４０９６号、１９９８年６月１１日に公開された第ＷＯ９８／２４８９３号、２０００年１２月２１日に公開された第ＷＯ００／７６３１０号も参照のこと。上記特許、出願、および参考文献のそれぞれの開示は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
代替のアプローチにおいて、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他のものは、「ミニローカス」アプローチを使用している。ミニローカスアプローチでは、Ｉｇ遺伝子座からの片（個々の遺伝子）を含めることを通じて、外来Ｉｇ遺伝子座が模倣される。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、ミュー定常領域、および通常第２の定常領域（好ましくは、ガンマ定常領域）が、動物中に挿入するための構築物中に形成される。このアプローチは、Ｓｕｒａｎｉらの米国特許第５，５４５，８０７号、ならびにそれぞれＬｏｎｂｅｒｇ ＆ Ｋａｙの米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，６２５，８２５号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，７７０，４２９号、同第５，７８９，６５０号、同第５，８１４，３１８号、同第５，８７７，３９７号、同第５，８７４，２９９号、同第６，２５５，４５８号、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ ＆ Ｂｅｒｎｓの米国特許第５，５９１，６６９号および同第６，０２３．０１０号、Ｂｅｒｎｓらの米国特許第５，６１２，２０５号、同第５，７２１，３６７号、同第５，７８９，２１５号、ならびにＣｈｏｉ ＆ ＤｕｎｎおよびＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許第５，６４３，７６３号、１９９０年８月２９日に出願された米国特許出願第０７／５７４，７４８号、１９９０年８月３１日出願された第０７／５７５，９６２号、１９９１年１２月１７日出願された第０７／８１０，２７９号、１９９２年３月１８日出願された第０７／８５３，４０８号、１９９２年６月２３日出願された第０７／９０４，０６８号、１９９２年１２月１６日出願された第０７／９９０，８６０号、１９９３年４月２６日出願された第０８／０５３，１３１号、１９９３年７月２２日出願された第０８／０９６，７６２号、１９９３年１１月１８日出願された第０８／１５５，３０１号、１９９３年１２月３日出願された第０８／１６１，７３９号、１９９３年１２月１０日出願された第０８／１６５，６９９号、１９９４年３月９日出願された第０８／２０９，７４１号において開示され、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。欧州特許第０ ５４６ ０７３ Ｂ１号、国際特許出願第ＷＯ９２／０３９１８号、同第ＷＯ９２／２２６４５号、同第ＷＯ９２／２２６４７号、同第ＷＯ９２／２２６７０号、同第ＷＯ９３／１２２２７号、同第ＷＯ９４／００５６９号、同第ＷＯ９４／２５５８５号、同第ＷＯ９６／１４４３６号、同第ＷＯ９７／１３８５２号、および同第ＷＯ９８／２４８８４号、ならびに米国特許第５，９８１，１７５号も参照されたく、これらの開示は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｔｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３、Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）、およびＴｕａｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）を参照されたく、これらの開示は、それらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｋｉｒｉｎは、微小細胞融合を通じて、染色体の大きな片または染色体全体が導入されているマウスからのヒト抗体の生成も立証した。欧州特許出願第７７３２８８号および同第８４３９６１号を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、ＫｉｒｉｎのＴｃマウスとＭｅｄａｒｅｘのミニローカス（Ｈｕｍａｂ）マウスとの交雑の結果であるＫＭ（商標）マウスが生成されている。これらのマウスは、ＫｉｒｉｎマウスのヒトＩｇＨトランス染色体およびＧｅｎｐｈａｒｍマウスのカッパ鎖トランス遺伝子を有する（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，（２００２）４：９１−１０２）。
ヒト抗体はまた、インビトロ法によっても誘導され得る。適切な例としては、ファージディスプレイ（ＣＡＴ、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、Ｄｙａｘ、Ｂｉｏｓｉｔｅ／Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｘｏｍａ、Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ、Ａｌｅｘｉｏｎ（旧Ｐｒｏｌｉｆｅｒｏｎ）、Ａｆｆｉｍｅｄ）リボソームディスプレイ（ＣＡＴ）、酵母ディスプレイ等が含まれるが、これらに限定されない。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ヒトＩｇＧ４重鎖およびＩｇＧ２重鎖を有する。抗体はまた、ＩｇＧ１を含む他のヒトイソタイプのものであり得る。様々な技術によって測定された場合に、抗体は、高い親和性を有しており、典型的には、約１０−６〜約１０−１３Ｍまたはそれ以下のＫｄを有する。
理解されるように、抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株中で発現させることができる。特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために使用することができる。形質転換は、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる）によって例示されるように、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中に（またはウイルスベクター中に）パッケージングし、ウイルス（またはベクター）で宿主細胞を形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の既知の方法によって、または 当技術分野で既知の形質移入手順によるものであり得る。使用される形質転換手順は、形質転換されるべき宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入するための方法は、当技術分野で公知であり、デキストラン媒介性形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性形質移入、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソーム中へのポリヌクレオチドのカプセル封入、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が含まれるが、これらに限定されない。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は当技術分野で公知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、および多くの他の細胞株が含まれるが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞株が含まれる。特に好ましい細胞株が、どの細胞株が高い発現レベルを有し、構造的なＰＣＳＫ９結合特性を有する抗体を生成するかの決定を通じて選択される。
ある特定の実施形態では、抗体および／またはＡＢＰは、２１Ｂ１２、３１Ｈ４、１６Ｆ１２、表２中に列記されるまたは実施例に開示される他のハイブリドーマのうちの少なくとも１つによって生成される。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、約１ｎＭ未満、例えば、１０００ｐＭ〜１００ｐＭ、１００ｐＭ〜１０ｐＭ、１０ｐＭ〜１ｐＭ、および／または１ｐＭ〜０．１ｐＭまたはそれ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＣＳＫ９に結合する。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＭイソタイプのうちの少なくとも１つの免疫グロブリン分子を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトカッパ軽鎖および／またはヒト重鎖を含む。ある特定の実施形態では、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＭイソタイプのものである。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、哺乳動物細胞中での発現のためにクローニングされている。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＭイソタイプの定常領域のいずれか以外の定常領域を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトラムダ軽鎖およびヒトＩｇＧ２重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトラムダ軽鎖およびヒトＩｇＧ４重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトラムダ軽鎖およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ重鎖を含む。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトカッパ軽鎖およびヒトＩｇＧ２重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトカッパ軽鎖およびヒトＩｇＧ４重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ヒトカッパ軽鎖およびヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＭ重鎖を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ２イソタイプに対する定常領域でも、ＩｇＧ４イソタイプに対する定常領域でもない定常領域に連結された抗体の可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、哺乳動物細胞中での発現のためにクローニングされている。
ある特定の実施形態では、ハイブリドーマ株：２１Ｂ１２、３１Ｈ４、および１６Ｆ１２のうちの少なくとも１つからの抗体の重および軽鎖に対する保存的修飾（ならびにコードするヌクレオチドに対する対応する修飾）は、ハイブリドーマ株：２１Ｂ１２、３１Ｈ４、および１６Ｆ１２からの抗体のものと同様の機能的および化学的特徴を有するＰＣＳＫ９に対する抗体を生成する。対照的に、ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗体の機能的および／または化学的特徴における実質的修飾は、（ａ）例えば、シートまたはヘリックス立体構造として、置換の領域中の分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさの維持におけるそれらの効果が大幅に異なる重および軽鎖のアミノ酸配列中の置換を選択することによって達成され得る。
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、自然のアミノ酸残基を、その位置でのアミノ酸残基の極性または電荷に与える効果がわずかまたは存在しない、非自然の残基で置換することを含み得る。さらに、アラニン走査突然変異誘発によって以前に記載されているように、ポリペプチド中の任意の自然の残基をアラニンで置換することができる。
所望のアミノ酸置換（保存的であろうと非保存的であろうと）は、このような置換が所望される時点で、当業者によって決定することができる。ある特定の実施形態では、アミノ酸置換は、本明細書に記載されるように、ＰＣＳＫ９に対する抗体の重要な残基を特定する、またはＰＣＳＫ９に対する抗体の親和性を増加もしくは減少させるために使用することができる。
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株中で発現させることができる。ある特定の実施形態では、特定の抗体をコードする配列は、適切な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために使用することができる。ある特定の実施形態によれば、形質転換は、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号、および同第４，９５９，４５５号（これらの特許は、あらゆる目的のために、参照により本明細書に組み込まれる）によって例示されるように、例えば、ポリヌクレオチドをウイルス中に（またはウイルスベクター中に）パッケージングし、ウイルス（またはベクター）で宿主細胞を形質導入することを含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための任意の既知の方法によって、または当技術分野で既知の形質移入手順によるものであり得る。ある特定の実施形態では、形質転換手順は、形質転換されるべき宿主に依存し得る。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入する方法は、当技術分野で公知であり、デキストラン媒介性形質移入、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性形質移入、プロトプラスト融合、およびＤＮＡの核内への直接微量注入が含まれるが、これらに限定されない。
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で公知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ Ｇ２）、および多くの他の細胞株を含むが、これらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な多くの不死化細胞系が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、構造的なＨＧＦ結合特性を有する抗体を生成するかの決定を通じて選択され得る。哺乳動物宿主細胞に対する適切な発現ベクターは、公知である。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、１つ以上のポリペプチドを含む。ある特定の実施形態では、１つ以上のＡＢＰ成分またはＡＢＰそのものを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を発現させるために、様々な発現ベクター／宿主系のいずれかを使用することができる。このような系には、組換えバクテリオファージ、プラスミド、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌等の微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で形質移入された、もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、１つ以上のＡＢＰ成分またはＡＢＰそのものを含むポリペプチドは、酵母中で組換え的に発現される。ある特定のこのような実施形態は、製造業者の説明書に従って、市販の発現系、例えば、Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用する。ある特定の実施形態では、このような系は、分泌を誘導するためにプレプロα配列に依存する。ある特定の実施形態では、挿入物の転写は、メタノールによる誘導時に、アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。
ある特定の実施形態では、１つ以上のＡＢＰ成分またはＡＢＰそのものを含む分泌されたポリペプチドは、酵母増殖培地から精製される。ある特定の実施形態では、酵母増殖培地からポリペプチドを精製するために使用される方法は、細菌および哺乳動物細胞上清からポリペプチドを精製するために使用されるものと同じである。
ある特定の実施形態では、１つ以上のＡＢＰ成分またはＡＢＰそのものを含むポリペプチドをコードする核酸は、ｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）等のバキュロウイルス発現ベクター中にクローニングされる。ある特定の実施形態では、このようなベクターは、ｓＦ９無タンパク質培地中でスポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞を感染させ、組換えポリペプチドを生成するために、製造業者の指示（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従って使用することができる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、このような培地から精製および濃縮される。
ある特定の実施形態では、１つ以上のＡＢＰ成分またはＡＢＰそのものを含むポリペプチドは、昆虫系内で発現される。ポリペプチド発現のためのある特定の昆虫系は、当業者には公知である。あるこのような系において、スポドプテラフルギペルダ細胞中またはトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）の幼虫内で外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が使用される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸分子は、ウイルスの非必須遺伝子中に、例えば、ポリヘドリン遺伝子内に挿入し、その遺伝子に対するプロモーターの制御下に置くことができる。ある特定の実施形態では、核酸分子の首尾よい挿入は、非必須遺伝子を不活性にする。ある特定の実施形態では、その不活化は検出可能な特徴をもたらす。例えば、ポリヘドリン遺伝子の不活化は、外被タンパク質を欠如したウイルスの生成をもたらす。
ある特定の実施形態では、組換えウイルスは、Ｓフルギペルダ細胞またはトリコプルシアの幼虫を感染させるために使用することができる。例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４６：５８４（１９８３）、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９１：３２２４−７（１９９４）を参照のこと。
ある特定の実施形態では、細菌細胞中で作製された１つ以上のＡＢＰ成分またはＡＢＰそのものを含むポリペプチドは、細菌中で、不溶性封入体として生成される。ある特定の実施形態では、このような封入体を含む宿主細胞は、遠心分離によって採取され、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄され、室温で１５分間０．１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で処理される。ある特定の実施形態では、可溶化液は音波処理によって清澄化され、細胞片は、１２，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドを含有するペレットは、５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、および１０ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁され、５０％のグリセロールに重層され、６０００×ｇで３０分間遠心分離される。ある特定の実施形態では、そのペレットは、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋を含んでいない標準的なリン酸緩衝化生理的食塩水溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁され得る。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中に再懸濁されたペレットを分画することによって、さらに精製される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，上記）。ある特定の実施形態では、このようなゲルは、タンパク質を可視化するために、０．４ＭのＫＣｌ中に浸漬させることが可能であり、これを切り出して、ＳＤＳを欠くゲル走行緩衝液中で電気溶出することができる。ある特定の実施形態によれば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質は、可溶性タンパク質として細菌中に生成される。ある特定の実施形態では、このようなＧＳＴ融合タンパク質は、ＧＳＴ精製分子（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製される。
ある特定の実施形態では、ある特定のポリペプチド、例えば、１つ以上のＡＢＰ成分またはＡＢＰそのものを含むポリペプチドを「再折り畳みする」ことが望ましい。ある特定の実施形態では、このようなポリペプチドは、本明細書で論述されるある特定の組換え系を用いて生成される。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、所望の三次構造を形成し、および／またはジスルフィド結合を生成するために、「再折り畳みされる」および／または酸化される。ある特定の実施形態では、このような構造および／または結合は、ポリペプチドのある特定の生物学的活性に関連している。ある特定の実施形態では、再折り畳みは、当技術分野で公知の多数の手法のいずれを用いても達成される。例となる方法には、カオトロピック剤の存在下で、典型的には７を上回るｐＨに、可溶化されたポリペプチド剤を曝露させることが含まれるがこれに限定されない。例となるカオトロピック剤は、グアニジンである。ある特定の実施形態では、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤およびその還元剤の酸化された形態も含有する。ある特定の実施形態では、還元剤およびその酸化された形態は、ジスルフィドシャフリングの発生を可能にする特定の酸化還元電位を生じ得る比で存在する。ある特定の実施形態では、このようなシャフリングは、システイン架橋の形成を可能にする。例となる還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、再折り畳みの効率を増加させるために、共溶媒が使用される。例となる共溶媒には、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが含まれるが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、１つ以上のＡＢＰ成分またはＡＢＰそのものを含むポリペプチドを実質的に精製する。ある特定のタンパク質精製技術が、当業者に公知である。ある特定の実施形態では、タンパク質精製は、非ポリペプチド画分からポリペプチド分画を粗分画することを含む。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、クロマトグラフィーおよび／または電気泳動技術を用いて精製される。例となる精製法には、硫酸アンモニウムを用いた沈殿；ＰＥＧを用いた沈殿；免疫沈降；熱変性後の遠心；親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ−セファロース）、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、および逆相クロマトグラフィーが含まれるがこれらに限定されない、クロマトグラフィー；ゲル濾過；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ならびにこのような技術および他の技術の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。ある特定の実施形態では、精製ステップは変化させることができ、またはある特定のステップを省略することができるが、実質的に精製されたポリペプチドの調製に適した方法をなおもたらす。
ある特定の実施形態では、ポリペプチド調製物の精製度を定量する。精製度を定量するためのある特定の方法は、当業者に公知である。ある特定の例となる方法は、調製物の特異的結合活性を測定すること、およびＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって調製物内のポリペプチドの量を評価することを含むが、これらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製の量を評価するためのある特定の例となる方法は、調製物の結合活性を計算すること、およびこれを最初の抽出物の結合活性と比較することを含む。ある特定の実施形態では、このような計算の結果は、「精製倍数」として表される。結合活性の量を表すために使用される単位は、実施されている特定のアッセイに依存する。
ある特定の実施形態では、１つ以上のＡＢＰ成分またはＡＢＰそのものを含むポリペプチドが、部分的に精製される。ある特定の実施形態では、部分精製は、より少ない精製ステップを使用することによって、または同じ一般的な精製スキームの異なる形態を用いることによって達成することができる。例えば、ある特定の実施形態では、ＨＰＬＣ装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的には、低圧クロマトグラフィー系を用いる同じ技術よりも大きな「精製倍数」をもたらし得る。ある特定の実施形態では、より低い精製度をもたらす方法は、ポリペプチドの総回収率の上で、またはポリペプチドの生物学的活性を維持する上で利点を有し得る。
ある特定の事例では、ポリペプチドの電気泳動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件によって時に著しく変動し得る。例えば、Ｃａｐａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７６：４２５（１９７７）を参照のこと。異なる電気泳動条件下において、精製されたまたは部分的に精製されたポリペプチドの見かけの分子量は異なり得ることが理解されよう。
例となるエピトープ
抗ＰＣＳＫ９抗体が結合するエピトープが提供される。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されている抗体によって結合されるエピトープが、特に有用である。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される抗体によって結合されるエピトープのいずれかに結合する抗原結合タンパク質が有用である。幾つかの実施形態では、表２ならびに図２および３に列記される抗体のいずれかによって結合されるエピトープが、特に有用である。幾つかの実施形態では、エピトープは、触媒ドメインＰＣＳＫ９上にある。
ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９エピトープは、抗ＰＣＳＫ９抗体またはＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の結合を妨げる（例えば、減少させる）ために用いることができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９エピトープは、抗ＰＣＳＫ９抗体またはＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の結合を減少させるために用いることができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９エピトープは、抗ＰＣＳＫ９抗体またはＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の結合を実質的に阻害するために用いることができる。
ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９エピトープは、ＰＣＳＫ９に結合する抗体または抗原結合タンパク質を単離するために用いることができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９エピトープは、ＰＣＳＫ９に結合する抗体または抗原結合タンパク質を生成するために用いることができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９エピトープまたはＰＣＳＫ９エピトープを含む配列は、ＰＣＳＫ９に結合する抗体または抗原結合タンパク質を生成するための免疫原として用いることができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９エピトープは、動物に投与することができ、その後、ＰＣＳＫ９に結合する抗体を、動物から取得することができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９エピトープまたはＰＣＳＫ９エピトープを含む配列は、ＬＤＬＲとのＰＣＳＫ９の会合等の正常なＰＣＳＫ９によって媒介される活性を妨害するために用いることができる。
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される抗原結合タンパク質は、Ｎ末端プロドメイン、サブチリシン様触媒ドメイン、および／またはＣ末端ドメインに特異的に結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ−９の基質結合溝に結合する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍらに記載されており、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
幾つかの実施形態では、抗体と接触し、または抗体によって埋没される残基を含有するドメイン（複数可）／領域（複数可）は、ＰＣＳＫ９（例えば、野生型抗原）中の特異的な残基を変異させ、抗原結合タンパク質が突然変異されたまたは変異ＰＣＳＫ９タンパク質と結合することができるかどうかを決定することによって特定され得る。多数の個別の突然変異体を作製することによって、突然変異体が抗原結合タンパク質と抗原との間の結合に影響を及ぼし得るように、結合に直接的な役割を果たしているまたは抗体と十分に近接している残基を特定することができる。これらのアミノ酸の知識から、抗原結合タンパク質と接触するか、または抗体によって被覆されている残基を含有する抗原のドメイン（複数可）または領域（複数可）が解明され得る。このようなドメインは、抗原結合タンパク質の結合エピトープを含むことができる。この一般的なアプローチの１つの具体例は、アルギニン／グルタミン酸スキャニングプロトコルを使用する（例えば、Ｎａｎｅｖｉｃｚ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：３７，２１６１９−２１６２５およびＺｕｐｎｉｃｋ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：２９，２０４６４−２０４７３を参照のこと）。一般に、アルギニンおよびグルタミン酸は、帯電しており、嵩が大きく、したがって、突然変異が導入されている抗原の領域中での抗原結合タンパク質と抗原との間の結合を乱す可能性を有するため、野生型ポリペプチド中のアミノ酸と（典型的には、個別に）置換される。野生型抗原中に存在するアルギニンは、グルタミン酸と置換される。このような様々な個別の突然変異体が得られ、どの残基が結合に影響を及ぼすかを決定するために、収集された結合結果が分析される。
抗原結合タンパク質と本明細書で使用される変異ＰＣＳＫ９との間の結合の変化（例えば、減少または増加）は、（例えば、実施例中で以下に記載されるＢｉａｃｏｒｅ検査またはビーズをベースとしたアッセイ等の公知の方法によって測定した場合に）結合親和性、ＥＣ５０の変化、および／または（例えば、抗原結合タンパク質濃度対抗原濃度のプロットにおけるＢｍａｘの減少によって明らかとなる）抗原結合タンパク質の総結合能力の変化（例えば、減少）が存在することを意味する。結合の著しい変化は、突然変異した残基が抗原結合タンパク質への結合に直接関与しており、または結合タンパク質が抗原に結合されたときに、結合タンパク質に近接していることを示す。
幾つかの実施形態では、結合の著しい減少は、抗原結合タンパク質と変異体ＰＣＳＫ９抗原との間での結合親和性、ＥＣ５０、および／または能力が、抗原結合タンパク質と野生型ＰＣＳＫ９（例えば、配列番号１および／または配列番号３０３に示されている）との間での結合と比較して、１０％超、２０％超、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、または９５％超減少していることを意味する。ある特定の実施形態では、結合は、検出可能な限界値を下回って減少する。幾つかの実施形態では、変異ＰＣＳＫ９タンパク質への抗原結合タンパク質の結合が、抗原結合タンパク質と野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１および／または配列番号３０３のタンパク質）との間で観察される結合の５０％未満（例えば、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、または１０％未満）である場合に、結合の著しい減少が証明される。このような結合の測定は、当技術分野で公知の様々な結合アッセイを用いて実施され得る。
幾つかの実施形態では、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号３０３）中の残基がアルギニンまたはグルタミン酸と置換される変異ＰＣＳＫ９タンパク質に対して著しくより低い結合を示す抗原結合タンパク質が提供される。幾つかの実施形態では、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号３０３）と比較して、突然変異：Ｒ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ、Ｅ５８２Ｒ、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ、およびＱ５５４Ｒのうちのいずれか１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２４４）を有する変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が著しく減少または増加する。本明細書において使用される省略型表記において、形式は、野生型残基：ポリペプチド中の位置：配列番号１または配列番号３０３に示されているように残基の付番がなされている。
幾つかの実施形態では、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号３０３）と比較して、配列番号１に示されるような位置：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１、および５５４で、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）の突然変異を有する突然変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が著しく減少または増加する。幾つかの実施形態では、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号３０３）と比較して、配列番号１に示されるような位置：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１、および５５４で、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）の突然変異を有する突然変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が減少または増加する。幾つかの実施形態では、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号３０３）と比較して、配列番号１内の位置：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１、および５５４で、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）の突然変異を有する突然変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が実質的に減少または増加する。
幾つかの実施形態では、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号３０３）と比較して、配列番号１または配列番号３０３内の突然変異：Ｒ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ、Ｅ５８２Ｒ、Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ、およびＱ５５４Ｒのうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５等）を有する突然変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、ＡＢＰの結合が著しく減少または増加する。
幾つかの実施形態では、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号３０３）と比較して、配列番号１または配列番号３０３内の突然変異：Ｒ２０７Ｅ、Ｄ２０８Ｒ、Ｒ１８５Ｅ、Ｒ４３９Ｅ、Ｅ５１３Ｒ、Ｖ５３８Ｒ、Ｅ５３９Ｒ、Ｔ１３２Ｒ、Ｓ３５１Ｒ、Ａ３９０Ｒ、Ａ４１３Ｒ、およびＥ５８２Ｒのうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５等）を有する突然変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、ＡＢＰの結合が著しく減少または増加する。幾つかの実施形態では、この結合は、減少する。幾つかの実施形態では、結合の減少は、ＥＣ５０の変化として観察される。幾つかの実施形態では、ＥＣ５０の変化は、ＥＣ５０の数値の増加（したがって、結合の減少）である。
幾つかの実施形態では、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質（例えば、配列番号１または配列番号３０３）と比較して、配列番号１内の突然変異：Ｄ１６２Ｒ、Ｒ１６４Ｅ、Ｅ１６７Ｒ、Ｓ１２３Ｒ、Ｅ１２９Ｒ、Ａ３１１Ｒ、Ｄ３１３Ｒ、Ｄ３３７Ｒ、Ｒ５１９Ｅ、Ｈ５２１Ｒ、およびＱ５５４Ｒのうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５等）を有する突然変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、ＡＢＰの結合が著しく減少または増加する。幾つかの実施形態では、この結合は減少する。幾つかの実施形態では、結合の減少は、Ｂｍａｘの変化として観察される。幾つかの実施形態では、Ｂｍａｘのシフトは、ＡＢＰによって生じた最大シグナルの減少である。幾つかの実施形態では、エピトープの一部であるアミノ酸に関して、Ｂｍａｘは、少なくとも１０％減少し、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、または１００％の少なくともいずれかの量の減少は、幾つかの実施形態では、残基がエピトープの一部であることを示し得る。
直前に列記されている変異形態は、配列番号１または配列番号３０３に示される野生型配列に関して引用されているが、ＰＣＳＫ９の対立遺伝子変異体において、表記位置のアミノ酸が異なり得ることが理解されよう。ＰＣＳＫ９のこのような対立遺伝子形態に対して著しく低い結合を示す抗原結合タンパク質も企図される。したがって、幾つかの実施形態では、上記実施形態のいずれも、図１Ａに示される純粋に野生型配列ではなく、対立遺伝子配列と比較され得る。
幾つかの実施形態では、野生型ＰＣＳＫ９タンパク質中に選択された位置における残基が他のいずれかの残基に突然変異されている変異体ＰＣＳＫ９タンパク質に対して、抗原結合タンパク質の結合が著しく減少する。幾つかの実施形態では、特定される位置に対して、本明細書に記載されるアルギニン／グルタミン酸置換が使用される。幾つかの実施形態では、アラニンは、特定される位置に対して使用される。
上述のように、結合に直接関与するまたは抗原結合タンパク質によって包含される残基は、スキャニングの結果から特定され得る。したがって、これらの残基は、抗原結合タンパク質が結合する結合領域（複数可）を含有する配列番号１（または配列番号３０３もしくは配列番号３）のドメインまたは領域の指標を提供し得る。実施例３９に要約されている結果から見られ得るように、幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１または配列番号３０３のアミノ酸：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１、および５５４のうちの少なくとも１つを含有するドメインに結合する。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１または配列番号３０３のアミノ酸：２０７、２０８、１８５、１８１、４３９、５１３、５３８、５３９、１３２、３５１、３９０、４１３、５８２、１６２、１６４、１６７、１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、５１９、５２１、および５５４のうちの少なくとも１つを含有する領域に結合する。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１または配列番号３０３のアミノ酸：１６２、１６４、１６７、２０７、および／または２０８のうちの少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態では、１つを超える（例えば、２、３、４、または５）特定された残基は、ＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＡＢＰ２１Ｂ１２と競合する。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１または配列番号３０３のアミノ酸：１８５の少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＡＢＰ３１Ｈ４と競合する。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１または配列番号３０３のアミノ酸：４３９、５１３、５３８、および／または５３９のうちの少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態では、１つを超える（例えば、２、３、または４）特定された残基は、ＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＡＢＰ３１Ａ４と競合する。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１または配列番号３０３のアミノ酸：１２３、１２９、３１１、３１３、３３７、１３２、３５１、３９０、および／または４１３のうちの少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態では、１つを超える（例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９）特定された残基は、ＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＡＢＰ１２Ｈ１１と競合する。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１または配列番号３０３のアミノ酸５８２、５１９、５２１、および／または５５４のうちの少なくとも１つを含有する領域に結合する。幾つかの実施形態では、１つを超える（例えば、２、３、または４）特定された残基は、ＡＢＰによって結合される領域の一部である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＡＢＰ３Ｃ４と競合する。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号１または配列番号３０３の断片または完全長配列内の前述領域に結合する。他の実施形態では、抗原結合タンパク質は、これらの領域からなるポリペプチドに結合する。「配列番号１または配列番号３０３」という表記は、これらの配列の一方または両方が使用され得ること、または関連し得ることを表す。この用語は、１つのみが使用されるべきことを表さない。
上述のように、上記記述は、配列番号１を参照して特定のアミノ酸位置を引用する。しかしながら、本明細書を通じて、一般に、配列番号３に提供される３１位で始まるＰｒｏ／Ｃａｔドメインが参照される。以下に記載されているように、配列番号１および配列番号３０３はＰＣＳＫ９のシグナル配列を欠如する。したがって、これらの様々な開示の間でのいずれの比較も、付番におけるこの差を考慮すべきである。特に、配列番号１中のいずれのアミノ酸位置も、配列番号３のタンパク質中の３０位のアミノ酸に対応する。例えば、配列番号１の２０７位、配列番号３の２３７位に対応する（完全長配列、および一般に本明細書中で使用されている付番系）。表３９．６は、配列番号１（および／または配列番号３０３）を参照する上記位置が、配列番号３（シグナル配列を含む）にどのように対応するかを要約する。したがって、配列番号１（および／または配列番号３０３）に関して記載される上記実施形態のいずれもが、記載される対応する位置によって、配列番号３を参照して記載されている。
幾つかの実施形態では、ＡＢＰ２１Ｂ１２は、残基１６２〜１６７（例えば、配列番号１の残基Ｄ１６２〜Ｅ１６７）を含むエピトープに結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰ１２Ｈ１１は、残基１２３〜１３２（例えば、配列番号１の残基Ｓ１２３〜Ｔ１３２）を含むエピトープに結合する。幾つかの実施形態では、ＡＢＰ１２Ｈ１１は、残基３１１〜３１３（例えば、配列番号１の残基Ａ３１１〜Ｄ３１３）を含むエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、ＡＢＰは、配列のこれらの鎖のいずれか１つを含むエピトープに結合し得る。
競合する抗原結合タンパク質
別の態様では、ＰＣＳＫ９への特異的結合に対して、本明細書に記載されるエピトープに結合する例となる抗体または機能的断片のうちの１つと競合する抗原結合タンパク質が提供される。そのような抗原結合タンパク質はまた、本明細書に例示される抗原結合タンパク質のうちの１つと同じエピトープまたは重複するエピトープにも結合し得る。例示される抗原結合タンパク質と同じエピトープと競合し、または結合する抗原結合タンパク質および断片は、同様な機能的特性を示すと予想される。例示される抗原結合タンパク質および断片には、表２および／または図２〜３に含まれる重および軽鎖可変、領域ドメイン、ならびにＣＤＲを有するもの等、上述されるものが含まれる。したがって、具体例として、提供される抗原結合タンパク質には、以下を有する抗体または抗原結合タンパク質と競合するものが含まれる：
（ａ）図２〜３に列記される抗体に対して列記されるＣＤＲの６つすべて、
（ｂ）表２に列記される抗体に対して列記されるＶＨおよびＶＬ、または
（ｃ）表２に列記される抗体に対して特定される２つの軽鎖および２つの重鎖。
治療的薬学的製剤および投与
本発明は、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含有する薬学的製剤を提供する。本明細書で使用される「薬学的製剤」は、非経口投与（静脈内、筋肉内、皮下、噴霧、肺内、鼻腔内、または髄腔内等であるが、これらに限定されない）に適している、それを必要とする患者への薬学的に活性な薬物、すなわち、ＰＣＳＫ９に対する少なくとも１つの抗原結合タンパク質の無菌組成物であり、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および連邦薬物管理機関または他の外国当局によって安全であると見なされる他の添加剤のみを含む。薬学的製剤には、液体、例えば、直接投与され得る水性溶液、および投与前に希釈剤を添加することによって溶液に再構成され得る凍結乾燥粉末を含む。患者への局所投与用の組成物、経口摂取用の組成物、および非経口的栄養補給用の組成物は、「薬学的製剤」という用語の範囲から特定的に除外される。
ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、安定な薬学的製剤である。本明細書で使用される「安定な薬学的製剤」、「安定な製剤」、または「薬学的製剤が安定している」という語句は、対照製剤試料と比較して、少なくとも１ヶ月間、または２ヶ月間、または３ヶ月間、または６ヶ月間、または１年間もしくは２年間、２〜８℃で保存される場合に、５％を超えない凝集の増加および／または生物学的活性の喪失の減少を示す生物学的に活性なタンパク質の薬学的製剤を指す。製剤の安定性は、サイズ排除ＨＰＬＣ（「ＳＥＣ−ＨＰＬＣ」）、陽イオンＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）、光不明瞭化による不可視粒子検出（Ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｌｉｇｈｔ Ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ）（「ＨＩＡＣ」）、および／または目視検査が含まれるが、これらに限定されない、多数の標準的なアッセイを用いて当業者により容易に決定され得る。
ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、表２ならびに図２および／または３ならびに図４８Ａおよび４８Ｂに示されるＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質のいずれかを含む。ある特定の他の実施形態では、薬学的製剤は、ＰＣＳＫ９に対する他の抗原結合タンパク質、すなわち、配列番号５８８の軽鎖可変ドメインおよび配列番号５８９の重鎖可変ドメインからなる抗体を含み得る。幾つかの実施形態では、薬学的製剤は、２１Ｂ１２、２６Ｈ５、３１Ｈ４、８Ａ３、１１Ｆ１、または８Ａ１のうちのいずれか１つを含む。
幾つかの実施形態では、薬学的製剤は、ＰＣＳＫ９に対する１つを超える異なる抗原結合タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、１つを超えるエピトープに結合するＰＣＳＫ９に対する１つを超える抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態では、様々な抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９に結合するために互いに競合しない。幾つかの実施形態では、表２ならびに図２および／または３に示される抗原結合タンパク質は、薬学的製剤中に一緒に組み合わせることができる。
ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質および／または治療的分子は、当技術分野で公知の半減期を延長するビヒクルに結合する。このようなビヒクルには、ポリエチレングリコール、グリコーゲン（例えば、ＡＢＰのグリコシル化）、およびデキストランが含まれるが、これらに限定されない。このようなビヒクルは、例えば、米国出願第０９／４２８，０８２号、現在、米国特許第６，６６０，８４３号に記載され、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２５０４４号に公開されており、これらは、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
ある特定の実施形態では、許容される製剤材料は、使用される投薬量および濃度において、受容者に対して非毒性である。幾つかの実施形態では、製剤材料は、皮下注射および／または静脈内投与用である。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、例えば、ｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、組成物の吸着または浸透を改変し、維持し、または保持するための製剤材料を含む。
ある特定の実施形態では、適切な製剤材料には、アミノ酸（プロリン、アルギニン、リジン、メチオニン、タウリン、グリシン、グルタミン、またはアスパラギン）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（ボラート、バイカーボナート、リン酸ナトリウム（「ＮａＯＡＣ」）、トリスＨＣｌ、トリス緩衝液、シトラート、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（すなわち、ＰＢＳ緩衝液）、または他の有機酸）；増量剤（マニトールまたはグリシン等）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（グルコース、スクロース、フルクトース、ラクトース、マンノース、トレハロース、またはデキストリン等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等）；着色剤、着香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドン等）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウム等）；防腐剤（ベンズアルコニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、スルビン酸、または過酸化水素等）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等）；糖アルコール（マニトールまたはソルビトール等）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール等）；安定性増強剤（スクロースまたはソルビトール等）；等張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム、マニトールソルビトール等）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５）。
ある特定の実施形態では、最適な薬学的製剤は、例えば、意図される投与経路、送達様式、および所望の投薬量に応じて、当業者によって決定されよう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記を参照のこと。ある特定の実施形態では、このような製剤は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボ除去の速度に影響を及ぼし得る。
一態様では、薬学的製剤は、ＰＣＳＫ９に対する高濃度の抗原結合タンパク質を含む。ある特定の実施形態では、ＡＢＰ濃度は、約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、例えば、約７０ｍｇ／ｍＬ、約８０ｍｇ／ｍＬ、約９０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２１０ｍｇ／ｍＬ、約２２０ｍｇ／ｍＬ、約２３０ｍｇ／ｍＬ、約２４０ｍｇ／ｍＬ、または約２５０ｍｇ／ｍＬ、およびその間のすべての値を含む。幾つかの実施形態では、２１Ｂ１２、２６Ｈ５、または３１Ｈ４の濃度は、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、例えば、１００ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、または約１５０ｍｇ／ｍＬである。幾つかの実施形態では、８Ａ３、１１Ｆ１、または８Ａ１の濃度は、約１４０ｍｇ／ｍＬ〜約２２０ｍｇ／ｍＬの範囲であり、例えば、１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２１０ｍｇ／ｍＬ、約２２０ｍｇ／ｍＬ、または約２５０ｍｇ／ｍＬである。
別の態様では、薬学的製剤は、例えば、ｐＨ約７．０〜８．５の酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ホスフェート、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）、および／またはトリス緩衝液等の少なくとも１つの緩衝剤を含む。緩衝剤は、生理学的に適切なｐＨを維持する役割を果たす。加えて、緩衝剤は、薬学的製剤の等張性および化学的安定性を増強する役割を果たし得る。ある特定の実施形態では、緩衝剤は、約０．０５ｍＭ〜約４０ｍＭの範囲であり、例えば、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１．０ｍＭ、約５．０ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、または約１００ｎＭの緩衝剤であり、およびその間のすべての値を含む。ある特定の実施形態では、緩衝剤は、ＮａＯＡＣである。薬学的製剤の例となるｐＨは、約４〜約６、または約４．８〜約５．８、または約５．０〜約５．２、または約５、または約５．２を含む。
ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、オスモル濃度が約２５０〜約３５０ミリオスモル／ｋｇの範囲であり、例えば、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ、または約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇで等張性であり、その間のすべての値を含む。本明細書で使用される「オスモル濃度」は、液体の体積に対する溶質の比の尺度である。すなわち、溶液のキログラム当たりの分子およびイオン（または分子）の数である。オスモル濃度は、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ２０２０マルチサンプル浸透圧計，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ等の浸透圧計と呼ばれる分析機器において測定され得る。Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｔｎｓ ２０２０マルチサンプル浸透圧計は、氷点降下法を用いることによってオスモル濃度を測定する。溶液中の浸透圧調節物質（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）が高いほど、それが凍結する温度が下がる。オスモル濃度はまた、あらゆる他の方法を用いて、そして線形外挿法等の当技術分野で公知のいずれかの他の単位において測定され得る。
さらに別の態様では、薬学的製剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、ポリソルベート４０、およびポリソルベート２０が含まれるが、これらに限定されない、少なくとも１つの界面活性剤を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、製剤の約０．００４％〜約１０％重量／体積（「ｗ／ｖ」）の範囲である濃度の界面活性剤、例えば、製剤の約０．００４％、約０．００５％、約０．００６％、約０．００７％、約０．００８％、約０．００９％、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、または約１０％ｗ／ｖの界面活性剤である。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、製剤の約０．００４％〜約０．１％ｗ／ｖの範囲である濃度のポリソルベート８０を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、製剤の約０．００４％〜約０．１％ｗ／ｖの範囲である濃度のポリソルベート２０を含む。
ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、少なくとも１つの安定剤、例えば、ポリヒドロキシ炭化水素（ソルビトール、マンニトール、グリセロール、およびズルシトールが含まれるが、これらに限定されない）、ならびに／または二糖類（スクロース、ラクトース、マルトース、およびトレハロースが含まれるが、これらに限定されない）、ならびに／またはアミノ酸（プロリン、アルギニン、リジン、メチオニン、およびタウリンが含まれるが、これらに限定されない）、ならびにまたはベンジルアルコールを含み、そのポリヒドロキシ炭化水素および／または二糖類および／またはアミノ酸および／またはベンジルアルコールの合計が、製剤の約０．５％〜約１０％ｗ／ｖである。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の濃度のスクロースの安定剤を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、約５％の濃度のスクロースの安定剤を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、または約１０％の濃度のソルビトールの安定剤を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、約９％の濃度のソルビトールの安定剤を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％の濃度のプロリン、アルギニン、リジン、メチオニン、および／またはタウリンの安定剤を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、約２〜３％の濃度のプロリンの安定剤を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％の濃度のベンジルアルコールの安定剤を含む。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、約１〜２％の濃度のベンジルアルコールの安定剤を含む。
一態様では、薬学的製剤は、室温（すなわち、２５℃）で測定される場合に、約３０センチポアズ（ｃＰ）未満の粘度レベルを有する。本明細書で使用される「粘度」は、流れに対する流体抵抗であり、センチポアズ（ｃＰ）またはミリパスカル秒（ｍＰａ−ｓ）の単位で測定され得、所与のせん断速度で１ｃＰ＝１ｍＰａ−ｓである。粘度は、粘度計、例えば、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｉａｌ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ、モデルＬＶＴを用いることによって測定され得る。粘度はまた、当技術分野で公知のあらゆる他の方法を用いて、あらゆる他の単位（例えば、絶対、運動学的、もしくは動的粘度または絶対粘度）で測定することもできる。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、約２５ｃＰ、約２０ｃＰ、約１８ｃＰ、約１５ｃＰ、約１２ｃＰ、約１０ｃＰ；約８ｃＰ、約６ｃＰ、約４ｃＰ；約２ｃＰ；または約１ｃＰ未満の粘度レベルを有する。
一態様では、生物学的に活性なタンパク質の生物物理学的または生化学的特徴を時間とともに調べるアッセイ等の当業者には公知の少なくとも１つの安定性のアッセイによって測定される場合に、薬学的製剤が安定している。上述のように、本発明の安定な薬学的製剤は、対照製剤試料と比較して、少なくとも１ヶ月間、または２ヶ月間、または３ヶ月間、または６ヶ月間、または１年間もしくは２年間、２〜８℃で保存される場合に、５％を超えない凝集の増加および／または生物学的活性の喪失の減少を示す生物学的に活性なタンパク質の薬学的製剤である。ある特定の実施形態では、薬学的製剤の安定性は、サイズ排除ＨＰＬＣ（「ＳＥＣ−ＨＰＬＣ」）を用いて測定される。ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、それらの流体力学的体積の差に基づいてタンパク質を分離する。より大きな流体力学的体積のタンパク質を有する分子は、より小さい体積を有する分子よりも早く溶出する。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの場合、安定な薬学的製剤は、対照試料と比較して、高分子量種の約５％を超えない増加を示すべきである。ある特定の他の実施形態では、薬学的製剤は、対照試料と比較して、高分子量種の約４％を超えない、約３％を超えない、約２％を超えない、約１％を超えない、約０．５％を超えない増加を示すべきである。
ある特定の実施形態では、薬学的製剤の安定性は、陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いて測定される。ＣＥＸ−ＨＰＬＣは、それらの表面電荷の差に基づいてタンパク質を分離する。設定されたｐＨで、抗ＰＣＳＫ９ ＡＢＰの荷電されたアイソフォームが、陽イオン交換カラム上で分離され、塩勾配を用いて溶離される。この溶離は、紫外吸光度によってモニターされる。荷電されたアイソフォームの分布は、総ピーク面積の割合としてそれぞれのアイソフォームのピーク面積を決定することによって評価される。ＣＥＸ−ＨＰＬＣの場合、安定な薬学的製剤は、対照試料と比較して、主要アイソフォームのピークの約５％を超えない減少を示すべきである。ある特定の他の実施形態では、安定な薬学的製剤は、対照試料と比較して、主要アイソフォームのピークの約３％〜約５％を超えない減少を示すべきである。ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、対照試料と比較して、主要アイソフォームのピークの約４％を超えない減少、約３％以下を超えない、約２％を超えない減少、約１％を超えない減少、約０．５％を超えない減少を示すべきである。
ある特定の実施形態では、薬学的製剤の安定性は、光不明瞭化による不可視粒子検出（Ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｌｉｇｈｔ Ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ）（「ＨＩＡＣ」）を用いて測定される。液体試料採取装置を有する光不明瞭化センサー（ＨＩＡＣ／Ｒｏｙｃｏ ＨＲＬＤ−１５０または同等物）を含む電気液体伝達（ｌｉｑｕｉｄ−ｂｏｒｎｅ）粒子計数システム（ＨＩＡＣ／Ｒｏｙｃｏ ９７０３または同等物）が、所与の試験試料中の粒子数およびそれらのサイズ範囲を定量化する。液体中の粒子が光源と検出器との間を通過する際、それらは、検出器上に位置する光線を減退させるか、または「不明瞭化する」。粒子の濃度がセンサーの正常な範囲内にある場合に、これらの粒子は、１つずつ検出される。それぞれの粒子の検出ゾーンの通過は、光検出器上の入射光を減少させ、光検出器の電圧出力が一過的に減少する。電圧の変化は、存在する粒子数に機器によって変換される電気パルスとして登録する。この方法は、非特異性であり、それらの起源に関わらず粒子を測定する。モニターされる粒径は、通常、１０μｍおよび２５μｍである。ＨＩＡＣの場合、安定な薬学的製剤は、対照試料と比較して、１容器（またはユニット）当たり６０００個を超えない１０μｍ粒子を示すべきである。ある特定の実施形態では、安定な薬学的製剤は、対照試料と比較して、１容器（またはユニット）当たり５０００個を超えない、４０００個を超えない、３０００個を超えない、２０００個を超えない、１０００個を超えない１０μｍ粒子を示すべきである。 さらに他の実施形態では、安定な薬学的製剤は、対照試料と比較して、１容器（またはユニット）当たり６００個を超えない２５μｍ粒子を示すべきである。ある特定の実施形態では、安定な薬学的製剤は、対照試料と比較して、１容器（またはユニット）当たり５００個を超えない、４００個を超えない、３００個を超えない、２００個を超えない、１００個を超えない、５０個を超えない２５μｍ粒子を示すべきである。
ある特定の実施形態では、薬学的製剤の安定性は、視覚的評価を用いて測定される。視覚的評価は、試料の可視的な物理的特徴を説明するために使用される定性的方法である。試料は、評価されるべき特徴（例えば、色、透明度、粒子または異物の存在）に応じて検査ブースの黒色および／または白色の背景に対して視察される。試料はまた、乳白色の参照基準および色の参照基準に対しても視察される。視覚的評価の場合、安定な薬学的製剤は、対照試料と比較して、著しい色、透明度の変化、粒子または異物の存在がないことを示すべきである。
本発明の一態様は、（ｉ）約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬのＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質と、（ｉｉ）約０．０５ｍＭ〜約４０ｍＭの緩衝剤、例えば緩衝剤としての役割を果たす酢酸ナトリウム（「ＮａＯＡＣ」）と、（ｉｉｉ）約１％〜約５％のプロリン、アルギニン、リジン、メチオニン、もしくはタウリン（２−アミノエタンスルホン酸としても知られている）、および／または０．５％〜約５％の安定剤としての役割を果たすベンジルアルコールと、（ｉｖ）製剤の約０．００４％〜約１０％ｗ／ｖの非イオン界面活性剤（ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、ポリソルベート４０、およびポリソルベート２０が含まれるが、これらに限定されない）とを含み、約４．０〜６．０の範囲内のｐＨを有する、薬学的製剤である。ある特定の他の実施形態では、本発明の薬学的製剤は、（ｉ）少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ９抗体と、（ｉｉ）約１０ｍＭのＮＡＯＡＣと、（ｉｉｉ）約０．０１％のポリソルベート８０と、（ｉｖ）約２％〜３％のプロリン（または約２５０ｍＭ〜約２７０ｍＭのプロリン）とを含み、約５のｐＨを有する。ある特定の他の実施形態では、本発明の薬学的製剤は、（ｉ）少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ９抗体、２１Ｂ１２、２６Ｈ５、および／または３１Ｈ４と、（ｉｉ）約１０ｍＭのＮＡＯＡＣと、（ｉｉｉ）約０．０１％のポリソルベート８０と、（ｉｖ）約２％〜３％のプロリン（または約２５０ｍＭ〜約２７０ｍＭのプロリン）とを含み、約５のｐＨを有する。ある特定の他の実施形態では、本発明の薬学的製剤は、（ｉ）少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ９抗体、８Ａ３、１１Ｆ１、および／または８Ａ１と、（ｉｉ）約１０ｍＭのＮＡＯＡＣと、（ｉｉｉ）約０．０１％のポリソルベート８０と、（ｉｖ）約２％〜３％のプロリン（または約２５０ｍＭ〜約２７０ｍＭのプロリン）とを含み、約５のｐＨを有する。
本発明の一態様は、（ｉ）少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ９抗体と、（ｉｉ）約５ｍＭ〜約２０ｍＭのＮＡＯＡＣ等の緩衝剤と、（ｉｉｉ）製剤の約１％〜約１０％ｗ／ｖがソルビトール等のポリヒドロキシ炭化水素、またはスクロース等の二糖類を含み、（ｉｖ）製剤の約０．００４％〜約１０％ｗ／ｖのポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０等の界面活性剤とを含み、約４．８〜５．８の範囲内のｐＨを有する、薬学的製剤であり、この薬学的製剤は、約８０ｍＭ〜約３００ｍＭのプロリン、アルギニン、リジン、メチオニン、もしくはタウリン、および／または０．５％〜約５％の粘度を減少させる役割を果たすベンジルアルコールを任意に含む。ある特定の他の実施形態では、本発明の薬学的製剤は、（ｉ）少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ９抗体と、（ｉｉ）約１０ｍＭのＮＡＯＡＣと、（ｉｉｉ）約９％のスクロースと、（ｉｖ）約０．００４％のポリソルベート２０とを含み、約５．２のｐＨを有する。ある特定の他の実施形態では、本発明の薬学的製剤は、（ｉ）少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ９抗体と、（ｉｉ）約１５ｍＭのＮＡＯＡＣと、（ｉｉｉ）約９％のスクロースと、（ｉｖ）約０．０１％のポリソルベート２０とを含み、約５．２のｐＨを有する。ある特定の他の実施形態では、本発明の薬学的製剤は、（ｉ）少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ９抗体と、（ｉｉ）約２０ｍＭのＮＡＯＡＣと、（ｉｉｉ）約９％のスクロースと、（ｉｖ）約０．０１％のポリソルベート２０とを含み、約５．２のｐＨを有する。ある特定の他の実施形態では、本発明の薬学的製剤は、（ｉ）少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬの抗ＰＣＳＫ９抗体と、（ｉｉ）約１０ｍＭのＮＡＯＡＣと、（ｉｉｉ）約９％のスクロースと、（ｉｖ）約０．０１％のポリソルベート８０と、（ｖ）約２５０ｍＭのプロリンとを含み、約５のｐＨを有する。
本発明の薬学的製剤は、併用療法、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与することができる。ある特定の実施形態では、併用療法は、少なくとも１つの抗コレステロール剤と組み合わせて、ＰＣＳＫ９に結合することができる抗原結合タンパク質を含む。薬剤には、インビトロで合成的に調製された化学的製剤、抗体、抗原結合領域、ならびにその組み合わせおよび複合体が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、薬剤は、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリック調節因子、または毒素としての役割を果たし得る。ある特定の実施形態では、薬剤は、その標的（例えば、受容体または酵素の活性化または阻害）を阻害または刺激する作用をし、それによってＬＤＬＲの発現の増加、または血清コレステロールレベルの減少を促進することができる。
ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、コレステロール低下（血清および／または総コレステロール）剤による治療前、それと同時に、およびその後に投与することができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症、心臓病、糖尿病、および／またはコレステロール関連障害のうちのいずれかの発症を予防するまたは軽減するために予防的に投与することができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、既存の高コレステロール血症の状態の治療のために投与することができる。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、障害および／または障害と関連する症状の発症を遅延させる。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、コレステロール関連障害またはそのサブセットのうちのいずれか１つの任意の症状がない対象に提供される。
ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症等の様々なコレステロール関連障害を治療するために特定の治療剤とともに使用される。ある特定の実施形態では、治療の状態および所望のレベルを考慮して、２つ、３つ、またはそれ以上の薬剤が投与され得る。ある特定の実施形態では、このような薬剤は、同じ製剤中に包含することにより一緒に提供され得る。ある特定の実施形態では、このような薬剤（複数可）およびＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、同じ製剤中に包含することにより一緒に提供され得る。ある特定の実施形態では、このような薬剤は、別々に製剤化され、治療キット中に包含することにより一緒に提供され得る。ある特定の実施形態では、このような薬剤およびＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、別々に製剤化され、治療キット中に包含することにより一緒に提供され得る。ある特定の実施形態では、このような薬剤は、別々に提供され得る。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤とともに、またはそれを伴わずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む製剤は、所望の純度を持つ選択された製剤を凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、任意の製剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記参照）と混合することによって保存用に調製され得る。さらに、ある特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤とともに、またはそれを伴わずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む製剤は、適切な賦形剤を用いて凍結乾燥体として製剤化され得る。
ある特定の実施形態では、非経口投与が企図される場合には、治療製剤は、薬学的に許容されるビヒクル中にさらなる治療剤を含むまたは含まない、ＰＣＳＫ９に対する所望の抗原結合タンパク質を含むピロゲンを含まない非経口で許容される水溶液の形態であり得る。ある特定の実施形態では、非経口注射用ビヒクルは、少なくとも１つのさらなる治療剤とともに、またはそれを伴わずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、適切に保存される滅菌等張溶液として製剤化される滅菌蒸留水である。ある特定の実施形態では、調製物は、生成物の制御放出または持続放出を提供し得、その後、デポー注射を介して送達され得る、注射用ミクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸等）、ビーズ、またはリポソーム等の薬剤との所望の分子の製剤を含み得る。ある特定の実施形態では、ヒアルロン酸を使用することも可能であり、循環中での持続的な期間を促進する効果を有し得る。ある特定の実施形態では、所望の分子を導入するために、インプラント可能な薬物送達デバイスを使用することができる。
ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、吸入用に製剤化することができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤とともに、またはそれを伴わずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤とともに、またはそれを伴わずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む吸入溶液は、エアロゾル送達用の噴射剤とともに製剤化することができる。ある特定の実施形態では、溶液は噴霧され得る。経肺投与は、化学的に修飾されたタンパク質の経肺送達を記載するＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号にさらに記載されている。
ある特定の実施形態では、薬学的製剤は、錠剤の製造に適している非毒性の賦形剤との混合物中に、少なくとも１つのさらなる治療剤とともに、またはそれを伴わずに、有効量のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含むことができる。ある特定の実施形態では、滅菌水または別の適切なビヒクル中に錠剤を溶解させることによって、溶液は、単位投薬形態で調製され得る。ある特定の実施形態では、好適な賦形剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム等の不活性材料；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアラビアゴム等の結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくはタルク等の潤滑剤が含まれるが、これらに限定されない。
持続的または制御送達製剤中に、少なくとも１つのさらなる治療剤とともに、またはそれを伴わずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を含む製剤等のさらなる薬学的製剤が、当業者には明らかであろう。ある特定の実施形態では、リポソーム担体、生体内分解性微粒子、または多孔性ビーズおよびデポー注射等の種々の他の持続的または制御送達手段を製剤化する技術も当業者に公知である。例えば、薬学的組成物の送達用の多孔性ポリマー微粒子の制御放出を記載しているＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照のこと。ある特定の実施形態では、持続放出調製物は、成型された物品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記）、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれ得る。ある特定の実施形態では、持続放出製剤はまた、リポソームも含み得、これは当技術分野で公知の幾つかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）、欧州特許第０３６，６７６号、欧州特許第０８８，０４６号、および欧州特許第１４３，９４９号を参照のこと。
インビボ投与のために使用されるべき薬学的製剤は、一般的には、滅菌である。ある特定の実施形態では、これは、滅菌濾過膜を通じた濾過によって達成することができる。ある特定の実施形態では、製剤が凍結乾燥される場合には、この方法を用いた滅菌化は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかにおいて実施し得る。ある特定の実施形態では、非経口投与用製剤は、凍結乾燥された形態で、または溶液中に保存され得る。ある特定の実施形態では、非経口製剤は、一般的に、滅菌アクセスポートを有する容器中に、例えば、皮下注射針によって突き刺すことが可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
ある特定の実施形態では、一旦薬学的製剤が製剤化されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥された粉末として、滅菌バイアル中に保存され得る。ある特定の実施形態では、このような製剤は、即時使用できる形態で、または投与前に再構成される（例えば、凍結乾燥された）形態のいずれかで保存され得る。
ある特定の実施形態では、一旦薬学的製剤が製剤化されると、それは、即時使用できる形態で、溶液または懸濁液として事前に充填されたシリンジ中に保存され得る。
ある特定の実施形態では、単回投薬投与単位を生成するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥されたタンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。ある特定の実施形態では、単一および／または複数のチャンバーの事前に充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。
ある特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤とともに、またはそれを伴わずに、治療に使用されるべきＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の有効量は、例えば、治療の状況および目的に依存するであろう。したがって、当業者は、ある特定の実施形態によれば、治療のための適切な投与量レベルが、部分的に、送達される分子、少なくとも１つのさらなる治療剤とともに、またはそれを伴わずに、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が用いられる適応症、投与経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または臓器サイズ）および／または状態（年齢および全体的な健康）に依存して、変動することを認識するであろう。ある特定の実施形態では、医師は、最適な治療効果を得るために、投薬量を滴定し、投与経路を修正することができる。
ある特定の実施形態では、製剤は、所望の分子が吸収されているか、またはカプセル化されている膜、スポンジ、または別の適切な材料の埋め込みを介して局所的に投与することができる。ある特定の実施形態では、埋め込みデバイスが用いられる場合、デバイスは、いずれかの適切な組織または臓器中に埋め込むことができ、所望の分子の送達は、拡散、持続放出型ボーラス、または連続放出を介して行われ得る。
投薬量および投与レジメン
表２ならびに図２および／または３および／または図４８Ａおよび４８Ｂ中に示されるＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質のいずれかを、本発明の方法に従って患者に投与することができる。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、２１Ｂ１２、２６Ｈ５、３１Ｈ４、８Ａ３、１１Ｆ１、または８Ａ１を含む。
本発明の方法に従って、患者に投与されるＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質（例えば、抗ＰＣＳＫ９抗体）の量は、一般に、治療的有効量である。ＡＢＰの量は、抗体のミリグラム（すなわち、ｍｇ）または患者の体重１キログラム当たりの抗体のミリグラム（すなわち、ｍｇ／ｋｇ）で表され得る。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９の抗原結合タンパク質の通常の投薬量は、約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇのＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質またはそれ以上の範囲であり得る。ある特定の実施形態では、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇ、もしくは１μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇ、もしくは５μｇ／ｋｇ〜最大約１００ｍｇ／ｋｇのＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質；または１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇのＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質；２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇのＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質；２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇのＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の範囲であり得る。
ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の量（または用量）は、少なくとも約１０ｍｇ〜約１４００ｍｇ、または約１４ｍｇ〜約１２００ｍｇ、または約１４ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または約１４ｍｇ〜約８００ｍｇ、または約１４ｍｇ〜約７００ｍｇ、または約１４ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２０ｍｇ〜最大約４８０ｍｇ、または約７０ｍｇ〜最大約４８０ｍｇ、または約８０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約９０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１００ｍｇ〜約４８０ｍｇもしくは約１０５ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１１０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１１５ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１２０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１２５ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１３０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１３５ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１４０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１４５ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１５０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１６０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１７０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約１８０ｍｇ〜約４８０ｍｇもしくは約１９０ｍｇ〜約４８０ｍｇもしくは約２００ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２１０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２２０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２３０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２４０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２５０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２６０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２７０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２８０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約２９０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３００ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３１０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３２０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３３０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３４０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３５０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３６０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３７０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３８０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約３９０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約４００ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約４１０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約４２０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約４３０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約４４０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約４５０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約４６０ｍｇ〜約４８０ｍｇ、または約４７０ｍｇ〜約４８０ｍｇのＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質の範囲であり得る。
ある特定の実施形態では、投薬の頻度は、使用される製剤中のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質および／またはさらなる治療剤の薬物動態パラメータを考慮に入れる。ある特定の実施形態では、医師は、所望の効果を達成する投薬量に到達するまで製剤を投与するであろう。ある特定の実施形態では、製剤は、したがって、単回用量として、または経時的に２回、３回、４回またはそれ以上の用量（所望の分子の同一量を含有しても、含有しなくてもよい）として、または埋め込みデバイスまたはカテーテルを介した連続輸液として投与することができる。製剤はまた、標準的な針およびシリンジを用いて、皮下または静脈内に送達させることができる。加えて、皮下送達に関して、ペン送達デバイスおよび自己注射送達デバイスは、本発明の薬学的製剤の送達に適用性を有する。適切な投与量のさらなる精緻化は、当業者により日常的に行われ、彼らにより日常的に行われる業務の範囲内である。ある特定の実施形態では、適切な投与量は、適切な用量応答データの使用により確認され得る。幾つかの実施形態では、投与の量および頻度は、得られるべき所望のコレステロールレベル（血清および／または総）、ならびに対象の現在のコレステロールレベル、ＬＤＬレベル、および／またはＬＤＬＲレベルを考慮に入れ、これらのすべては、当業者に公知である方法によって得ることができる。
ある特定の実施形態では、少なくとも約１０ｍｇ、または最大約１４ｍｇ、または最大約２０ｍｇ、または最大約３５ｍｇ、または最大約４０ｍｇ、または最大約４５ｍｇ、または最大約５０ｍｇ、または最大約７０ｍｇの用量のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が、それを必要とする患者に週１回（ＱＷ）投与される。
幾つかの他の実施形態では、少なくとも約７０ｍｇ、または最大約１００ｍ、または最大約１０５ｍｇ、または最大約１１０ｍｇ、または最大約１１５ｍｇ、または最大約１２０ｍｇ、または最大約１４０ｍｇ、または最大約１６０ｍｇ、または最大約２００ｍｇ、または最大約２５０ｍｇ、または最大２８０ｍｇ、または最大３００ｍｇ、または最大３５０ｍｇ、または最大４００ｍｇ、または最大４２０ｍｇの用量のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が、それを必要とする患者に隔週１回（または２週間ごと）（Ｑ２Ｗ）投与される。
ある特定の他の実施形態では、少なくとも約２５０ｍｇ、または最大約２８０ｍｇ、または最大約３００ｍｇ、または最大約３５０ｍｇ、または最大約４００ｍｇ、または最大約４２０ｍｇ、または最大約４５０ｍｇ、または最大４８０ｍｇの用量のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質が、それを必要とする患者に４週間に１回（または月１回）投与される。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約１５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７５％低下する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約９０％減少する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約１５％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約２０％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約２５％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約３０％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約３５％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約４０％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約４５％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約５０％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約５５％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約６０％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約６５％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約７０％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約７５％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約８０％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約８５％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、投与前の血清ＬＤＬコレステロールレベルと比較して、少なくとも約９０％減少し、この減少は、投与前のレベルと比較して、少なくとも約３日間、少なくとも約５日間、少なくとも約７日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２８日間、または少なくとも約３１日間の期間持続する。
ある特定の治療的用途
当業者によって理解されるように、変動したコレステロール、ＬＤＬ、ＬＤＬＲ、ＰＣＳＫ９、ＶＬＤＬ−Ｃ、アポタンパク質Ｂ（「ＡｐｏＢ」）、リポタンパク質Ａ（「Ｌｐ（ａ）」）、トリグリセリド、ＨＤＬ−Ｃ、非−ＨＤＬ−Ｃ、および総コレステロールレベルと関連し、それらに伴い、またはそれらによって影響を受け得る障害は、本発明に記載されるＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質によって対処することができる。一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、血清コレステロールレベルの上昇と関連する、または血清コレステロールレベルの上昇が関連する障害を治療し、および／または予防し、および／または障害のリスクを減少させるための方法に使用することができる。一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９値の上昇と関連する、またはＰＣＳＫ９値の上昇が関連する障害を治療し、および／または予防し、および／または障害のリスクを減少させるための方法に使用することができる。一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、総コレステロールレベルの上昇と関連する、または総コレステロールレベルの上昇が関連する障害を治療し、および／または予防し、および／または障害のリスクを減少させるための方法に使用することができる。一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、非ＨＤＬコレステロールレベルの上昇と関連する、または非ＨＤＬコレステロールレベルの上昇が関連する障害を治療し、および／または予防し、および／または障害のリスクを減少させるための方法に使用することができる。一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、ＡｐｏＢレベルの上昇と関連する、またはＡｐｏＢレベルの上昇が関連する障害を治療し、および／または予防し、および／または障害のリスクを減少させるための方法に使用することができる。一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、Ｌｐ（ａ）レベルの上昇と関連する、またはＬｐ（ａ）レベルの上昇が関連する障害を治療し、および／または予防し、および／または障害のリスクを減少させるための方法に使用することができる。一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、トリグリセリドレベルの上昇と関連する、またはトリグリセリドレベルの上昇が関連する障害を治療し、および／または予防し、および／または障害のリスクを減少させるための方法に使用することができる。一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、ＶＬＤＬ−Ｃレベルの上昇と関連する、またはＶＬＤＬ−Ｃレベルの上昇が関連する障害を治療し、および／または予防し、および／または障害のリスクを減少させるための方法に使用することができる。
一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、患者における血清ＬＤＬコレステロールレベルを調節するために使用される。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、異常に高いレベルからまたは正常なレベルでさえも血清ＬＤＬコレステロールの量を減少させるために使用される。ある特定の実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３０％減少する。ある特定の実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３５％減少する。ある特定の実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。ある特定の実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４５％減少する。ある特定の実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。ある特定の実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＬＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約９０％減少する。
一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、患者における血清ＰＣＳＫ９値を調節するために使用される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、中和性である。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、異常に高いレベルからまたは正常なレベルでさえもＰＣＳＫ９値を減少させるために使用される。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約８５％減少する。幾つかの実施形態では、血清ＰＣＳＫ９値は、少なくとも約９０％減少する。
一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、患者における総コレステロールレベルを調節するために使用される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、中和性である。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、異常に高いレベルからまたは正常なレベルでさえも総コレステロールの量を減少させるために使用される。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、総コレステロール値は、少なくとも約６０％まで減少する。
一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、患者における非ＨＤＬコレステロールレベルを調節するために使用される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、中和性である。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、異常に高いレベルからまたは正常なレベルでさえも非ＨＤＬコレステロールを減少させるために使用される。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約７５％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８０％減少する。幾つかの実施形態では、非ＨＤＬコレステロールレベルは、少なくとも約８５％減少する。
一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、患者におけるＡｐｏＢレベルを調節するために使用される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、中和性である。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、異常に高いレベルからまたは正常なレベルでさえもＡｐｏＢの量を減少させるために使用される。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約３５％減少する。 幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約６５％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約７０％減少する。幾つかの実施形態では、ＡｐｏＢレベルは、少なくとも約７５％減少する。
一態様では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、患者におけるＬｐ（ａ）レベルを調節するために使用される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、中和性である。幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、異常に高いレベルからまたは正常なレベルでさえもＬｐ（ａ）の量を減少させるために使用される。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約１０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約１５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約２０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約２５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約３０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約３５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約４０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約４５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約５０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約５５％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約６０％減少する。幾つかの実施形態では、Ｌｐ（ａ）レベルは、少なくとも約６５％減少する。
当業者によって理解されるように、本発明のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、コレステロール関連障害を治療し、および／または予防するのに治療的に有用であり得る。幾つかの実施形態では、「コレステロール関連障害」（「血清コレステロール関連障害」を含む）は、家族性高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、高脂血症、心臓病、代謝症候群、糖尿病、冠状動脈性心臓病、脳卒中、心臓血管疾患、アルツハイマー病、ならび一般的な脂質異常症のうちのいずれか１つ以上を含み、これらは、例えば、血清総コレステロールの上昇、ＬＤＬの上昇、トリグリセリドの上昇、ＶＬＤＬの上昇、および／または低ＨＤＬが認められ得る。単独で、または１つ以上の他の薬剤と組み合わせたＡＢＰを用いて治療され得る原発性および続発性脂質異常症の幾つかの非限定的な例には、代謝症候群、真性糖尿病、家族性複合型高脂血症、家族性高トリグリセリド血症、ヘテロ接合型高コレステロール血症、ホモ接合型高コレステロール血症を含む家族性高コレステロール血症、家族性欠陥アポリポタンパク質Ｂ−１００；多遺伝子性高コレステロール血症；レムナント除去病（ｒｅｍｎａｎｔ ｒｅｍｏｖａｌ ｄｉｓｅａｓｅ）、肝リパーゼ欠乏症；暴食、甲状腺機能低下症、エストロゲンおよびプロゲスチン療法を含む薬物、β遮断薬およびチアジド利尿薬のうちのいずれかに続発する脂肪異常症；ネフローゼ症候群、慢性腎不全、クッシング症候群、原発性胆汁性肝硬変、糖原病、肝臓癌、胆汁鬱滞、末端肥大症、膵島細胞腫、成長ホルモン単独欠損症、ならびにアルコール誘発性高トリグリセリド血症が含まれる。ＡＢＰはまた、例えば、心血管系死亡、非心血管系死亡、または原因を問わない死亡、冠動脈性心臓病、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、卒中（虚血性および出血性）、狭心症、または脳血管疾患および急性冠症候群、心筋梗塞、および不安定狭心症（ｕｎｔａｂｌｅ ａｎｇｉｎａ）等のアテローム性動脈硬化症を予防し、または治療するのに有用であり得る。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、致命的および非致命的心臓発作、致命的および非致命的脳卒中、ある特定の種類の心臓手術、心不全のための入院、心臓病に患っている患者における胸部痛、および／または以前の心臓発作、以前の心臓手術等の確立された心臓病による心血管事象、および／または閉塞した動脈の徴候を有する胸部痛、および／または移植関連血管疾患のリスクを減少させるのに有用である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＣＲＰまたはｈｓＣＲＰの増加による心血管のリスクを防止または減少させるのに有用である。幾つかの実施形態では、ＡＢＰおよび方法は、再発性の心血管事象のリスクを減少させるために使用することができる。
当業者に理解されるように、スタチンの使用を通じて一般に対処可能な（治療可能なまたは予防可能な）疾患または障害にも、本発明の抗原結合タンパク質の適用が有益であり得る。さらに、幾つかの実施形態では、コレステロール合成の防止またはＬＤＬＲ発現の増加が有益であり得る障害または疾患も、抗原結合タンパク質の様々な実施形態によって治療することができる。さらに、当業者によって理解されるように、抗ＰＣＳＫ９抗体の使用は、糖尿病の治療に特に有用であり得る。糖尿病は、冠状動脈性心臓病に対するリスク因子であるのみならず、インシュリンはＰＣＳＫ９の発現を増加させる。すなわち、糖尿病を患っている人々は、（高いＰＣＳＫ９レベルと関連し得る）血漿脂質レベルの上昇を有し、これらのレベルを低下させることが有益であり得る。これは、一般に、Ｃｏｓｔｅｔ ｅｔ ａｌ．（“Ｈｅｐａｔｉｃ ＰＣＳＫ９ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｔｕｓ ｖｉａ Ｉｎｓｕｌｉｎ ａｎｄ Ｓｔｅｒｏｌ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ １Ｃ”，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１：６２１１−６２１８，２００６）においてさらに詳しく論述されており、これらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、真性糖尿病、腹部大動脈瘤、アテローム性動脈硬化症、および／または末梢血管疾患を有する者に、その血清コレステロールレベルをより安全な範囲まで減少させるために投与される。幾つかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載される障害のいずれかを発症するリスクを有する患者に投与される。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、喫煙し、または喫煙したことがある（すなわち、喫煙経験者）、高血圧、または若年心臓発作の家族歴を有する対象に投与される。
幾つかの実施形態では、対象が２００４ＮＣＥＰ治療目標において中度のリスクまたはそれより高いリスクを有する場合に、対象にＡＢＰが投与される。幾つかの実施形態では、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１６０ｍｇ／ｄＬを上回る場合、ＡＢＰが対象に投与される。幾つかの実施形態では、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１３０を上回る（および２００４ＮＣＥＰ治療目標に従って、対象が、中度のリスクまたは中程度に高いリスクを有する）場合、ＡＢＰが投与される。幾つかの実施形態では、対象のＬＤＬコレステロールレベルが１００を上回る（および２００４ＮＣＥＰ治療目標に従って、対象が、高いリスクまたは極めて高いリスクを有する）場合、ＡＢＰが投与される。幾つかの実施形態では、対象のＬＤＬコレステロールレベルが８０ｍｇ／ｄＬを上回る場合、ＡＢＰが投与される。幾つかの実施形態では、対象のＬＤＬコレステロールレベルが７０ｍｇ／ｄＬを上回る場合、ＡＢＰが投与される。
特定の患者の個別のプロファイルに応じて、医師は、適切な治療適応および目標脂質レベルを選択することができる。高脂血症の治療に指針を与えるための十分に受け入れられている１つの基準は、「成人の高い血液コレステロールの検出、評価、および治療に関する全米コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ）専門部会の第３次報告」（成人治療パネルＩＩＩ）、最終報告、国立衛生研究所、ＮＩＨ公開番号０２−５２１５（２００２）（Ｔｈｉｒｄ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＣＥＰ） Ｅｘｐｅｒｔ Ｐａｎｅｌ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｉｇｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ Ａｄｕｌｔｓ（Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ） Ｆｉｎａｌ Ｒｅｐｏｒｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．０２−５２１５（２００２）」であり、その印刷された刊行物の全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
幾つかの実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、高コレステロール血症、高脂血症、もしくは脂質異常症を治療または予防するために、ならびに／またはそれらのためおよび／もしくは他のコレステロール関連障害（本明細書に記載されているもの等）のための薬物の調製において使用される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、ＰＣＳＫ９活性が正常である高コレステロール血症等の状態を治療または予防するために使用される。このような状態では、例えば、正常を下回るＰＣＳＫ９活性の減少は、治療効果を提供することができる。
併用療法
ある特定の実施形態では、治療的有効量の１つ以上のＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質および別の治療剤を投与することを含む、高コレステロール血症、高脂血症、または脂質異常症等のコレステロール関連障害を治療する方法が提供される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与と同時に投与される。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与後に投与される。
治療剤（抗原結合タンパク質以外）には、少なくとも１つの他のコレステロール低下（血清および／または全身コレステロール）剤が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、ＬＤＬＲの発現を増加させる薬剤は、血清ＨＤＬレベルを増加させ、ＬＤＬレベルを低下させ、またはトリグリセリドレベルを低下させることが観察されている。例となる薬剤には、スタチン（アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン）、ニコチン酸（ナイアシン）（ＮＩＡＣＯＲ、ＮＩＡＳＰＡＮ（徐放性ナイアシン）、ＳＬＯ−ＮＩＡＣＩＮ（徐放性ナイアシン）、ＣＯＲＤＡＰＴＩＶＥ（ラロピプラント））、フィブリン酸（ＬＯＰＩＤ（ゲムフィブロジル）、ＴＲＩＣＯＲ（フェノフィブラート）、胆汁酸封鎖剤（ＱＵＥＳＴＲＡＮ（コレスチラミン）、コレセベラム（ＷＥＬＣＨＯＬ）、ＣＯＬＥＳＴＩＤ（コレスチポール））、コレステロール吸収阻害剤（ＺＥＴＩＡ（エゼチミブ））、ニコチン酸とスタチンの組み合わせ（ＡＤＶＩＣＯＲ（ＬＯＶＡＳＴＡＴＩＮおよびＮＩＡＳＰＡＮ）、スタチンと吸収阻害剤の組み合わせ（ＶＹＴＯＲＩＮ（ＺＯＣＯＲおよびＺＥＴＩＡ）、ならびに／または脂質修飾剤が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト、スクアレン合成阻害剤、ＣＥＴＰ阻害剤、降圧剤、抗糖尿病薬（スルホニル尿素、インシュリン、ＧＬＰ−１類似体、ＤＤＰＩＶ阻害剤、例えばメトホルミン等）、ミポペルサン（ｍｉｐｏｍｅｒｓａｎ）等のＡｐｏＢ調節物質、ＭＴＰ阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｉｓ）および／または閉塞性動脈硬化症治療と組み合わされる。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、スタチン、オンコスタチンＭのようなある特定のサイトカイン、エストロゲン、および／またはベルベリン等のある特定の植物成分のような、対象におけるＬＤＬＲタンパク質のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、（ある特定の抗精神病薬、ある特定のＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、高フルクトース、スクロース、コレステロール、またはある特定の脂肪酸等の食事要因、ならびにＲＸＲ、ＲＡＲ、ＬＸＲ、ＦＸＲに対するある特定の核受容体アゴニストおよびアンタゴニスト等）、対象における血清コレステロールレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、スタチンおよび／またはインシュリン等の、対象におけるＰＣＳＫ９のレベルを増加させる薬剤と組み合わされる。２つの組み合わせは、他の薬剤の望ましくない副作用をＡＢＰによって軽減させることを可能とし得る。
ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの炎症用治療剤とともに使用することができる。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質は、少なくとも１つの免疫障害用治療剤とともに使用することができる。例となる炎症および免疫障害用治療剤には、シクロオキシゲナーゼ１型（ＣＯＸ−１）およびシクロオキシゲナーゼ２型（ＣＯＸ−２）阻害剤 ３８ｋＤ分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ｐ３８−ＭＡＰＫ）の小分子調節物質；炎症経路に関与している細胞内分子の小分子調節物質（このような細胞内分子には、ｊｎｋ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢ、ＺＡＰ７０、およびｌｃｋが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の例となる炎症用治療剤は、例えば、Ｃ．Ａ．Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ ＆ Ｌ．Ｌ．Ｍｏｌｄａｗｅｒ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１） Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ．Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡに記載されている。
診断用途
幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、診断用ツールとして使用される。ＡＢＰは、試料および／または対象中に存在するＰＣＳＫ９の量をアッセイするために使用することができる。当業者によって理解されるように、このようなＡＢＰは中和ＡＢＰである必要はない。幾つかの実施形態では、診断用ＡＢＰは中和ＡＢＰではない。幾つかの実施形態では、診断用ＡＢＰは、中和ＡＢＰが結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。幾つかの実施形態では、２つのＡＢＰは互いに競合しない。
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＢＰは、ＰＣＳＫ９のレベルの変化と関連する疾患または障害に対するスクリーニング／診断するために、哺乳動物組織または細胞中のＰＣＳＫ９の検出用アッセイキットおよび／または方法において使用され、または提供される。キットは、ＰＣＳＫ９と結合するＡＢＰ、存在する場合に、ＰＣＳＫ９とのＡＢＰの結合を示し、任意にＰＣＳＫ９タンパク質レベルを示す手段を含む。ＡＢＰの存在を示すための様々な手段が使用され得る。例えば、蛍光色素、他の分子プローブ、または酵素をＡＢＰに連結することができ、ＡＢＰの存在は様々な方法で観察することができる。このような障害をスクリーニングするための方法は、キットの使用、または開示されているＡＢＰのうちの１つの単に使用すること、およびＡＢＰが試料中のＰＣＳＫ９に結合するかどうかの測定を含み得る。当業者によって理解されるように、ＰＣＳＫ９の高いまたは上昇したレベルは、試料中のより多い量のＰＣＳＫ９へのＡＢＰ結合をもたらす。したがって、試料中にどの程度の量のＰＣＳＫ９が存在するかを測定するために、ＡＢＰ結合の程度を使用することができる。所定の量（例えば、ＰＣＳＫ９関連障害を持たない者が有する量または範囲）より多いＰＣＳＫ９の量を有する対象または試料は、ＰＣＳＫ９によって媒介される障害を有するものとして特徴付けることができる。幾つかの実施形態では、スタチンが対象中のＰＣＳＫ９の量を増加させたかどうかを判定するために、スタチンを服用している対象にＡＢＰが投与される。
幾つかの実施形態では、ＡＢＰは、非中和ＡＢＰであり、ＡＢＰおよび／またはスタチン治療を受けている対象中のＰＣＳＫ９の量を測定するために使用される。
実施される実験および達成された結果を含めて、以下の実施例は、例示の目的でのみ提供されるものであり、本発明を限定するものと解釈されるものではない。
実施例１
免疫化および力価測定
抗ＰＣＳＫ９抗体およびハイブリドーマの生成
ＰＣＳＫ９の成熟形態に対する抗体（図１Ａ中の配列として示されており、プロドメインに下線が付されている）を、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含有するマウスであるＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウス（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）中で産生した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）マウスの２つの群、群１および群２が、ＰＣＳＫ９に対する抗体を生成するために使用された。群１は、完全ヒトＩｇＧ２κおよびＩｇＧ２λ抗体を生成するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株ＸＭＧ２−ＫＬのマウスを含んだ。群１のマウスを、ヒトＰＣＳＫ９で免疫化した。参照としてのＧｅｎＢａｎｋ配列（ＮＭ＿１７４９３６）を使用し、標準的組換え技術を用いてＰＣＳＫ９を調製した。群２は、完全ヒトＩｇＧ４κおよびＩｇＧ４λ抗体を生成するＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株ＸＭＧ４−ＫＬのマウスを含んだ。群２のマウスも、ヒトＰＣＳＫ９で免疫化した。
表３中のスケジュールに従って、両方の群のマウスに抗原を１１回注射した。最初の免疫化において、腹部に腹腔内送達される合計１０μｇの抗原をそれぞれのマウスに注射した。その後の追加免疫は５μｇの用量であり、注射法は、腹部への腹腔内注射と尾の基部への皮下注射との間で交互に行う。腹腔内注射のために、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｔ２６８４）を加えたエマルジョンとして抗原が調製され、皮下注射のために、抗原をＡｌｕｍ（リン酸アルミニウム）およびＣｐＧオリゴと混合する。注射２から８および１０において、アジュバントａｌｕｍゲル中の合計５μｇの抗原をそれぞれのマウスに注射した。マウス当たり５μｇの抗原の最終注射をリン酸緩衝化された生理的食塩水中で送達し、５０％の腹腔内投与および尾の基部に５０％の皮下投与の２つの部位に送達する。免疫化プログラムは、以下に示される表３中に要約される。
Figure 0006166717
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ動物を力価測定するために使用されるプロトコルは、以下の通りであった。Ｃｏｓｔａｒ３３６８培地結合プレートを、８ｕｇ／ｍＬ（５０μＬ／ウェル）のニュートラビジンで被覆し、１ＸＸＰＢＳ／０．０５％のアジ化物中において、４℃で一晩インキュベートした。ＲＯ水でのＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を用いて、それらを洗浄した。プレートを、２５０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルクを用いて遮断し、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。ＲＯ水でのＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を用いて、遮断物を洗浄除去した。次いで、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋（アッセイ希釈液）５０μＬ／ウェル中に、ｂヒトＰＣＳＫ９を２ｕｇ／ｍＬで捕捉し、室温で１時間インキュベートした。次いで、ＲＯ水でのＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を用いて洗浄した。一次抗体に関しては、１：１００から２重に、血清を１：３で滴定した。アッセイ希釈液５０μＬ／ウェル中でこれを行い、室温で１時間インキュベートした。次いで、ＲＯ水でのＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を用いて洗浄した。二次抗体は、５０μＬ／ウェルのアッセイ希釈液中の４００ｎｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰであった。これを室温で１時間インキュベートした。次いで、ＲＯ水でのＴｉｔｅｒＴｅｋ３サイクル洗浄を用いて、これを洗浄し、ペーパータオル上で軽く押さえて乾燥させた。基質に関しては、１ステップのＴＭＢ溶液（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）を使用し（５０μＬ／ウェル）、室温で３０分間展開させた。
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて従ったプロトコルは、以下の通りであった。Ｖ５Ｈｉｓタグを持たないｂ−ＰＣＳＫ９を含む試料に関しては、以下のプロトコルを使用した。Ｃｏｓｔａｒ３３６８培地結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。このプレートを、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジ化物（５０μＬ／ウェル）中の８μｇ／ｍＬのニュートラビジンで被覆した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍ３８４プレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。２５０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルクでプレートを遮断し、室温で約３０分間インキュベートした。次いで、Ｍ３８４プレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。捕捉は、Ｖ５タグを持たないｂヒトＰＣＳＫ９であり、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋（４０μＬ／ウェル）中に２μｇ／ｍＬで添加された。次いで、プレートを、室温で１時間インキュベートした。３サイクル洗浄を行った。１：１００から２重で、血清を１：３に滴定し、列Ｈは血清のためのブランクとした。滴定は、５０μＬ／ウェルの体積で、アッセイ希釈液中において行った。プレートを、室温で１時間インキュベートした。次に、３サイクル洗浄を行った。１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋（５０μＬ／ウェル）中の１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）のヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。次いで、ペーパータオルで軽く押さえてプレートを乾燥させた。最後に、１ステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）（５０μＬ／ウェル）をプレートに添加し、室温で３０分後、１Ｎ 塩酸（５０μＬ／ウェル）を用いて反応停止処理を行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
ＰＣＳＫ９が結合したプレートを検出するための陽性対照は、アッセイ希釈液中の３μｇ／ｍＬから２重で１：３に滴定された可溶性ＬＤＬ受容体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃２１４８ＬＤ／ＣＦ）およびポリクローナルウサギ抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｃａｙｍｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＃１０００７１８５）であった。４００ｎｇ／ｍＬの濃度でヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＡＦ２１４８）およびウサギ抗ヤギＩｇＧＦｃ ＨＲＰを用いて、ＬＤＬＲを検出し、アッセイ希釈液中の、４００ｎｇ／ｍＬの濃度で抗ウサギＩｇＧ Ｆｃを用いて、ウサギポリクローナルを検出した。陰性対照は、アッセイ希釈液中の１：１００から２重で１：３に滴定されたナイーブＸＭＧ２−ＫＬおよびＸＭＧ４−ＫＬ血清であった。
Ｖ５Ｈｉｓタグを持つｂ−ＰＣＳＫ９を含む試料に関しては、以下のプロトコルを使用した。Ｃｏｓｔａｒ３３６８培地結合プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。このプレートを、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジ化物（５０μＬ／ウェル）中の８μｇ／ｍＬのニュートラビジンで被覆した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍ３８４プレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。２５０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルクでプレートを遮断し、室温で約３０分間インキュベートした。次いで、Ｍ３８４プレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。捕捉は、Ｖ５タグを持つｂヒトＰＣＳＫ９であり、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋（４０μＬ／ウェル）中に２μｇ／ｍＬで添加された。次いで、プレートを、室温で１時間インキュベートした。３サイクル洗浄を行った。１：１００から２重で、血清を１：３に滴定し、列Ｈは血清のためのブランクとした。滴定は、５０μＬ／ウェルの体積で、アッセイ希釈液中において行った。プレートを、室温で１時間インキュベートした。次に、サイクル洗浄を用いて作動されるＭ３８４プレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中の４００ｎｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰを５０μＬ／ウェルでプレートに添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。次いで、ペーパータオルで軽く押さえてプレートを乾燥させた。最後に、１ステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）（５０μＬ／ウェル）をプレートに添加し、室温で３０分後に、１Ｎ 塩酸（５０μＬ／ウェル）を用いて、プレートの反応停止処理を行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
陽性対照は、ＬＤＬＲ、アッセイ希釈液中の３μｇ／ｍＬから２重で１：３に滴定されたウサギ抗ＰＣＳＫ９であった。４００ｎｇ／ｍＬの濃度でヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃ＡＦ２１４８）およびウサギ抗ヤギＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰを用いてＬＤＬＲを検出し、アッセイ希釈液中の、４００ｎｇ／ｍＬの濃度でヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃを用いてウサギポリを検出した。ヒト抗Ｈｉｓ１．２，３および抗Ｖ５ １．７．１は、アッセイ希釈液中の１μｇ／ｍＬから２重で１：３に滴定され、両方とも、アッセイ希釈液中の４００ｎｇ／ｍＬの濃度でヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰで検出した。陰性対照は、アッセイ希釈液中の１：１００から２重で１：３に滴定されたナイーブＸＭＧ２−ＫＬおよびＸＭＧ４−ＫＬ血清であった。
ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体の力価は、記載される可溶性抗原を用いて免疫化されたマウスのＥＬＩＳＡアッセイによって試験した。表４は、ＥＬＩＳＡデータを要約し、ＰＣＳＫ９に対して特異的であるように見られる幾つかのマウスが存在したことを示す。例えば、表４を参照のこと。したがって、免疫化プログラムの終わりに、１０匹のマウス（表４中の太字）を採集のために選択し、本明細書に記載されるように、それぞれ、脾臓およびリンパ節から脾細胞およびリンパ球を単離した。
Figure 0006166717
実施例２
リンパ球の回収、Ｂ細胞の単離、融合、およびハイブリドーマの生成
この実施例は、免疫細胞がどのようにして回収され、ハイブリドーマがどのようにして生成されたかについて概説する。選択された免疫化マウスを頸椎脱臼によって殺処分し、それぞれのコホートから流入領域リンパ節を採集し、プールした。細胞を組織から放出させるために、ＤＭＥＭ中で磨り潰すことによって、リンパ系組織からＢ細胞を解離させ、細胞をＤＭＥＭ中に懸濁した。細胞を計数し、穏やかに、但し、完全に細胞を再懸濁させるために、１億個のリンパ球につき０．９ｍＬのＤＭＥＭを細胞沈降物に添加した。
１：４の比で、リンパ球をＡＴＣＣ、カタログ＃ＣＲＬ１５８０から購入した非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞と混合した（Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９７９） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３，１５４８−１５５０）。４００×ｇで４分間の遠心分離によって、細胞混合物を穏やかにペレット化した。上清をデカントした後、１ｍＬピペットを用いて、細胞を穏やかに混合した。１分間にわたって、穏やかに撹拌しながら、Ｓｉｇｍａ（カタログ＃Ｐ７３０６）からの事前加熱されたＰＥＧ／ＤＭＳＯ溶液（Ｂ細胞１００万個当たり１ｍＬ）をゆっくり添加した後、１分間混合した。次いで、穏やかに撹拌しながら、２分間にわたって、事前加熱されたＩＤＭＥＭ（Ｂ細胞１００万個当たり２ｍＬ）（グルタミン、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ非必須アミノ酸なしのＤＭＥＭ）（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た）を添加した。最後に、３分間にわたって、事前加熱されたＩＤＭＥＭ（１０６個のＢ細胞当たり８ｍＬ）を添加した。
４００×ｇで６分間、融合された細胞を沈降させ、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＭＥＭ非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、２−メルカプトエタノール（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得た）、ＨＡ−アゼセリンヒポキサンチンおよびＯＰＩ（オキサロ酢酸、ピルビン酸塩、ウシインスリン）（両方ともＳｉｇｍａから得た）、ならびにＩＬ−６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ））が補充された、Ｂ細胞１００万個当たり２０ｍＬの選択培地（ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５％ ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中に再懸濁した。細胞は、３７Ｃで２０〜３０分間インキュベートし、次いで、２００ｍＬの選択培地中で再懸濁し、９６ウェルへの播種の前に、Ｔ１７５フラスコ中で３〜４日間培養した。このようにして、ＰＣＳＫ９に対する抗原結合タンパク質を生成したハイブリドーマを生成した。
実施例３
ＰＣＳＫ９抗体の選択
本実施例は、様々なＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質がどのようにして特徴付けされ、選択されたかについて概説する。ＰＣＳＫ９に対する分泌された抗体の結合（実施例１および２において生成されたハイブリドーマから生成された）が評価された。抗体の選択は、結合データおよびＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合の阻害および親和性に基づいた。以下に記載されるように、ＥＬＩＳＡによって、可溶性ＰＣＳＫ９への結合を分析した。結合親和性を定量化するために、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（表面プラズモン共鳴）を使用した。
一次スクリーニング
野生型ＰＣＳＫ９に結合する抗体に対する一次スクリーニングを行った。２つの採集物に対して、一次スクリーニングを行った。一次スクリーニングは、ＥＬＩＳＡアッセイを含み、以下のプロトコルを用いて行った。
Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。このプレートを、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、４μｇ／ｍＬの濃度のニュートラビジンで被覆した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。９０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルクで、プレートを遮断し、室温で約３０分間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄した。再度、３サイクル洗浄を行った。捕捉試料は、Ｖ５タグを持たないビオチン化されたＰＣＳＫ９であり、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中に０．９μｇ／ｍＬで添加された。次いで、プレートを、室温で１時間インキュベートした。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１０μＬの上清を、４０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中に移し、室温で１．５時間インキュベートした。再度、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度の４０μＬ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＰＯＤをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。最後に、４０μＬ／ウェルの１ステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）をプレートに添加し、室温で３０分後、４０μＬ／ウェルの１Ｎ 塩酸を用いて反応停止処理を行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
一次スクリーニングは、２つの採集物から特定された合計３１０４の抗原特異的ハイブリドーマを生じた。最高のＥＬＩＳＡ ＯＤに基づいて、合計３０００の陽性に対して、１採集物当たり１５００のハイブリドーマを進行させた。
確認的スクリーニング
次いで、安定なハイブリドーマが確立されたことを確認するために、野生型ＰＣＳＫ９への結合に関して、３０００の陽性を再スクリーニングした。スクリーニングは、以下のように行った。Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。このプレートを、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、３μｇ／ｍＬのニュートラビジンで被覆した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。９０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルクで、プレートを遮断し、室温で約３０分間インキュベートした。次いで、Ｍ３８４プレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。捕捉試料は、Ｖ５タグを持たないｂ−ＰＣＳＫ９であり、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中に０．９μｇ／ｍＬで添加された。次いで、プレートを、室温で１時間インキュベートした。次に、３サイクル洗浄を用いて、プレートを洗浄した。１０μＬの上清を、４０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中に移し、室温で１．５時間インキュベートした。再度、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度の４０μＬ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＰＯＤをプレートに添加し、このプレートを室温で１時間インキュベートした。３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートをもう一度洗浄した。最後に、４０μＬ／ウェルの１ステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）をプレートに添加し、室温で３０分後、４０μＬ／ウェルの１Ｎ 塩酸を用いて反応停止処理を行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。合計２４４１の陽性を、第２のスクリーニングで反復した。次いで、これらの抗体は、その後のスクリーニングにおいて使用された。
マウス交差反応スクリーニング
次いで、抗体がヒトおよびマウスＰＣＳＫ９の両方に結合できることを確認するために、マウスＰＣＳＫ９に対する交差反応性に関して、ハイブリドーマのパネルをスクリーニングした。交差反応スクリーニングにおいて、以下のプロトコルを使用した。Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。このプレートを、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、３μｇ／ｍＬのニュートラビジンで被覆した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。９０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルクで、プレートを遮断し、室温で約３０分間インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。捕捉試料は、ビオチン化されたマウスＰＣＳＫ９であり、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中に１μｇ／ｍＬで添加された。次いで、プレートを、室温で１時間インキュベートした。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。５０μＬの上清を、プレートに移し、室温で１時間インキュベートした。再度、３サイクル洗浄を用いて、プレートを洗浄した。１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中、１００ｎｇ／ｍＬ（１：４０００）の濃度の４０μＬ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＰＯＤをプレートに添加し、このプレートを室温で１時間インキュベートした。３サイクル洗浄を用いて、プレートをもう一度洗浄した。最後に、４０μＬ／ウェルの１ステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）をプレートに添加し、室温で３０分後、４０μＬ／ウェルの１Ｎ 塩酸を用いて反応停止処理を行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。５７９抗体は、マウスＰＣＳＫ９と交差反応することが観察された。次いで、これらの抗体は、その後のスクリーニングにおいて使用された。
Ｄ３７４Ｙ突然変異体結合スクリーニング
ＰＣＳＫ９中のＤ３７４Ｙ突然変異体は、ヒト集団において文書で証明されている（例えば、Ｔｉｍｍｓ ＫＭ ｅｔ ａｌ，“Ａ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＰＣＳＫ９ ｃａｕｓｉｎｇ ａｕｔｏｓｏｍａｌ−ｄｏｍｉｎａｎｔ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ ｉｎ ａ Ｕｔａｈ ｐｅｄｉｇｒｅｅ”，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１１４：３４９−３５３，２００４）。抗体が野生型に対して特異的であり、またはＰＣＳＫ９のＤ３７４Ｙ形態に結合されているかどうかを決定するために、次いで、試料は、突然変異体Ｄ３７４Ｙを含む突然変異体ＰＣＳＫ９配列への結合に関して、スクリーニングされた。スクリーニングのためのプロトコルは、以下の通りであった。Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をスクリーニングにおいて使用した。このプレートを、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、４μｇ／ｍＬのニュートラビジンで被覆した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。９０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルクで、プレートを遮断し、室温で約３０分間インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１μｇ／ｍＬの濃度のビオチン化されたヒトＰＣＳＫ９ Ｄ３７４Ｙでプレートを被覆し、室温で１時間インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。後期枯渇ハイブリドーマ培養上清をＰＢＳ／ミルク／Ｃａ２＋中に１：５希釈し（１０ｍＬ＋４０ｍＬ）、室温で１時間インキュベートした。次に、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、１μｇ／ｍＬで、４０μＬ／ウェルのウサギ抗ヒトＰＣＳＫ９（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）およびヒト抗Ｈｉｓ１．２．３を１：２でプレート上に滴定し、次いで、これを室温で１時間インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中の１００ｎｇ／ｍＬの濃度（１：４０００）の４０μＬ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰをプレートに添加し、このプレートを室温で１時間インキュベートした。１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中の１００ｎｇ／ｍＬの濃度（１：４０００）の４０μＬ／ウェルのヤギ抗ウサギＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰをプレートに添加し、このプレートを室温で１時間インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。最後に、４０μＬ／ウェルの１ステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）をプレートに添加し、室温で３０分後に、４０μＬ／ウェルの１Ｎ 塩酸を用いて反応停止処理を行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。野生型ＰＣＳＫ９に対する陽性ヒットの９６％以上が、突然変異体ＰＣＳＫ９にも結合した。
大規模受容体リガンド遮断スクリーニング
ＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９結合を遮断する抗体をスクリーニングするために、Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９突然変異体を用いたアッセイを開発した。ＬＤＬＲに対してより高い結合親和性を有するので、このアッセイに対してこの突然変異体が使用され、より感度が高い受容体リガンド遮断アッセイの開発を可能とした。受容体リガンド遮断スクリーニングにおいて、以下のプロトコルを使用した。Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をスクリーニングにおいて使用した。このプレートを、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、２μｇ／ｍＬのヤギ抗ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ カタログ＃ＡＦ２１４８）で被覆した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。９０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルクでプレートを遮断し、室温で約３０分間インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。捕捉試料は、ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ、カタログ＃２１４８ＬＤ／ＣＦ）であり、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中に０．４μｇ／ｍＬで添加された。次いで、プレートを、室温で１時間１０分間インキュベートした。同時に、２０ｎｇ／ｍＬのビオチン化されたヒトＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９を、Ｎｕｎｃポリプロピレンプレート中の１５μＬのハイブリドーマ枯渇上清とともにインキュベートし、枯渇上清濃度を１：５希釈した。次いで、このプレートを室温で約１時間３０分間事前にインキュベートした。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。５０μＬ／ウェルの事前にインキュベートした混合物を、ＬＤＬＲで被覆されたＥＬＩＳＡプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。ＬＤＬＲに結合されたｂ−ＰＣＳＫ９を検出するために、５００ｎｇ／ｍＬのアッセイ希釈液中の４０μＬ／ウェルのストレプトアビジンＨＲＰをプレートに添加した。プレートを、室温で１時間インキュベートした。再度、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。最後に、４０μＬ／ウェルの１ステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）をプレートに添加し、室温で３０分後に、４０μＬ／ウェルの１Ｎ 塩酸を用いて反応停止処理を行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。スクリーニングは、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲウェルとの間の相互作用を遮断した特定された３８４の抗体を特定し、１００の抗体が、相互作用を強く遮断した（ＯＤ＜０．３）。これらの抗体は、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの結合相互作用を９０％超阻害した（９０％超の阻害）。
遮断物質のサブセットに対する受容体リガンド結合アッセイ
次いで、第１の大規模受容体リガンド阻害アッセイにおいて特定された中和物質の３８４メンバーのサブセットに対して、突然変異体酵素を用いて受容体リガンドアッセイを反復した。３８４メンバーの遮断物質サブセットアッセイのスクリーニングにおいて、大規模受容体リガンド遮断スクリーニングにおいて行われたものと同じプロトコルを使用した。この反復スクリーニングは、初期のスクリーニングデータを確認した。
３８４メンバーのサブセットのこのスクリーニングは、ＰＣＳＫ９突然変異体酵素と９０％超のＬＤＬＲとの間の相互作用を遮断する８５の抗体が特定された。
野生型ＰＣＳＫ９に結合するが、Ｄ３７４Ｙ突然変異体に結合しない遮断物質の受容体リガンド結合アッセイ
３０００の上清の初期パネルでは、野生型ＰＣＳＫ９に特異的に結合するが、ｈｕＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）突然変異体に結合しないことが示される８６の抗体が存在した。ＬＤＬＲ受容体への野生型ＰＣＳＫ９結合を遮断する能力について、これらの８６の上清を試験した。以下のプロトコルを使用した。Ｃｏｓｔａｒ３７０２培地結合３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をスクリーニングにおいて使用した。このプレートを、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／０．０５％アジ化物中、１０μｇ／ｍＬの抗Ｈｉｓ１．２．３で被覆した。プレートを、４℃で一晩インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。９０μＬの１ＸＰＢＳ／１％ミルクで、プレートを遮断し、室温で約３０分間インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。ＬＤＬＲ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２１４８ＬＤ／ＣＦまたはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，＃２１４８ＬＤ）を、４０μＬ／ウェルの体積で、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭ Ｃａ２＋中に５μｇ／ｍＬで添加された。次いで、プレートを、室温で１時間インキュベートした。次に、３サイクル洗浄を用いて作動されるＴｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。同時に、ビオチン化されたヒト野生型ＰＣＳＫ９を、Ｎｕｎｃポリプロピレンプレート中のハイブリドーマ枯渇上清とともに事前にインキュベートした。２２μＬのハイブリドーマ上清を、１ＸＰＢＳ／１％ミルク／１０ｍＭＣａ２＋中、５８３ｎｇ／ｍＬの濃度３３ｕＬのｂ−ＰＣＳＫ９に移し、最終のｂ−ＰＣＳＫ９濃度＝３５０ｎｇ／ｍＬおよび１：２．５の最終希釈で枯渇上清を得た。次いで、プレートを、室温で１時間３０分間事前にインキュベートした。５０μＬ／ウェルの事前にインキュベートされた混合物を、ＬＤＬＲが捕捉されたＥＬＩＳＡプレート上に移し、室温で１時間インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。５００ｎｇ／ｍＬのアッセイ希釈液中の４０μＬ／ウェルのストレプトアビジンＨＲＰをプレートに添加した。プレートを、室温で１時間インキュベートした。次いで、Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレート洗浄装置を用いて、プレートを洗浄した。３サイクル洗浄を行った。最後に、４０μＬ／ウェルの１ステップＴＭＢ（Ｎｅｏｇｅｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）をプレートに添加し、室温で３０分後に、４０μＬ／ウェルの１Ｎ 塩酸を用いて反応停止処理を行った。Ｔｉｔｅｒｔｅｋプレートリーダーを用いて、４５０ｎｍでＯＤを直ちに読み取った。
スクリーニングの結果
記載されるアッセイの結果に基づいて、ＰＣＳＫ９との所望の相互作用を有する抗体を生成するとして、幾つかのハイブリドーマ株が特定された。それぞれの株からの管理可能な数のクローンを単離するために、限外希釈を使用した。ハイブリドーマ株番号（例えば、２１Ｂ１２）およびクローン番号（例えば、２１Ｂ１２．１）によって、クローンを表記した。一般に、本明細書に記載されている機能的アッセイによって、特定の株の異なるクローン間には、差は検出されなかった。少数の例では、機能的アッセイにおいて異なる挙動を示した特定の株からクローンが特定され、例えば、２５Ａ７．１は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲを遮断しないが、２５Ａ７．３（本明細書において、２５Ａ７と称される）は中和性であることが見出された。単離されたクローンはそれぞれ、５０〜１００ｍＬのハイブリドーマ培地中で拡大させ、枯渇するまで（すなわち、約１０％未満の細胞生存率）膨張させた。これらの培養物の上清中でのＰＣＳＫ９に対する抗体の濃度および効力は、本明細書に記載されるようなＥＬＩＳＡによって、およびインビトロ機能的試験によって決定された。本明細書に記載されるスクリーニングの結果として、ＰＣＳＫ９に対する抗体の最も高い力価を有するハイブリドーマを特定した。選択されたハイブリドーマを、図２Ａ〜３Ｄおよび表２に示す。
実施例４．１
ハイブリドーマからのヒト３１Ｈ４ ＩｇＧ４抗体の生成
この実施例は、一般に、抗原結合タンパク質のうちの１つがハイブリドーマ株からどのように生成されたかについて記載する。生成作業は、５０ｍＬの枯渇上清作製を使用した後、プロテインＡ精製を行った。Ｉｎｔｅｇｒａ生成を大規模化し、その後実行した。ハイブリドーマ株３１Ｈ４を、２０ｍＬの培地中のＴ７５フラスコ中で増殖させた（Ｉｎｔｅｇｒａ培地、表５）。ハイブリドーマがＴ７５フラスコ中でほぼ集密状態になった時点で、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコに移した（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００、カタログ＃９０ ００５）。
Ｉｎｔｅｇｒａフラスコは、２つのチャンバーである小チャンバーおよび大チャンバーへ膜によって分けられた細胞培養フラスコである。３１Ｈ４ハイブリドーマ株からの１ｍＬ当たり１×１０６細胞の最小細胞密度の２０〜３０ｍＬの体積のハイブリドーマ細胞を、Ｉｎｔｅｇｒａ培地中のＩｎｔｅｇｒａフラスコの小チャンバー中に配置した（Ｉｎｔｅｇｒａ培地の成分に関しては、表５を参照）。Ｉｎｔｅｇｒａ培地のみ（１Ｌ）を、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの大チャンバー中に配置した。２つのチャンバーを分割する膜は、小分子量の栄養素に対して透過性であるが、ハイブリドーマ細胞およびハイブリドーマ細胞によって生成された抗体に対して不透過性である。したがって、ハイブリドーマ細胞およびこれらのハイブリドーマ細胞によって生成された抗体は、小チャンバー中に保持された。
１週間後、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの両チャンバーから培地を除去し、新鮮なＩｎｔｅｇｒａ培地と交換した。小チャンバーから採取された培地は、別々に保持された。増殖から２週間後、小チャンバーからの培地を再度採取した。１週目にハイブリドーマ株から採取された培地を、２週目にハイブリドーマ株から採取された培地と合わせた。ハイブリドーマ株から得られた採取された培地試料を遠心分離して、細胞および細胞片を除去して（３０００ｒｐｍで１５分）、得られた上清を濾過した（０．２２μｍ）。浄化された馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に装填した。任意に、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡ−セファロースカラム上に装填することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラム上に結合された抗体タンパク質は、プロテインＡカラムからの標準的な酸性抗体溶出（例えば、５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ３．０）によって回収された。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーまたはＱセファロース樹脂等の陰イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。３１Ｈ４タンパク質に対して特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ７．８〜８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム体積の１０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
Figure 0006166717
実施例４．２
トランスフェクト細胞からの組換え３１Ｈ４ヒトＩｇＧ２抗体の生成
本実施例は、３１Ｈ４ ＩｇＧ２抗体がトランスフェクト細胞からどのようにして生成されたかを概説している。一過性発現のために２９３細胞および安定な発現のためにＣＨＯ細胞が、３１Ｈ４重および軽鎖をコードするプラスミドでトランスフェクトされた。細胞および細胞片を除去することによって、トランスフェクト細胞からの馴化培地を回収した。浄化された馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に装填した。任意に、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡ−セファロースカラム上に装填することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラム上に結合された抗体タンパク質は、プロテインＡカラムからの標準的な酸性抗体溶出（例えば、５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ３．０）によって回収された。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーまたはＱセファロース樹脂等の陰イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。３１Ｈ４タンパク質に対して特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ７．８〜８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム体積の１０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
実施例５
ハイブリドーマからのヒト２１Ｂ１２ ＩｇＧ４抗体の生成
本実施例は、抗体２１Ｂ１２ ＩｇＧ４がどのようにしてハイブリドーマから生成されたかを概説する。ハイブリドーマ株２１Ｂ１２を、培地中のＴ７５フラスコ中で増殖させた（Ｉｎｔｅｇｒａ培地、表５）。ハイブリドーマがＴ７５フラスコ中でほぼ集密状態になった時点で、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコに移した（Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｔｅｇｒａ ＣＬ１０００、カタログ＃９０ ００５）。
Ｉｎｔｅｇｒａフラスコは、２つのチャンバーである小チャンバーおよび大チャンバーへ膜によって分けられた細胞培養フラスコである。３１Ｈ４ハイブリドーマ株からの１ｍＬ当たり１×１０６細胞の最小細胞密度の２０〜３０ｍＬの体積のハイブリドーマ細胞を、Ｉｎｔｅｇｒａ培地中のＩｎｔｅｇｒａフラスコの小チャンバー中に配置した（Ｉｎｔｅｇｒａ培地の成分に関しては、表５を参照）。Ｉｎｔｅｇｒａ培地のみ（１Ｌ）を、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの大チャンバー中に配置した。２つのチャンバーを分割する膜は、小分子量の栄養素に対して透過性であるが、ハイブリドーマ細胞およびハイブリドーマ細胞によって生成された抗体に対して不透過性である。このようにして、ハイブリドーマ細胞およびこれらのハイブリドーマ細胞によって生成された抗体が、小チャンバー中に保持された。
１週間後、Ｉｎｔｅｇｒａフラスコの両チャンバーから培地を除去し、新鮮なＩｎｔｅｇｒａ培地と交換した。小チャンバーから採取された培地は、別々に保持された。増殖から２週間後、小チャンバーからの培地を再度採取した。１週目にハイブリドーマ株から採取された培地を、２週目にハイブリドーマ株から採取された培地と合わせた。ハイブリドーマ株から得られた採取された培地試料を遠心分離して、細胞および細胞片を除去して（３０００ｒｐｍで１５分）、得られた上清を濾過した（０．２２μｍ）。浄化された馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に装填した。任意に、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡ−セファロースカラム上に装填した。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラム上に結合された抗体タンパク質は、プロテインＡカラムからの標準的な酸性抗体溶出（例えば、５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ３．０）によって回収された。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーまたはＱセファロース樹脂等の陰イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。２１Ｂ１２タンパク質に対して特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ７．８〜８．０でＱ−セファロースＨＰである。２５カラム体積の１０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を用いて、抗体を溶出した。
実施例６
トランスフェクト細胞からのヒト２１Ｂ１２ ＩｇＧ２抗体の生成
本実施例は、２１Ｂ１２ ＩｇＧ２抗体がトランスフェクト細胞からどのようにして生成されたかを概説している。細胞（一過性発現のために２９３細胞および安定な発現のためにＣＨＯ細胞）が、２１Ｂ１２重および軽鎖をコードするプラスミドでトランスフェクトされた。細胞および細胞片を除去することによって、ハイブリドーマ細胞からの馴化培地を回収した。浄化された馴化培地をプロテインＡ−セファロースカラム上に装填した。任意に、培地をまず濃縮し、次いで、プロテインＡ−セファロースカラム上に装填することができる。徹底的なＰＢＳ洗浄によって、非特異的結合を除去した。プロテインＡカラム上に結合された抗体タンパク質は、プロテインＡカラムからの標準的な酸性抗体溶出（例えば、５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ３．０）によって回収された。プロテインＡセファロースプール中の凝集した抗体タンパク質を、サイズ排除クロマトグラフィーまたはＳＰセファロース樹脂等の陽イオン交換樹脂上の結合イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。２１Ｂ１２タンパク質に対して特異的なＩＥＸ条件は、ｐＨ５．２でＳＰ−セファロースＨＰである。２０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝剤中の１０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌ勾配を含有する緩衝液の２５カラム体積で抗体を溶出した。
実施例７
抗体重鎖および軽鎖の配列分析
次いで、Ｓａｎｇｅｒ（ジデオキシ）ヌクレオチド配列決定によって、上記抗体の軽鎖および重鎖に対する核酸およびアミノ酸配列を決定した。次いで、核酸配列に対してアミノ酸配列を推定した。可変ドメインに対する核酸配列を図３Ｅ〜３ＪＪに示す。
３１Ｈ４、２１Ｂ１２、および１６Ｆ１２のラムダ軽鎖可変領域に対するｃＤＮＡ配列が決定され、それぞれ、配列番号１５３、９５、および１０５として開示される。
３１Ｈ４、２１Ｂ１２、および１６Ｆ１２の重鎖可変領域に対するｃＤＮＡ配列が決定され、それぞれ、配列番号１５２、９４、および１０４として開示される。
ラムダ軽鎖定常領域（配列番号１５６）、ならびにＩｇＧ２およびＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号１５４および１５５）を図３ＫＫに示す。
これらのｃＤＮＡ配列のそれぞれから予想されたポリペプチド配列を決定した。３１Ｈ４、２１Ｂ１２、および１６Ｆ１２のラムダ軽鎖可変領域に対して予測されたポリペプチドが予測され、それぞれ、配列番号１２、２３、および３５として開示され、ラムダ軽鎖定常領域（配列番号１５６）、３１Ｈ４、２１Ｂ１２、および１６Ｆ１２の重鎖可変領域が予測され、それぞれ、（配列番号６７、４９、および７９として開示される。ＩｇＧ２およびＩｇＧ４重鎖定常領域（配列番号１５４および１５５）。
ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の分類を図２Ａ〜３Ｄに示す。
配列データに基づいて、それぞれの重鎖または軽鎖可変領域が得られた生殖系列遺伝子が決定された。生殖系列遺伝子の特定は、図２Ａ〜３Ｄ中において、対応するハイブリドーマ株の隣に示され、それぞれが、固有の配列番号によって表される。図２Ａ〜３Ｄはまた、特徴付けられたさらなる抗体に対して決定されたアミノ酸配列も示す。
実施例８
ＰＣＳＫ９に対する抗体の結合の特徴付け
ＰＣＳＫ９に結合する多くの抗体が特定され、幾つかのアプローチが、結合の性質を定量化し、それをさらに特徴付けるために使用された。研究の一態様では、Ｂｉａｃｏｒｅ親和性分析が行われた。研究の別の態様では、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）親和性分析が行われた。これらの研究において使用された試料および緩衝剤を下の表６に示す。
Figure 0006166717
ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）親和性測定
この実施例に記載されるＰＣＳＫ９に対する２１Ｂ１２抗体のＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（表面プラズモン共鳴装置、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）親和性分析は、製造業者の説明書に従って行われた。
簡潔に述べると、表面プラズモン共鳴実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００光学的バイオセンサー（Ｂｉａｃｏｒｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて行われた。それぞれの個別の抗ＰＣＳＫ９抗体は、２００以下の共鳴単位（ＲＵ）の最大分析物結合応答（Ｒｍａｘ）を与えるレベルで、アミン結合によって研究等級のＣＭ５バイオセンサーチップに固定化された。ＰＣＳＫ９タンパク質の濃度は、２倍間隔で変動させ（分析物）、（１．５分間、１００μＬ／分の流速で）固定化された抗体表面上に注入した。０．０１％ ＢＳＡが補充された新鮮なＨＢＳ−Ｐ緩衝剤（ｐＨ７．４、０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ−２０、Ｂｉａｃｏｒｅ）が結合緩衝剤として使用された。それぞれの抗ＰＣＳＫ９抗体の結合親和性は、ｐＨ７．４で、ヒト、マウス、およびカニクイザルのＰＣＳＫ９タンパク質のそれぞれに対する別々の実験において測定された（使用された濃度は、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、および０ｎＭであった）。
さらに、ヒトＰＣＳＫ９に対する抗体の結合親和性はまた、０．０１％ ＢＳＡが補充されたｐＨ６．０のＨＢＳ−Ｐ緩衝剤（ｐＨ６．０、０．０１Ｍ Ｈｅｐｅｓ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ 界面活性剤Ｐ−２０、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、ｐＨ６．０でも測定された。得られた結合シグナルは、溶液中の遊離ＰＣＳＫ９に比例した。解離平衡定数（ＫＤ）は、二重曲線一部位均一結合モデル（ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）ソフトウェア、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）（６．０ｐＨの実行に対して、ｎ＝１）を用いて、競合曲線の非線形回帰分析から得た。興味深いことに、抗体は、より低いｐＨで、より強固な結合親和性を示すように見受けられた（Ｋｄはそれぞれ、３１Ｈ４、２１Ｂ１２、および１６Ｆ１２に対して、１２．５、７．３、および２９ｐＭであった）。
ｋａ（会合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（解離平衡定数）を含む抗体結合の速度論的パラメータを、ＢＩＡ評価３．１コンピュータプログラム（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて測定した。より低い解離平衡定数は、ＰＣＳＫ９に対する抗体のより大きな親和性を示す。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）親和性分析によって測定されたＫＤ値を、以下に示される表７．１に表す。
Figure 0006166717
表７．２は、ｋｏｎおよびｋｏｆｆ速度を示す。
Figure 0006166717
ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）親和性測定
１６Ｆ１２および３１Ｈ４のＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）親和性分析が、製造業者の説明書に従って行われた。簡潔に述べると、Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ（商標）（６ｘ）（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ヒトＶ５タグ付加されたカニクイザルまたはＨｉｓタグ付加されたマウスＰＣＳＫ９タンパク質のうちの１つを用いて事前に被覆し、ＢＳＡにより遮断した。次いで、１０または１００ｐＭの抗体３１Ｈ４およびＰＣＳＫ９タンパク質のうちの１つを、ＰＣＳＫ９で被覆されたビーズを通過させる前に、室温で８時間、様々な濃度（０．１ｐＭ〜２５ｎＭ）のＰＣＳＫ９タンパク質とともにインキュベートした。ビーズが結合された３１Ｈ４の量は、蛍光的に（Ｃｙ５）標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）によって定量化した。結合シグナルは、結合平衡で遊離３１Ｈ４の濃度に比例する。平衡解離定数（ＫＤ）は、一部位均一結合モデルを用いて、競合曲線の２つの組の非線形回帰から得た。ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェアを分析において使用した。この分析において作製された結合曲線が、図４Ａ〜４Ｆとして表されている。
１６Ｆ１２および３１Ｈ４抗体はいずれも、ヒトおよびカニクイザルＰＣＳＫ９に対して類似の親和性を示したが、マウスＰＣＳＫ９に対して約１０〜２５０倍低い親和性を示した。ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）システムを用いて試験された２つの抗体のうち、抗体３１Ｈ４はそれぞれ、３および２ｐＭのＫＤで、ヒトおよびカニクイザルＰＣＳＫ９の両方に対してより高い親和性を示した。１６Ｆ１２は、ヒトＰＣＳＫ９に対して１５ｐＭのＫＤで、カニクイザルＰＣＳＫ９に対して１６ｐＭのＫＤで、若干より弱い親和性を示した。
ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）親和性分析の結果を、以下に示される表８．１に要約する。
Figure 0006166717
さらに、試料の質および量を確認するために、ＳＤＳ ＰＡＧＥを実施し、図５Ａに示す。ｃＰＣＳＫ９は、ゲル上で約５０％未満を示し、ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）アッセイから計算された活性結合濃度からも示した。したがって、ｃＰＣＳＫ９に対するのｍＡｂのＫＤは、活性なｃＰＣＳＫ９の５０％として存在するように調整された。
ＢＩＡｃｏｒｅ溶液平衡結合アッセイは、ＡＢＰ２１Ｂ１２に対するＫｄ値を測定するために使用した。２１Ｂ１２．１は、ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いてほとんどシグナルを示さず、そのため、ｂｉａｃｏｒｅ溶液平衡結合アッセイを使用した。固定化されたＰＣＳＫ９表面への抗体の結合に対して有意な結合が観察されなかったため、約７０００ＲＵの密度でアミン結合を用いて、ＣＭ５チップのフローセル４の上に２１Ｂ１２抗体を固定化した。フローセル３を、バックグラウンド対照として使用した。０．３、１、および３ｎＭのヒトＰＣＳＫ９またはカニクイザルＰＣＳＫ９を、０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、０．００５％ Ｐ２０を加えたＰＢＳ中の２１Ｂ１２．１抗体試料（０．００１〜２５ｎＭの範囲）を段階希釈して混合した。混合された溶液中での遊離ＰＣＳＫ９の結合を、２１Ｂ１２．１抗体表面上に注入することによって測定した。２１Ｂ１２．１表面上の１００％ ＰＣＳＫ９結合シグナルを、溶液中のｍＡｂの不在下で判定した。ｍＡｂの濃度の増加に伴うＰＣＳＫ９結合応答の減少は、溶液中でのｍＡｂへのＰＣＳＫ９の結合が、固定化されたペプチボディ表面への結合からＰＣＳＫ９を遮断したことを示した。ｍＡｂ濃度に対してＰＣＳＫ９結合シグナルをプロットして、ＫｉｎＥｘＡ Ｐｒｏ（商標）ソフトウェア中の一部位均一結合モデルを用いて３つの組の曲線（０．３、１、および３ｎＭの固定されたＰＣＳＫ９濃度）からＫＤを計算した。ｃＰＣＳＫ９は、ＫｉｎＥｘＡアッセイおよびＳＤＳ−ゲルから観察されたより低いタンパク質濃度を有するが、ｃＰＣＳＫ９の濃度がＫＤの計算のために使用されなかったため、ここでは、その濃度は調整しなかった。これらの結果を以下の表８．２および図５Ｂ〜５Ｄ中に示す。図５Ｂは、ｈＰＣＳＫ９に対する３つの異なるｈＰＣＳＫ９濃度での溶液平衡アッセイからの結果を示す。図５Ｃは、ｍＰＣＳＫ９に対する一群の類似の結果を示す。図５Ｄは、上記ｂｉａｃｏｒｅ捕捉アッセイからの結果を示す。
Figure 0006166717
実施例９
Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合を遮断することについての３１Ｈ４および２１Ｂ１２の有効性
この実施例は、ＰＣＳＫ９ Ｄ３７４ＹのＬＤＬＲに結合する能力を遮断する上での、抗体の２つに対するＩＣ５０値を提供する。透明な３８４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、緩衝剤Ａ（１００ｍＭ カコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中で希釈された２マイクログラム／ｍＬのヤギ抗ＬＤＬ受容体抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆した。プレートを緩衝剤Ａで十分に洗浄し、次いで、緩衝剤Ｂ（緩衝剤Ａ中の１％ミルク）で２時間遮断した。洗浄後、緩衝剤Ｃ（１０ｍＭ ＣａＣｌ２が補充された緩衝剤Ｂ）中で希釈された０．４マイクログラム／ｍＬのＬＤＬ受容体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、プレートを１．５時間インキュベートした。このインキュベーションと同時に、緩衝剤Ａ中に希釈された様々な濃度の３１Ｈ４ ＩｇＧ２、３１Ｈ４ ＩｇＧ４、２１Ｂ１２ ＩｇＧ２、または２１Ｂ１２ ＩｇＧ４抗体、または緩衝剤Ａのみ（対照）とともに、２０ｎｇ／ｍＬのビオチン化されたＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９をインキュベートした。ＬＤＬ受容体を含有するプレートを洗浄し、ビオチン化されたＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９／抗体の混合物をそれらに移し、室温で１時間インキュベートした。ＬＤＬ受容体へのビオチン化されたＤ３７４Ｙの結合を、緩衝剤Ｃ中の５００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）とともにインキュベートし、続いて、ＴＭＢ基質（ＫＰＬ）とともにインキュベートすることによって検出した。１Ｎ ＨＣｌを用いて、このシグナルを消光し、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。
この結合研究の結果を、図６Ａ〜６Ｄに示す。要約すると、それぞれの抗体に対してＩＣ５０値を測定し、３１Ｈ４ ＩｇＧ２に対して１９９ｐＭ（図６Ａ）、３１Ｈ４ ＩｇＧ４に対して１５６ｐＭ（図６Ｂ）、２１Ｂ１２ ＩｇＧ２に対して１７０ｐＭ（図６Ｃ）、および２１Ｂ１２ ＩｇＧ４に対して１６９ｐＭ（図６Ｄ）であることが見出された。
抗体はまた、このアッセイにおいて、ＬＤＬＲへの野生型ＰＣＳＫ９の結合も遮断した。
実施例１０
細胞ＬＤＬ取り込みアッセイ
この実施例は、細胞によるＬＤＬ取り込みを減少させる様々な抗原結合タンパク質の能力を示す。１０％ ＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ）中の１ウェル当たり５×１０５細胞の濃度で、黒色透明底９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に、ヒトＨｅｐＧ２細胞を播種し、３７℃（５％ ＣＯ２）で一晩インキュベートした。ＰＣＳＫ９および抗体複合体を形成するために、取り込み緩衝剤（１％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ）中に希釈された様々な濃度の抗体または取り込み緩衝剤のみ（対照）とともに、室温で１時間、２μｇ／ｍＬのＤ３７４ＹヒトＰＣＳＫ９をインキュベートした。ＰＢＳで細胞を洗浄した後、Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９／抗体の混合物を細胞に移し、続いて、６μｇ／ｍＬの最終濃度で、取り込み緩衝剤中にＬＤＬ−ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を希釈した。３７℃（５％ ＣＯ２）で３時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで完全に洗浄し、４８０〜５２０ｎｍ（励起）および５２０〜６００ｎｍ（発光）で、Ｓａｆｉｒｅ（商標）（ＴＥＣＡＮ）によって、細胞蛍光シグナルを検出した。
細胞取り込みアッセイの結果を図７Ａ〜７Ｄに示す。要約すると、それぞれの抗体に対してＩＣ５０値を測定し、３１Ｈ４ ＩｇＧ２に対して１６．７ｎＭ（図７Ａ）、３１Ｈ４ ＩｇＧ４に対して１３．３ｎＭ（図７Ｂ）、２１Ｂ１２ ＩｇＧ２に対して１３．３ｎＭ（図７Ｃ）、および２１Ｂ１２ ＩｇＧ４に対して１８ｎＭ（図７Ｄ）であることが見出された。これらの結果は、適用された抗原結合タンパク質がＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）の効果を減少させて、細胞によるＬＤＬ取り込みを遮断することができることを示す。抗体はまた、このアッセイにおいて野生型ＰＣＳＫ９の効果も遮断した。
実施例１１
６日間の研究における３１Ｈ４抗体の血清コレステロール低下効果
ＰＣＳＫ９タンパク質に対する抗体療法を介した野生型（ＷＴ）マウスにおける総血清コレステロール（ＴＣ）低下を評価するために、以下の手順を行った。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得られた雄の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統、９〜１０週齢、１７〜２７ｇ）に、実験の期間を通じて、通常の食餌（Ｈａｒｌａｎｄ−Ｔｅｋｌａｄ，Ｄｉｅｔ ２９１８）を与えた。Ｔ＝０において、マウスの尾静脈を通じて、１０ｍｇ／ｋｇのレベルで、抗ＰＣＳＫ９抗体３１Ｈ４（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）または対照ＩｇＧ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）のいずれかをマウスに投与した。ナイーブマウスも、ナイーブ対照群として別に分けた。投与群および殺処分の時間を表９に示す。
Figure 0006166717
表９に示される所定の時点でＣＯ２窒息を用いて、マウスを殺処分した。大静脈を介して、エッペンドルフチューブの中に血液を採取し、室温で３０分間凝固させた。次いで、血清を分離するために、１０分間、１２，０００×ｇでの卓上遠心機中で、試料を遠心沈降させた。Ｈｉｔａｃｈｉ９１２臨床分析装置およびＲｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ ＴＣおよびＨＤＬ−Ｃキットを用いて、血清総コレステロールおよびＨＤＬ−Ｃを測定した。
実験の結果を図８Ａ〜８Ｄに示す。要約すると、抗体３１Ｈ４が投与されたマウスは、実験の間に、血清コレステロールレベルの減少を示した（図８Ａおよび図８Ｂ）。さらに、マウスはＨＤＬレベルの減少も示したことが注目される（図８Ｃおよび図８Ｄ）。図８Ａおよび図８Ｃに関して、割合の変化は、同じ時点での対照ＩｇＧに関するものである（＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５）。図８Ｂおよび図８Ｄに関して、割合の変化は、ｔ＝０時間で、ナイーブ動物において測定された総血清コレステロールおよびＨＤＬレベルに関するものである（＊Ｐ＜０．０１、＃Ｐ＜０．０５）。
ＨＤＬレベルの低下に関して、マウスにおけるＨＤＬの減少はＨＤＬの減少がヒトで起きることを示すものではなく、この生物における血清コレステロールが減少したことをさらに反映するに過ぎないことが当業者に理解されることが注目される。マウスは高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子中に血清コレステロールの大部分を輸送し、これはＬＤＬ粒子上にほとんどの血清コレステロールを有するヒトとは異なることが注目される。マウスでは、総血清コレステロールの測定は、血清ＨＤＬ−Ｃのレベルを最も近似する。マウスＨＤＬは、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）に対するリガンドであるアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）を含有しており、ＬＤＬＲによってそれが排除されることを可能とする。したがって、ＨＤＬを調べることは、マウスにおける、本実施例での適切な指標である（ＨＤＬの減少は、ヒトに対しては予測されないことが理解される）。例えば、対照的に、ヒトＨＤＬは、ａｐｏＥを含有せず、ＬＤＬＲに対するリガンドではない。ＰＣＳＫ９抗体は、マウスにおけるＬＤＬＲ発現を増加させると、肝臓は、より多くのＨＤＬを排除させることができ、したがって、血清ＨＤＬ−Ｃレベルを低下させる。
実施例１２
６日間の研究におけるＬＤＬＲレベルに対する抗体３１Ｈ４の効果
本実施例は、予測されるように、抗原結合タンパク質が時間とともに、対象におけるＬＤＬＲのレベルを変化させることを示す。ＬＤＬＲレベルに対する抗体３１Ｈ４の効果を確認するために、ウェスタンブロット分析を行った。実施例１３に記載される殺処分したマウスから得られた５０〜１００ｍｇの肝臓組織を、完全なプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する０．３ｍＬのＲＩＰＡ緩衝剤（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）中に均質化した。ホモゲネートを氷上で３０分間インキュベートし、細胞片をペレット化させるために遠心分離した。ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイ試薬（ＢｉｏＲａｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、上清中のタンパク質濃度を測定した。７０℃で１０分間、１００μｇのタンパク質を変性させ、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ ＳＤＳ勾配ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で分離した。タンパク質を０．４５μｍ ＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移し、５％ 無脂肪ミルクを含有する洗浄緩衝剤（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＰＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）中で、室温で１時間遮断した。次いで、ヤギ抗マウスＬＤＬＲ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）１：２０００または抗βアクチン（ｓｉｇｍａ）１：２０００を用いて、室温で１時間、ブロットのプローブ検査を行った。ブロットを短時間洗浄し、ウシ抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）１：２０００またはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｕｐｓｔａｔｅ）１：２０００とともにインキュベートした。室温で１時間のインキュベーション後、ブロットを完全に洗浄し、ＥＣＬプラスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、免疫反応性バンドを検出した。ウェスタンブロットは、図９に示されるように、抗体３１Ｈ４の存在下でＬＤＬＲタンパク質レベルの増加を示した。
実施例１３
１３日間の研究における抗体３１Ｈ４の血清コレステロール低下効果
１３日間の研究において、ＰＣＳＫ９タンパク質に対する抗体療法を介した野生型（ＷＴ）マウスにおける総血清コレステロール（ＴＣ）低下を評価するために、以下の手順を行った。
Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得られた雄の野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６系統、９〜１０週齢、１７〜２７ｇ）に、実験の期間を通じて、通常の食餌（Ｈａｒｌａｎｄ−Ｔｅｋｌａｄ，Ｄｉｅｔ ２９１８）を与えた。Ｔ＝０において、マウスの尾静脈を通じて、１０ｍｇ／ｋｇのレベルで、抗ＰＣＳＫ９抗体３１Ｈ４（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）または対照ＩｇＧ（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）のいずれかをマウスに投与した。ナイーブマウスも、ナイーブ対照群として別に分けた。
投与群および殺処分の時間を表１０に示す。動物を殺処分し、肝臓を摘出し、実施例１３の通りに調製した。
Figure 0006166717
６日間の実験を１３日間の研究に延長すると、６日間の研究において観察された同じ血清コレステロール低下効果が、１３日間の研究においても観察された。より具体的には、１０ｍｇ／ｋｇで投与した動物は、３日目に血清コレステロールの３１％の減少を示し、１３日目までに投与前のレベルに徐々に戻った。図１０Ａは、この実験の結果を示す。図１０Ｃは、３１Ｈ４の１０ｍｇ／ｋｇ用量を用いた、ならびに同様に１０ｍｇ／ｋｇの別の抗体１６Ｆ１２を用いた上記手順を反復した結果を示す。投与群および殺処分の時間を表１１に示す。
Figure 0006166717
図１０Ｃに示されるように、１６Ｆ１２および３１Ｈ４はいずれも、単回投薬のみの後に、総血清コレステロールの著しく、大幅な減少を生じ、１週以上にわたって（１０日またはそれ以上）有益をもたらした。反復された１３日間の研究の結果は、最初の１３日間の研究の結果と合致しており、３日目における２６％の血清コレステロールレベルの減少が観察される。図１０Ａおよび図１０Ｂに関して、変化率は、同じ時点での対照ＩｇＧに関するものである（＊Ｐ＜０．０１）。図１０Ｃに関して、変化率は、同じ時点での対照ＩｇＧに関するものである（＊Ｐ＜０．０５）。
実施例１４
１３日間の研究におけるＨＤＬレベルに対する抗体３１Ｈ４の効果
実施例１５中の動物に対するＨＤＬレベルも調べた。ＨＤＬレベルは、マウスにおいて減少した。より具体的には、１０ｍｇ／ｋｇで投与された動物は、３日目に、ＨＤＬレベルの３３％の減少を示し、１３日目までに、投与前レベルまで徐々に戻った。図１０Ｂは、この実験の結果を示す。３日目に、３４％のＨＤＬレベルの減少があった。図１０Ｂは、反復された１３日の実験の結果を示す。
当業者に理解されるように、抗体はマウスＨＤＬを低下させるが、ヒトおよび他の生物（マウス等）におけるＨＤＬの差のため、これは、ヒトにおいて起こるとは予想されない。したがって、マウスＨＤＬの減少はヒトＨＤＬの減少を示すものではない。
実施例１５
抗体の複数回投与は抗原結合ペプチドの継続的な利益をもたらす
追加の投与によるさらなる利益に関して、上記実施例において得られた結果を延長することができるかを確認するために、図１１Ａに示される投薬スケジュールを用いて実施例１５および１６の実験を反復した。結果を図１１Ｂに示す。図１１Ｂのグラフで見ることができるように、すべてのマウスが３１Ｈ４抗原結合タンパク質の最初の注射を受けたので、マウスの両群は総血清コレステロールの著しい減少を示し、３１Ｈ４ ＡＢＰのさらなる注射を受けたマウスは、総血清コレステロールの継続した減少を示したのに対して、対照注射を受けただけのマウスは、最終的には、総血清コレステロールの増加を示した。図１１に関して、変化率は、ｔ＝０時間でのナイーブ動物に関するものである（＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．００１）。
この実施例からの結果は、対象中での生物学的調整のため、反復適用が効力の減少をもたらす他のコレステロール治療法とは異なり、本発明のアプローチには、検査した時間においては、この問題に悩まされないように見受けられることを示す。さらに、このことは、前実施例において観察された、ベースラインへの総血清コレステロールまたはＨＤＬコレステロールレベルの復帰が、対象によって発達された治療に対する何らかの耐性によるものではなく、対象における利用可能な抗体の枯渇によるものであることを示唆している。
実施例１６
コレステロール関連障害の治療のためのＰＣＳＫ９抗体の使用
（コレステロール（血清コレステロール等）の減少が有益であり得る）コレステロール関連障害を示すヒト患者に、治療的有効量のＰＣＳＫ９抗体３１Ｈ４（または、例えば２１Ｂ１２）が投与される。治療中の定期的な時点で、障害の症候が沈静化したかどうかを判定するために、患者をモニターする。治療後に、ＰＣＳＫ９抗体を用いた治療を行っている患者は、治療されていない患者と比較して、血清コレステロールレベルの減少を有することが見出される。
実施例１７
高コレステロール血症の治療のためのＰＣＳＫ９抗体の使用
高コレステロール血症の症候を示すヒト患者に、３１Ｈ４（または、例えば２１Ｂ１２）等の治療的有効量のＰＣＳＫ９抗体を投与する。治療中の定期的な時点で、血清コレステロールレベルが低下したかどうかを判定するために、ヒト患者をモニターする。治療後に、ＰＣＳＫ９抗体を用いた治療を受けている患者は、治療を受けていない関節炎患者と比較して、血清コレステロールレベルが減少していることが見出される。
実施例１８
冠状動脈性心臓病および／または再発性心血管事象の予防のためのＰＣＳＫ９抗体の使用
冠状動脈性心臓病を発症するリスクを有するヒト患者を特定する。単独で、例えば、シンバスタチン等のスタチンと同時に、または順次に、３１Ｈ４（または、例えば２１Ｂ１２）等の治療的有効量のＰＣＳＫ９抗体を患者に投与する。治療中の定期的な時点で、患者の総血清コレステロールレベルが変化するかどうかを判定するために、ヒト患者をモニターする。予防的処置全体を通じて、ＰＣＳＫ９抗体を用いた治療を受けている患者は血清コレステロールが減少し、それによって、処置を受けていない患者と比較して、冠動脈性心臓病または再発性心血管事象に対するリスクを減少させることが見出される。
実施例１９
高コレステロール血症の予防のためのＰＣＳＫ９抗原結合タンパク質の使用
高コレステロール血症を発症するリスクを示すヒト患者が、家族歴分析および／または生活様式、および／または現在のコレステロールレベルによって特定される。対象は、治療的有効量のＰＣＳＫ９抗体３１Ｈ４（または、例えば２１Ｂ１２）を定期的に投与される（例えば週に１回）。治療中の定期的な時点で、血清コレステロールレベルが減少したかどうかを判定するために、患者をモニターする。治療後に、ＰＣＳＫ９抗体を用いた治療を行っている対象は、治療されていない対象と比較して、血清コレステロールレベルが低下していることが見出される。
実施例２０
健常な対象におけるヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の安全性、忍容性、薬物動態、および薬理学を評価するための第１相の無作為化、二重盲検、プラセボ対照、上昇する単回投与研究
この研究は、健常な対象におけるヒト抗ＰＣＳＫ９抗体（モノクローナル抗体２１Ｂ１２）の安全性、忍容性、ＰＫ、および薬理学（ＰＤ）（ＬＤＬ−Ｃ）を評価するための無作為化、二重盲検、プラセボ対照、上昇する単回投与研究であった。対象は、７、２１、７０、２１０、もしくは４２０ｍｇの用量での２１Ｂ１２の皮下投与、または対応するプラセボ；または２１もしくは４２０ｍｇの用量での２１Ｂ１２の静脈内投与、または対応するプラセボを受けるように、３：１の比率（２１Ｂ１２：プラセボ；７つのコホート中の合計５６人の対象に対して１用量コホート当たり８人の対象）で無作為化された。
５６人の対象が、無作為化され、治験薬を受け（４２人の２１Ｂ１２、１４人のプラセボ）、４０人の対象（３０人の２１Ｂ１２、１０人のプラセボ）は皮下投与経路によって治験薬を受け、１６人の対象（１２人の２１Ｂ１２、４人のプラセボ）は静脈内経路によって治験薬を受けた。治験薬を受けた５６人の対象のうちの５３人（９５％）が、この研究を完了した。２１Ｂ１２を受けた３人の対象は、完全な同意を取り下げ、この研究を完了しなかった。
研究集団は、主に、男性（５４人［９６％］）からなり、平均年齢は３１．２（範囲：２０〜４５）歳であった。８６％の対象は、白人で、続いて、９％のヒスパニック系／ラテン系、４％の黒人、および１％のその他であった。平均ベースラインＬＤＬ−Ｃ値は、処置群間で類似しており、１１３〜１４３ｍｇ／ｄＬの範囲であった。
この研究では、２１Ｂ１２は、７０ｍｇ以上の単回皮下投与で、ＬＤＬ−Ｃが平均５５％〜６０％減少し、効果持続期間が用量依存性であった。ＬＤＬ−Ｃの最下点は、投与から２週間以内に観察された。ＰＣＳＫ９の完全抑制は、７０ｍｇ以上の単回皮下投与で観察され、これは循環するＬＤＬ−Ｃにおいて見られる効果と関連した。
ＰＫ分析は、２１Ｂ１２が非線形（濃度依存性）消失を示すことを示した。平均ｔｍａｘは、４〜６日間であった。予想されたように、最高の中央最大値を観察した濃度（Ｃｍａｘ）および０時間から無限大時間までの濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）が、４２０ｍｇの静脈内投与群で生じ、それぞれ、１３９μｇ／ｍＬおよび１５５０日・μｇ／ｍＬであった。
治療中に発生した有害反応は、任意の用量で２１Ｂ１２を受けた４２人の対象のうちの２９人（６９％）、およびプラセボを受けた１４人の対象のうちの１０人（７１％）について報告された。対象への有害事象の発生と２１Ｂ１２の投与、または対象への有害事象の発生と２１Ｂ１２の投与経路（皮下投与対静脈内投与）との間で、いかなる関係も明らかではなかった。
重篤であると報告された有害事象はなく、有害事象のため研究を中止した対象はいなかった。研究における死亡はなかった。
治療中に発生した有害反応は、２１Ｂ１２を受けた４２人の対象のうちの１８人の対象（４３％）、およびプラセボを受けた１４人の対象のうちの１０人（７１％）について報告された。対象の治療関連有害事象の発生と２１Ｂ１２の投与、または対象の治療関連有害事象の発生と２１Ｂ１２の投与経路（皮下投与対静脈内投与）との間で、いかなる関係も明らかではなかった。
選択された実験室での変動、心電図（ＥＣＧ）、またはバイタルサインにおける２１Ｂ１２の臨床的に重要な効果を示す傾向はなかった。
この研究では、２１Ｂ１２は、最大４２０ｍｇまでの単回皮下投与および静脈内投与で良好な耐容性を示すと見受けられた。
この研究に登録された対象からの血清試料は、抗２１Ｂ１２抗体の存在（ベースライン）または発現（治療後）について試験された。２１Ｂ１２を受けた４２人すべての対象からの血清試料は、抗２１Ｂ１２抗体に対して陰性であった。
実施例２１
安定なスタチンの投与時の高脂血症を患っている対象におけるヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の安全性、忍容性、薬物動態、および薬理学を評価するための第１相の無作為化、二重盲検、プラセボ対照、上昇する複数回投与研究
この研究は、現在、安定なスタチンの投与時の高脂血症の（例えば、高コレステロール血症の）対象における、ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体（モノクローナル抗体２１Ｂ１２）を用いた、第１ｂ相の無作為化、二重盲検、プラセボ対照、上昇する複数回投与研究である。この研究は、７つのコホートを有した。すべてのコホートに対する目的は、２１Ｂ１２の安全性、忍容性、および免疫原性の特徴付け、ならびにＰＫおよびＰＤ（ＬＤＬ−ＣおよびＰＣＳＫ９）の特徴付けが含まれた。研究のコホート１〜５は、安定な低度から中等度のスタチンの投与時の高コレステロール血症の対象における２１Ｂ１２の用量漸増部分を示した。１ヶ月以上、安定的に毎日ロスバスタチンを４０ｍｇ未満、アトルバスタチンを８０ｍｇ未満、またはシンバスタチンを２０〜８０ｍｇを処方されているＬＤＬ−Ｃ（７０〜２００ｍｇ／ｄＬ）を有するコホート１〜５の対象（コホート当たりｎ＝８）がそれぞれ、２１Ｂ１２の５つの皮下投与の投与量のうちの１つ（１４もしくは３５ｍｇを週１回で６回；または１４０ｍｇもしくは２８０ｍｇを隔週１回で３回；または４２０ｍｇを４週間に１回で２回）を受けるように、３：１の比率で無作為化された。コホート６は、高用量のスタチン（アトルバスタチン８０ｍｇまたはロスバスタチン４０ｍｇ）を投与されている高コレステロール血症の対象において行われた。このコホート中の対象（ｎ＝１２）は、ロスバスタチン４０ｍｇまたはアトルバスタチン８０ｍｇのいずれかを処方され、それぞれ、２１Ｂ１２（１４０ｍｇの皮下投与を隔週１回で３回）または対応するプラセボを受けるように、３：１の比率で無作為化された。コホート７は、（ＷＨＯ基準を用いて識別された）ヘテロ接合型家族性高コレステロール血症を患っている対象において行われ、このコホート中の対象（ｎ＝６）はそれぞれ、２１Ｂ１２（１４０ｍｇの皮下投与を隔週１回で３回）または対応するプラセボを受けるように、２：１の比率で無作為化された。明確にするために、コホート１は、１４ｍｇの用量の２１Ｂ１２の皮下投与を週１回で６回受けた。コホート２は、３５ｍｇの用量の２１Ｂ１２の皮下投与を週１回、６回受けた。コホート３は、１４０ｍｇの用量の２１Ｂ１２の皮下投与を隔週１回で３回受けた。コホート４は、２８０ｍｇの用量の２１Ｂ１２の皮下投与を隔週１回で３回受けた。コホート５は、４２０ｍｇの用量の２１Ｂ１２の皮下投与を４週間に１回で２回受けた。
予備的結果は、登録され、２１Ｂ１２またはプラセボに無作為化された４０人の対象から得られた。これらの４０人の対象のうち、２８人の対象は、治験薬（２１Ｂ１２またはプラセボ）の１回以上の投与を受け、したがって、（治療に対して盲検化された）予備的な安全性分析セットを表した。予備的な盲検化された安全性データは、これらの２８人の対象に利用でき、これらのすべては、コホート１〜４であった。有害事象による死亡、重篤な有害事象、または早期離脱は報告されなかった。概して、少なくとも１つの有害事象が、治験薬の１回以上の投与を受けた２８人の対象のうちの１５人（５４％）に対して報告された。（治療に対して盲検化された）ほとんどの有害事象は、１人の対象に対して報告され、疲労、関節痛、便秘、およびウイルス性上気道感染を除いて、これらのそれぞれは、２８人の対象のうちの２人（７％）に対して報告された。
（治療に対して盲検化された）予備的な薬理学的結果が、コホート１、２、および３に利用できた。安定な中等度のスタチンの投与時の対象において、循環するＬＤＬ−Ｃの２１Ｂ１２用量依存的な減少が観察された。ＬＤＬ−Ｃの最下点が、初期投与から２週間以内に観察され、コホート３（１４０ｍｇで２週間ごと皮下投与で３回）において６０％〜８０％の減少であった。ＰＣＳＫ９のほぼ完全な抑制が、コホート３において観察され、これは循環するＬＤＬ−Ｃに見られる効果と関連した。
最終結果では、コホート１〜６中の対象（Ｎ＝５１）が、２１Ｂ１２（Ｎ＝３９）またはプラセボ（Ｎ＝１２）を受けるように無作為化され、２６人の対象（５１％）が男性であり、平均（標準偏差）年齢は、５８（７）歳であった。死亡または重篤な有害事象（ＡＥ）は報告されず、有害事象のため研究を中止した対象はいなかった。２１Ｂ１２に対する中和抗体は検出されなかった。
低用量から中等用量のスタチンに対するコホート１〜５中の対象は、最大限の減少のプラセボに対して最大８１％、そして、２１Ｂ１２の３回の週２回皮下投与後の投与間隔の終了時で（すなわち、６週目で）プラセボに対して７５％、および２回の４週間ごとの皮下投与後の投与間隔の終了時で（すなわち、８週目で）６６％のＬＤＬ−Ｃの平均減少があった。低用量から中等用量のスタチンに対するコホート１〜５中の対象は、最大限の減少のプラセボに対して最大８１％、そして、投与間隔の終了時でプラセボに対して７５％のＬＤＬ−Ｃの平均減少があった（図１４）。効果の大きさおよび持続時間は、用量依存的であった。血清ＰＣＳＫ９は、より高用量では検出できなかった。同様に、３回の週２回投与後の投与間隔の終了時に、高用量のスタチンに対する対象（コホート６）は、プラセボに対して６３％のＬＤＬ−Ｃの平均減少、そして、プラセボに対して７３％のＬＤＬ−Ｃの最大の減少があった（図１５）。
これらのデータは、低用量から中等用量または高用量のスタチンのいずれかにおける対象において、投与レジメンに応じて、６週間にわたる２１Ｂ１２の複数回の皮下投与が、重篤な有害事象はなく、プラセボに対して最大８１％の循環するＬＤＬ−Ｃを減少させたことを示す。２１Ｂ１２のＬＤＬ−Ｃ低下効果は、高用量のスタチンと低用量から中等用量のスタチンの投与群との間で同等であった。
低用量から中等用量のスタチンに対するコホート１〜５中の対象は、データは示されないが、投与間隔の終了時でプラセボに対して最大９４％のＰＣＳＫ９レベルの平均減少があった。低用量から中等用量のスタチンに対するコホート１〜５中の対象は、投与間隔の終了時でプラセボに対して最大５４％のＡｐｏＢの平均減少、そして、研究中、４８％（３５ｍｇで週１回）〜５９％（１４０ｍｇおよび２８０ｍｇで２週間ごと、ならびに４２０ｍｇで４週間ごと）の範囲で最大の減少があった（ｐ＜０．００１）（図１６）。さらに、低用量から中等用量および高用量のスタチンに対するコホート１〜６中の対象は、投与間隔の終了時でプラセボに対して最大４３％のＬｐ（ａ）の平均減少があった（図１７）。
ｈｅＦＨを患っているコホート７中の対象は、投与間隔の終了時で（すなわち、６週目、２１Ｂ１２の３回目の週２回皮下投与から２週間後）プラセボに対して６５％のＬＤＬ−Ｃの平均減少、そして、プラセボに対して７０％のＬＤＬ−Ｃの最大の減少があった（図１８）。投与間隔時のＬＤＬ−Ｃの減少は、ｈｅＦＨを患っていない対象において観察されたものと同等であった。２１Ｂ１２での処置後、循環するＰＣＳＫ９は、ｈｅＦＨ対象において検出できなかった。
ｈｅＦＨを患っているコホート７中の対象は、投与間隔の終了時で（すなわち、６週目、２１Ｂ１２の３回目の週２回皮下投与から２週間後）プラセボに対して最大７８％の血清ＰＣＳＫ９値の平均減少があった（図１９）。ｈｅＦＨを患っているコホート７中の対象は、投与間隔の終了時で（すなわち、６週目、２１Ｂ１２の３回目の週２回皮下投与から２週間後）プラセボに対して最大４２％の総コレステロールの平均減少、そして、プラセボに対して４７％の総コレステロールの最大の減少があった（図２０）。ｈｅＦＨを患っているコホート７中の対象は、投与間隔の終了時で（すなわち、６週目、２１Ｂ１２の３回目の週２回皮下投与から２週間後）プラセボに対して６１％の非ＨＤＬコレステロールの平均減少、そして、プラセボに対して６７％の非ＨＤＬコレステロールの最大の減少があった（図２１）。ｈｅＦＨを患っているコホート７中の対象は、投与間隔の終了時で（すなわち、６週目、２１Ｂ１２の３回目の週２回皮下投与から２週間後）プラセボに対して４７％のＡｐｏＢレベルの平均減少、そして、プラセボに対して６７％のＡｐｏＢレベルの最大の減少があった（図２２）。ｈｅＦＨを患っているコホート７中の対象は、投与間隔の終了時で（すなわち、６週目、２１Ｂ１２の３回目の週２回皮下投与から２週間後）プラセボに対して５０％のリポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の平均減少があった（図２３）。
コホート７では、２１Ｂ１２は、標準治療を受けていたｈｅＦＨおよび高脂血症を患っている対象において、非結合ＰＣＳＫ９レベルを減少させ、実質的には、循環するＬＤＬ−Ｃレベルを低下させた。試験された週２回投与は、非ｈｅＦＨ対象におけるものと同等のＬＤＬ−Ｃの減少を提供した。重篤な有害事象は報告されなかった。
実施例２２
ヘテロ接合型家族性高コレステロール血症を患っている対象におけるヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の忍容性および有効性を評価するための二重盲検、プラセボ対照研究
この研究の目的は、ヘテロ接合型家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）を患っている対象における低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のベースラインからのパーセント変化について、プラセボと比較したヒト抗ＰＣＳＫ９抗体（モノクローナル抗体２１Ｂ１２）の１２週間の皮下投与（ＳＣ）の効果を評価することである。
この研究は、ＨｅＦＨという診断が下されている対象におけるモノクローナル抗体２１Ｂ１２の安全性、忍容性、および有効性を評価するための二重盲検、無作為化、層別化、プラセボ対照臨床試験である。合計１５０人の対象の登録が計画されている。すべての試験対象患者基準／除外基準を満たす対象が、モノクローナル抗体２１Ｂ１２を３５０ｍｇもしくは４２０ｍｇで４週間ごと皮下投与（４週間に１回皮下投与）、またはプラセボを４週間ごと皮下投与の３つの処置群への均等な割り当てにより無作為化される。無作為化は、ＬＤＬ−Ｃレベル（１３０ｍｇ／ｄＬ［３．４ｍｍｏｌ／Ｌ］未満対１３０ｍｇ／ｄＬ以上）をスクリーニングし、ベースラインでエゼチミブの使用（はい対いいえ）により層別化される。無作為化は、適格性を判定するために使用されるスクリーニングＬＤＬ−Ｃ評価から５〜１０日間以内になされるべきである。モノクローナル抗体２１Ｂ１２およびプラセボは、盲検化される。研究来院は、２、４、８、および１２週目である。モノクローナル抗体２１Ｂ１２またはプラセボの最終投与は、８週目である。研究終了時（ＥＯＳ）来院および脂質の最終評価は、１２週目である。
Ｓｉｍｏｎ Ｂｒｏｏｍｅ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＳＢＲＧ）の診断基準によりヘテロ接合型家族性高コレステロール血症と診断された１８歳以上７５歳以下の男性および女性が、この研究に適格である。登録のためには、対象は、ＬＤＬ−Ｃスクリーニング前の少なくとも４週間、すべての許容される（例えば、エゼチミブ、胆汁酸封鎖樹脂、スタノール、または規制認可される市販のナイアシン（例えば、ＮｉａｓｐａｎもしくはＮｉａｃｏｒ））脂質規制薬物に対して安定な用量を有する、認可されたスタチンを常用していなければならず、
責任医師の意見では、
漸増（ｕｐｔｉｔｒａｔｉｏｎ）を必要としない。スクリーニング時の中央実験室で、空腹時のＬＤＬ−Ｃは、１００ｍｇ／ｄＬ（２．６ｍｍｏｌ／Ｌ）以上であり、空腹時のトリグリセリドは、４００ｍｇ／ｄＬ（４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）以下でなければならない。
予備的データ（データは示さず）は、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３８．４６％のＬＤＬ−Ｃのベースラインからの最小二乗（ＬＳ）平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、４５．６８％のＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した。３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２１．６９％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、２８．２３％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有した。３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、１５．３９％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの増加を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、６．７７％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの増加を有した。３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、１７．１６％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、１８．４９％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有した。３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、１７．２４％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、４．５６％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有した。３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３６．１６％の非ＨＤＬコレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、４１．８１％の非ＨＤＬコレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有した。最後に、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２４．８２％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、２９．４５％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有した。（データは示さず）
図２４は、２１Ｂ１２の以下の投与：７０ｍｇ、１０５ｍｇ、および１４０ｍｇ（２週間ごとまたは２週間に１回の投与）、ならびに２８０ｍｇ、３５０ｍｇ、および４２０（４週間ごとまたは月に１回の投与）に対する、ＬＤＬ−Ｃの減少データを表すグラフである。このデータは、実施例２２〜２５に記載される研究からの集約データである）。簡潔に言えば、この集約データは、２週間ごとに１４０ｍｇでは、１２週目でＬＤＬ−Ｃのベースラインから約６０％の減少をもたらし、ＬＤＬ−Ｃの減少が滑らかに維持されることを示す。さらに、このデータは、４週間ごとに４２０ｍｇでは、１２週目でＬＤＬ−Ｃのベースラインから約５６％の減少をもたらし、投与間隔の終了時に、ＬＤＬ−Ｃの跳ね返りが少ないことを示す。
図２５Ａ〜２５Ｄはそれぞれ、実施例２２〜２５に記載される研究からの集約データから得られる、Ｌｐ（ａ）、ＨＤＬ−Ｃ、トリグリセリド、およびＶＬＤＬ−Ｃに対する２１Ｂ１２の用量の有益な効果を示す棒グラフである。さらに、ベースラインからの用量依存性の減少は、総コレステロール（２５〜３７％、ｐ値＜０．００１）、非ＨＤＬ−Ｃ（３６〜５３％、ｐ値＜０．００１）、およびＡｐｏＢ（３６〜５３％、ｐ値＜０．００１）に対して観察された（データは示さず）。
実施例２３
有効量のＨＭＧ−Ｃｏ−Ａレダクターゼ阻害剤を忍容できない高コレステロール血症患者における、エゼチミブと比較したＬＤＬ−Ｃに対するヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の忍容性および有効性を評価するための無作為化研究
この研究の目的は、有効量のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤を忍容できない高コレステロール血症患者における、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のベースラインからのパーセント変化について、エゼチミブと比較したヒト抗ＰＣＳＫ９抗体（モノクローナル抗体２１Ｂ１２）の１２週間の皮下投与（ＳＣ）の効果を評価することである。
この研究は、ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体、モノクローナル抗体２１Ｂ１２に対する無作為化、層別化、並列群臨床試験である。１５０人の対象を登録することが計画される。すべての試験対象患者基準／除外基準を満たす対象が、モノクローナル抗体２１Ｂ１２を２８０ｍｇ、３５０ｍｇ、もしくは４２０ｍｇで４週間ごと皮下投与（４週間に１回、皮下投与）、モノクローナル抗体２１Ｂ１２を４２０ｍｇで４週間ごと皮下投与とともにエゼチミブを１０ｍｇで毎日（ＱＤ）経口投与（ＰＯ）、またはプラセボを４週間ごと皮下投与とともにエゼチミブを１０ｍｇで毎日経口投与の５つの処置群への均等な割り当てにより無作為化される。無作為化は、ＬＤＬ−Ｃレベル（１３０ｍｇ／ｄＬ［３．４ｍｍｏｌ／Ｌ］未満対１３０ｍｇ／ｄＬ以上）をスクリーニングし、ベースラインでスタチンの使用（はい対いいえ）により層別化される。無作為化は、適格性を判定するために使用されるスクリーニングＬＤＬ−Ｃ評価から５〜１０日間以内に行われるべきである。モノクローナル抗体２１Ｂ１２およびプラセボは、盲検化される。エゼチミブは、盲検化されない。研究来院は、２、４、８、および１２週目である。モノクローナル抗体２１Ｂ１２またはプラセボの最終投与は、８週目である。研究終了時来院および脂質の最終評価は、１２週目である。
１８歳以上７５歳以下の男性および女性が、この研究に適格である。対象は、少なくとも１つのスタチンを試行していなければならず、筋肉痛または筋障害のため、アトルバスタチン７０ｍｇ以下、シンバスタチン１４０ｍｇ以下、プラバスタチン１４０ｍｇ以下、ロスバスタチン３５ｍｇ以下、ロバスタチン１４０ｍｇ以下、フルバスタチン２８０ｍｇ以下のような、１週間の総最大用量を上回るいかなる用量またはスタチン投与の増加にも耐えられなくなっていなければならない。列記されていないスタチンについては、１週間の最大総用量は、最小の利用可能な錠剤サイズの７倍を超えるべきではない。スタチンが中止されたか、または用量が低減されたときに、症状は、消散されていなければならない。スタチン（上に定義された最大用量を超えない）、胆汁酸封鎖樹脂、および／またはスタノールでの治療を受けている場合、用量（複数可）は、ＬＤＬ−Ｃスクリーニング前の少なくとも４週間安定していなければならない。対象は、スクリーニングの開始時に、エゼチミブを常用している場合、エゼチミブは、ＬＤＬ−Ｃスクリーニング前の４週間以上中止しなくてはならない。それらのリスク分類に応じて（ＮＣＥＰ ＡＴＰ ＩＩＩの治療目標に基づく）、対象は、スクリーニング時、以下の空腹時のＬＤＬ−Ｃ（中央検査室で）基準を満たさなければならない：冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）であると診断されたもしくはＣＨＤと同等の危険を有する対象については１００ｍｇ／ｄＬ（２．６ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、ＣＨＤであると診断されないもしくは同等の危険を有さず、２つ以上の危険因子がない対象については１３０ｍｇ／ｄＬ（３．４ｍｍｏｌ／Ｌ）以上、ＣＨＤであると診断されないもしくは同等の危険を有さず、１つの危険因子を有する、もしくは危険因子がない対象については１６０ｍｇ／ｄＬ（４．１ｍｍｏｌ／Ｌ）以上。空腹時のトリグリセリドは、スクリーニング時、中央実験室分析で示されるように、４００ｍｇ／ｄＬ（４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）以下でなければならない。
予備的データ（データは示さず）は、２８０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３８．７９％のＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、４０．０１％のＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少でを有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、ベースラインからのＬＳ平均パーセントのＬＤＬ−Ｃの減少で５０．６３％を有したことを示した。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２７．３８％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、１６．０４％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、２３．８４％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、８．６２％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの増加を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、４．６２％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの増加を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、７．５５％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの増加を有したことを示した。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３１．０２％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３８．１４％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、３７．２７％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、１５．３５％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、１９．２２％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、１９．５５％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３１．０３％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３４．４６％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、４２．２３％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３９．９２％の非ＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、４２．８６％の非ＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、５３．４９％の非ＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した。
実施例２４
１０年間のフラミンガムリスクスコアが１０％以下の高コレステロール血症患者における、ＬＤＬ−Ｃに対するヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の忍容性および有効性を評価するための無作為化、プラセボおよびエゼチミブ対照化、投与量範囲研究
この研究の目的は、１０年間のフラミンガムリスクスコアが１０％以下の高コレステロール血症患者において単剤療法として使用されるとき、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のベースラインからのパーセント変化に対してプラセボと比較した２週間ごと（Ｑ２Ｗ）または４週間ごと（Ｑ４Ｗ）のヒト抗ＰＣＳＫ９抗体（モノクローナル抗体２１Ｂ１２）の１２週間の皮下投与（ＳＣ）の効果を評価することであった。
この研究は、ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体、モノクローナル抗体２１Ｂ１２に対する無作為化、層別化、プラセボおよびエゼチミブ対照化、並列群用量範囲臨床試験であり、４１１人の対象を登録した。すべての試験対象患者基準／除外基準を満たす対象が、モノクローナル抗体２１Ｂ１２の６つの投与レジメン（７０ｍｇ、１０５ｍｇ、もしくは１４０ｍｇで２週間ごとに皮下投与、または２８０ｍｇ、３５０ｍｇ、もしくは４２０ｍｇで４週間ごとに皮下投与（４週間に１回、皮下投与）のうちの１つ、２週間ごともしくは４週間ごとのいずれかでの皮下投与を伴うプラセボ、または毎日（ＱＤ）経口投与（ＰＯ）を伴うエゼチミブの９つの処置群への均等な割り当てにより無作為化された。無作為化は、ＬＤＬ−Ｃレベル（１３０ｍｇ／ｄＬ［３．４ｍｍｏｌ／Ｌ］未満対１３０ｍｇ／ｄＬ超）をスクリーニングすることによって層別化された。無作為化は、適格性を判定するために使用されるスクリーニングＬＤＬ−Ｃ評価から５〜１０日間以内になされた。研究来院は、対象が、２週間ごとに皮下投与または４週間ごとの処置もしくはエゼチミブを受けるかどうかを問わず、２週間ごとであった。モノクローナル抗体２１Ｂ１２の３つの２週間ごとの投与群および１つの２週間ごとのプラセボ群が互いに対して盲検化され、３つの４週間ごとの投与群および１つの４週間ごとのプラセボ群が互いに対して盲検化された。エゼチミブは、盲検化されなかった。研究終了時来院および脂質の最終評価は、４週間ごとのＩＰスケジュールの対象については、１２週目であり、２週間ごとのＩＰスケジュールの対象については、１４週目であった。
１８歳以上７５歳以下の男性および女性が、この研究に適格であった。スクリーニング時の中央実験室で、空腹時のＬＤＬ−Ｃは１００ｍｇ／ｄＬ（２．６ｍｍｏｌ／Ｌ）以上で１９０ｍｇ／ｄＬ（４．９ｍｍｏｌ／Ｌ）未満であり、空腹時のトリグリセリドは４００ｍｇ／ｄＬ（４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）以下であった。対象は、全米コレステロール教育プログラムの成人治療パネルＩＩＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐａｎｅｌ Ａｄｕｌｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｐａｎｅｌ ＩＩＩ）（ＮＣＥＰ ＡＴＰ ＩＩＩ）の１０％以下のフラミンガムリスクスコアを有した。
主要評価項目は、１２週目でのＬＤＬ−Ｃのベースラインからのパーセント変化であった。副次的評価項目には、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）、リポタンパク質（ａ）（Ｌｐ（ａ））のパーセント変化、および総コレステロールの高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）−Ｃに対する比率のパーセント変化が含まれた。忍容性および安全性も評価された。
予備的データは、７０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、４１．２１％のＬＤＬ−Ｃのベースラインからの平均パーセントの減少を有し、１０５ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、４５．４４％のＬＤＬ−Ｃのベースラインからの平均パーセントの減少を有し、１４０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、５１．５６％のＬＤＬ−Ｃのベースラインからの平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。
予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２（４週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３７．５３％のＬＤＬ−Ｃのベースラインからの平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、４２．１６％のＬＤＬ−Ｃのベースラインからの平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、４７．５２％のＬＤＬ−Ｃのベースラインからの平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。
最終データは、１２週目で、２１Ｂ１２を受けている対象が、最大５１％のＬＤＬ−Ｃのベースラインからの最小二乗（ＬＳ）平均パーセントの減少を有し（表１２）、エゼチミブに対するベースラインからのパーセント変化が１４％であったことを示した。１２週目までのベースラインからの変化は、プラセボを用いたものよりも２１Ｂ１２を用いたものが最大７２ｍｇ／ｄＬ多かった。２１Ｂ１２を受けている対象は、プラセボよりもベースラインからのＬＤＬ−Ｃの減少が３７％〜５３％多く、エゼチミブよりも３７％多かった。ＡｐｏＢ（最大４４％）、Ｌｐ（ａ）（最大２９％）、および総コレステロール／ＨＤＬの比率（最大３８％）に対するベースラインからの平均減少は、プラセボを用いたものより２１Ｂ１２を用いたものが多かった。
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実施例２５
高コレステロール血症患者における、ＨＭＧ−Ｃｏ−Ａレダクターゼ阻害剤と組み合わせたＬＤＬ−Ｃに対するヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の忍容性および有効性を評価するための二重盲検、無作為化、プラセボ対照、用量範囲研究
この研究の目的は、高コレステロール血症を患っている対象において、ＨＭＧ−Ｃｏ−Ａレダクターゼ阻害剤（例えば、スタチン）に加えて使用されるとき、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）のベースラインからのパーセント変化に対する、プラセボと比較したヒト抗ＰＣＳＫ９抗体（モノクローナル抗体２１Ｂ１２）の２週間ごと（Ｑ２Ｗ）または４週間ごと（Ｑ４Ｗ）の１２週間の皮下投与（ＳＣ）の効果を評価することである。
この研究は、６３１人の対象を登録する、ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体、モノクローナル抗体２１Ｂ１２に対するの二重盲検、無作為化、層別化、プラセボ対照、並列群用量範囲臨床試験である。エゼチミブを用いてまたは用いることなく、少なくとも４週間スタチンを安定な用量で常用し、すべての試験対象患者基準／除外基準を満たす対象が、モノクローナル抗体２１Ｂ１２の皮下投与（ＳＣ）（７０ｍｇで２週間ごと、１０５ｍｇで２週間ごと、１４０ｍｇで２週間ごと、２８０ｍｇで４週間ごと、３５０ｍｇで４週間ごと、４２０ｍｇで４週間ごと、プラセボで２週間ごと皮下投与、またはプラセボで４週間ごと皮下投与）の８つの処置群への均等な割り当てにより無作為化される。無作為化は、ＬＤＬ−Ｃレベル（１３０ｍｇ／ｄＬ［３．４ｍｍｏｌ／Ｌ］未満対１３０ｍｇ／ｄＬ以上）をスクリーニングし、ベースラインでエゼチミブの使用（はい対いいえ）により層別化される。無作為化は、適格性を判定するために使用されるスクリーニングＬＤＬ−Ｃ評価から５〜１０日間以内になされるべきである。研究来院は、対象が、２週間ごとに皮下投与または４週間ごとの処置を受けるかどうかを問わず、２週間ごとである。モノクローナル抗体２１Ｂ１２の３つの２週間ごとの投与群および１つの２週間ごとのプラセボ群が互いに対して盲検化され、３つの４週間ごとの投与群および１つの４週間ごとのプラセボ群が互いに対して盲検化される。研究終了時来院および脂質の最終評価は、４週間ごとのＩＰスケジュールの対象については、１２週目で、２週間ごとのＩＰスケジュールの対象については、１４週目である。
１８歳以上８０歳以下の男性および女性が、この研究に適格である。登録のためには、
対象は、エゼチミブを用いてまたは用いることなく、ＬＤＬ−Ｃスクリーニング前の少なくとも４週間安定な用量で、漸増を必要とせず、スタチンを常用していなければならない。スクリーニング時、空腹時のＬＤＬ−Ｃは、８５ｍｇ／ｄＬ（２．２ｍｍｏｌ／Ｌ）以上でなければならない。８５ｍｇ／ｄＬ（２．２ｍｍｏｌ／Ｌ）以上で１００ｍｇ／ｄＬ（２．６ｍｍｏｌ／Ｌ）未満の空腹時のＬＤＬ−Ｃのスクリーニングを伴う対象の登録は、全体の計画された登録のうちの約２０％以下に限定される。空腹時のトリグリセリドは、スクリーニング時、中央実験室分析で判定されるように、４００ｍｇ／ｄＬ（４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）以下でなければならない。
予備的データは、７０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３９．２２％のＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１０５ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、５６．３８％のＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１４０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、６８．７６％のＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、７０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２１．１７％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１０５ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３３．４１％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１４０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、３３．８７％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、７０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２１．１７％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１０５ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、６．８０％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１４０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、８．４３％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、７０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、１４．８４％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１０５ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、１２．７５％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１４０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、４５．１４％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、７０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、７．２０％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１０５ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、５．６５％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１４０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、１７．６０％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、７０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３６．２０％の非ＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１０５ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、５１．２０％の非ＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１４０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、６４．６１％の非ＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、７０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２６．３３％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１０５ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３６．９１％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、１４０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、４６．１７％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。
予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２（４週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、４２．６２％のＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、投与間隔の終了時に、５６．８４％のＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２で処置された対象が、５２．１９％のＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２２．５４％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２９．４３％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、２３．２９％のＬｐ（ａ）のベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２．１７％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの増加を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、６．９２％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの増加を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、７．４２％のＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの増加を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、１８．１２％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２０．８９％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、２８．６６％のＶＬＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、６．７５％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、９．１７％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、１１．１３％のトリグリセリドのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３８．８９％の非ＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、５０．８３％の非ＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、４８．５４％の非ＨＤＬ−ＣのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。予備的データは、２８０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、２８．０８％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、３５０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、投与間隔の終了時に、３６．０４％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有し、４２０ｍｇの２１Ｂ１２（２週間ごと）で処置された対象が、４２．７６％の総コレステロールのベースラインからのＬＳ平均パーセントの減少を有したことを示した（データは示さず）。
実施例２６
ＰＣＳＫ９ ＡＢＰは、スタチンの存在下でＬＤＬＲをさらに上方制御した
この実施例は、スタチンの存在下で使用されるとき、ＰＣＳＫ９に対するＡＢＰは、ＬＤＬＲの利用可能性のさらなる増加をもたらしたことを示し、２つの併用によりさらなる利益が達成され得ることを示す。
１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中でＨｅｐＧ２細胞を播種し、約９０％の集密度になるまで増殖させた。３％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で指示された量のメビノリン（スタチン、Ｓｉｇｍａ）およびＰＣＳＫ９ ＡＢＰ（図１２Ａ〜１２Ｃ）で細胞を４８時間処理した。全細胞溶解物を調製した。ゲル電気泳動によって５０ｍｇの総タンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウサギ抗ヒトＬＤＬ受容体抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）またはウサギ抗ヒトｂ−アクチン抗体を用いて、免疫ブロットを行った。増強された化学発光の結果を、図１２Ａ〜１２Ｃの上部パネルに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって、バンドの強度を定量化し、ｂ−アクチンによって正規化した。ＬＤＬＲの相対的レベルを、図１２Ａ〜１２Ｃの下部パネルに示す。ＡＢＰ２１Ｂ１２および３１Ｈ４は、ＰＣＳＫ９中和抗体であるのに対して、２５Ａ７．１は非中和抗体である。
ＨｅｐＧ２−ＰＣＳＫ９細胞も作製した。これらは、ヒトＰＣＳＫ９でトランスフェクトされた安定なＨｅｐＧ２細胞株であった。１０％ ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で細胞を播種し、約９０％の集密度になるまで増殖させた。３％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で指示された量のメビノリン（Ｓｉｇｍａ）およびＰＣＳＫ９ ＡＢＰ（図１２Ｄ〜１２Ｆ）で細胞を４８時間処理した。全細胞溶解物を調製した。ゲル電気泳動によって５０ｍｇの総タンパク質を分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウサギ抗ヒトＬＤＬ受容体抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）またはウサギ抗ヒトｂ−アクチン抗体を用いて、免疫ブロットを行った。増強された化学発光の結果を、上部パネルに示す。ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって、バンドの強度を定量化し、ｂ−アクチンによって正規化した。
図１２Ａ〜１２Ｆに示される結果から見られ得るように、中和抗体の増加する量およびスタチンの増加する量は、ＬＤＬＲのレベルの増加を一般にもたらした。ＡＢＰの増加するレベルの有効性のこの増加は、細胞がＰＣＳＫ９でもトランスフェクトされており、ＡＢＰがより大きな程度までその有効性を示すことができる図１２Ｄ〜１２Ｆにおいて特に明瞭である。
興味深いことに、図１２Ｄ〜１２Ｆないし１２Ａ〜１２Ｃの比較の結果によって示されるように、ＬＤＬＲレベルに対するＡＢＰ濃度の影響は、ＰＣＳＫ９が細胞によって産生された場合に劇的に増加した。さらに、中和ＡＢＰ（２１Ｂ１２および３１Ｈ４）が２５Ａ７．１ ＡＢＰ（非中和物質）より、スタチンの存在下でさえ、ＬＤＬＲレベルのより大きな増加をもたらしたことは明らかであり、スタチンおよびＰＣＳＫ９に対するＡＢＰの両方を使用することによって、さらなる利益が達成され得ることを示す。
実施例２７
コンセンサス配列
抗ＰＣＳＫ９ ＡＢＰのＶＨおよびＶＬに対応するＣＤＲの標準的な系統発生学的分析を用いて、コンセンサス配列を決定した。ＶＨまたはＶＬに対応する同じ配列内に隣接するＣＤＲを保持することによって、コンセンサス配列を決定した。簡潔に言えば、比較アラインメントのプロセシングおよび系統発生の推論を容易にするために、ＶＨまたはＶＬのいずれかの全可変ドメインに対応するアミノ酸配列をＦＡＳＴＡフォーマットに変換した。次に、ＶＨまたはＶＬに対応する同じ配列内にＣＤＲをなお隣接させながら、偶発的現象（例えば、共通の生殖系列フレームワークの継承を偶然共有する無関係の抗体等）に起因するアミノ酸位置重み付けバイアスを一切導入することなく、ＣＤＲのみの検査を行うことができるように、これらの配列のフレームワーク領域を、人工のリンカー配列（「ｂｂｂｂｂｂｂｂｂｂ」代用配列、非特異的な核酸構築物）と置き換えた。次いで、このフォーマットのＶＨまたはＶＬ配列は、標準的なＣｌｕｔａｌＷ様アルゴリズムを使用するプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３〜４６８０を参照）を用いて、配列相同性アラインメント検索に供された。８．０のギャップ生成ペナルティーが、２．０のギャップ伸長ペナルティーとともに使用された。同様に、このプログラムは、分岐長の比較およびグループ分けを介して配列群の相同性および相違を構築し、図解するために、ＵＰＧＭＡ法（相加平均を用いた重み付けされていないペアグループ法）または隣接連結法（Ｓａｉｔｏｕ ａｎｄ Ｎｅｉ，１９８７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ４：４０６〜４２５を参照）のいずれかを用いて配列相同性アラインメントに基づいて系統樹（系統発生樹の図解）を作成した。いずれの方法も、類似の結果をもたらしたが、ＵＰＧＭＡ法はより単純で、より保守的な一群の仮説を使用するので、ＵＰＧＭＡによって得られた系統樹が最終的に使用された。グループ内の個々の配列のうち、１００残基当たり１５未満の置換を有するとして、配列の類似のグループ（スケールに関しては、系統樹の図解中の注釈を参照）が定義された、ＵＰＧＭＡによって得られた系統樹を作成し、コンセンサス配列集合を定義するために使用した。比較の結果を図１３Ａ〜１３Ｊおよび図４８〜４９に示す。図１３Ｅでは、クレードを形成する軽鎖中の配列が、重鎖中でもクレードであり、１５未満の置換を有するように、グループが選択された。
実施例２８
ＰＣＳＫ９ ＡＢＰ製剤の調製
ＵＦ／ＤＦ−限外濾過法／透析濾過法
薬物物質、例えば、抗体２１Ｂ１２および抗体１１Ｆ１は、５０ｃｍ２の大きさのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ＸＬフィルター（再生セルロース、３０，０００分子量カットオフ）膜を使用して、ベンチスケールのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＴＦＦ ＵＦ／ＤＦシステムを用いて、安定剤を含む製剤緩衝液に緩衝液交換された。透析濾過ステップは、少なくとも１０体積の透析濾過緩衝剤が交換されるまで行われた。一旦透析濾過ステップが完了すると、ＵＦ／ＤＦシステムは、透析濾過モードに切り替えられ、それぞれの製剤は標的濃度レベルまで濃縮された。
ＵＦ／ＤＦステップが完了した後、適切な量のポリソルベート２０または８０を１．０％（ｗ／ｗ）の新たに調製されたポリソルベート（「ＰＳ」）原液からそれぞれの製剤に添加し、所望のポリソルベート濃度を得た。
主要な容器に充填する前に、それぞれの製剤は、層流フード下で、０．２ミクロンのフィルターを用いて無菌濾過された。また、充填も無菌で行われ、適切な濾過器具を用いて手動または自動で行われた。
実施例２９
低粘度を有する高濃度のＰＣＳＫ９ ＡＢＰ製剤
高濃度タンパク質の粘度に対する異なる賦形剤の効果を評価するために、粘度、安定性、および溶解性スクリーニングアッセイが、高濃度タンパク質製剤に対する賦形剤の粘度の調節物質を調べるために使用された。具体的には、例えば抗体２１Ｂ１２試料等のすべての試料の調製は、層流フード下で、無菌で行われた。試験されるべき試料の凍結乾燥により、高濃度タンパク質を達成するための簡易な方法を可能にした。１．５ｍＬの７０ｍｇ／ｍＬのタンパク質（例えば２１Ｂ１２）を、３ｃｃの凍結乾燥用ガラスバイアルに分注した。凍結乾燥は、ＶｉｒＴｉｓ実験室規模凍結乾燥機において一般的な凍結サイクルを用いて行われた。凍結乾燥緩衝剤は、１．０％ スクロース、ｐＨ４．８を含む１０ｍＭ Ｌ−グルタメートであった。凍結乾燥された試料（例えば、凍結乾燥された２１Ｂ１２試料）は、タンパク質の最終濃度が１５０〜２００ｍｇ／ｍＬになるまで、以下の表１３に示される、約０．６５ｍＬの賦形剤緩衝剤を用いて個々に再構成された。再構成された試料は、溶解が完了するまで一晩放置した。次いで、以下に記載されるように、粘度を測定した。
Figure 0006166717
粘度、安定性、溶解性のスクリーニングからの結果は、様々な賦形剤の添加後に２１Ｂ１２の粘度の変化を示した（図２６）。スクリーニング目的のために使用されたすべての賦形剤が、溶液粘度を低下させたわけではなく、Ｌ−アラニン、グリセロール、硫酸ナトリウム、スクロース、および塩化亜鉛の添加は、対照試料と比較してはるかにより高い粘度をもたらした。例えば、Ｌ−アルギニン、カルニチン、クレアチニン、Ｌ−メチオニン、およびタウリン等のスクリーニングに使用された幾つかの賦形剤は、良好な粘度を調節する候補であると見受けられた。
特定のＰＣＳＫ９ ＡＢＰの粘度に対する異なる製剤の効果を評価するために、２１Ｂ１２の組成物が、以下の表２９．２に示される６つの異なる製剤中に製剤化された。すべての製剤中の２１Ｂ１２の濃度は、１３４ｍｇ／ｍＬであった。組成物は、バイアル中に最終体積が１．０ｍＬになるまで充填された。組成物は、室温（すなわち、２５℃）でインキュベートされた。
２１Ｂ１２の透析および濃縮
もともと１０ｍＭの酢酸ナトリウム、９．０％（ｗ／ｖ） スクロース中の２１Ｂ１２からのスクロース除去は、約１０ｍＬの２１Ｂ１２をＰｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）透析カセットを加えて、完全な緩衝液交換のために４℃で３サイクル（２時間×２および１６時間×１）、２Ｌの緩衝液に対して透析することによる透析を介して達成された。透析用緩衝液は、ｐＨ５．０で、（酢酸から作製された）１０ｍＭ 酢酸ナトリウムを含有した。続いて、すべての試料は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ ＵｌｔｒａＰｒｅｐ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて濃縮され、試料体積が所望の濃度に必要とされる体積をわずかに下回るまで、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ遠心分離機（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で、３０００ｒｐｍで回転させた。
次いで、濃度決定は、Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３分光光度計（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、Ａ２８０で吸光度を測定することによって行われた。タンパク質濃度は、適切な減衰係数を用いて計算された。次いで、適切な量の緩衝液を試料に添加し、それが所望の濃度に下がるまで希釈し、別のＡ２８０を行って、この実験のための最終濃度を得た。
粘度を低下させる役割も果たし得る安定剤の添加：
プロリン、ベンジルアルコール、クレアチニン、メチオニン、タウリン等の賦形剤は、粘度を低下させるために試験された。これらの賦形剤は、高濃度原液からの２１Ｂ１２製剤試料に個々に添加された。
粘度の測定
粘度は、一定の２５℃の循環水浴によって調節される試料カップの温度に合わさせながら、ＣＰＥ−４０スピンドルを備えるＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＬＶ−ＤＶＩＩコーンおよびプレート粘度計（Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて測定された。５００μＬの試料を、ポジティブディスプレイスメントピペッターを用いて試料カップに加えた。試料カップを固定した後、スピンドルの回転速度を約８０％のトルクが達成されるまで徐々に増加させた。この時点で、回転速度が停止し、粘度の読み出し、Ｒｈｅｏｃａｌｃソフトウェアによって生成された。
Figure 0006166717
これらの結果は、Ｌ−プロリン、ベンジルアルコール、クレアチニン、メチオニン、およびタウリンのすべてが、高濃度のＰＣＳＫ９ ＡＢＰ、２１Ｂ１２において有意な粘度を低下させる効果を有したことを示す（表１４を参照）。
特定のＰＣＳＫ９ ＡＢＰに対する異なる製剤の効果をさらに評価するために、２１Ｂ１２の組成物が、以下の表１５に示される異なる製剤中で製剤化された。製剤は、以下の３つの群に分類される：（１）１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ５．２中の一連の様々な濃度の２１Ｂ１２、（２）それぞれの試料に添加される３％（約２６１ｍＭ） Ｌ−プロリンを含む、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ５．２中の一連の様々な濃度の２１Ｂ１２、および（３）異なるｐＨレベル（４．０〜５．５）で、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝剤中の約１１７〜１３４ｍｇ／ｍＬで濃縮された一連の２１Ｂ１２試料、さらに、ＮａＣｌもしくはＬ−メチオニン／ベンジルアルコールの組み合わせのいずれかが添加された、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝剤、ｐＨ５．２中の２つの試料。
Figure 0006166717
これらの結果は、Ｌ−プロリンが高濃度のＰＣＳＫ９ ＡＢＰ、２１Ｂ１２において有意な粘度を低下させる効果を有したことを示した（図２７を参照）。
特定のＰＣＳＫ９ ＡＢＰに対する異なる製剤の効果をなおさらに評価するために、２１Ｂ１２の組成物が、以下の表１６に示される異なる製剤中で製剤化された。
Figure 0006166717
これらの結果は、１．５％または２．０％ プロリン（約１３１ｎＭ〜１７４ｍＭ プロリン）および１％ ベンジルアルコールを用いて製剤化された２１Ｂ１２製剤が、高濃度のＰＣＳＫ９ ＡＢＰ、２１Ｂ１２において有意な粘度を低下させる効果を有したことを示す。
特定のＰＣＳＫ９ ＡＢＰに対する異なる製剤の効果をなおさらに評価するために、２１Ｂ１２の組成物が、以下の表１７に示される異なる製剤中で製剤化された。
Figure 0006166717
これらの結果は、特定の安定剤／賦形剤を有する製剤を含む粘度を減少させる高濃度の２１Ｂ１２タンパク質を得る能力を示す（図２８Ａ〜２８Ｄを参照）。具体的には、図２８Ａは、ｐＨ５．２で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、９％のスクロースを含む製剤中の様々な濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体、２１Ｂ１２の粘度を示すグラフである。
図２８Ｂは、ｐＨ５．０で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１２５ｍＭのアルギニン、および３％のスクロースを含む製剤と比較して、ｐＨ５．２で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび９％のスクロースを含む製剤中の様々な濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体、２１Ｂ１２の粘度を示すグラフである。
図２８Ｃは、ｐＨ５．０で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、１００ｍＭのメチオニン、および４％のスクロースを含む製剤と比較して、ｐＨ５．２で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび９％のスクロースを含む製剤中の様々な濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体、２１Ｂ１２の粘度を示すグラフである。
図２８Ｄは、ｐＨ５．０で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび２５０ｍＭのプロリンを含む製剤と比較して、ｐＨ５．２で、２５℃および４０℃での、１０ｍＭの酢酸ナトリウムおよび９％のスクロースを含む製剤中の様々な濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体、２１Ｂ１２の粘度を示すグラフである。
実施例３０
高濃度１１Ｆ１の粘度研究
表３０は、２５℃での様々な抗体濃度および様々な製剤中の１１Ｆ１抗体の粘度を示す。
高濃度原液の１１Ｆ１を、上の実施例２９において２１Ｂ１２について記載されるように、同様に調製した。次いで、濃度決定は、Ａｇｉｌｅｎｔ８４５３分光光度計（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、Ａ２８０で吸光度を測定することによって行われた。タンパク質濃度は、適切な減衰係数を用いて計算された。次いで、適切な量の緩衝剤を試料に添加し、それが所望の濃度に下がるまで希釈し、別のＡ２８０を行って、この実験のための最終濃度を得た。賦形剤を、高濃度原液から得られる１１Ｆ１製剤に個々に加えた。
粘度は、一定の２５℃の循環水浴によって調節される試料カップの温度に合わさせながら、ＣＰＥ−４０スピンドルを備えるＢｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＬＶ−ＤＶＩＩコーンおよびプレート粘度計（Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて測定された。５００μＬの試料を、ポジティブディスプレイスメントピペッターを用いて試料カップに加えた。試料カップを固定した後、スピンドルの回転速度を約８０％のトルクが達成されるまで徐々に増加させた。この時点で、回転速度が停止し、粘度の読み出しは、Ｒｈｅｏｃａｌｃソフトウェアによって生成された。
高濃度タンパク質製剤は、時折、ＣＰ５０−１スピンドルを備えた異なる種類の粘度計Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ Ｐｈｙｓｉｃａ Ｍｏｄｅｌ ＭＣＲ３００を用いて測定された。この機器では、６００μＬの試料が使用され、Ｒｈｅｏｐｌｕｓソフトウェアバージョン３．４を使用して、溶液粘度を計算した。いずれの粘度計を使用しても測定には大きな差異がなかった。
Figure 0006166717
表３０中に示される結果は、特定の安定剤／賦形剤を有する製剤において比較的低い粘度を有する高濃度の１１Ｆ１抗体を得る能力を示す。安定剤のメチオニン、プロリン、アルギニン、グリシン、セリン、およびアラニンを含む製剤は、特に低い粘度を示した。
実施例３１
高濃度ＰＣＳＫ９ ＡＢＰ製剤の安定性研究
高タンパク質ＰＣＳＫ９ ＡＢＰ製剤に対する安定性の効果を評価するために、２１Ｂ１２の組成物が、以下の表３１．１に示される異なる製剤中で製剤化された。製剤は、−３０℃または４℃で、０週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、６ヶ月間、および１年間、指示された容器内でインキュベートされた。それぞれの製剤に関しては、それぞれの時点で、試料を、天然サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および光不明瞭化による不可視粒子検出（ＨＩＡＣ）によって抗体モノマーをモニタリングするためにそれぞれのパッケージから取り出した。
Figure 0006166717
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：
ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、それらの流体力学的体積の差に基づいてタンパク質を分離する。より大きな流体力学的体積のタンパク質を有する分子は、より小さい体積を有する分子よりも早く溶出する。可変波長検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ上で、５μｍ 粒径を有するＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ ７．８ｍｍ×３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、天然ＳＥＣ−ＨＰＬＣを行った。移動相は、１００ｍＭ リン酸ナトリウム、２５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．８±０．１であった。流速は、０．５ｍＬ／分であった。カラム溶出液は、２８０ｎｍでモニタリングされた。クロマトグラム内の積分ピーク面積を使用して、モノマーおよび高分子量種の分量を定量化した。
Figure 0006166717
表３１．２は、０週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、および６ヶ月間、Ｘ℃でインキュベートされた、表３１．１中に列記される２１Ｂ１２製剤の天然ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。「高分子量（ＨＭＷ）の割合（％）」は、試料中の高分子量２１Ｂ１２モノマーの分量を示す。これらの結果は、いかなる製剤の問題点も６ヶ月後に観察されなかったことを示すが、幾つかの高分子量種は、メチオニン製剤（すなわち、製剤２、５、および８）中で増加した。
不明瞭化による不可視粒子検出（ＨＩＡＣ）：
液体試料採取装置を有する光不明瞭化センサー（ＨＩＡＣ／Ｒｏｙｃｏ ＨＲＬＤ−１５０または同等物）を含む電気液体伝達（ｌｉｑｕｉｄ−ｂｏｒｎｅ）粒子計数システム（ＨＩＡＣ／Ｒｏｙｃｏ ９７０３または同等物）は、所与の試験試料中の粒子数およびそれらのサイズ範囲を定量化する。液体中の粒子が光源と検出器との間を通過する場合に、それらは、検出器上に位置する光線を減退させるか、または「不明瞭化する」。粒子の濃度がセンサーの正常な範囲内にある場合に、これらの粒子は、１つずつ検出される。それぞれの粒子の検出ゾーンの通過は、光検出器上の入射光を減少させ、光検出器の電圧出力が一過的に減少する。電圧の変化は、存在する粒子数に機器によって変換される電気パルスとして登録する。この方法は、非特異性であり、それらの起源に関わらず粒子を測定する。モニタリングされた粒径は、１０μｍおよび２５μｍであった。
この実施例では、ＨＩＡＣ分析が、４℃で保存された試料を用いて行われた。具体的には、表３１．１中の２１Ｂ１２製剤の試料は、分子計数システムにおいて粒子として検出される可能性がある気泡を除去するために、真空処理に供された（「脱ガス」とも称される）。２１Ｂ１２試料に関しては、この方法は、この試料を７５トール（約１０ｋＰａ）で１〜２時間真空処理に供することであった。粒子計数は、脱ガスプロセスが完了してから２時間以内に行われた。
図２９Ａおよび２９Ｂは、０週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、および６ヶ月間、容器内でインキュベートされた、上で特定された製剤についてのＨＩＡＣアッセイの結果を示す。１０μｍおよび２５μｍの粒子が計数された。図２９Ａおよび２９Ｂは、２１Ｂ１２の製剤のすべてがＨＩＡＣで測定されるように安定していたことを示す。ガラスシリンジ内の製剤、すなわち、製剤４〜６が、タンパク質濃度および製剤にわたってより高いレベルの粒子を示したが、それらの粒子計数は、それぞれの粒径（１０μｍおよび２５μｍ）に対してＵＳＰ限界値を下回る。１０μｍ 粒子のＵＳＰ限界値は、１容器当たり６０００であり、２５μｍ 粒子では、１容器あたり６００である。
実施例３２
１１Ｆ１の安定性研究
１１Ｆ１の高濃度製剤（１５０ｍｇ／ｍＬ）を研究するために、幾つかの製剤が以下表３２Ａに示されるように、候補賦形剤を用いて作製された。製剤は、−３０℃または４℃で、少なくとも６ヶ月間、指示された容器内で保存された。
Figure 0006166717
高分子量種の割合（％）が、以下の表３２Ｂに示される時点で、−３０℃および４℃で保存後、サイズ排除ＨＰＬＣによって評価された。簡潔に言えば、サイズ排除ＨＰＬＣは、それらの流体力学的体積の差に基づいてタンパク質を分離する。より大きな流体力学的体積のタンパク質を有する分子は、より小さい体積を有する分子よりも早く溶出する。可変波長検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ上で、５μｍ 粒径を有するＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ＳＷＸＬ ７．８ｍｍ×３０ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、天然ＳＥＣ−ＨＰＬＣを行った。移動相は、１００ｍＭ リン酸ナトリウム、２５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ６．８＋／−０．１であった。流速は、０．５ｍＬ／分であった。カラム溶出液は、２８０ｎｍでモニタリングされた。クロマトグラフ内の積分ピーク面積を使用して、モノマーおよび高分子量種の分量を定量化した
Figure 0006166717
表３２Ｂは、０週間、２ヶ月間、４ヶ月間、または６ヶ月間、４℃または−３０℃でインキュベートした、表３２Ａ中に列記される１１Ｆ１製剤の天然ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析の結果を示す。「高分子量（ＨＭＷ）の割合（％）」は、試料中の高分子量１１Ｆ１モノマーの分量を示す。これらの結果は、いかなる製剤の問題点も最大６ヶ月までに観察されなかったことを示すが、幾つかの高分子量種は、−３０℃で保存されたメチオニン製剤（すなわち、製剤３、および６）中で増加した。
さらなる高濃度１１Ｆ１製剤の安定性は、下の表３２Ｃに示されるように主要容器内で製剤を調製することによって評価された。
Figure 0006166717
製剤は、４℃で１年間インキュベートされた。下の表３２Ｄで示された時点で、試料は、それぞれの容器から取り出され、上の表３２Ｂに記載されるように、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析された。
Figure 0006166717
下の表３２Ｅに示された時点で、試料はそれぞれの容器から取り出され、陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）によって分析された。陽イオン交換ＨＰＬＣは、それらの表面電荷の差に基づいてタンパク質を分離する。設定されたｐＨで、１１Ｆ１の荷電されたアイソフォームは、陽イオン交換カラム上で分離され、塩勾配を用いて溶出される。この溶離は、紫外吸光度によってモニターされる。荷電されたアイソフォームの分布は、総ピーク面積の割合（％）としてそれぞれのアイソフォームのピーク面積を決定することによって評価される。
可変波長検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ上で、１０μｍ 粒径を有するＤｉｏｎｅｘ Ｇ３０００ＳＷＸＬ ４．０ｍｍ ＩＤ×２５０ｍｍ カラム（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて、天然ＣＥＸ−ＨＰＬＣを行った。移動相は、２０ｍＭ ＭＥＳの線形勾配、ｐＨ６．０＋／−０．１、および５００ｍＭ 塩化ナトリウムを含む同じ緩衝液であった。流速は、０．６ｍＬ／分であった。カラム溶出液は、２８０ｎｍでモニタリングされた。クロマトグラフ内の積分ピーク面積を使用して、変化の異なるアイソフォームの分量を定量化した。
Figure 0006166717
表３２Ｄおよび３２Ｅはいずれも、記載された１１Ｆ１製剤が、４℃で最大１年間の保存で、高分子量の割合（％）の５％未満の増加（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）または主要なアイソフォームピークの３〜５％未満の変動（陽イオンＨＰＬＣ）を示したことを示す。つまり、両パラメータの変化は、非常に低く、このことは高度に安定した製剤であることを示す。
不明瞭化による不可視粒子検出（ＨＩＡＣ）：
液体試料採取装置を有する光不明瞭化センサー（ＨＩＡＣ／Ｒｏｙｃｏ ＨＲＬＤ−１５０または同等物）を含む電気液体伝達（ｌｉｑｕｉｄ−ｂｏｒｎｅ）粒子計数システム（ＨＩＡＣ／Ｒｏｙｃｏ ９７０３または同等物）は、所与の試験試料中の粒子数およびそれらのサイズ範囲を定量化する。液体中の粒子が光源と検出器との間を通過する場合に、それらは、検出器上に位置する光線を減退させるか、または「不明瞭化する」。粒子の濃度がセンサーの正常な範囲内にある場合に、これらの粒子は、１つずつ検出される。それぞれの粒子の検出ゾーンの通過は、光検出器上の入射光を減少させ、光検出器の電圧出力が一過的に減少する。電圧の変化は、存在する粒子数に機器によって変換される電気パルスとして登録する。この方法は、非特異性であり、それらの起源に関わらず粒子を測定する。モニタリングされた粒径は、１０μｍおよび２５μｍであった。
この実施例では、ＨＩＡＣ分析は、４℃で保存された試料を用いて行われた。具体的には、表３２ａ中の１１Ｆ１製剤の試料は、分子計数システムにおいて粒子として検出される可能性がある気泡を除去するために、真空処理に供された（「脱ガス」とも称される）。１１Ｆ１試料に関しては、この方法は、この試料を７５トール（約１０ｋＰａ）で１〜２時間真空処理に供することであった。粒子計数は、脱ガスプロセスが完了してから２時間以内に行われた。
図３０Ａおよび３０Ｂは、０週間および４ヶ月間、容器内でインキュベートされた上で特定された製剤についてのＨＩＡＣアッセイの結果を示す。１０μｍおよび２５μｍの粒子が計数された。図３０Ａおよび３０Ｂは、１１Ｆ１の製剤のすべてがＨＩＡＣで測定されるように安定していたことを示す。すべての製剤についての粒子計数は、それぞれの粒径（１０μｍおよび２５μｍ）に対してＵＳＰ限界値を下回る。１０μｍ粒子のＵＳＰ限界値は、１容器当たり６０００であり、２５μｍ粒子では、１容器あたり６００である。
実施例３３
１１Ｆ１の結合特異性
このアッセイからの結果は、１１Ｆ１がＰＣＳＫ９に結合するが、ＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２、ＰＣＳＫ７、またはフーリンには結合しないことを示し、このことはＰＣＳＫ９に対する１１Ｆ１の特異性を示す。
緩衝液Ａ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＢＳＡ、０．０５％ ｔｗｅｅｎ、ｐＨ７．５）中に希釈されたビオチン化されたＰＣＳＫ９は、０．２μｇ／ｍＬの濃度で、室温で１時間インキュベートされた、ニュートラアビジンで被覆された９６ウェルプレートに結合された。別々に、（ｔｗｅｅｎを含まない緩衝液Ａ中で希釈された）様々な濃度（０〜２０μｇ／ｍＬの範囲）のＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２、ＰＣＳＫ７、ＰＣＳＫ９、またはフーリン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）のいずれかを用いて、０．４μｇ／ｍＬの１１Ｆ１を、室温で１時間インキュベートした。４．５μｇ／ｍＬのフーリン阻害剤は、すべてのフーリン含有反応物とともに含まれた。ＰＣＳＫ９で被覆されたストレプトアビジンプレートを、緩衝液Ａで洗浄し、抗体／前駆タンパク質転換酵素の混合物を、プレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ヤギαヒトＦｃ−ＨＲＰ（１６０ｎｇ／ｍＬ、緩衝液Ａ中で希釈された）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）によるインキュベーション、続いて、ＴＭＢ基質によるインキュベーションによって、結合抗体を検出した。１Ｎ ＨＣｌを用いて反応を停止させ、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ３８４分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で４５０ｎｍの波長で吸光度を読み取った。
このアッセイは、溶液中の前駆タンパク質転換酵素の能力に依存して、プレートに捕捉されたＰＣＳＫ９への１１Ｆ１の結合に競合した。溶液中の１１Ｆ１およびＰＣＳＫ９の事前インキュベーションは、ＯＤ４５０の減少として検出された、プレートに捕捉されたＰＣＳＫ９への１１Ｆ１の結合の量を用量依存的かつ確実に減少させた（図３１）。すべての結果は、前駆タンパク質転換酵素の濃度に対して平均ＯＤ４５０値±標準偏差として表された。溶液中のＰＣＳＫ１、ＰＣＳＫ２、ＰＣＳＫ７、またはフーリンを用いた１１Ｆ１の事前インキュベーションは、プレートに捕捉されたＰＣＳＫ９への１１Ｆ１の結合に著しい影響を受けなかった。したがって、研究されたタンパク質濃度で、１１Ｆ１は、ＰＣＳＫ９にのみ結合し、試験された他の前駆タンパク質転換酵素ファミリーメンバーには結合しない。
実施例３３
ＬＤＬＲ：ＰＣＳＫ９結合の１１Ｆ１阻害の有効性
本実施例は、ナノモル濃度の１１Ｆ１が、このアッセイの条件下でＬＤＬＲへのＤ３７４Ｙおよび野生型ＰＣＳＫ９の両方の結合を阻害することができることを示す。
簡潔に言えば、透明な３８４ウェルプレートを、４℃で一晩のインキュベーションによりＰＢＳ中で希釈された２μｇ／ｍＬのヤギ抗ＬＤＬ受容体抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で被覆した。緩衝液Ａ（１００ｍＭ カコジル酸ナトリウム ｐＨ７．５）を用いて、プレートを十分に洗浄し、室温で２時間、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ中の１％ 脱脂粉乳［Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ］）で遮断した。洗浄後、緩衝液Ｃ（１０ｍＭ ＣａＣｌ２が補充された緩衝液Ｂ）中で希釈された０．４μｇ／ｍＬのＬＤＬ受容体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）とともに、プレートを１．５時間室温でインキュベートした。このインキュベーションと同時に、２０ｎｇ／ｍＬのビオチン化されたＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９または１００ｎｇ／ｍＬのビオチン化された野生型ＰＣＳＫ９を、緩衝液Ａ（Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９アッセイに対しては、６．０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｕｇ／ｍＬの最終濃度または野生型ＰＣＳＫ９アッセイに対しては、３．１ｎｇ／ｍＬ〜２５ｕｇ／ｍＬの最終濃度）中で希釈された、様々な濃度の抗ＰＣＳＫ９抗体１１Ｆ１とともにインキュベートした。ＬＤＬＲで被覆したプレートを洗浄し、ビオチン化されたＰＣＳＫ９／抗体の混合物を添加した。ＬＤＬＲプレートを、室温で１時間インキュベートした。ＬＤＬＲへのビオチン化されたＰＣＳＫ９の結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（緩衝液Ｃ中の５００ｎｇ／ｍＬ）とともにインキュベートし、続いて、ＴＭＢ基質とともにインキュベートすることによって検出した。１Ｎ ＨＣｌを用いて反応を停止させ、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ３８４分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で４５０ｎｍの波長で吸光度を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ４．０１）ソフトウェアを用いて、ＯＤ４５０に対して抗体濃度のｌｏｇをプロットして、非線形回帰によるＩＣ５０値を決定した。
１１Ｆ１は、ＬＤＬＲ：ＰＣＳＫ９結合を阻害した。Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９アッセイにおける１１Ｆ１に対するＩＣ５０値は、７．３ｎＭ〜１０．１ｎＭの範囲であり、９．１ｎＭ±１．５ｎＭ（ｎ＝３）の平均（±標準偏差）を有した。野生型ＰＣＳＫ９アッセイにおける１１Ｆ１に対するＩＣ５０値は、４．４ｎＭ〜８．１ｎＭの範囲であり、５．９ｎＭ±１．９ｎＭ（ｎ＝３）の平均（±標準偏差）を有した。これらのＩＣ５０値は、結合アッセイに使用される組換えＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９または野生型ＰＣＳＫ９の量に依存していることに留意するべきである。Ｄ３７４Ｙおよび野生型アッセイの両方に対する代表的な用量反応曲線がそれぞれ、図３２および図３３に表される。
実施例３４
細胞ＬＤＬ取り込みを遮断する１１Ｆ１の有効性
１１Ｆ１は、インビトロでＰＣＳＫ９とＬＤＬＲとの間の相互作用を遮断し、ＨｅｐＧ２細胞中のＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬ取り込みの減少を防ぐことができる。
簡潔に言えば、１０％ ＦＢＳおよび１％の抗生物質−抗真菌溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）が補充されたＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中の１ウェル当たり５×１０４細胞の濃度で、黒色透明底９６ウェルプレート（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＣＯ ＬＬＣ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）中にヒトＨｅｐＧ２細胞を播種した。細胞を３７℃（５％ ＣＯ２）で一晩インキュベートした。Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９と抗体または野生型ＰＣＳＫ９と抗体との間で複合体を形成させるために、６６６．７ｎＭ〜０．７ｎＭ（Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９を遮断するため）または３．３μｍ〜３．３ｎＭ（野生型ＰＣＳＫ９を遮断するため）の１１Ｆ１の段階希釈液（１：２）を、製剤緩衝剤（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣＬ）中で調製した。Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９（２μｇ／ｍＬ）または野生型ＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍＬ）のいずれかを、取り込み緩衝液（１％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）中で希釈し、様々な濃度の１１Ｆ１または緩衝剤のみ（陰性対照）とともに、室温で１時間、振とうしながらインキュベートした。ＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、１２μｇ／ｍＬの濃度になるまで取り込み緩衝液中で希釈した。一晩のインキュベーション後、ＨｅｐＧ２細胞をＤＰＢＳ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）で２回すすいだ。２５マイクロリットルのＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９または野生型ＰＣＳＫ９を、１１Ｆ１と複合化し、２５μＬの希釈されたＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を細胞に添加し、３７℃（５％ ＣＯ２）で３時間インキュベートした。細胞をＤＰＢＳで５回洗浄し、１００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁した。４８０〜５２０ｎｍ（励起）および５２０〜６００ｎｍ（発光）で、Ｓａｆｉｒｅプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、蛍光シグナルを検出し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン４．０２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ソフトウェアを用いて、ＲＦＵに対して抗体濃度のｌｏｇをプロットし、シグモイド用量反応（可変勾配）の曲線適合プログラムを用いて非線形回帰によってＥＣ５０値を決定した。
この実施例は、１１Ｆ１が、用量依存的様式において、ＨｅｐＧ２細胞中のＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９または野生型ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬ取り込みの減少を阻止したことを示す。ＨｅｐＧ２細胞への組換え精製されたＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９（２μｇ／ｍＬ）または野生型ＰＣＳＫ９（２５μｇ／ｍＬ）の添加はそれぞれ、未処理の細胞中で測定されたＢＯＤＩＰＹ−ＬＤＬの取り込みを約５０〜６０％および約４０％のレベルまで減少させた。未処理の細胞中で観察されたレベルまで、抗体は、ＬＤＬ取り込みを用量依存的に回復させた。Ｄ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬ取り込みの減少を阻止するための１１Ｆ１の能力に対する平均（±標準偏差）のＥＣ５０値は、３５．３±９．１ｎＭであった（ｎ＝６、図３４）。野生型ＰＣＳＫ９媒介によるＬＤＬ取り込みの減少を阻止するための１１Ｆ１の能力に対するＥＣ５０値は、１２４．２±２８．５ｎＭであった（ｎ＝３、図３５）。これらのＥＣ５０値は、細胞アッセイに使用される組換えＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９または野生型ＰＣＳＫ９の量の関数であることに留意するべきである。野生型ＰＣＳＫ９（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ，２００７、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，２００７、Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ，２００８）のものよりもＬＤＬＲに対する結合親和性が５倍〜３０倍高いため、このアッセイにおいてより少ないＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９が使用されたので、ＥＣ５０値は、野生型ＰＣＳＫ９よりもＤ３７４Ｙ ＰＣＳＫ９に対して低い。
ここで報告されたＥＣ５０値は、１１Ｆ１に対する３〜６の別々の測定値から得られる平均値に対して代表的なものである。
実施例３５
マウスモデルにおけるアデノ随伴ウイルスを介して発現されたヒトＰＣＳＫ９を遮断する１１Ｆ１および８Ａ３の有効性
抗ＰＣＳＫ９抗体１１Ｆ１または８Ａ３の単回静脈内ボーラス投与は、ＡＡＶによりヒトＰＣＳＫ９を発現するマウスにおける血清非ＨＤＬ−ＣおよびＴＣの有意な減少をもたらす。この実施例は、インビボでのヒトＰＣＳＫ９の機能を遮断する両方の抗ＰＣＳＫ９抗体の有効性を示す。
簡潔に言えば、ヒトＰＣＳＫ９を発現する１２０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスが、ヒトＰＣＳＫ９をコードする改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の感染により生成され、上昇したレベルの循環する低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）をもたらした。血清コレステロール分析が、Ｃｏｂａｓ Ｉｎｔｅｇｒａ ４００ ｐｌｕｓ化学分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて行われた。動物が、同様レベルの非ＨＤＬ−Ｃ（ＬＤＬ−ＣおよびＶＬＤＬ−Ｃ）、ＨＤＬ−Ｃ、およびＴＣを有する処置群に無作為化された。処置０日目（Ｔ＝０）において、一部のマウスを殺処分し、血清が回収され、その日のベースラインレベルを構築した。次いで、尾静脈投与を介して、１１Ｆ１、８Ａ３、または抗キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）ＩｇＧ２対照抗体を３０ｍｇ／ｋｇで残りのマウスに投与した。注射後、１日〜５日目に、一部のマウスを殺処分し、大静脈から全血を回収し、室温で３０分間凝固させた。卓上遠心分離機を用いて１０分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離後、血清を回収した。血清コレステロール分析は、Ｃｏｂａｓ Ｉｎｔｅｇｒａ ４００ ｐｌｕｓ化学分析装置を用いて行われた。
ＰＣＳＫ９の血清濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。透明な９６ウェルプレートを、１ＸＰＢＳ中で希釈された２μｇ／ｍＬのモノクローナル抗ＰＣＳＫ９抗体（３１Ｈ４）を用いて一晩被覆した。１ＸＰＢＳ／０．０５％ ｔｗｅｅｎを用いて、プレートを十分に洗浄し、３％ ＢＳＡ／１ＸＰＢＳを用いて２時間遮断した。洗浄後、一般的なアッセイ希釈液（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ）中で希釈された血清とともに、プレートを２時間インキュベートした。組換えヒトＰＣＳＫ９（１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ）を同時にアッセイし、それぞれのＥＬＩＳＡプレート上で標準曲線を生成するために使用した。ウサギポリクローナルビオチン化された抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｄ８７７３，Ａｍｇｅｎ Ｉｎｃ，ＣＡ）を、１ｕｇ／ｍＬ（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中）で添加し、続いて、２００ｎｇ／ｍＬ（１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中）でニュートラアビジン−ＨＲＰを添加した。結合ＰＣＳＫ９を、ＴＭＢ基質とともにインキュベートすることにより検出した。１Ｎ ＨＣｌを用いて反応を停止させ、吸光度が、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ ３８４分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で、４５０ｎｍで測定された。組換えヒトＰＣＳＫ９を用いて生成された標準曲線（４−パラメータロジスティック適合）を使用して、血清試料中のＰＣＳＫ９の対応する濃度を測定した。
抗体の血清濃度を、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。ポリクローナルヤギ抗ヒトＦｃ ＩｇＧおよびＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγポリクローナル試薬（ともに、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃから市販、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）をそれぞれ、捕捉および検出抗体として使用した。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液を過酸化物と反応させ、西洋ワサビペロキシダーゼ（ＨＲＰ）の存在下で、捕捉試薬によって結合された代表的な抗ＰＣＳＫ９抗体の量に比例した発色シグナルを生じさせた。色の強度（光学密度、ＯＤ）は、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｐｌｕｓ ３８４）を用いて、４５０ｎｍ−６５０ｎｍで測定された。別々に調製された標準曲線のロジスティック（自動推定）回帰を用いるＷａｔｓｏｎ バージョン７．０．０．０１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）データ整理パッケージを用いて、データを分析した。アッセイの定量下限（ＬＬＯＱ）は、３４．４ｎｇ／ｍＬであった。
ＡＡＶマウスにおける薬物動態パラメータの算出
ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ，バージョン５．１．１（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用い、それぞれの対象に対して事前に決定された公称時点（ｎｏｍｉｎａｌ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）を用い、血清濃度に対する非コンパートメント分析（ＮＣＡ）を行った。末端排出速度定数および半減期を推定するためのデータ点は、濃縮−時間プロファイルの目視検査により選択された。報告されたＮＣＡパラメータには、見かけの半減期（ｔ１／２）、時間ゼロから最後に測定された濃度（ＡＵＣ０−ｔ）までの血清濃度−時間曲線下面積、および見かけの血清クリアランス（ＣＬ０−ｔ）が含まれる。ＡＵＣ０−ｔは、線形対数線形台形法則を用いて決定され、ＣＬ０−ｔは、Ｄｏｓｅ／ＡＵＣ０−ｔによって算出された。１１Ｆ１、８Ａ３、および３１Ｈ４抗体については。研究後の用量溶液分析は、実際の用量が、３０ｍｇ／ｋｇの標的の２０％以内であったことを示した。しかしながら、ＩｇＧ２対照については、分析は、実際の用量が、意図された標的のわずか４０％であったことを示した。したがって、１２ｍｇ／ｋｇの訂正された用量が、ＩｇＧ２対照用のＣＬ０−ｔ算出のために使用された。パラメータは、２つの有意な統計に対して報告された半減期を除いては、３つの有意な統計に対して報告された。
統計分析
すべてのコレステロール結果は、平均±標準誤差として表された。すべての薬物動態学的データは、平均±標準偏差として表された。一元配置ＡＮＯＶＡによって決定された０．０５のｐ値を閾値として使用して、同じ時点で、抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体を注射された動物と抗ＰＣＳＫ９抗体を投与したものとの間の統計的優位性を決定した。
血清非ＨＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、およびＴＣに対する抗ＰＣＳＫ９抗体の効果
ベースラインを構築するために、ヒトＰＣＳＫ９を発現する一部のマウスを抗体の注射前に殺処分し、血液を回収した。これらの動物における非ＨＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、およびＴＣレベルはそれぞれ、３３±４、１１７±４、および１８３±９ｍｇ／ｄＬ（平均±平均誤差）であった。ナイーブ動物におけるＰＣＳＫ９のレベルは、４９２１ｎｇ／ｍＬ±２０４４ｎｇ／ｍＬであると判定された。
抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体を注射されたマウス（対照動物）と比較して、１１Ｆ１の注射は、注射してから１、２、および４日目に、非ＨＤＬ−Ｃの有意な低下を生じ（５９％の最大値を有する）、その一方で、ＴＣは、４日目のみ（２２％まで）有意に低下した（図３６、図３７）。いかなる時点でも、ＨＤＬ−Ｃの有意な低下は観察されなかった（図３８）。
対照動物と比較して、８Ａ３の注射は、注射してから１、２、および４日目に、非ＨＤＬ−Ｃの有意な低下を生じ（６５％の最大値を有する）、その一方で、ＴＣは、注射してから２日目に（２４％の最大値を有する）有意に低下した（図３６、図３７）。いかなる時点でも、ＨＤＬ−Ｃの有意な低下は観察されなかった（図３８）。
薬物動態
３０ｍｇ／ｋｇの静脈内投与で、１１Ｆ１および８Ａ３は、非常に類似した薬物動態学的挙動を有した（図３９）。これらの２つの分子については、ＡＵＣ０−ｔの曝露量、推定されたＣＬ０−ｔ、および見かけの半減期が同等であった（図４０の表）。抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体は、１１Ｆ１および８Ａ３よりも予想外に低いＡＵＣ０−ｔの曝露量を有したが、これは、意図された用量よりも低い抗体が投与されたためである可能性が高い（３０ｍｇ／ｋｇとは対照的に１２ｍｇ／ｋｇ、用量溶液分析は、抗体濃度が標的の４０％であることを示した。抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体ＣＬ０−ｔは、訂正された用量を用いて算出された場合、１１Ｆ１および８Ａ３のものと同様であり、１２０時間を超える抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体の見かけの半減期が推定された。ＡＡＶモデルにおいて投与された他の抗体と比較した場合に、１１Ｆ１および８Ａ３のＣＬ０−ｔ値が抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体に対してより類似しているため、抗体配置に対するＰＣＳＫ９リガンドの影響が、１１Ｆ１および８Ａ３に対してあまり生じないことをこれらのデータは示唆した。
要約
マウスにおけるＡＡＶによるヒトＰＣＳＫ９の発現（約５μｇ／ｍＬ）は、約３３ｍｇ／ｄＬの血清非ＨＤＬ−Ｃレベルにおいて生じた。３０ｍｇ／ｋｇの１１Ｆ１の注射後、有意な血清非ＨＤＬ−Ｃの低下が、注射から１、２、および４日目に観察された（対照動物と比較して、５９％の最大値を有する）。ＴＣの有意な低下は、４日目のみに見られた。８Ａ３の注射は、対照動物と比較して、６５％の最大値で非ＨＤＬ−Ｃを低下させる類似パターンを生じた。しかしながら、８Ａ３投与は、２４％の最大値で、注射してから２日目のみ、有意なＴＣ低下をもたらした。１１Ｆ１または８Ａ３のいずれを投与した動物においても、ＨＤＬ−Ｃの有意な低下は観察されなかった。１１Ｆ１および８Ａ３の血清抗体レベルの分析は、抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体に対して同様のプロファイルを示した。
実施例３６
カニクイザルにおける血清脂質に対する１１Ｆ１、２１Ｂ１２、および８Ａ３の単回皮下投与の効果
カニクイザルに対する１１Ｆ１、８Ａ３、または２１Ｂ１２の単回皮下投与は、血清ＬＤＬ−ＣおよびＴＣの有意な低下をもたらす。この研究は、非ヒト霊長類における血清コレステロールを低下させる抗ＰＣＳＫ９抗体の能力を示した。
簡潔に言えば、ナイーブ雄カニクイザルを、実験前の少なくとも２週間、それらの環境に順化させた。動物は、血清ＴＣ、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ、トリグリセリドレベル、および体重の選別に基づいて処置群に無作為化された。１週間後、動物を一晩絶食させ、Ｔ＝０の指定された時点でベースラインの血清脂質レベルの測定のために、末梢血管系（橈側皮または伏在静脈）から出血させた。次いで、動物に、０．５ｍｇ／ｋｇ（すべて、０．４ｍＬ／ｋｇ体重）で、抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体、１１Ｆ１、２１Ｂ１２、または８Ａ３のいずれかを皮下投与した（すべて、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．２、９％ スクロースの量で）。次いで、空腹時の血液試料を、４５日間にわたって、指定された時点で動物から採取した。
Figure 0006166717
指定の時点で、一晩の絶食条件下の動物から、末梢血管系（橈側皮または伏在静脈）から、血液を採取した。室温で３０分間、全血を凝固させた。２０分間３，０００ｒｐｍで遠心分離した後、血清を採取した。直接血清コレステロール分析を、Ｃｏｂａｓ Ｉｎｔｅｇｒａ ４００分析装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて行った。以下の手法を用いて、Ａｎｉｌｙｔｉｃｓ，ＭＤにより指定の時点（０、３、６、１５、２４、および３３日目）で、アポリポタンパク質Ｂ血清レベルを決定した。１７μＬの試料のアリコート（調製なし）は、６点標準曲線を用い、Ｈｉｔａｃｈｉ ７１７Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた分析用に使用した。試料の初期値が標準的な曲線の線形性よりも高かった場合、試料は、希釈され、適切な希釈係数によって乗じられた結果を反復した。アッセイ用の試薬（ＡＰＯ−Ｂ試薬キット＃８６０７１、抗体セット＃８６０６０、対照セット＃８６１０３）は、ＤｉａＳｏｒｉｎ（Ｓｔｉｌｌｗａｔｅｒ，ＭＮ）から得た。
３４．４〜３０００ｎｇ／ｍＬのアッセイ範囲（３４．４ｎｇ／ｍＬが定量下限［ＬＬＯＱ］である）を有する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、血清中の抗体濃度を決定した。
Ｗａｔｓｏｎ（登録商標）ＬＩＭＳ，ｖｅｒｓｉｏｎ７．０．０．０１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用い、それぞれの対象に対して事前に決定された公称時点（ｎｏｍｉｎａｌ ｔｉｍｅ ｐｏｉｎｔ）を用いて、血清濃度に対する非コンパートメント分析（ＮＣＡ）を行った。末端排出速度定数および半減期を推定するためのデータ点は、濃縮−時間プロファイルおよび最良線形当てはめの目視検査により選択された（一般には、３６０時間から抗体濃度が定量下限にまで下落するまで）。報告されたＮＣＡパラメータには、末端半減期（ｔ１／２，ｚ）、最大血清濃度（Ｃｍａｘ）、時間ゼロから無限大までの血清濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）、および見かけの血清クリアランス（ＣＬ／Ｆ）が含まれる。ＡＵＣ０−∞は、線形の対数線形台形法を用いて算出した。すべてのパラメータは、２つの有意な統計に対して報告された半減期を除いては、３つの有意な統計に対してすべて報告された。
統計分析
ベースラインを共変量として見なし、処置群を母数効果として見なす統計的モデルを、ＬＤＬ−Ｃ、ＨＤＬ−Ｃ、ＴＣ、およびトリグリセリドに対するそれぞれの時点で対数変換した反応に当てはめた。Ｔｕｋｅｙの多重比較補正は、それぞれの時点で、ペアワイズ比較（ｐａｉｒ ｗｉｓｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を調整するために適用した。統計的有意性は、調整したｐ値を用いて、α＝０．０５で評価された。
血清ＬＤＬコレステロールに対する１１Ｆ１、２１Ｂ１２、および８Ａ３の効果
１１Ｆ１に対する最大のＬＤＬ−Ｃ低下が、注射してから９日間後に観察され、抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体で処置したサル（対照動物）と比較して、ＬＤＬ−Ｃが５７％低下した。ＬＤＬ−Ｃは、２７日目に対照動物において観察されたものと同様のレベルまで戻った。２１Ｂ１２に対する最大のＬＤＬ−Ｃ低下が、注射してから３日後に観察され、対照動物と比較して、ＬＤＬ−Ｃが６４％低下した。ＬＤＬ−Ｃは、６日目に対照動物と同様のレベルまで戻った。８Ａ３に対する最大のＬＤＬ−Ｃ低下が、注射してから４日後に観察され、対照動物と比較して、ＬＤＬ−Ｃが５４％低下した。ＬＤＬ−Ｃは、２７日目に対照動物において観察されたものと同様のレベルまで戻った（図４１）。
血清総コレステロールに対する１１Ｆ１、２１Ｂ１２、および８Ａ３の効果
１１Ｆ１に対する最大のＴＣ低下が、注射してから９日間後に観察され、抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体で処置したサル（対照動物）と比較して、ＴＣが２７％低下した。ＴＣは、２７日目に対照動物において観察されたものと同様のレベルまで戻った。２１Ｂ１２に対する最大のＴＣ低下が、注射してから３日間後に観察され、対照動物と比較して、ＴＣが２０％低下した。ＴＣは、４日目にビヒクルで処置したサルにおいて観察されたものと同様のレベルまで一時的に戻ったが、１４日目〜１８日目（両端の日を含む）の間で著しく低下した。８Ａ３に対する最大のＴＣ低下が、注射してから９日間後に観察され、対照動物と比較して、ＴＣが２２％低下した。ＴＣは、３０日目に対照動物において観察されたものと同様のレベルまで戻った（図４２）。
血清ＨＤＬコレステロールおよびトリグリセリドに対する１１Ｆ１、２１Ｂ１２、および８Ａ３の効果
平均して、それぞれの時点で、１１Ｆ１または８Ａ３で処置された動物に対するＨＤＬ−Ｃまたはトリグリセリドは、抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体で処置したサルにおいて観察されたものと有意に異ならなかった（α＝０．０５の有意水準に基づく）。しかしながら、２１Ｂ１２は、単一の時点（注射してから１８日目）でＨＤＬ−Ｃの統計的に有意な変化を引き起こした（図４３および図４５）。
アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）に対する１１Ｆ１、２１Ｂ１２、および８Ａ３の効果
血清ＡｐｏＢレベルが、注射後、３、６、１５、２４、および３３日目に測定された。１１Ｆ１および８Ａ３は、抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体で処置したサルと比較して、３日目〜２４日目でのＡｐｏＢ低下と関連していた（図４６）。２１Ｂ１２は、３日目のみ統計的に有意に低いＡｐｏＢレベルと関連していた。
１１Ｆ１、２１Ｂ１２、および８Ａ３の薬物動態プロファイル
処置による平均濃度時間プロファイルの要約プロットを７４８に示す。１１Ｆ１、２１Ｂ１２、８Ａ３、および抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体を受けている動物に対して推定された平均薬物動態パラメータを図４７の表に示す。
すべての群における抗体吸収は、一貫しており、抗体の皮下投与の特徴であった。ＣＬ／Ｆ、Ｃｍａｘ、およびＡＵＣ０−∞に関する２１Ｂ１２の薬学動態学的挙動は、２１Ｂ１２が同じ用量で投与された以前の研究において観察されたものと一致していた。１１Ｆ１および８Ａ３の薬物動態は、２１Ｂ１２とは有意に異なり、ＣＬ／Ｆの低下が観察され（２１Ｂ１２のＣＬ／Ｆの約１５％）、より長い半減期が推定された（２１Ｂ１２の４０時間と比較して約２００時間）。とりわけ、１１Ｆ１および８Ａ３の薬物動態は、互いに、そして、抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体といずれも区別できなかった。これらのデータは、１１Ｆ１および８Ａ３がＰＣＳＫ９に対して親和性がない抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体と同じ曝露プロファイルを有すると考えると、１１Ｆ１および８Ａ３の体内動態が、２１Ｂ１２よりもＰＣＳＫ９の標的との関連によりはるかに少ない範囲まで影響を及ぼすことを示唆する。
結果の要約
４５日間の研究にわたって、ＴＣおよびＬＤＬ−Ｃの統計的に有意な低下が、抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体と比較して、１１Ｆ１、２１Ｂ１２、または８Ａ３を投与した動物において観察された。１１Ｆ１は、２日目〜２４日目（両端の日を含む）で（抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体に対して）統計的に有意なＬＤＬ−Ｃ低下と関連していた。２１Ｂ１２は、包括的には、１日目〜４日目で（抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体に対して）統計的に有意なＬＤＬ−Ｃ低下を示した。８Ａ３は、包括的には、１日目〜２４日目で（抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体に対して）統計的に有意なＬＤＬ−Ｃ低下を示した。ＴＣおよびＡｐｏＢの変化は、すべての群でのＬＤＬ−Ｃにおいて観察された変化を反映した。１１Ｆ１は、注射してから９日後、（同じ時点で抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体に対して）ＬＤＬ−Ｃの最大の低下（−５７％）を達成した。２１Ｂ１２は、注射してから３日後、（同じ時点で抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体に対して）ＬＤＬ−Ｃの最大の低下（−６４％）を達成した。８Ａ３は、注射してから４日後、（同じ時点で抗ＫＬＨ ＩｇＧ２対照抗体に対して）ＬＤＬ−Ｃの最大の低下（−５４％）を達成した。２１Ｂ１２は、注射してから１８日後、単一の時点で、ＨＤＬ−Ｃが低下した。１１Ｆ１または８Ａ３投与後のＨＤＬ−Ｃレベルにおいて、統計的に有意な変化は観察されなかった。１１Ｆ１、２１Ｂ１２、または８Ａ３投与後のトリグリセリドレベルにおいて、統計的に有意な変化は観察されなかった。
実施例３７
ホモ接合型家族性高コレステロール血症を患っている対象におけるＬＤＬ−Ｃに対するヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の安全性、忍容性、および有効性を評価するための二部研究
研究設計：これは２つの部分を含む研究である。パートＡは、非盲検、単一アームの多施設試験的研究である。パートＢは、広範な登録を有するが、その他は、パートＡと同一の設計である、ヒト抗体２１Ｂ１２の二重盲検、無作為化、プラセボ対照、多施設研究である。試験対象患者基準／除外基準および評価スケジュールはいずれも、パートＡおよびＢに対して同じである。
試験対象患者基準には、以下が含まれる：
・１２歳以上６５歳以下の男性および女性
・ホモ接合型家族性高コレステロール血症の診断
・少なくとも４週間の安定した脂質低下療法
・１３０ｍｇ／ｄＬ（３．４ｍｍｏｌ／Ｌ）超のＬＤＬコレステロール
・４００ｍｇ／ｄＬ（４．５ｍｍｏｌ／Ｌ）未満のトリグリセリド
・スクリーニング時、４０ｋｇ以上の体重。
除外基準には、以下が含まれる：
・無作為化する８週間以内にＬＤＬまたは血漿吸着法
・ニューヨーク心臓病協会（ＮＹＨＡ）のクラスＩＩＩもしくはＩＶまたは最新の左心室駆出分画率が３０％未満
・無作為化する３ヶ月以内に心筋梗塞、不安定狭心症、経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）、冠動脈バイパスグラフト（ＣＡＢＧ）、または脳卒中
・心臓手術または血管再開通術が予定されている
・非制御の心不整脈
・非制御の高血圧症。
評価スケジュールには、有害事象（ＡＥ）および有意な有害事象（ＳＡＥ）データ、バイタルサイン、併用薬、実験室での試験等の収集が含まれるが、これらに限定されない。
試験対象患者基準／除外基準を満たす対象は、ＮＣＥＰの成人治療パネルＴＬＣ（または同等の）食生活に従うように指示され、研究の期間を通して現行の脂質低下療法を維持することが要求される。
２１Ｂ１２製剤は、滅菌の透明無色な冷凍液として示される。それぞれの滅菌バイアルは、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ５．２とともに製剤化された、１ｍＬの送達可能な体積の７０ｍｇ／ｍＬ ２１Ｂ１２で充填される。それぞれのバイアルは、単回使用のみのものである。プラセボは、透明無色の滅菌した無タンパク質冷凍液として同一の容器内に示され、１０ｍＭ 酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、０．００４％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０、ｐＨ５．２として製剤化される。
パートＡでは、４〜１６人の対象が登録され、非盲検の２１Ｂ１２製剤（４２０ｍｇで４週間ごと）を受ける。研究来院は、４週間ごとである。これらの来院は、有害事象（ＡＥ）および有意な有害事象（ＳＡＥ）データ、バイタルサイン、併用薬、実験室での試験等の収集を伴う。空腹時脂質パネルが、２１Ｂ１２製剤による処置に反応したＬＤＬ−Ｃレベルの最下点を評価するために、６週目に収集される。２１Ｂ１２製剤は、１日目、４週間目、および８週間目に投与される。研究終了時来院（ＥＯＳ）および脂質の最終評価は１２週間目である。
約５１人の新しい対象が、パートＢに登録される。登録された対象は、４２０ｍｇで２１Ｂ１２を４週間ごとに皮下投与またはプラセボを４週間ごとに皮下投与の２つの処置群への２：１での割り当てに無作為化される。無作為化は、ベースラインのＬＤＬ−Ｃレベルによって層別化される。研究来院は、４週間ごとにあり、２回の任意の来院は、２週間目および１０週間目である。来院は、ＡＥおよびＳＡＥデータ、バイタルサイン、併用薬、実験室での試験等の収集を伴う。空腹時脂質パネルは、２１Ｂ１２処置に反応したＬＤＬ−Ｃレベルの最下点を評価するために、６週目に収集される。２１Ｂ１２製剤は、１日目、４週間目、および８週間目に投与される。研究終了時来院（ＥＯＳ）および脂質の最終評価はすべての対象に対して１２週間目である。
参照による組込み
特許、特許出願、論文、および教科書等をふくむ本明細書中のすべての引用文献、ならびにそれらに引用された文献は、それらが既に引用されていない限り、ここで参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれた参照文献中に与えられている定義または用語のいずれもが本明細書に与えられている用語および論述と異なる場合には、本発明の用語および定義が優先する。
均等物
前記明細書は、当業者が本発明の実施を可能にするのに十分であると考えられる。前述の記載および実施例は、本発明のある特定の好ましい実施形態を詳述し、本発明者らによって想定される最良の様式を記載する。しかしながら、前記述が本文中でどれほど詳細に記載されているとしても、本発明は、多くの様式で実施することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびそのあらゆる均等物に従って解釈すべきであることが理解されよう。

Claims (40)

  1. 安定な製剤であって、
    （ａ）配列番号１のアミノ酸を含むＰＣＳＫ９に特異的に結合する、７０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの量で存在するモノクローナル抗体又はその断片、ここで、前記モノクローナル抗体又はその断片は、
    ｉ）配列番号１５８のＣＤＲ１である軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号１６２のＣＤＲ２である軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号３９５のＣＤＲ３である軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖ポリペプチド、及び、配列番号３０８又は３６８のＣＤＲ１である重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１７５のＣＤＲ２である重鎖ＣＤＲ２と、配列番号１８０のＣＤＲ３である重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖ポリペプチドを含むモノクローナル抗体又はその断片、又は
    ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び、配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体又はその断片
    である、
    （ｂ）１０〜２０ｍＭの酢酸ナトリウム、
    （ｃ）０．５％ｗ／ｖから１０％ｗ／ｖのプロリン、及び
    （ｄ）０．００４％ｗ／ｖ〜０．０１％ｗ／ｖのポリソルベート２０又はポリソルベート８０、
    を含み、
    （ｅ）ｐＨ５．０〜５．５
    を有する、安定な製剤。
  2. モノクローナル抗体又はその断片が、
    （ａ）配列番号１５６の軽鎖定常配列、
    （ｂ）配列番号１５７の軽鎖定常配列、
    （ｃ）配列番号１５４の重鎖定常配列、
    （ｄ）配列番号１５５の重鎖定常配列、
    （ｅ）配列番号１５６の軽鎖定常配列及び配列番号１５４の重鎖定常配列、
    （ｆ）配列番号１５７の軽鎖定常配列及び配列番号１５４の重鎖定常配列、
    （ｇ）配列番号１５６の軽鎖定常配列及び配列番号１５５の重鎖定常配列、又は
    （ｈ）配列番号１５７の軽鎖定常配列及び配列番号１５５の重鎖定常配列
    をさらに含む請求項１に記載の安定な製剤。
  3. 抗体が１４０ｍｇ／ｍＬの量で存在し、酢酸ナトリウムが２０ｍＭの量で存在し、プロリンが２％ｗ／ｖ〜３％ｗ／ｖの量で存在し、ポリソルベート８０が、０．０１％ｗ／ｖの量で存在し、ｐＨが５．０である、請求項１又は２に記載の安定な製剤。
  4. 抗体が１２０ｍｇ／ｍＬの量で存在し、酢酸ナトリウムが２０ｍＭの量で存在し、プロリンが２％ｗ／ｖ〜３％ｗ／ｖの量で存在し、ポリソルベート８０が、０．０１％ｗ／ｖの量で存在し、ｐＨが５．０である、請求項１又は２に記載の安定な製剤。
  5. 酢酸ナトリウムが２０ｍＭの量で存在し、プロリンが２％ｗ／ｖ〜３％ｗ／ｖの量で存在し、ポリソルベート８０が、０．０１％ｗ／ｖの量で存在し、ｐＨが５．０である、請求項１又は２に記載の安定な製剤。
  6. ポリソルベート２０を含む請求項１に記載の安定な製剤。
  7. ポリソルベート８０を含む請求項１に記載の安定な製剤。
  8. ポリソルベート２０が０．０１％ｗ／ｖの量で存在する請求項６に記載の安定な製剤。
  9. ポリソルベート８０が０．０１％ｗ／ｖの量で存在する請求項７に記載の安定な製剤。
  10. 酢酸ナトリウムが１０ｍＭの量で存在する請求項１に記載の安定な製剤。
  11. プロリンが２％ｗ／ｖ〜３％ｗ／ｖの量で存在する請求項１に記載の安定な製剤。
  12. ｐＨ５．０を有する請求項１に記載の安定な製剤。
  13. ｐＨ５．２を有する請求項１に記載の安定な製剤。
  14. ポリソルベート８０を含む請求項２に記載の安定な製剤。
  15. ポリソルベート８０が０．０１％ｗ／ｖの量で存在する請求項１４に記載の安定な製剤。
  16. 酢酸ナトリウムが１０ｍＭの量で存在する請求項１５に記載の安定な製剤。
  17. プロリンが２％ｗ／ｖ〜３％ｗ／ｖの量で存在する請求項１６に記載の安定な製剤。
  18. ｐＨ５．０を有する請求項１７に記載の安定な製剤。
  19. ２５℃で３０ｃＰ以下の粘度を有する請求項１に記載の安定な製剤。
  20. モノクローナル抗体の量が１００ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬであり、２５℃で１２ｃＰ以下の粘度を有する請求項１に記載の安定な製剤。
  21. ２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有する請求項１に記載の安定な製剤。
  22. 少なくとも３、６、１２、又は２４ヶ月間、安定した状態を保つ請求項１に記載の安定な製剤。
  23. ２５℃で３０ｃＰ以下の粘度を有する請求項１８に記載の安定な製剤。
  24. モノクローナル抗体の量が７０ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬであり、２５℃で１２ｃＰ以下の粘度を有する請求項１８に記載の安定な製剤。
  25. ２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有する請求項１８に記載の安定な製剤。
  26. 少なくとも３、６、１２、又は２４ヶ月間、安定した状態を保つ請求項１８に記載の安定な製剤。
  27. 安定な製剤であって、
    （ａ）７０ｍｇ／ｍＬ〜２００ｍｇ／ｍＬの量のモノクローナル抗体であって、
    ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号４９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、又は
    ｉｉ）配列番号１５８のＣＤＲ１である軽鎖ＣＤＲ１と、配列番号１６２のＣＤＲ２である軽鎖ＣＤＲ２と、配列番号３９５のＣＤＲ３である軽鎖ＣＤＲ３とを含む軽鎖ポリペプチド、及び、配列番号３０８又は３６８のＣＤＲ１である重鎖ＣＤＲ１と、配列番号１７５のＣＤＲ２である重鎖ＣＤＲ２と、配列番号１８０のＣＤＲ３である重鎖ＣＤＲ３とを含む重鎖ポリペプチド
    を含む、モノクローナル抗体、
    （ｂ）１０ｍＭの酢酸ナトリウム、
    （ｃ）２．０％〜３．０％ｗ／ｖのプロリン、及び
    （ｄ）０．０１％ｗ／ｖのポリソルベート８０
    を含み、
    （ｅ）ｐＨ５．０
    を有する、安定な製剤。
  28. モノクローナル抗体が１２０ｍｇ／ｍＬで存在する請求項２７に記載の安定な製剤。
  29. モノクローナル抗体が１４０ｍｇ／ｍＬで存在する請求項２７に記載の安定な製剤。
  30. 患者のコレステロール関連障害を治療又は予防するための医薬の製造における、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の安定な製剤の使用。
  31. コレステロール関連障害が、家族性高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、リポタンパク質（ａ）の上昇、心臓病、代謝症候群、糖尿病、冠状動脈性心臓病、脳卒中、心臓血管疾患、アルツハイマー病、末梢動脈疾患、高脂血症、ならびに脂質異常症からなる群から選択される請求項３０に記載の使用。
  32. 家族性高コレステロール血症が、ヘテロ接合型家族性高コレステロール血症及びホモ接合型家族性高コレステロール血症を含む請求項３１に記載の使用。
  33. 酢酸ナトリウムが、２０ｍＭの量で存在する請求項１に記載の安定な製剤。
  34. 酢酸ナトリウムが、２０ｍＭの量で存在する請求項１５に記載の安定な製剤。
  35. プロリンが、２％ｗ／ｖ〜３％ｗ／ｖの量で存在する請求項３４に記載の安定な製剤。
  36. ５．０のｐＨを有する請求項３５に記載の安定な製剤。
  37. ２５℃で３０ｃＰ以下の粘度を有する請求項３６に記載の安定な製剤。
  38. モノクローナル抗体の量が、７０ｍｇ／ｍＬ〜１５０ｍｇ／ｍＬであり、２５℃で１２ｃＰ以下の粘度を有する請求項３６に記載の安定な製剤。
  39. ２５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ〜３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇの浸透圧を有する請求項３６に記載の安定な製剤。
  40. 少なくとも３、６、１２、又は２４ヶ月間、安定した状態を保つ請求項３６に記載の安定な製剤。
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