JP6132255B2 - クェルセチンを有効成分とする魚類の抗ウィルス組成物 - Google Patents

Description

本発明は、クェルセチンを有効成分とする魚類のウィルス性出血性敗血症ウィルス（以下、「ＶＨＳＶ」と称する。）に対する抗ウィルス組成物に係り、さらに詳しくは、様々な方法を用いて適量のクェルセチンを魚類に投与することにより、魚類のウィルス性出血性敗血症の感染を予防したり、感染された魚類を治療したりする組成物に関する。

ウィルス性出血性敗血症（Ｖｉｒａｌ Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ；ＶＨＳ）は、主としてヨーロッパ地域に分布されていたが、１９８８年米国西部太平洋沿岸へ回遊するギンザケ及びマスノスケから発見された後、様々な海水魚種から分離された。最近、日本及び韓国の自然産海水魚種からウィルス性出血性敗血症が検出されただけではなく、低水温期中に養殖ヒラメに致命的な疾病を引き起こすことが報告された（非特許文献１）。感染が確認された魚種としては、ヒラメ、ニジマス、タイセイヨウサケ、ブラウントラウト、ギンザケ、マスノスケ、タラなどが挙げられる。韓国でも、東海及び南海水域において海水養殖魚類だけではなく、自然産魚類からも検出されている。このような出血性敗血症ウィルスは、ヨーロッパのマスと、韓国及び日本のヒラメの重要な病原体である。

ＶＨＳＶは、小さい魚体だけではなく、出荷時期の大きい魚体も斃死を引き起こして経済的な損失を招いている。例えば、ヒラメは、韓国の主な養殖魚種であり、生産量は、２００８年基準で約４万７，０００トンであり、生産金額は４，０８３億ウォンであり、全体の養殖生産額の２６．８％を占める重要な養殖品目である。しかしながら、ウィルス、細菌又は寄生虫などによる各種の感染性疾病により約４０％が斃死して深刻な経済的な損失を招いている。特に、ＶＨＳなどのウィルス性疾病は、稚魚だけではなく、商品価値の高い成魚において大量斃死を引き起こすが、養殖水産物の疾病及び斃死、それによる海洋汚染に起因する経済的な損失が年間約３，０００億ウォンに至ることが報告される。

ＶＨＳＶは、紫外線処理にも不活化され、塩素、次亜塩素酸、ヨードフォアなどの消毒剤にも不活化され易いため、養殖場において器具及び水槽を消毒することが効果的であることが知られている。しかしながら、他のウィルス性疾病と同様に、ＶＨＳを治療する化学療法剤は未だ開発されていない（非特許文献２）。

特許文献１には、ヒラメの養殖のための水温が１８〜２２℃に保たれるように調節することにより、ヒラメのＶＨＳＶによる感染を予防する方法及びシステムが開示されている。しかしながら、この方法は、冬場に水温維持のためにかかる暖房費が高過ぎるという問題がある。

特許文献２には、クルクミン（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ）を有効成分とするＶＨＳＶに対する抗ウィルス組成物が開示されている。しかしながら、上記の従来の技術は、細胞レベルにおける抗ウィルス活性を確認したものであるため、実際の養殖個体からも所望の効果が得られるか否かは確認されておらず、且つ、たとえフィールドにおいて効果があるとしても、クルクミンを大量で入手し難いという欠点がある。

弱毒化ウィルスワクチンは、ウィルスの病原性修復の危険性及び自然界への拡散危険性がある。また、出血性敗血ウィルスＧ若しくはＮ遺伝子を埋め込んだプラスミドを筋肉注射したＤＮＡワクチン実験においては、強力な免疫反応が誘導され、死亡率もニジマス及びヒラメにおいて軽減されたと報告されたが（非特許文献３）、未だ実用化レベルには至っていない。

クェルセチン（Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）は、フラボノイドの一つであり、赤葡萄酒や玉ねぎ、キーウィ、緑茶、りんご、ベリー、白菜属（キャベツ、ブロッコリ、カリフラワー、カブなど）に豊富に存在することが知られている。クェルセチンは、重金属の除去、血中コレステロールの減少、高血圧及び糖尿病などの成人病の予防など様々な生理活性及び抗酸化作用と抗ウィルス活性を有していることが知られているが、実際には、冠状動脈疾患、腦卒中、高血圧、癌などの発病率の減少に及ぼす影響に関するいくつかの論文があるに過ぎない。特に、ＶＨＳＶに対するクェルセチンの抗ウィルス性効果及び研究に対する報告は全くない。クェルセチンの化学構造は、下記の通りである。

本発明者らは、養殖魚類のウィルス感染性疾病について、感染機序及び防御機序を調べて抗ウィルス組成物を開発するために鋭意努力した。その結果、クェルセチンがウィルス性出血性敗血症に対して優れた抗ウィルス効果を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。

韓国公開特許第１０−２００９−００７７３０３号公報 韓国公開特許第１０−２０１３−００５８１０４号公報

Ｔａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｓｈ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ， １８６−１９２， ２０００； Ｉｓｓｉｋｉ ｅｔ．， ａｌ． Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ａｑｕａｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ， ８７−９９，２００１ 国立水産化学院、ｈｔｔｐ：／／ｆｄｃｃ．ｎｆｒｄｉ．ｒｅ．ｋｒ／０２／０１＿ｃｌｉｃｋ．ｊｓｐ？ＤＳＳ＿ＣＤ＝ＩＶ００９ Ｂｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ， ９２１−９３０， ２００５

本発明の目的は、魚類のための抗ウィルス組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、魚類感染性ウィルスによる疾患の予防又は治療用薬剤学的組成物を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、魚類感染性ウィルスによる疾患の予防又は治療のための魚類飼料添加用組成物及び飼料を提供することにある。

本発明の更に他の目的は、抗ウィルス組成物を魚類に給与することを特徴とする、魚類における魚類感染性ウィルスの感染を予防する方法を提供することにある。

上述した目的を達成するためになされた本発明は、クェルセチンを有効成分とする魚類のＶＨＳＶに対する抗ウィルス組成物であることを特徴とする。

「有効成分とする」とは、クェルセチンの効能又は活性を達成するのに十分な量を含むことを意味する。下記の実施例から明らかなように、クェルセチンを過剰に投与しても動物細胞に毒性が現れないため、本発明の組成物に含まれているクェルセチンの量的上限は、当業者が適切な範囲内において選択可能である。

本発明における前記クェルセチンは、合成されるか、純粋に分離されるか、植物体から抽出されるか、又は分画されたものであるが、できる限り、クェルセチンを含む天然抽出物、好ましくは、玉ねぎ抽出物又は玉ねぎ分画物を含む。

本発明の組成物は、出血性敗血ウィルスの宿主となるあらゆる魚種に適用される。例えば、自然産又は養殖されるヒラメ、ブリ、マダイ、トラフグ、ヒラマサ、マス、カンパチ、アジ、マハタ、本マグロ、コイ、ゼブラフィッシュ、ナマズ、ティラピア、サケ、メダカ又はエビなどを対象とする。下記の実施例において、実際の生体テストはヒラメを対象として行われたが、クェルセチンが出血性敗血ウィルスの複製を阻害し、出血性敗血ウィルスに感染された細胞の生存率を増大させることが確認された他の実施例をも検討したとき、本発明の組成物が出血性敗血ウィルスの宿主となるあらゆる魚種に適用されるということはいうまでもない。

本発明は、別の言い方をすると、クェルセチンを有効成分とするウィルス性出血性敗血症の予防又は治療用薬剤学的組成物である。

本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含むことができる。前記薬剤学的に許容される担体は、調製時に通常的に用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニールピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分に加えて、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。本発明による薬剤学的組成物の剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液状であるか、又はエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤状であり、分散剤又は安定化剤を更に含むことができる。

本発明による抗ウィルス組成物（又は、予防又は治療用薬剤学的組成物）は、経口的又は非経口的に投与され、非経口投与である場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、経皮投与などにより投与され、好ましくは、経口投与である。下記の実施例においては、早い実験結果を得るために腹腔注射方法を適用したが、これに限定されない。

本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、動物の獣齢、体重、性別、病的状態、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応生などの要因により様々であり、普通、熟練された医師であれば、所望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。例えば、生体１Ｋｇ当たりに本発明の組成物を有効成分の含量が１ｍｇになるようにして１〜３日おきに１回ずつ腹腔注射又は経口投与することが好ましい。

本発明の他の態様によれば、本発明は、クェルセチンを有効成分とする魚類感染性ＶＨＳＶ疾患の予防又は改善用魚類飼料又は魚類飼料添加用組成物を提供する。

本発明による魚類飼料又は魚類飼料添加用組成物は、一般的に用いられる様々な成分とともに製造されることができる。例えば、海洋タンパク質（例えば、魚粉又はクリルミ−ル）、植物性タンパク質（例えば、豆粉末、小麦グルテン、トウモロコシグルテン、ハウチワマメ粉末、豌豆粉末又はヒマワリ種子粉末）、血粉及び骨粉よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のタンパク質源、魚類油（例えば、いか肝油）又は植物性油（例えば、ナタネ油，豆油及び大豆油）よりなる群から選ばれるいずれか一種以上のエネルギー源、ビタミン混合物及び無機質混合物を含むことができる。

事前実験によれば、クェルセチンが０．００２５％含有されている通常の養魚用飼料を投与したとき、ヒラメにおいて卓越した抗ウィルス活性を示した。このため、養魚用飼料に０．０００５〜０．００５％のクェルセチンを含有させることが好ましい。クェルセチンの含量がこれよりも低ければ、予防及び治療効果がほとんど現れず、クェルセチンの含量がこれよりも高い場合、添加量に比べて効果性が低い。

一方、クェルセチンは、水溶液状において化学的物理的に非常に安定的である。このため、本発明による抗ウィルス組成物を直接的に養殖場に投与する方法により、ＶＨＳＶ疾患の予防又は治療効果が得られる。

具体的な投与量や投与間隔などは、養殖魚種や養殖密度、養殖場の水温などに応じて種々に変更可能であるが、他の養殖場用添加物を参照して１〜３日おきに０．１〜１０ｐｐｍの濃度になるようにクェルセチンを投与することが好ましい。

以上述べたように、本発明による組成物は、ＶＨＳＶの複製を抑える効果があるので、究極的にＶＨＳＶに対する宿主魚類の生存率を増加させる。

このため、本発明による組成物を腹腔注射したり、経口投与したり、水槽投与したりすることにより、養殖魚類の死亡率に大きな影響を及ぼすＶＨＳＶによる疾患の予防又は治療が可能になる。

これにより、魚類養殖産業のコスト節減及び付加価値の増大に大きく寄与する。

クェルセチン及びクェルセチン配糖体のウィルス感染に対する抗ウィルス活性を比較確認した結果を示す図表である。 クェルセチンを濃度依存的に処理した魚類細胞（ファットヘッドミノー（Ｆａｔ ｈｅａｄ Ｍｉｎｎｏｗ；ＦＨＭ細胞）における細胞毒性を確認した結果を示す図表である。 クェルセチンを濃度依存的に処理した後に、ＶＨＳＶ感染による魚類細胞（ＦＨＭ細胞）の生存率を確認した結果を示す図表である。 クェルセチン処理により細胞培養液におけるＶＨＳＶ複製阻害能を確認した結果を示す図表である。 クェルセチンの腹腔投与によるヒラメにおけるＶＨＳＶ感染に対する生存率を比較した生体内での実験結果を示す図表である。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明の技術的思想の内容及び範囲を容易に説明するための例示に過ぎず、これらにより本発明の技術的範囲が限定又は変更されない。なお、これらの例示に基づいて本発明の技術的思想の範囲内において種々の変形及び変更が可能であるということはいうまでもない。

実施例１：クェルセチン及びクェルセチン配糖体の抗ウィルス活性の比較
クェルセチン及びこれと類似の化合物においてクェルセチンの抗ウィルス活性に優れていることを確認した。

９６ウェルプレートにＶＨＳＶ感染に最も高い感受性を示すコイ由来の魚類細胞株であるＦＨＭ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２８７２、Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ）を各ウェルに１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬずつ２４時間培養した。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するライボビッツＬ−１５培地を全て除去した後、クェルセチン（シグマ社製、Ｑ４９５１）及びクェルセチン配糖体７種（クェルセチン−３−β−Ｄ−グルコシド、クェルセチン−３−Ｏ−α−Ｌ−アラビノピラノシド、ケンペロール−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、クェルセチン−３−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、クェルセチン−３−グルクロニド、ルチン、クェルセチン−３−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトシド）を魚類細胞にそれぞれ１００μＭずつ９０分間処理した。次いで、残留液を除去し、ＶＨＳＶを０．２ＭＯＩレベルで魚類細胞に２時間感染させた。２時間後に残留液を除去し、新鮮な培地に交感した後、４２時間培養した。セルカウンティングキット−８試薬を１０μＬずつ各ウェルに処理し、８時間培養した後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度値を測定して細胞生存率を比較した。その結果、クェルセチンが他のクェルセチン配糖体に比べてＶＨＳＶに対する抗ウィルス活性に優れていることを確認した（図１）。

実施例２：魚類細胞に対するクェルセチンの毒性有無の確認
クェルセチンの魚類細胞に対する毒性の有無を確認した。

９６ウェルプレートに魚類細胞を各ウェルに１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬずつ２４時間培養し、クェルセチンを２５−４００μＭずつ２４時間処理した。次いで、培地を新たな培地に交換し、セルカウンティングキット−８試薬を１０μＬずつ各ウェルに処理し、８時間培養した後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度値を測定して細胞生存率を比較した。その結果、クェルセチンを処理しなかった陰性対照群と比較したとき、クェルセチンが魚類細胞に毒性を示さないことを確認した（図２）。

実施例３：クェルセチンの抗ウィルス活性
クェルセチンの先処理時のＶＨＳＶ感染に対する細胞生存率の増加を確認しようとした。

９６ウェルプレートに魚類細胞を各ウェルに１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／１００μＬずつ２４時間培養し、クェルセチンを２５−４００μＭずつ２４時間処理した。次いで、培地を全て除去した後、ＶＨＳＶを０．２ＭＯＩの濃度で２時間感染させた。次いで、新たな培地に交換して４２時間培養した。セルカウンティングキット−８試薬を１０μＬずつ各ウェルに処理して８時間培養した後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度値を測定して濃度の増加による細胞生存率を比較した。その結果、濃度が増加するにつれて、クェルセチンを処理しなかった対照群に比べて細胞生存率が４０％増加することを確認した（図３）。

実施例４：クェルセチンのＶＨＳＶ遺伝子複製制御の確認
クェルセチンの先処理時のＶＨＳＶの複製制御有無を確認した。

６０ｍｍの皿に魚類細胞を３．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／３ｍＬずつ２４時間培養し、１００μＭのクェルセチンを９０分間処理した。次いで、培地を全て除去した後、ＶＨＳＶを０．２ＭＯＩの濃度で２時間感染させた。次いで、新たな培地に交換して４２時間培養した。

クェルセチンを処理しなかった陽性対照群及び１００μＭを処理した実験群の上澄液をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて分析した。リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用いて確認しようとするＶＨＳＶ遺伝子はＮＶ−遺伝子であり、ＮＶ＿Ｆ（配列１、５’−ＴＴＧ ＴＣＣ ＴＴＣ ＧＣＧ ＡＧＡ ＴＧＡ ＴＣＧ−３’）及びＮＶ＿Ｒ（配列２、５’−ＴＴＴ ＣＴＧ ＡＣＣ ＧＡＴ ＣＧＡ ＧＧＴ ＣＡＣ ＴＧ−３’）プライマーを用いて絶対定量分析した。

その結果、クェルセチンを処理した実験群が陽性対照群に比べて約４２％複製減少率を示すことを確認した（図４）。これは、クェルセチンがＶＨＳＶ複製を抑えて陽性対照群に比べて細胞生存率を高める効果を示し、ＶＨＳＶに対する抗ウィルス剤であることを裏付ける結果である。

実施例５：クェルセチンの腹腔投与によるヒラメの生存率の延長効果の確認
クェルセチンを腹腔投与したヒラメのＶＨＳＶに対する抗ウィルス変化を調べてみた。

約１００ｇのヒラメ１４匹を流水式水槽に分けて馴致させた後、実験に供した。実験を行う間に水温は１２℃に保った。クェルセチンは、０．１ｍｇ／ｆｉｓｈの濃度（すなわち、生体１Ｋｇ当たりに１ｍｇ）で０．１ｍＬ筋肉注射できるようにした後、クェルセチンを筋肉注射する実験群及び投与しなかった陽性対照群を群別した。クェルセチンを筋肉注射してから２４時間後に、ＶＨＳＶ １０^６．８ＴＣＩＤ_５０／ｍＬを実験群及び陽性対照群に筋肉注射した。ＶＨＳＶを感染させてから３日後にクェルセチンを一回ずつさらに筋肉注射して実験を行った。

飼料の給餌を止めて死亡率を調べてみた。２週後にクェルセチン無処理群である陽性対照群と比較したとき、クェルセチン０．１ｍｇ／ｆｉｓｈを処理した後に３日後にもう一回クェルセチンを処理した実験群においてヒラメの生存率延長効果が現れた（図５）。

Claims (3)

1. クェルセチンを有効成分とし、腹腔注入により投与される、魚類のウィルス性出血性敗血症ウィルスに対する抗ウィルス組成物。
2. 前記クェルセチンは、合成されるか、純粋に分離されるか、植物体から抽出されるか、又は分画されることを特徴とする請求項１に記載の抗ウィルス組成物。
3. 前記魚類は、
   ヒラメ、ブリ、マダイ、トラフグ、ヒラマサ、マス、カンパチ、アジ、マハタ、本マグロ、コイ、ゼブラフィッシュ、ナマズ、ティラピア、サケ、メダカ又はエビであることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の抗ウィルス組成物。