JP6120223B2 - オレキシンニューロンの誘導法 - Google Patents
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Description
本発明は、オレキシンニューロンの誘導法に関し、詳しくは多能性幹細胞または神経前駆細胞から効率的にオレキシンニューロンを製造する方法に関する。
オレキシンは、覚醒を促す脳内ペプチドで、広く脳内に分布するオレキシン受容体を介して、オレキシン制御系を形成し、覚醒-睡眠の調節の中心的な機能を果たしている（非特許文献１）。実験的には、オレキシン欠損は、ナルコレプシー（突然発作的に短い睡眠に陥る病態）を来たす（非特許文献２および３）。さらに、ナルコレプシー患者の脳脊髄液中のオレキシンの濃度は、健常者の約1/3程度と低く、オレキシンニューロンの数の減少も認められる。オレキシン系の機能低下は、覚醒-睡眠サイクルに影響を及ぼし、恒常性の維持にも悪影響を及ぼすことが明らかになっている。正常な覚醒-睡眠の維持や恒常性の維持には、適切なオレキシン系の活動が欠かせない（非特許文献４）。そのため、オレキシン作用促進剤（アゴニスト）や阻害剤（アンタゴニスト）の開発に関心が集まっている。一方、オレキシン産生細胞（オレキシンニューロン）が欠損もしくは減少した場合、促進剤や阻害剤の有効性は限定的である。しかし、これまでに、オレキシンニューロンの誘導は、in vivoおよびin vitro実験で成功した報告はない。
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの異性体であるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンは、例えば、医薬品や医薬品原料となるシアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）の酵素合成原料として知られている。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンは、その誘導体から、シアル酸誘導体を酵素合成することが可能であり、産業上、重要な物質である。Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの製造方法として、Ｎ−アセチルグルコサミンをアルカリ条件下で異性化する際に、ホウ酸またはホウ酸塩を添加することにより、Ｎ−アセチルマンノサミンへのモル変換収率を増大させる方法が知られている（特許文献１）。また、シアル酸を基質としてＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼを反応させることにより、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを製造する方法も知られている（特許文献２）。Ｎ−マンノサミンのアシル化体を細胞に接触することにより、細胞表面へのレクチン結合を調節する方法または神経細胞の増殖を調節する方法が提案されている（特許文献３）。
本発明者らは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンが脳機能低下の改善や睡眠障害の改善に有効であることを見出している（特許文献４および５）。
Pharmacological Reviews 61:162-176, 2009
Cell 98: 365-376, 1999
Cell 98: 437-451, 1999
Neuroscience 178: 82-88, 2011
覚醒-睡眠の不安定化は、認知または学習能力の低下など深刻な脳機能障害の原因となり、脳機能の低下をもたらす。睡眠の改善を目指して、従来は睡眠導入薬で睡眠を誘導することが図られてきた。オレキシン作用促進剤や阻害剤もその延長上にある。しかし、特に老化に伴う覚醒-睡眠の問題は、睡眠時間減少よりむしろ睡眠の質の低下、あるいは覚醒-睡眠の不安定が問題である。オレキシン系は、覚醒-睡眠の安定化に欠かせない。オレキシンニューロンを誘導することが可能になれば、覚醒-睡眠サイクルの異常を呈する疾患を対象とした、新たな治療法となる。本発明の目的は、in vitroでオレキシンニューロンを誘導する手段を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンまたは、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと特定の阻害剤との組合せを、神経細胞への分化過程で培地に添加することにより、多能性幹細胞または神経前駆細胞からオレキシンニューロンを誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕 多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法。
〔２〕 多能性幹細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞または人工多能性幹細胞である〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕 神経前駆細胞が胎児由来神経塊である〔１〕に記載の製造方法。
〔４〕 〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の製造方法により得られうるオレキシンニューロン。
〔５〕 〔４〕に記載のオレキシンニューロンを用いることを特徴とする、覚醒-睡眠の調節に作用する薬物のスクリーニング方法。
〔６〕 薬物がナルコレプシーの治療薬である、〔５〕に記載のスクリーニング方法。
〔７〕 Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの有効量をそれを必要とする対象に投与または摂取させる工程を含む、オレキシンニューロンの誘導方法。
〔８〕 Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを有効成分として含有してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンの誘導剤。
〔９〕 多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンならびに、サーチュイン（Sirt）阻害剤およびO-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（OGT）阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤の存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法。
〔１０〕 多能性幹細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞または人工多能性幹細胞である〔９〕に記載の製造方法。
〔１１〕 神経前駆細胞が胎児由来神経塊である〔９〕に記載の製造方法。
〔１２〕 〔９〕〜〔１１〕いずれかに記載の製造方法により得られうるオレキシンニューロン。
〔１３〕 〔１２〕に記載のオレキシンニューロンを用いることを特徴とする、覚醒-睡眠の調節に作用する薬物のスクリーニング方法。
〔１４〕 薬物がナルコレプシーの治療薬である、〔１３〕に記載のスクリーニング方法。
〔１５〕 Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンならびに、サーチュイン1（Sirt1）阻害剤およびO-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（OGT）阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤を有効成分として含有してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンの誘導剤。
〔１〕 多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法。
〔２〕 多能性幹細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞または人工多能性幹細胞である〔１〕に記載の製造方法。
〔３〕 神経前駆細胞が胎児由来神経塊である〔１〕に記載の製造方法。
〔４〕 〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の製造方法により得られうるオレキシンニューロン。
〔５〕 〔４〕に記載のオレキシンニューロンを用いることを特徴とする、覚醒-睡眠の調節に作用する薬物のスクリーニング方法。
〔６〕 薬物がナルコレプシーの治療薬である、〔５〕に記載のスクリーニング方法。
〔７〕 Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの有効量をそれを必要とする対象に投与または摂取させる工程を含む、オレキシンニューロンの誘導方法。
〔８〕 Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを有効成分として含有してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンの誘導剤。
〔９〕 多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンならびに、サーチュイン（Sirt）阻害剤およびO-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（OGT）阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤の存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法。
〔１０〕 多能性幹細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞または人工多能性幹細胞である〔９〕に記載の製造方法。
〔１１〕 神経前駆細胞が胎児由来神経塊である〔９〕に記載の製造方法。
〔１２〕 〔９〕〜〔１１〕いずれかに記載の製造方法により得られうるオレキシンニューロン。
〔１３〕 〔１２〕に記載のオレキシンニューロンを用いることを特徴とする、覚醒-睡眠の調節に作用する薬物のスクリーニング方法。
〔１４〕 薬物がナルコレプシーの治療薬である、〔１３〕に記載のスクリーニング方法。
〔１５〕 Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンならびに、サーチュイン1（Sirt1）阻害剤およびO-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（OGT）阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤を有効成分として含有してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンの誘導剤。
本発明者らは、ES細胞を含む多能性幹細胞、あるいは、神経前駆細胞の培養系において、ManNAc（その誘導体、前駆体もしくはプロドラッグを含む）は、またはManNAcとSirt阻害剤および／またはOgt（O結合型β-N-アセチルグルコサミン（O-GlcNAc）転移酵素)阻害剤とを組み合わせて添加することにより、オレキシンニューロンを誘導する作用があることを初めて実証した。
オレキシンニューロンの減少または欠損による症状を呈する病気に対して、ManNAc（その誘導体、前駆体もしくはプロドラッグを含む）、またはManNAcとSirt阻害剤および／またはOgt阻害剤との組合せは有効である。ManNAc（その誘導体、前駆体もしくはプロドラッグを含む）、またはManNAcとSirt阻害剤および／またはOgt阻害剤との組合せを用いて製造したオレキシンニューロンにより、新たな薬物療法や薬物スクリーニングを提供することができる。本発明により、オレキシンニューロン回復を目指した再生医療にも貢献することができる。
オレキシンニューロンの減少または欠損による症状を呈する病気に対して、ManNAc（その誘導体、前駆体もしくはプロドラッグを含む）、またはManNAcとSirt阻害剤および／またはOgt阻害剤との組合せは有効である。ManNAc（その誘導体、前駆体もしくはプロドラッグを含む）、またはManNAcとSirt阻害剤および／またはOgt阻害剤との組合せを用いて製造したオレキシンニューロンにより、新たな薬物療法や薬物スクリーニングを提供することができる。本発明により、オレキシンニューロン回復を目指した再生医療にも貢献することができる。
本発明において、オレキシンニューロンとは、オレキシン（hypocretin: Hcrt）遺伝子を発現している神経細胞をいう。オレキシンニューロンは、生体内では主に視床下部の外側核に分布している。オレキシンニューロンは、インビトロでは、多能性幹細胞または神経前駆細胞から、後述する本発明の製造方法により分化誘導されるものである。神経細胞がオレキシンニューロンであるか否かは、当該細胞におけるHcrt遺伝子の発現の有無をＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション、抗体を用いた免疫学的検出（免疫染色、ウェスタンブロッティング、酵素免疫アッセイ（ELISA））、さらに該ニューロンの各種刺激に対する反応を検出する等の公知の手法により調べ、同定することにより確認することができる。
Hcrtは、ヒトHcrtのｍRNAおよびタンパク質が、NCBI Reference Sequence: NM_001524.1として、およびマウスHcrtのｍRNAおよびタンパク質がNCBI Reference Sequence: NM_010410.2として公表されている。
本発明において、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとは、下記式（Ｉ）：
で示される、Ｄ−マンノサミンのＮ−アセチル体であってもよい。式（Ｉ）で示される化合物を「ManNAc」と省略する場合がある。
本発明において、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンとは、上記式（Ｉ）で示される単体に限定されるものではなく、その誘導体、前駆体もしくはプロドラッグ、その塩、その溶媒和物（以下、「誘導体等」と省略する場合がある）を含む概念である。
Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンは、例えば、下記式（ＩＩ）で示される化合物であってもよい。
Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンは、例えば、下記式（ＩＩ）で示される化合物であってもよい。
〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は各々独立して水素（Ｈ）、Ｒ６、−Ｃ(＝Ｏ)Ｒ６、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ６、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ６Ｒ７を示し、Ｒ６は置換していてもよいＣ１−Ｃ７の鎖状炭化水素または環状炭化水素を示し、Ｒ７は水素（Ｈ）、置換していてもよいＣ１−Ｃ７の鎖状炭化水素または環状炭化水素を示す。〕
置換基としてはＦ、Ｃｌ、Ｂｒを用いることができる。
置換基としてはＦ、Ｃｌ、Ｂｒを用いることができる。
Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの塩としては、薬理学的に許容し得る塩、例えば、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機酸との塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の例としては、安息香酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の例としては、アルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との塩の例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
溶媒和物としては、好ましくは水和物（例、一水和物、二水和物など）、エタノレートなどがあげられる。
Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンは、市販品を用いてもよく、公知の方法により製造したものを用いてもよい。式（Ｉ）で示されるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの製造方法として、Ｎ−アセチルグルコサミンをアルカリ条件下で異性化する方法（特開平１０−１８２６８５号公報）、シアル酸を基質としてＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼを反応させることにより製造する方法（特開２００１−７８７９４号公報）があげられるが、これに限定されるものではない。Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの誘導体等も、式（Ｉ）で示されるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを原料として自体公知の方法により製造することができる。
本発明において「サーチュイン阻害剤」とは、サーチュイン（Sirtuin: Sirt1-7を含むタンパク質ファミリー）の発現または活性を阻害する物質をいう。サーチュインとは、代謝または加齢の調節因子であって、Sirt1-3、5、6はヒストンを始めとするタンパク質の脱アセチル化酵素として知られている（Nature Reviews Molecular Cell Biology, 13, 225-238 (2012)）。サーチュイン阻害剤としては、サーチュイン遺伝子の発現を特異的に阻害するsiRNA、shRNA、アンチセンスRNA、アンチセンスDNA、タンパク質脱アセチル化酵素活性を阻害する低分子化合物などが例示されるが、これに限定されるものではない。好適なサーチュイン阻害剤としては、Sirt1阻害剤として市販されている6-クロロ-2,3,4,9-テトラヒドロ-1H-カルバゾール-1-カルボキサミド（EX-527：SIGMA-ALDRICH）があげられる。
本発明において「O結合型β-N-アセチルグルコサミン（O-GlcNAc）転移酵素阻害剤」とは、O結合型β-N-アセチルグルコサミン転移酵素（Ogt）の発現または活性を阻害する物質をいう。Ogtとは、セリンまたはスレオニンの水酸基へのN-アセチルグルコサミン付加を触媒する酵素である（Nature Reviews Cancer, 11, 678-684 (2011)）。Ogt阻害剤としては、Ogt遺伝子の発現を特異的に阻害するsiRNA、N-アセチルグルコサミン付加活性を阻害する低分子化合物などが例示されるが、これに限定されるものではない。好適なOgt阻害剤としては、市販されているベンジル2-アセトアミド-2-デオキシ-α-D-ガラクトピラノシド（BADGP：SIGMA-ALDRICH）があげられる。
＜オレキシンニューロンの製造方法＞
本発明は、多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法を提供する。
また、本発明は、多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンならびに、Sirt阻害剤およびOgt阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤の存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法を提供する。
本発明は、多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法を提供する。
また、本発明は、多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンならびに、Sirt阻害剤およびOgt阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤の存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法を提供する。
本発明において「多能性幹細胞」とは、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべて、もしくはその一部、特に神経細胞に分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞をいう。多能性幹細胞としては、胚性幹（ＥＳ）細胞、始原生殖幹（ＥＧ）細胞、分化多能性生殖細胞（ｍＧＳ）、成体や胎児脳から単離された神経幹細胞、骨髄や血中、成体組織から単離された間葉系幹細胞やストローマ細胞などの体性幹細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞があげられる。
本発明において「神経前駆細胞」とは、前記「多能性幹細胞」から神経前駆細胞形成期を経て神経細胞への分化決定を受けた細胞をいう。神経前駆細胞は胎児由来神経塊として得ることができる。また分化多能性幹細胞を適当な神経分化条件下で培養する、体細胞を適切な方法で脱分化させ、神経分化条件下で培養することにより得ることができる。
本発明が対象とする細胞は、哺乳動物（例、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、サル、ヒト）由来であり、好ましくはマウスまたはヒトである。
具体的には、本発明の方法で用いられる胚性幹細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物の胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞Ｉ」と省略）、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩ」と省略）、および胚性幹細胞Ｉ又はＩＩの胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩＩ」と省略）があげられる。
より具体的には、胚性幹細胞Ｉとしては、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立された胚性幹細胞、始原生殖細胞から樹立されたＥＧ細胞、着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、あるいはその細胞を培養することによって得られる細胞などがあげられる。
胚性幹細胞Ｉは、着床以前の初期胚を、文献(Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994))に記載された方法に従って培養することにより調製することができる。
胚性幹細胞ＩＩは、例えば、Wilmutら(Nature, 385, 810 (1997))、Cibelliら(Science, 280, 1256 (1998))、入谷明ら（蛋白質核酸酵素, 44, 892 (1999)）、Baguisiら(Nature Biotechnology, 17, 456 (1999))、Wakayamaら(Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999))、RideoutIIIら(Nature Genetics, 24, 109 (2000))等によって報告された方法を用いることにより、例えば以下のように作製することができる。
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を開始した卵が得られる。
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、核を提供する側の細胞を培養している培地を、５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、好ましくは０．５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導することで初期化することができる。
また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し、数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することができる。
初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複数の方法が知られている。細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。
同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。
いったん発生を開始した卵が得られれば、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 (1995)等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。
胚性幹細胞ＩＩＩは、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。胚性幹細胞ＩＩＩの作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社(1995)等に記載の方法を用い、行なうことができる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製することができる。
胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
本発明において「体性幹細胞」とは、外胚葉系列の神経系細胞に分化できる「分化多能性」を有する未分化細胞であって、生殖細胞由来ではない細胞をいう。体性幹細胞としては、神経幹細胞、間葉系幹細胞、ストローマ細胞、脂肪前駆細胞があげられる。
マウスおよびヒトの人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、国際公開第２００４／０９２３５７号公報および国際公開第２００７／０６９６６６号公報に従って樹立することができる。また、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子を除いた３因子（Ｏｃｔ３/４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２が代表として例示される）によるｉＰＳ細胞の作製（Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006)）や、プラスミドやエピソーマルベクターを用いて初期化因子がゲノムに組み込まれることなくｉＰＳ細胞を誘導することも可能である（Okita, K. et al., Science, 322: 949-953 (2008)；Yu, J. et al., Science, 324: 797-801 (2009)）。ｉＰＳ細胞は、例えば皮膚線維芽細胞などの体細胞から上記文献に記載された方法に従って樹立することができる。
ｉＰＳ細胞は、所定の機関より入手することができる。例えば、ヒトｉＰＳ細胞である２０１Ｂ７株は、理化学研究所、理研バイオリソースセンターより入手可能である。
神経前駆細胞は、胎児由来神経塊（終脳由来、ニューロスフェアともいう）を用いることが望ましい。マウス胎仔の場合、胎齢１４．５日で終脳を摘出することが望ましい。神経前駆細胞の培養は、Ciccolini F, Svendsen CN. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. (1998) J Neurosci. 18(19):7869-80に記載の方法に準じて行うことができ、後述する実施例に詳細な培養方法が記載されている。
本発明の製造方法で用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、DMEM/Ｆ12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
本発明の製造方法で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得る。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を含む培地は無血清培地に該当するものとする。かかる無血清培地としては、例えば、市販のKNOCKOUTTM SR (KSR)を適量（例えば、１-20％）添加した無血清培地、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地（例えば、CHO-S-SFM II（GIBCO BRL社製）、Hybridoma-SFM（GIBCO BRL社製）、eRDF Dry Powdered Media（GIBCO BRL社製）、UltraCULTURETM（BioWhittaker社製）、UltraDOMATM（BioWhittaker社製）、UltraCHOTM（BioWhittaker社製）、UltraMDCKTM（BioWhittakeｒ社製）、ITPSG培地（Cytotechnology, 5, S17 (1991)）、ITSFn培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 457 (1980)）、mN3培地（Mech. Dev. 59, 89 (1996) など）、細胞由来の因子を添加した培地（例えば、多能性奇形癌腫細胞ＰＳＡ１の培養上清を添加した培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634 (1981)）などがあげられる。
また、本発明の製造方法で用いられる培地は、必要に応じてその他の成分、例えば、アミノ酸、ピルビン酸、２−メルカプトエタノール、サイトカイン、増殖因子等を適切な濃度で含有していてもよい。
本発明の製造方法の培養工程で用いられる培養器は、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリディッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルがあげられる。
多能性幹細胞または神経前駆細胞胚性幹細胞は、上記した培地および培養器の中から細胞の種類および目的等に応じて適宜選択し、インビトロで神経細胞に分化する条件下で培養を開始する。一般的な培養条件としては、３２〜４０℃、２〜１０％のＣＯ２を通気したインキュベータ内で１〜２０日程度培養する方法があげられる。
Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン単独添加の場合、培養初日（分化０日）から培養終了時まで培地に添加することができる。あるいは、分化４〜７日にＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを添加してもオレキシンニューロンを誘導することができる。
Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンと、Sirt阻害剤およびOgt阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤との併用添加の場合、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを培養初日（分化０日）から培養終了時まで培地に添加することができる。あるいは、分化４〜７日にＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを培地に添加することもできる。Sirt阻害剤および／またはOgt阻害剤は、分化０日から添加してもよいが、分化４〜７日に培地に添加するプロトコルが推奨される。
培地におけるＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの濃度は、０．００１〜５ｍＭ、好ましくは０．０１〜１ｍＭが推奨される。培地におけるSirt阻害剤の濃度は、阻害剤の種類に応じて適宜決定されるが、EX-527を用いた場合、１〜２００ｎＭ、好ましくは５〜５０ｎＭが推奨される。培地におけるOgt阻害剤の濃度は、阻害剤の種類に応じて適宜決定されるが、BADGPを用いた場合、１〜５０ｍＭ、好ましくは２〜１０ｍＭが推奨される。
本発明の製造方法では、多能性幹細胞または神経前駆細胞から神経系細胞への分化効率をより向上させるため、既知の神経系細胞への分化誘導物質を併用することができる。このような分化誘導物質としては、例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３、レチノイン酸、ＦＧＦ、ＢＭＰ阻害因子、ＩＧＦ、ＣＮＴＦがあげられる。培地における分化誘導物質の濃度は、分化誘導物質の種類に応じて適宜決定される。
１つの実施形態において、幹細胞または前駆細胞を４〜７日間前培養し、その後必要により上記神経系細胞への分化誘導物質の存在下、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン単独を培地に添加することにより、オレキシンニューロンへの分化が誘導される。
別の実施形態において、幹細胞または前駆細胞の培養開始日（０日）にＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを培地に添加し、その後４〜７日目に、Sirt阻害剤およびOgt阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤を培地に添加することにより、オレキシンニューロンへの分化誘導が増強される。
本発明の製造方法により、インビトロで効率よくオレキシンニューロンを誘導することができ、培養オレキシンニューロンを提供することができる。
＜スクリーニング方法＞
本発明は、本発明の製造方法により得られうるオレキシンニューロンを用いて、覚醒−睡眠の調節に作用する薬物のスクリーニング方法を提供する。
本発明は、本発明の製造方法により得られうるオレキシンニューロンを用いて、覚醒−睡眠の調節に作用する薬物のスクリーニング方法を提供する。
本発明のスクリーニング方法において、上記のようにして得られたオレキシンニューロンをインビトロで生存する条件下で培養を続け、培地中に被験物質を添加してオレキシンニューロンの増殖を所定の期間観察する。
ここで被験物質とは、いかなる公知物質および新規物質であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分などがあげられる。
オレキシンニューロンのインビトロでの培養（維持）方法は、本発明の製造方法において上述した通りである。本工程においては、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、Sirt阻害剤およびOgt阻害剤の無添加培地を用いることが望ましい。
オレキシンニューロンの増殖の有無は、被験物質非添加群と被験物質添加群におけるオレキシンニューロンの数と分布状態を例えば、Hcrt遺伝子の発現を指標とするin situハイブリダイゼーション法により調べることにより確認することができる。また、蛍光抗体を用いた蛍光免疫染色法など抗体を用いた染色法、適当な刺激下で処理することにより培養液中に放出されたオレキシン、もしくは細胞内中に蓄積されたオレキシンを、ELISAやウェスタンブロッティングなどの免疫学的手法で検出、または測定する方法、オレキシン感受性ニューロン、オレキシンの単離の際に用いられたような、オレキシン受容体遺伝子を導入することにより受容体を発現する細胞、またはオレキシン受容体を発現している腎臓細胞、精巣細胞などに培養上清や細胞抽出液を反応させ、反応を適当な方法によって検出する方法などを用いることができる。
被験物質非添加群に比べて、被験物質添加群においてオレキシンニューロンの増殖が有意に促進されている場合、当該被験物質は、オレキシンニューロンの増殖（誘導）を介して覚醒−睡眠の調節に作用する薬物の候補となる。選択された被験物質は、Hcrtのいわゆるアゴニスト、アンタゴニストのみならず、本スクリーニング方法の性質上、これらタンパク質の発現量を変動させ得る物質をも含む。
本発明のスクリーニング方法により選別される薬物は、オレキシンニューロンの増殖（誘導）や機能増強を介して覚醒−睡眠の調節に作用するものであり、認知または学習能力の低下などの脳機能障害、ＲＥＭ睡眠の断片化を示すＲＥＭ睡眠障害、特に老化や老化に伴う神経性疾患の覚醒-睡眠の問題、さらにナルコレプシーの治療薬の候補となることが期待される。
＜オレキシンニューロンの誘導剤およびキット＞
本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを有効成分として含有してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンの誘導剤を提供する。
また、本発明は、（1）Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、ならびに
（2）サーチュイン1阻害剤およびO-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤
を有効成分として含有する試薬を別々の容器に収容してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンを誘導するためのキットを提供する。
本発明は、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを有効成分として含有してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンの誘導剤を提供する。
また、本発明は、（1）Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、ならびに
（2）サーチュイン1阻害剤およびO-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤
を有効成分として含有する試薬を別々の容器に収容してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンを誘導するためのキットを提供する。
本発明の誘導剤およびキットに含まれる有効成分は、本発明の製造方法において上述した通りである。後述する実施例に示すように、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンのオレキシンニューロンの誘導作用は、Sirt阻害剤またはOgt阻害剤の併用により増強され、Sirt阻害剤およびOgt阻害剤の併用によりさらに増強される。
本発明の誘導剤およびキットに含まれる試薬は、培地への添加に供するために、任意の成分を含有してもよい。任意成分としては、特に限定されるものではないが、溶媒、緩衝剤、防腐剤などがあげられる。
以下、実施例を示してさらに具体的に本発明を説明する。以下は代表的な実施例を示すものでこれらに限定されるものではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で種々の応用が可能である。
実施例1：ES細胞からの神経分化誘導の系を用いたManNAcによるオレキシン遺伝子(Hcrt)の発現誘導
Stromal cell-derived inducing activity (SDIA)分化培養系を用いた解析
分化培養
ES細胞用培地[15% FBS (Biowest)、1 mM sodium pyruvate (Invitrogen)、100 mM β-mercaptoethanol (Invitrogen)、2 mM L-glutamine (Invitrogen)、1 mM non essential amino acid (Invitrogen)、50 U/ml penicillin/50 μg/ml streptomycin (Invitrogen)、2000 U leukemia inhibitory factor (Chemicon、CA) をDMEM (Wako) に添加]で維持したマウスES細胞(J1株)を、10cm培養皿1枚当たり1x105個になるように、予めPA6間質細胞がまかれた培養皿に播種し、神経分化用培地 [10% KSR (Invitrogen)、100 mM β-mercaptoethanol (Invitrogen)、1 mM non essential amino acid (Invitrogen)、50 U/ml penicillin/50μg/ml streptomycin (Invitrogen)をGlasgow MEM (Invitrogen) に添加]で１０日間分化誘導を行った。分化培養４および７日目に培地の交換を行った。また、分化培養４日目から5 nM recombinant human BMP4(Wako)を添加した(図1)。分化培養１０日目に細胞を回収し、遠心操作により細胞をペレット状にし、培養液を除去した。その後、直ちに液体窒素中で凍結させ、使用するまで-80℃で保存した。
Stromal cell-derived inducing activity (SDIA)分化培養系を用いた解析
分化培養
ES細胞用培地[15% FBS (Biowest)、1 mM sodium pyruvate (Invitrogen)、100 mM β-mercaptoethanol (Invitrogen)、2 mM L-glutamine (Invitrogen)、1 mM non essential amino acid (Invitrogen)、50 U/ml penicillin/50 μg/ml streptomycin (Invitrogen)、2000 U leukemia inhibitory factor (Chemicon、CA) をDMEM (Wako) に添加]で維持したマウスES細胞(J1株)を、10cm培養皿1枚当たり1x105個になるように、予めPA6間質細胞がまかれた培養皿に播種し、神経分化用培地 [10% KSR (Invitrogen)、100 mM β-mercaptoethanol (Invitrogen)、1 mM non essential amino acid (Invitrogen)、50 U/ml penicillin/50μg/ml streptomycin (Invitrogen)をGlasgow MEM (Invitrogen) に添加]で１０日間分化誘導を行った。分化培養４および７日目に培地の交換を行った。また、分化培養４日目から5 nM recombinant human BMP4(Wako)を添加した(図1)。分化培養１０日目に細胞を回収し、遠心操作により細胞をペレット状にし、培養液を除去した。その後、直ちに液体窒素中で凍結させ、使用するまで-80℃で保存した。
参考文献
Mizuseki K, Sakamoto T, Watanabe K, Muguruma K, Ikeya M, Nishiyama A, Arakawa A, Suemori H, Nakatsuji N, Kawasaki H, Murakami F, Sasai Y. Generation of neural crest-derived peripheral neurons and floor plate cells from mouse and primate embryonic stem cells. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100(10):5828-33.
Mizuseki K, Sakamoto T, Watanabe K, Muguruma K, Ikeya M, Nishiyama A, Arakawa A, Suemori H, Nakatsuji N, Kawasaki H, Murakami F, Sasai Y. Generation of neural crest-derived peripheral neurons and floor plate cells from mouse and primate embryonic stem cells. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100(10):5828-33.
RT-PCR法による発現解析
回収した細胞からRNeasy plus Mini Kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。次いでSuperScript III First Strand Synthesis System (Invitrogen) を用いて、total RNA 1 μgおよびOligo(dT)を含む反応液中で逆転写反応を行いcDNAを合成した。
PCR反応は10 μlスケールで行い、0.5 μlのcDNA、5 μlの2xGC Buffer I、200 μM各dNTP、1.5 mM MgCl2、終濃度0.2 μM各プライマーに1 UのLA-Taq DNA Polymerase (Takara) を加え、95℃ 3分の熱変性後、(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒)x35サイクル (Actbの場合は20サイクル) の条件で行った。用いたプライマーは以下に示す。
Hcrt Forward; 5'- CTCCAGGCACCATGAACTTT -3'（配列番号：１）
Hcrt Reverse; 5'- AGTTCGTAGAGACGGCAGGA -3'（配列番号：２）
Actb Forward; 5'- TTCTACAATGAGCTGCGTGTGG -3'（配列番号：３）
Actb Reverse; 5'- ATGGCTGGGGTGTTGAAGGT -3'（配列番号：４）
各PCR産物は2% アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、UV照射によりバンドの観察を行った。
回収した細胞からRNeasy plus Mini Kit (QIAGEN)を用いてtotal RNAを抽出した。次いでSuperScript III First Strand Synthesis System (Invitrogen) を用いて、total RNA 1 μgおよびOligo(dT)を含む反応液中で逆転写反応を行いcDNAを合成した。
PCR反応は10 μlスケールで行い、0.5 μlのcDNA、5 μlの2xGC Buffer I、200 μM各dNTP、1.5 mM MgCl2、終濃度0.2 μM各プライマーに1 UのLA-Taq DNA Polymerase (Takara) を加え、95℃ 3分の熱変性後、(95℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 30秒)x35サイクル (Actbの場合は20サイクル) の条件で行った。用いたプライマーは以下に示す。
Hcrt Forward; 5'- CTCCAGGCACCATGAACTTT -3'（配列番号：１）
Hcrt Reverse; 5'- AGTTCGTAGAGACGGCAGGA -3'（配列番号：２）
Actb Forward; 5'- TTCTACAATGAGCTGCGTGTGG -3'（配列番号：３）
Actb Reverse; 5'- ATGGCTGGGGTGTTGAAGGT -3'（配列番号：４）
各PCR産物は2% アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色後、UV照射によりバンドの観察を行った。
結果
(実験1、図2)
分化培養開始時からGlcNAc（N-アセチル-D-グルコサミン）、ManNAcおよびNeu5Ac（N-アセチルノイラミン酸）を0.2、1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養10日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。オレキシン遺伝子（Hcrt）の発現解析を行った結果、ManNAc添加区のみでHcrtの発現が認められた。なお、ヒト由来の多能性幹細胞でも同様の効果が得られた。
(実験1、図2)
分化培養開始時からGlcNAc（N-アセチル-D-グルコサミン）、ManNAcおよびNeu5Ac（N-アセチルノイラミン酸）を0.2、1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養10日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。オレキシン遺伝子（Hcrt）の発現解析を行った結果、ManNAc添加区のみでHcrtの発現が認められた。なお、ヒト由来の多能性幹細胞でも同様の効果が得られた。
(実験2、図3)
次に、GlcNAc、ManNAcおよびNeu5Acの添加する時期を変えて1.0 mMの濃度で添加し神経分化培養を行った。RT-PCRの解析の結果、いずれの添加時期においてもManNAcを添加した区でのみHcrtの発現が観察された。また、1.0 mM ManNAc添加区の中でも、分化7日目以降に培地にManNAcが添加されている区 (4-10日、7-10日および0-10日目に添加)はその他の２区 (0-4日および0-7日に添加)に比べて発現が高かった。
次に、GlcNAc、ManNAcおよびNeu5Acの添加する時期を変えて1.0 mMの濃度で添加し神経分化培養を行った。RT-PCRの解析の結果、いずれの添加時期においてもManNAcを添加した区でのみHcrtの発現が観察された。また、1.0 mM ManNAc添加区の中でも、分化7日目以降に培地にManNAcが添加されている区 (4-10日、7-10日および0-10日目に添加)はその他の２区 (0-4日および0-7日に添加)に比べて発現が高かった。
実施例２：SFEB/gfCDM*分化培養系を用いた解析
*：serum-free culture of embryoid body-like aggregates/growth factor-free chemically defined mediumの略
分化培養
ES細胞用培地で維持したマウスES細胞(J1株)を、1ウェル当たり10,000個になるように96ウェル低接着丸底培養皿(Nunc)に播種し、gfCDM [5 mg/ml BSA (SIGMA)、450μM Monothioglycerol (Wako)、1x chemically defined lipid concentrate (Invitrogen)、50 U/ml penicillin/50μg/ml streptomycinをIMDM/F12(Invitrogen)に添加]で7日間培養した。1ウェル当たり150 μlの培地で培養した。分化培養7日目にDFK培地 [7 g/l glucose、10% KSR、50 U/ml penicillin/50μg/ml streptomycinをDMEM/F12(Invitrogen)に添加]に交換し、10日目で半量の培地を10 ng/ml CNTFを含むDFNB培地 [7 g/l glucose、1x N2 (Wako)、1xB27 (Invitrogen)]と交換した。培養13日目に細胞を0.05% トリプシン/EDTAで剥離し、10 cm培養皿1枚当たり4.8x106個になるようにポリ-D-リシン/ラニミンで処理した培養皿(Falcon)に播種し、10% FBS、10 ng/ml CNTF、50 ng/ml BDNFおよび50 ng/ml NT3を含むDFNB培地で培養した。培地交換は3日毎に行った。分化培養25日目に細胞を回収し、遠心操作により細胞をペレット状にし、培養液を除去した。その後、直ちに液体窒素中で凍結させ、使用するまで-80℃で保存した。
*：serum-free culture of embryoid body-like aggregates/growth factor-free chemically defined mediumの略
分化培養
ES細胞用培地で維持したマウスES細胞(J1株)を、1ウェル当たり10,000個になるように96ウェル低接着丸底培養皿(Nunc)に播種し、gfCDM [5 mg/ml BSA (SIGMA)、450μM Monothioglycerol (Wako)、1x chemically defined lipid concentrate (Invitrogen)、50 U/ml penicillin/50μg/ml streptomycinをIMDM/F12(Invitrogen)に添加]で7日間培養した。1ウェル当たり150 μlの培地で培養した。分化培養7日目にDFK培地 [7 g/l glucose、10% KSR、50 U/ml penicillin/50μg/ml streptomycinをDMEM/F12(Invitrogen)に添加]に交換し、10日目で半量の培地を10 ng/ml CNTFを含むDFNB培地 [7 g/l glucose、1x N2 (Wako)、1xB27 (Invitrogen)]と交換した。培養13日目に細胞を0.05% トリプシン/EDTAで剥離し、10 cm培養皿1枚当たり4.8x106個になるようにポリ-D-リシン/ラニミンで処理した培養皿(Falcon)に播種し、10% FBS、10 ng/ml CNTF、50 ng/ml BDNFおよび50 ng/ml NT3を含むDFNB培地で培養した。培地交換は3日毎に行った。分化培養25日目に細胞を回収し、遠心操作により細胞をペレット状にし、培養液を除去した。その後、直ちに液体窒素中で凍結させ、使用するまで-80℃で保存した。
参考文献
Wataya T, Ando S, Muguruma K, Ikeda H, Watanabe K, Eiraku M, Kawada M, Takahashi J, Hashimoto N, Sasai Y. Minimization of exogenous signals in ES cell culture induces rostral hypothalamic differentiation. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105(33):11796-801.
Wataya T, Ando S, Muguruma K, Ikeda H, Watanabe K, Eiraku M, Kawada M, Takahashi J, Hashimoto N, Sasai Y. Minimization of exogenous signals in ES cell culture induces rostral hypothalamic differentiation. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 105(33):11796-801.
RT-PCR法による発現解析
上記の実施例１と同じ方法で行った。
上記の実施例１と同じ方法で行った。
結果（図４、５）
分化培養7日目からGlcNac、ManNAcおよびNeu5Acを1.0 mMの濃度で培地に添加し、神経分化誘導を行った。その結果、ManNAcおよびNeu5Ac添加区でHcrtの発現が認められた。また、Hcrtの発現はNeu5Acに比べてManNAc添加区の方が高かった。
分化培養7日目からGlcNac、ManNAcおよびNeu5Acを1.0 mMの濃度で培地に添加し、神経分化誘導を行った。その結果、ManNAcおよびNeu5Ac添加区でHcrtの発現が認められた。また、Hcrtの発現はNeu5Acに比べてManNAc添加区の方が高かった。
実施例３：マウス胎仔由来ニューロスフィア（NSph）に対するManNAcのオレキシン誘導作用
終脳由来神経塊（ニューロスフィア、NSph）の培養およびニューロンへの分化誘導
Ciccolini and Svendsen(1998, J Neurosci. 18(19):7869-80)の方法に基づいて、培養および分化誘導実験を行った。概略を図６に示す。氷冷PBS/0.6%グルコース中で、胎齢14.5日のC57BL/6Nマウス胎仔より終脳を摘出した。ピペッティングにより単一の細胞に分散し、NSph用培地［1xB27 (Invitrogen)、20 ng/ml EGF (Sigma)、20 ng/ml FGF-basic (PEPROTECH)、5 μg/ml heparin (Sigma)を含むDMEM/F12 (Wako)］に懸濁して2x106cells/10 mlの量で10 cmペトリディッシュに播種した。培養開始3日後に培地を半量交換し、さらに3日間の培養を行った（合計6日間）。
培養開始6日後にNSphを回収し、PBS/0.6%グルコース中でのピペッティングにより細胞を分散した。遠心分離により細胞を集め、分化誘導用培地（NSph用培地のEGF、FGF-basicおよびheparinを含まないもの）に細胞を懸濁した。4.5x105cells/7.5 mlの量で、予めpoly-L-lysine/laminin (ともにSigma)コート処理を施した6 cmディッシュに細胞を播種し分化誘導を行った。分化誘導開始5日後に培地を半量交換し、さらに5日間の培養を行った（合計10日間）。PBSで細胞を洗浄した後、0.5 mlのTRIzol Reagent (Invitrogen)で細胞を溶解して1.5 mlマイクロチューブに回収し、使用するまで-80℃で保存した。
終脳由来神経塊（ニューロスフィア、NSph）の培養およびニューロンへの分化誘導
Ciccolini and Svendsen(1998, J Neurosci. 18(19):7869-80)の方法に基づいて、培養および分化誘導実験を行った。概略を図６に示す。氷冷PBS/0.6%グルコース中で、胎齢14.5日のC57BL/6Nマウス胎仔より終脳を摘出した。ピペッティングにより単一の細胞に分散し、NSph用培地［1xB27 (Invitrogen)、20 ng/ml EGF (Sigma)、20 ng/ml FGF-basic (PEPROTECH)、5 μg/ml heparin (Sigma)を含むDMEM/F12 (Wako)］に懸濁して2x106cells/10 mlの量で10 cmペトリディッシュに播種した。培養開始3日後に培地を半量交換し、さらに3日間の培養を行った（合計6日間）。
培養開始6日後にNSphを回収し、PBS/0.6%グルコース中でのピペッティングにより細胞を分散した。遠心分離により細胞を集め、分化誘導用培地（NSph用培地のEGF、FGF-basicおよびheparinを含まないもの）に細胞を懸濁した。4.5x105cells/7.5 mlの量で、予めpoly-L-lysine/laminin (ともにSigma)コート処理を施した6 cmディッシュに細胞を播種し分化誘導を行った。分化誘導開始5日後に培地を半量交換し、さらに5日間の培養を行った（合計10日間）。PBSで細胞を洗浄した後、0.5 mlのTRIzol Reagent (Invitrogen)で細胞を溶解して1.5 mlマイクロチューブに回収し、使用するまで-80℃で保存した。
RT-PCR法による発現解析
TRIzol Reagentで溶解した細胞からtotal RNAを抽出した。SuperScript III First Strand Synthesis System (Invitrogen)を用い、90 ngのtotal RNAおよびOligo(dT)を含む10 μlの反応液中で逆転写反応を行いcDNAを合成した。反応液を10 mM Tris-HCl (pH 8.0)/0.1 mM EDTAで5倍希釈しPCRに用いた。
1 x ImmoBuffer、1.5 mM MgCl2、0.2 mM each dNTP、0.2 μM forward primer、0.2 μM reverse primer、1 U BIOTAQ HS Polymerase (BIOLINE)および2 μlのcDNAを含む20 μlの反応液を調整し、95℃で7分を１サイクルの後、94℃で30秒、62℃で30秒、72℃で30秒を24 (Actb)/32 (Prkcz)/36 (Hcrt)サイクルの条件でPCRを行った。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
Actb forward; 5’- GACAACGGCTCCGGCATGTGCAAAG -3’（配列番号：５）
Actb reverse; 5’- TTCACGGTTGGCCTTAGGGTTCAG -3’（配列番号：６）
Prkcz forward; 5’- ATGTCTGCTCCTCCAGCAGT -3’（配列番号：７）
Prkcz reverse; 5’- ATATCCTTTCGCTGCACTGG -3’（配列番号：８）
Hcrt forward; 5’- CTCCAGGCACCATGAACTTT -3’（配列番号：１）
Hcrt reverse; 5’- AGTTCGTAGAGACGGCAGGA -3’（配列番号：２）
PCR産物を2％アガロースゲルで電気泳動しエチジウムブロマイドで染色後、UV照射によりバンドの観察を行った。
TRIzol Reagentで溶解した細胞からtotal RNAを抽出した。SuperScript III First Strand Synthesis System (Invitrogen)を用い、90 ngのtotal RNAおよびOligo(dT)を含む10 μlの反応液中で逆転写反応を行いcDNAを合成した。反応液を10 mM Tris-HCl (pH 8.0)/0.1 mM EDTAで5倍希釈しPCRに用いた。
1 x ImmoBuffer、1.5 mM MgCl2、0.2 mM each dNTP、0.2 μM forward primer、0.2 μM reverse primer、1 U BIOTAQ HS Polymerase (BIOLINE)および2 μlのcDNAを含む20 μlの反応液を調整し、95℃で7分を１サイクルの後、94℃で30秒、62℃で30秒、72℃で30秒を24 (Actb)/32 (Prkcz)/36 (Hcrt)サイクルの条件でPCRを行った。用いたプライマーの塩基配列を以下に示す。
Actb forward; 5’- GACAACGGCTCCGGCATGTGCAAAG -3’（配列番号：５）
Actb reverse; 5’- TTCACGGTTGGCCTTAGGGTTCAG -3’（配列番号：６）
Prkcz forward; 5’- ATGTCTGCTCCTCCAGCAGT -3’（配列番号：７）
Prkcz reverse; 5’- ATATCCTTTCGCTGCACTGG -3’（配列番号：８）
Hcrt forward; 5’- CTCCAGGCACCATGAACTTT -3’（配列番号：１）
Hcrt reverse; 5’- AGTTCGTAGAGACGGCAGGA -3’（配列番号：２）
PCR産物を2％アガロースゲルで電気泳動しエチジウムブロマイドで染色後、UV照射によりバンドの観察を行った。
結果
NSphの培養開始時にGlcNAc、ManNAcあるいはNeuAcを1 mMとなるように添加して6日間の培養を行った。添加された条件で引き続き10日間の分化誘導を行った後細胞を回収した（図６）。
Hcrtの発現をRT-PCRにより解析した結果、1.0 mM ManNAc添加区のみでバンドが検出された（図７）。
NSphの培養開始時にGlcNAc、ManNAcあるいはNeuAcを1 mMとなるように添加して6日間の培養を行った。添加された条件で引き続き10日間の分化誘導を行った後細胞を回収した（図６）。
Hcrtの発現をRT-PCRにより解析した結果、1.0 mM ManNAc添加区のみでバンドが検出された（図７）。
実施例４：マウスES細胞からの神経分化誘導の系を用いたManNAcならびにSirt阻害剤およびOgt阻害剤によるオレキシン遺伝子(Hcrt)の発現誘導
分化培養
実施例１に記載の方法と同様にして、マウスES細胞(J1株)を10日間、神経細胞への分化誘導のために培養した。神経細胞への分化誘導プロトコルを図１１の上段に示す。分化培養開始時（0日）からManNAcを1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養4および7日目に培地の交換を行った。また、分化培養4日目から5 nM recombinant human BMP4(Wako)を添加した。分化培養7日目にEX-527（SIGMA-ALDRICH）を50nMになるように神経分化培地に添加し、あるいはBADGP（SIGMA-ALDRICH）を1または5mMになるように神経分化培地に添加し、分化培養10日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。RT-PCRの条件は、実施例１と同様である。
分化培養
実施例１に記載の方法と同様にして、マウスES細胞(J1株)を10日間、神経細胞への分化誘導のために培養した。神経細胞への分化誘導プロトコルを図１１の上段に示す。分化培養開始時（0日）からManNAcを1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養4および7日目に培地の交換を行った。また、分化培養4日目から5 nM recombinant human BMP4(Wako)を添加した。分化培養7日目にEX-527（SIGMA-ALDRICH）を50nMになるように神経分化培地に添加し、あるいはBADGP（SIGMA-ALDRICH）を1または5mMになるように神経分化培地に添加し、分化培養10日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。RT-PCRの条件は、実施例１と同様である。
結果
(実験3、図８)
分化培養開始時からManNAcを1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養7日目にEX-527（SIGMA-ALDRICH）を50nMになるように神経分化培地に添加し、分化培養10日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。オレキシン遺伝子（Hcrt）の発現解析を行った結果、EX-527添加区でHcrtの発現が認められたが、ManNAcとEX-527とを併用することにより、Hcrtの発現が増強することがわかった。
(実験3、図８)
分化培養開始時からManNAcを1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養7日目にEX-527（SIGMA-ALDRICH）を50nMになるように神経分化培地に添加し、分化培養10日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。オレキシン遺伝子（Hcrt）の発現解析を行った結果、EX-527添加区でHcrtの発現が認められたが、ManNAcとEX-527とを併用することにより、Hcrtの発現が増強することがわかった。
(実験4、図９)
次に、分化培養開始時からManNAcを1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養7日目にBADGP（SIGMA-ALDRICH）を1mMまたは5mMになるように神経分化培地に添加し、分化培養10日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。オレキシン遺伝子（Hcrt）の発現解析を行った結果、ManNAc添加区で認められたHcrtの発現が、ManNAcとBADGPとを併用することにより増強されることがわかった。Hcrtの発現は、BADGPの濃度に依存して増大される傾向が観察された。
次に、分化培養開始時からManNAcを1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養7日目にBADGP（SIGMA-ALDRICH）を1mMまたは5mMになるように神経分化培地に添加し、分化培養10日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。オレキシン遺伝子（Hcrt）の発現解析を行った結果、ManNAc添加区で認められたHcrtの発現が、ManNAcとBADGPとを併用することにより増強されることがわかった。Hcrtの発現は、BADGPの濃度に依存して増大される傾向が観察された。
実施例５：ヒトiPS細胞からの神経分化誘導の系を用いたManNAcならびにSirt阻害剤およびOgt阻害剤によるオレキシン遺伝子(Hcrt)の発現誘導
分化培養
ヒトiPS細胞株201B7(HSP0001)は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（MEXT、日本）を介して、理研バイオリソースセンターより入手した。ヒトiPS細胞は、5 ng/mLのrecombinant human bFGF（Wako)を補足した霊長類ＥＳ培地(ReproCELL)中、マイトマイシンＣ処理STO/Neo resistant/LIF(SNL)フィーダー細胞のフィーダー層上で維持した。SIDAとBMP4系による神経への分化誘導のため、ヒトiPS細胞をPA6とともに20日間共培養した。5nM BMP4を、7日目から補足した。詳細な神経細胞への分化誘導プロトコルを図１１の下段に示す。分化培養開始時（0日）からManNAcを1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養7、10および14日目に培地の交換を行った。また、分化培養7日目から5 nM recombinant human BMP4(Wako)を添加した。分化培養14日目にEX-527（SIGMA-ALDRICH）を50nMになるように神経分化培地に添加し、あるいはBADGP（SIGMA-ALDRICH）を5mMになるように神経分化培地に添加し、分化培養20日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。RT-PCRの条件は、実施例１と同様である。
分化培養
ヒトiPS細胞株201B7(HSP0001)は、ナショナルバイオリソースプロジェクト（MEXT、日本）を介して、理研バイオリソースセンターより入手した。ヒトiPS細胞は、5 ng/mLのrecombinant human bFGF（Wako)を補足した霊長類ＥＳ培地(ReproCELL)中、マイトマイシンＣ処理STO/Neo resistant/LIF(SNL)フィーダー細胞のフィーダー層上で維持した。SIDAとBMP4系による神経への分化誘導のため、ヒトiPS細胞をPA6とともに20日間共培養した。5nM BMP4を、7日目から補足した。詳細な神経細胞への分化誘導プロトコルを図１１の下段に示す。分化培養開始時（0日）からManNAcを1.0mMになるように神経分化培地中に添加し、分化培養7、10および14日目に培地の交換を行った。また、分化培養7日目から5 nM recombinant human BMP4(Wako)を添加した。分化培養14日目にEX-527（SIGMA-ALDRICH）を50nMになるように神経分化培地に添加し、あるいはBADGP（SIGMA-ALDRICH）を5mMになるように神経分化培地に添加し、分化培養20日目に細胞を回収してRT-PCRに供した。RT-PCRの条件は、実施例１と同様である。
結果（図１０）
RT-PCRによるオレキシン遺伝子（Hcrt）の発現解析を行った結果、ManNAc添加区およびEX-527添加区で同程度に認められたHcrtの発現が、ManNAcとEX-527、ManNAcとBADGP、ManNAcとEX-527とBADGPとを併用することにより増強されることがわかった。Hcrtの発現は、ManNAcとEX-527とBADGPの3種併用によって最も増大された。
RT-PCRによるオレキシン遺伝子（Hcrt）の発現解析を行った結果、ManNAc添加区およびEX-527添加区で同程度に認められたHcrtの発現が、ManNAcとEX-527、ManNAcとBADGP、ManNAcとEX-527とBADGPとを併用することにより増強されることがわかった。Hcrtの発現は、ManNAcとEX-527とBADGPの3種併用によって最も増大された。
実施例６：ヒトiPS細胞から分化誘導された神経分化コロニーにおけるオレキシン陽性細胞の解析
実施例５に記載された方法で4ウェル培養プレートで分化誘導させた細胞を、4％パラホルマリン溶液で固定した後、0.2％ Triton-X100溶液で細胞膜透過性処理を行った。5％牛血清アルブミン溶液で処理した後、一次抗体（抗ヒトオレキシン抗体、抗ヒトチューブリンIII抗体）で4℃、一夜処理をした。二次標識抗体（Alex-Fluor 488標識ロバ抗ヤギ抗体、Alexa-Fluor 594標識ウサギ抗マウス抗体）と反応させた後、DAPIで核DNAを染色した。蛍光は蛍光顕微鏡で観察し、オレキシン抗体との反応が認められた神経分化コロニー中のオレキシン陽性細胞の割合を計測した。
実施例５に記載された方法で4ウェル培養プレートで分化誘導させた細胞を、4％パラホルマリン溶液で固定した後、0.2％ Triton-X100溶液で細胞膜透過性処理を行った。5％牛血清アルブミン溶液で処理した後、一次抗体（抗ヒトオレキシン抗体、抗ヒトチューブリンIII抗体）で4℃、一夜処理をした。二次標識抗体（Alex-Fluor 488標識ロバ抗ヤギ抗体、Alexa-Fluor 594標識ウサギ抗マウス抗体）と反応させた後、DAPIで核DNAを染色した。蛍光は蛍光顕微鏡で観察し、オレキシン抗体との反応が認められた神経分化コロニー中のオレキシン陽性細胞の割合を計測した。
その結果、ManNAc処理では4.9％の細胞が、ManNAcとEX-527処理区では6.1％の細胞が、ManNAcとBADGP処理区では7.0％の、そしてManNAc、EX-527、BADGPの同時処理区では18.7％の細胞がオレキシン陽性となり、ManNAcとサーチュイン阻害剤および／またはOGT阻害剤との組み合わせによりオレキシンニューロンの分化が著しく増強されたことが分かった。
本発明により、ＭａｎＮＡｃを有効成分として含有する医薬、食品などが提供される。本発明の医薬または食品の服用または摂取により老化に伴う脳機能低下を予防、改善または治療することができる。
本出願は、アメリカ合衆国で出願された仮出願番号第６１／５４０６０１（出願日：２０１１年９月２９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
Claims (13)
- 多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞または人工多能性幹細胞である請求項１に記載の製造方法。
- 神経前駆細胞が胎児由来神経塊である請求項１に記載の製造方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法により、オレキシンニューロンを製造する工程、並びに
製造されたオレキシンニューロンを被験物質の存在下で培養し、Hcrt遺伝子の発現又は培地中に放出されたオレキシン若しくは細胞内に蓄積されたオレキシンを検出又は測定する工程、
を含む、覚醒−睡眠の調節に作用する薬物のスクリーニング方法。 - 薬物がナルコレプシーの治療薬である、請求項４に記載のスクリーニング方法。
- Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンの有効量をそれを必要とするヒトを除く対象に投与する、または摂取させる工程を含む、オレキシンニューロンの誘導方法。
- Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミンを有効成分として含有してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンの誘導剤。
- 多能性幹細胞または神経前駆細胞をＮ−アセチル−Ｄ−マンノサミンならびに、サーチュイン阻害剤およびO-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤の存在下で培養する工程を含む、オレキシンニューロンの製造方法。
- 多能性幹細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞または人工多能性幹細胞である請求項８に記載の製造方法。
- 神経前駆細胞が胎児由来神経塊である請求項８に記載の製造方法。
- 請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法により、オレキシンニューロンを製造する工程、並びに
製造されたオレキシンニューロンを被験物質の存在下で培養し、Hcrt遺伝子の発現又は培地中に放出されたオレキシン若しくは細胞内に蓄積されたオレキシンを検出又は測定する工程、
を含む、覚醒−睡眠の調節に作用する薬物のスクリーニング方法。 - 薬物がナルコレプシーの治療薬である、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
- （1）Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン、ならびに
（2）サーチュイン阻害剤およびO-結合型β-N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼ阻害剤からなる群より選ばれる少なくとも１種の阻害剤を有効成分として別々の容器に収容してなる、神経前駆細胞または神経細胞からオレキシンニューロンを誘導するためのキット。
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