JP6103577B2 - Green sulfur bacterial mutant and method for producing bacteriochlorophyll c homologue using the same - Google Patents
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description
本発明は、バクテリオクロロフィルeを産生する緑色硫黄細菌において、クロリン骨格のC7位のホルミル化に関与する遺伝子を欠損させた新規緑色硫黄細菌変異株、並びに該変異株を用いた高級なバクテリオクロロフィルc同族体の製造方法に関する。 The present invention relates to a novel green sulfur bacterium mutant lacking a gene involved in formylation at the C7 position of the chlorin skeleton in a green sulfur bacterium producing bacteriochlorophyll e, and a high-grade bacteriochlorophyll c using the mutant The present invention relates to a method for producing a homologue.
緑色硫黄細菌は光合成によってのみ生育する絶対嫌気性の光合成生物である。そのため、これらの細菌は優れた光合成能を持ち合わせており、極めて微弱光に適応した膜外アンテナ系であるクロロソームを有している。クロロソーム内の光捕集部は、タンパク質が関与しない色素のみの自己会合体から形成されている (非特許文献１)。このことは、他の全ての光合成生物のアンテナ系で色素がタンパク質の支持体中で機能していることに対する、唯一の例外である。
クロロソームは生体内から容易に単離精製することができ、また生体外で分解させた後に再構成させることが可能である。さらには、再構成時に光化学反応を誘起する色素を加えておけば、機能を持つ会合体を容易に作り出すことができる (非特許文献２)。よって、色素分子の種類、組成などを緑色硫黄細菌の遺伝子改変で調節することができれば、様々な機能を持つクロロソームを形成させることが可能である。
Green sulfur bacteria are absolutely anaerobic photosynthetic organisms that grow only by photosynthesis. Therefore, these bacteria have an excellent photosynthetic ability, and have chlorosome, which is an extra-membrane antenna system adapted to extremely low light. The light collecting part in the chlorosome is formed from a self-aggregate of only a dye not involving a protein (Non-patent Document 1). This is the only exception to the dye functioning in the protein support in all other photosynthetic organism antenna systems.
Chlorosomes can be easily isolated and purified from the living body, and can be reconstituted after being decomposed in vitro. Furthermore, if a dye that induces a photochemical reaction at the time of reconstitution is added, a functional aggregate can be easily produced (Non-patent Document 2). Therefore, chlorosomes having various functions can be formed if the type and composition of pigment molecules can be controlled by genetic modification of green sulfur bacteria.
クロロソーム内の自己会合色素としてバクテリオクロロフィル (BChl) c、d及びeが知られている。どの種類の色素を持つかは緑色硫黄細菌の種によって異なる。これらの色素分子は、BChl cを基に構造を比較すると、そのC20位のメチル基を水素原子に置き換えたものがBChl dであり、C7位のメチル基をホルミル基に置き換えたものがBChl eである。尚、天然には未だ見出されていないが、BChl eのC20位脱メチル体がBChl fという名前で予約されている (図１参照)。
BChl c、d及びeは、C82位及びC121位上でのメチル化度が異なる同族体の総称であり、これまでC8位にエチル、プロピル、イソブチル又はネオペンチル基を、C12位にメチル又はエチル基を有するものが見出されている。さらに、それぞれの同族体において、31位の不斉炭素原子に関して立体異性体 (R体とS体) が存在することも多い。しかし、天然に存在する緑色硫黄細菌が産生するBChl cのほとんどは低級BChl cであり、メチル化度の高い高級BChl c分子種は微量しか含まれない。そのため、相当量の高級BChl c分子種を取得するには大量の菌体が必要となる。しかし、C8位にイソブチル基、C12位にエチル基を有するS[I,E]BChl c等の高級BChl c分子種は、微弱光な培養条件において増量する色素であることから、クロロソームの光エネルギー捕集または伝達を効率化していると考えられており (非特許文献３)、人工光合成などの応用面においても有用な素材となりうると期待される。従って、これらの高級BChl c分子種を高生産する変異株を遺伝子操作により作製する技術の開発が望まれる。
Bacteriochlorophyll (BChl) c, d and e are known as self-associating dyes in chlorosomes. Which type of pigment is present depends on the species of green sulfur bacteria. When these dye molecules are compared in structure based on BChl c, BChl d is obtained by replacing the methyl group at the C20 position with a hydrogen atom, and BChl e is obtained by replacing the methyl group at the C7 position with a formyl group. It is. Although not yet found in nature, the C20-demethylated form of BChl e is reserved under the name BChl f (see FIG. 1).
BChl c, d and e, C8 degree of methylation on positions 2 and C12 1-position is the general term for different congeners, heretofore ethyl C8 position, propyl, isobutyl or neopentyl groups, methyl or C12 position Those having an ethyl group have been found. Further, in each homolog, 3 1-position of the stereoisomers with respect to the asymmetric carbon atom (R and S-isomers) can also often present. However, most of BChl c produced by naturally occurring green sulfur bacteria is lower BChl c, and only a small amount of higher BChl c molecular species having a high degree of methylation is contained. Therefore, a large amount of cells are required to obtain a considerable amount of high-grade BChl c molecular species. However, higher BChl c molecular species, such as S [I, E] BChl c, which has an isobutyl group at the C8 position and an ethyl group at the C12 position, are dyes that increase in weak light culture conditions. It is considered that collection or transmission is made efficient (Non-Patent Document 3), and is expected to be a useful material in applications such as artificial photosynthesis. Therefore, it is desired to develop a technique for producing mutant strains that produce these high-grade BChlc molecular species at high levels by genetic manipulation.
これまで、BChl cを有する緑色硫黄細菌としてクロロバキュラム・テピダム (Chlorobaculum (Cba.) tepidum) とBChl dを有する緑色硫黄細菌Cba. パルバム (Chlorobaculum parvum) において、人為的に遺伝子改変を行えることが報告されている (非特許文献４及び５)。そのため、BChl cとBChl dの生合成経路に関する研究が最も進んでおり、全ての合成酵素遺伝子が解明されている。かかる知見に基づき、BChl c産生菌において、クロリン骨格のC82位及びC121位のメチル化酵素であるBchQ及びBchR、更にはC20位のメチル化酵素であるBchUを欠損させた変異株 (結果として、この変異株のBChl組成は、C8位にエチル基、C12位にメチル基を有する低級BChl d分子種 (R[E,M]BChl d) が95%以上を占める) なども作製されている (非特許文献３)。しかし、高級BChl c分子種を高生産する変異株の作製に関する報告は皆無である。
一方、BChl eを有する細菌ではこれまで遺伝子改変可能な菌株の報告例がなかったが、最近、本発明者らは、BChl eを有するCba. リムナエウム (Chlorobaculum limnaeum) の育種・選抜により、遺伝子改変が可能なRK-j-1株を単離することに成功した。さらに当該菌株において、クロリン骨格のC20位をメチル化する酵素遺伝子を欠損させることにより、天然からは未だ見出されていないBChl fを合成する変異株の作製にも成功した (図１参照；非特許文献６、特願2012-028919)。
しかしながら、BChl eの生合成経路は未だ明らかではなく、BChl e合成において最も重要なC7位のホルミル化酵素遺伝子は同定されていなかったため、RK-j-1株を用いて、遺伝子改変によりC7位にメチル基を有するBChl cを産生する変異株を作製するには至っていなかった。
Until now, it has been possible to artificially modify the genes in Chlorobaculum (Cba.) Tepidum and BC1 d as green sulfur bacteria with BChl c and Chlorobaculum parvum. It has been reported (Non-Patent Documents 4 and 5). Therefore, research on the biosynthetic pathway of BChl c and BChl d is the most advanced, and all synthase genes have been elucidated. Based on these findings, the BChl c Sanseikin a methylation enzyme C8 2-position and C12 1-position of the chlorin skeleton BchQ and BchR, more mutants (results obtained by deficient BchU a methylation enzyme of C20 As a result, the BChl composition of this mutant strain was also made of a lower BChl d molecular species (R [E, M] BChl d) occupying 95% or more) having an ethyl group at the C8 position and a methyl group at the C12 position. (Non-Patent Document 3). However, there are no reports on the production of mutants that produce high-grade BChlc molecular species at high production.
On the other hand, there have been no reports of strains that can be genetically modified in bacteria having BChl e, but recently, the present inventors have made genetic modifications by breeding and selecting Cba. Limnaeum having BChl e. RK-j-1 strain was successfully isolated. Furthermore, in this strain, a mutant strain that synthesizes BChl f that has not yet been found in nature has been successfully produced by deleting the enzyme gene that methylates the C20 position of the chlorin skeleton (see FIG. 1; Patent Document 6, Japanese Patent Application 2012-028919).
However, the biosynthesis pathway of BChl e is not yet clear, and the most important formylation gene at position C7 in BChl e synthesis has not been identified. However, it has not been possible to produce a mutant that produces BChl c having a methyl group.
したがって、本発明の第一の目的は、BChl e合成におけるC7位のホルミル化反応に関与する酵素遺伝子を探索・同定し、遺伝子改変可能なBChl e産生緑色硫黄細菌を用いて該遺伝子を欠損させることにより、BChl c産生変異株を提供することである。当該変異株において、非特許文献６と同様の方法でC20位のメチル化酵素遺伝子をさらに欠損させることにより、BChl d産生変異株を得ることもできる。従って、本発明の第二の目的は、同一のBChl e産生緑色硫黄細菌を親株として、クロリン骨格を有する他の3種のBChl (BChl c/d/f) を産生する変異株シリーズを提供することである。
さらに、本発明の第三の目的は、クロロソームの光エネルギー捕集または伝達を効率化するとの利点を有するものの、天然の緑色硫黄細菌には微量しか含まれない高級なBChl c同族体を高生産する変異株を、遺伝子改変により提供することである。
Accordingly, the first object of the present invention is to search and identify an enzyme gene involved in the C7-formylation reaction in BChl e synthesis, and to delete the gene using BChle-producing green sulfur bacteria that can be genetically modified. By providing a BChl c production mutant. In this mutant strain, a BChld-producing mutant strain can also be obtained by further deleting the methylase gene at the C20 position in the same manner as in Non-Patent Document 6. Accordingly, the second object of the present invention is to provide a mutant series that produces the other three types of BChl (BChl c / d / f) having the chlorin skeleton using the same BChl e-producing green sulfur bacterium as a parent strain. That is.
Furthermore, the third object of the present invention is to produce high-grade BChl c homologues that have the advantage of improving the efficiency of light energy collection or transmission of chlorosomes, but have a small amount in natural green sulfur bacteria. The mutant strain to be provided is provided by genetic modification.
本発明者らはまず、上記第一の目的を達成すべく、ゲノム情報が公開されている数種のBChl e産生緑色硫黄細菌株と、他の光合成細菌との間で、比較ゲノム解析を実施し、抽出されたBChl e産生緑色硫黄細菌のみに特有の遺伝子群の中から、ラジカルSAMファミリーに属する酵素をコードすると目される遺伝子に着目し、該遺伝子をbciDと名づけた。一方で、遺伝子改変可能なBChl e産生緑色硫黄細菌Cba. limnaeum RK-j-1株のゲノム解読を行い、該ゲノム配列の中から、bciD遺伝子と相同性のある遺伝子を検索した結果、配列番号１に示されるヌクレオチド配列 (ORF) を有する遺伝子を同定した。
次いで、相同組換えを用いてRK-j-1株のbciD遺伝子を欠損させ、得られたbciD欠損株から色素を抽出して、野生株及びBChl c産生緑色硫黄細菌から抽出した色素と比較した。その結果、該欠損株は、BChl cを合成するがBChl eを産生しないことが明らかとなり、bciDがC7位のホルミル化に関与する遺伝子であることが実証された。さらに、驚くべきことに、bciD欠損株のBChl c同族体の組成は、野生株においてBChl cを合成するCba. tepidumとは異なり、S[I,E]BChl cが主成分であることが判明した。親株であるRK-j-1株において、C8位のイソブチル基、C20位にエチル基を有する高級BChl e同族体は微量成分であることから、本結果は全く予想外であった。J. Harada et al. (2012) Scientific Rep., 2: DOI: 10.1038/srep00671 (非特許文献６) に示されるとおり、RK-j-1株においてC20位のメチル化酵素遺伝子であるbchU遺伝子を欠損させた場合には、欠損株におけるBChl f同族体の組成は、親株におけるBChl e同族体の組成と比較して、S[I,E]体は増加傾向にあるものの、R[E,E]やR[P,E]といった低級BChl f分子種が依然として主成分である。このことから、bciD欠損株においてさらにbchUを欠損させてBChl d産生変異株を作製した場合 (図１参照)、bciD欠損株と同様に、bciD/bchU二重変異株におけるBChl d同族体の組成は、S[I,E]BChl dが主成分となるものと考えられる。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
First, in order to achieve the first object, the present inventors conducted comparative genome analysis between several BChle-producing green sulfur bacteria strains whose genome information has been released and other photosynthetic bacteria. Then, attention was paid to a gene expected to encode an enzyme belonging to the radical SAM family from among the extracted gene group specific to only BChle-producing green sulfur bacteria, and the gene was named bciD. On the other hand, the genome of BChl e-producing green sulfur bacterium Cba. Limnaeum RK-j-1 that can be genetically modified was deciphered, and a gene homologous to the bciD gene was searched from the genome sequence. A gene having the nucleotide sequence (ORF) shown in 1 was identified.
Next, the bciD gene of RK-j-1 strain was deleted using homologous recombination, and the pigment was extracted from the obtained bciD-deficient strain and compared with the pigment extracted from the wild strain and BChl c-producing green sulfur bacteria. . As a result, it was clarified that the deficient strain synthesized BChl c but did not produce BChl e, and it was demonstrated that bciD is a gene involved in formylation at the C7 position. Surprisingly, the composition of BChl c homologues of bciD-deficient strains was found to be mainly composed of S [I, E] BChl c, unlike Cba. Tepidum, which synthesizes BChl c in wild-type strains. did. In the parent strain RK-j-1, the higher BChle homologue having an isobutyl group at the C8 position and an ethyl group at the C20 position is a minor component, so this result was completely unexpected. As shown in J. Harada et al. (2012) Scientific Rep., 2: DOI: 10.1038 / srep00671 (Non-patent document 6), the bchU gene, which is a methylation enzyme gene at the C20 position in the RK-j-1 strain, In the case of deletion, the composition of BChl f homologues in the deficient strain is higher than that of the BChl e homologues in the parent strain, while R [E, E] ] And R [P, E] are still the main components. Therefore, when a bchD-deficient strain is further deficient in bchU to produce a BChl d-producing mutant strain (see Fig. 1), the composition of the BChl d homologue in the bciD / bchU double mutant strain is the same as in the bciD-deficient strain. It is considered that S [I, E] BChl d is the main component.
As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
即ち、本発明は以下のものを提供する。
〔１〕 BChl eを産生する緑色硫黄細菌において、bciD遺伝子が欠損してなる、BChl c産生変異株。
〔２〕 天然のBChl c産生緑色硫黄細菌と比較して、高級BChl c分子種の組成比が高いことを特徴とする、前記〔１〕記載の変異株。
〔３〕 高級BChl c分子種がC8位にイソブチル基を有し、且つC12位にエチル基を有する、前記〔２〕記載の変異株。
〔４〕 BChl eを産生する緑色硫黄細菌がクロロバキュラム・リムナエウム(Chlorobaculum limnaeum) RK-j-1株（受託番号：NITE P-1202）である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の変異株。
〔５〕 前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の変異株を培地中で培養し、得られる培養物からBChl cを回収することを含む、BChl cの製造方法。
〔６〕 前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の変異株を培地中で培養し、得られる培養物からクロロソームを回収することを含む、天然のBChl c産生緑色硫黄細菌由来のクロロソームと比較して高級BChl c分子種の組成比が高いクロロソームの製造方法。
〔７〕 前記〔６〕に記載の方法により得られるクロロソーム。
That is, the present invention provides the following.
[1] A BChl c production mutant strain in which the bciD gene is deleted in a green sulfur bacterium producing BChl e.
[2] The mutant strain according to [1] above, wherein the composition ratio of the higher BChl c molecular species is higher than that of natural BChl c-producing green sulfur bacteria.
[3] The mutant strain according to [2] above, wherein the higher BChl c molecular species has an isobutyl group at the C8 position and an ethyl group at the C12 position.
[4] Any of [1] to [3] above, wherein the green sulfur bacterium producing BChl e is Chlorobaculum limnaeum RK-j-1 strain (Accession Number: NITE P-1202) The mutant strain described in 1.
[5] A method for producing BChl c, comprising culturing the mutant strain according to any of [1] to [4] in a medium and recovering BChl c from the obtained culture.
[6] A chlorosome derived from a natural BChl c-producing green sulfur bacterium, comprising culturing the mutant strain of any one of [1] to [4] in a medium and recovering the chlorosome from the obtained culture. A method for producing chlorosomes, which has a higher composition ratio of higher BChl c molecular species.
[7] A chlorosome obtained by the method according to [6].
本発明によれば、BChl e産生緑色硫黄細菌からBChl c産生変異株を作製することができる。また、該変異株において、さらにC20位のメチル化酵素遺伝子を欠損させることにより、BChl d産生変異株を作製することもできる。
また、本発明によれば、クロロソームの光エネルギー捕集または伝達の効率化に寄与し得る、C82位及びC121位のメチル化度の高い高級BChl c/ｄを高生産することができるので、人工光合成、色素増感太陽電池などの応用分野において、光エネルギーの捕獲・変換効率が向上した光デバイス等の生産に利用可能である。
According to the present invention, a BChl c-producing mutant strain can be prepared from BChle-producing green sulfur bacteria. In addition, in this mutant strain, a BChld production mutant strain can also be prepared by deleting the methylase gene at C20 position.
Further, according to the present invention, high-grade BChl c / d having a high degree of methylation at the C8 2 position and the C12 1 position, which can contribute to the efficiency of light energy collection or transmission of chlorosomes, can be produced at a high rate. In application fields such as artificial photosynthesis and dye-sensitized solar cells, it can be used for the production of optical devices and the like with improved light energy capture and conversion efficiency.
本発明は、BChl eを産生する緑色硫黄細菌において、bciD遺伝子が欠損してなる、BChl c産生変異株を提供する。
本発明で使用される「BChl eを産生する緑色硫黄細菌」(以下、「BChl e産生菌」と略記する場合がある) は、クロロソーム色素の主成分としてBChl eを産生する緑色硫黄細菌であって、遺伝子改変が可能な菌株であれば特に制限されない。BChl e産生菌としては、例えば、Cba. limnaeum、クロロビウム・ファエオバクテロイデス (Chlorobium (Chl.) phaeobacteroides)、Chl. ファエオビブリオイデス (Chlorobium phaeovibrioides)、ペロディチオン・ファエオクラトラティフォルメ (Pelodictyon (Pld.) phaeoclathratiforme)、が挙げられるが、これらに限定されない。BChl e産生菌は、例えば、ATCC、CAUP、CCAP、CCMP、CCCM、CGC(CC)、CSIRO、DSMZ、香川県水産試験場 赤潮研究所、神戸大学海藻類系統コレクション (KU-MACC)、独立行政法人 国立環境研究所 微生物系統保存施設 (NIES)、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 (NITE) 等の光合成生物のカルチャーコレクションから入手することができる。
遺伝子改変可能なBChl e産生菌としては、これまでにChlorobaculum limnaeum RK-j-1株（「Cba. limnaeum RK-j-1株」、又は単に「RK-j-1株」と略記する場合がある）が報告されているが (J. Harada et al. (2012) Scientific Rep., 2: DOI: 10.1038/srep00671)、これに限定されず、任意のBChl e産生菌を長期間継代培養を繰り返すことにより、自発的な変異を促すか、あるいは変異原 (例えば、アルキル化剤(N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン (NTG)、エチルメタンスルホン酸 (EMS) 等)、ヌクレオチド塩基類似体 (ブロモウラシル等)、ニトロソ化合物、DNAインターカレーター、DNA架橋剤、放射線、紫外線等) 処理により人為的に変異を誘発し、遺伝子改変可能な変異株を選抜することによって作製したものであってもよい。選抜は、固形培地上で生育の早いコロニーを選択し、自体公知の形質転換法、例えば、自然形質転換法やエレクトロポレーション法等により、薬剤耐性遺伝子を導入し、薬剤耐性コロニーの出現を確認することにより行うことができる。
The present invention provides a BChl c-producing mutant strain in which the bciD gene is deleted in a green sulfur bacterium that produces BChl e.
The “green sulfur bacterium producing BChle” used in the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as “BChle producing bacterium”) is a green sulfur bacterium producing BChle as the main component of the chlorosome pigment. Any strain that can be genetically modified is not particularly limited. Examples of BChl e-producing bacteria include Cba. Limnaeum, Chlorobium (Chl.) Phaeobacteroides, Chl. Phaeobibrioides, and Pelodictyon (Pelodictyon Pld. ) phaeoclathratiforme), but not limited to. BChl e-producing bacteria are, for example, ATCC, CAUP, CCAP, CCMP, CCCM, CGC (CC), CSIRO, DSMZ, Kagawa Prefectural Fisheries Experiment Station, Akashi Research Institute, Kobe University Seaweed Collection (KU-MACC), Independent Administrative Institution It can be obtained from culture collections of photosynthetic organisms such as the National Institute for Environmental Studies, Microbial System Preservation Facility (NIES), National Institute of Technology and Evaluation (NITE).
BChl e-producing bacteria that can be genetically modified may be abbreviated as Chlorobaculum limnaeum RK-j-1 strain (“Cba. Limnaeum RK-j-1 strain” or simply “RK-j-1 strain”). (J. Harada et al. (2012) Scientific Rep., 2: DOI: 10.1038 / srep00671), but it is not limited to this. Repeat to promote spontaneous mutation or mutagen (e.g. alkylating agents (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethyl methanesulfonic acid (EMS) etc.), nucleotides Base analogs (bromouracil, etc.), nitroso compounds, DNA intercalators, DNA cross-linking agents, radiation, ultraviolet rays, etc.) These are created by artificially inducing mutations by treatment and selecting mutants that can be genetically modified. There may be. For selection, select colonies that grow quickly on solid medium, introduce drug resistance genes using known transformation methods such as natural transformation or electroporation, and confirm the appearance of drug-resistant colonies. This can be done.
Cba. limnaeum RK-j-1株は、久留米大学医学部医化学講座で保存されているChlorobaculum limnaeum 1549株を親株として、約10年間継続培養を行うことにより形質転換可能となったクローンであり、長期継続培養中に生じた自然変異により形質転換能を獲得したものであると考えられる。16S rDNAはGenebankに登録されているChlorobaculum limnaeumの塩基配列（Accession No.: AJ299413。旧名Chlorobium phaeobacteroides strain 1549で登録）と99.99％以上一致している。形態は、親株の1549株とほぼ同様であり、嫌気光合成培養にて、光独立栄養的に生育が可能である。
RK-j-1株は、2012年1月12日付で、独立行政法人製品 評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号NITE P-1202として寄託され、2012年12月25日付でブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、新たな受託番号NITE BP-1202が付されている。
The Cba.limnaeum RK-j-1 strain is a clone that can be transformed by continuous culture for about 10 years using the Chlorobaculum limnaeum 1549 strain, which is preserved at the Department of Medical Chemistry, Kurume University School of Medicine. It is thought that transformation ability was acquired by natural mutation that occurred during continuous culture. 16S rDNA matches 99.99% or more with the base sequence of Chlorobaculum limnaeum registered in Genebank (Accession No .: AJ299413, registered under the former name Chlorobium phaeobacteroides strain 1549). The morphology is almost the same as the parent strain 1549, and it can grow photoautotrophically in anaerobic photosynthesis culture.
The RK-j-1 strain was established on January 12, 2012 at the National Institute of Technology and Evaluation Patent Microbiology Depositary Center (2-5-8 Kazusa-Kamashita, Kisarazu, Chiba, Japan). -1202, deposited on December 25, 2012 to the international deposit under the Budapest Treaty and given the new deposit number NITE BP-1202 .
本発明において欠損させるべき「bciD遺伝子」は、Cba. limnaeumゲノムから単離された、配列番号１に示されるヌクレオチド配列からなるコード領域 (cds) を有する遺伝子 (該cdsにコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す)、並びに他のBChl e産生菌におけるそのオルソログである。全ゲノム配列が解読されているChl. phaeobacteroides BS-1株及びDSM266株、Pld. phaeoclathratiforme BU-1株のbciD遺伝子は、それぞれNCBIデータベースにGene ID：6373925 (NC_010831.1の261683-262900位；locus tag：Cphamn1_0270)、Gene ID：4570577 (NC_008639.1の221628-222833位 (相補鎖)；locus tag：Cpha266_0196)、及びGene ID：6462626 (NC_011060.1の2835539-2836744位 (相補鎖)；locus tag：Ppha_2747)として登録されており、当業者は当該遺伝子及びその上下流領域のゲノム配列情報を容易に取得することができる。ゲノム配列が解読されていないBChl e産生菌のbciD遺伝子は、常法によりそのゲノム配列を解読し、次いで、配列番号１に示されるヌクレオチド配列をqueryとして、得られたゲノム配列に対してBlast検索をかけることにより同定することができる。Blast検索は、例えば以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて行うことができる。Blast検索の結果、配列番号２に示されるアミノ酸配列と、約70%以上、好ましくは約80%以上、さらに好ましくは約90％以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を、該菌株のbciD遺伝子と推定することができる。ヒットした遺伝子がbciD遺伝子であることの確認は、例えば、後述の方法により当該遺伝子を欠損させた場合に、得られる欠損株がBchl cを産生することを調べることによって行うことができる。あるいは、BChl c産生菌 (例えば、Cba. tepidumなど) に当該遺伝子を含む発現ベクターを導入し、得られる形質転換体がBChl eを産生するか否かを調べることによっても、当該遺伝子がbciD遺伝子であることを確認することができる。 The “bciD gene” to be deleted in the present invention is a gene having a coding region (cds) consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 isolated from the Cba. Limnaeum genome (the amino acid sequence encoded by the cds). As well as its orthologs in other BChl e producing bacteria. The bciD genes of Chl. Phaeobacteroides BS-1 and DSM266 strains and Pld. Phaeoclathratiforme BU-1 strains whose entire genome sequences have been decoded are respectively stored in the NCBI database with Gene ID: 6373925 (positions 261683-262900 of NC_010831.1; locus tag: Cphamn1_0270), Gene ID: 4570577 (NC_008639.1 positions 22122628-222833 (complementary strand); locus tag: Cpha266_0196) and Gene ID: 6462626 (NC_011060.1 positions 2835539-2836744 (complementary strand); locus tag : Ppha_2747), and those skilled in the art can easily obtain the genomic sequence information of the gene and its upstream and downstream regions. For the bciD gene of BChl e producing bacteria whose genome sequence has not been decoded, the genome sequence is decoded by a conventional method, and then the Blast search is performed on the obtained genome sequence using the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 as a query. Can be identified. The Blast search can be performed, for example, under the following conditions (expected value = 10; allow gap; matrix = BLOSUM62; filtering = OFF). As a result of the Blast search, a gene encoding an amino acid sequence having a homology of about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is obtained. It can be estimated as a bciD gene. Confirmation that the hit gene is the bciD gene can be carried out, for example, by examining that the obtained defective strain produces Bchlc when the gene is deleted by the method described below. Alternatively, by introducing an expression vector containing the gene into a BChl c-producing bacterium (for example, Cba. Tepidum etc.) and examining whether the resulting transformant produces BChl e, the gene is also converted to the bciD gene. It can be confirmed.
BChl e産生菌のbciD遺伝子を欠損させるとは、当該遺伝子を破壊したり、除去したりすることにより完全なmRNAを産生不能にすることを意味する。bciD遺伝子を欠損させる具体的な手段としては、対象BChl e産生菌由来のbciD遺伝子(ゲノムDNA) を常法に従って単離し、例えば、(1) そのコード領域 (cds) やプロモーター領域に他のDNA断片 (例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等) を挿入することによりcdsもしくはプロモーターの機能を破壊するか、(2) bciD遺伝子の全部または一部を切り出して該遺伝子を欠失させる (例えば、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子等で置換する) か、(3) cds内に終止コドンを挿入して完全な蛋白質の翻訳を不能にするか、あるいは (4) 転写領域内部へ遺伝子の転写を終結させるDNA配列 (ターミネーター配列) を挿入して、完全なmRNAの合成を不能にすることによって、結果的に遺伝子を不活性化するように構築したDNA配列を有するDNA鎖 (以下、ターゲッティングベクターと略記する) を、相同組換えにより対象BChl e産生菌のbciD遺伝子座に組み込ませる方法などが用いられ得る。好ましくは、薬剤耐性遺伝子をcds内に挿入してbciD遺伝子を破壊するか、bciD遺伝子の全部もしくは一部を薬剤耐性遺伝子で置換除去する方法が挙げられる。特に好ましくは、後述の実施例に記載のとおり、RK-j-1株のbciD遺伝子の大部分を除去し、pHP46Ω由来のaadA遺伝子で置換する方法が挙げられる。 Deletion of the bciD gene of BChl e-producing bacteria means that complete mRNA cannot be produced by destroying or removing the gene. As a specific means of deleting the bciD gene, the bciD gene (genomic DNA) derived from the target BChle-producing bacterium is isolated according to a conventional method.For example, (1) other DNA in its coding region (cds) or promoter region By inserting a fragment (for example, a drug resistance gene or a reporter gene), the function of cds or the promoter is destroyed, or (2) all or part of the bciD gene is excised and the gene is deleted (for example, a drug (3) Insert a stop codon in cds to disable complete protein translation, or (4) DNA that terminates gene transcription into the transcription region. Inserting a sequence (terminator sequence) to disable the synthesis of complete mRNA, resulting in a DNA strand with a DNA sequence constructed to inactivate the gene (hereinafter the targeting vector). The over and abbreviated), a scheme of incorporated bciD locus of interest BChl e Sanseikin may be used by homologous recombination. Preferably, a drug resistance gene is inserted into cds to destroy the bciD gene, or a method in which all or part of the bciD gene is replaced with a drug resistance gene. Particularly preferred is a method in which most of the bciD gene of the RK-j-1 strain is removed and replaced with the aadA gene derived from pHH46Ω as described in the Examples below.
薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子などを用いることができるが、緑色硫黄細菌の中には、カナマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンに耐性を持ちやすい菌株も存在するので、好ましくはストレプトマイシン及びスペクチノマイシン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが用いられる。例えば、ストレプトマイシン及びスペクチノマイシン耐性遺伝子として、pHP45Ω (Gene, 29: 303-313 (1984))、pSRA2、pSRA81 (以上、Methods Mol. Biol., 274; 325-340 (2004)) に含まれるaadA遺伝子が、ゲンタマイシン耐性遺伝子として、pMS255、pMS266 (Gene, 162: 37-39 (1995)) に含まれるaacC1遺伝子が、エリスロマイシン耐性遺伝子及びクロラムフェニコール耐性遺伝子として、pRL409 (Gene, 68: 119-138 (1988) に含まれるermC遺伝子及びcat遺伝子が、それぞれ挙げられる。これらの遺伝子は、上記プラスミドから適当な制限酵素により切り出すこともできるし、あるいは上記プラスミドを鋳型として、これらの遺伝子の上下流域の配列をプライマーに用い、PCR法により増幅してもよい。 As drug resistance genes, kanamycin resistance gene, streptomycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, gentamicin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, etc. can be used, Since there are strains that are easily resistant to kanamycin, streptomycin, and spectinomycin, streptomycin and spectinomycin resistance genes, gentamicin resistance genes, erythromycin resistance genes, chloramphenicol resistance genes, and the like are preferably used. For example, the streptomycin and spectinomycin resistance genes include aHPA 45Ω (Gene, 29: 303-313 (1984)), pSRA2, pSRA81 (above, Methods Mol. Biol., 274; 325-340 (2004)). The aacC1 gene contained in pMS255, pMS266 (Gene, 162: 37-39 (1995)) as a gentamicin resistance gene, and pRL409 (Gene, 68: 119- as erythromycin resistance gene and chloramphenicol resistance gene) 138 (1988) include the ermC gene and the cat gene, which can be excised from the plasmid with an appropriate restriction enzyme, or the upstream and downstream regions of these genes using the plasmid as a template. These sequences may be used as primers and amplified by PCR.
薬剤耐性遺伝子をbciD遺伝子のcds内に挿入するか、bciD遺伝子の全部もしくは一部を薬剤耐性遺伝子で置換したターゲッティングベクター構築の詳細については、例えば、Appl. Environ. Microbiol., 67; 2538-2544 (2001) やMethods Mol. Biol., 274; 325-340 (2004) に記載されているが、それらに限定されず、当該技術分野で周知の方法を適宜用いることができる。 For details on the construction of a targeting vector in which a drug resistance gene is inserted into the cds of the bciD gene or all or part of the bciD gene is replaced with the drug resistance gene, see, for example, Appl. Environ. Microbiol., 67; 2538-2544 (2001) and Methods Mol. Biol., 274; 325-340 (2004), but are not limited thereto, and methods well known in the art can be appropriately used.
対象BChl e産生菌に上記ターゲッティングベクターを導入することにより、該ベクターを、相同組換えにより対象BChl e産生菌のbciD遺伝子座に組み込ませることができる。遺伝子導入方法としては、対象BChl e産生菌に適用可能な方法であれば特に制限されず、自体公知のいかなる方法を用いてもよいが、好ましくは自然形質転換法もしくはエレクトロポレーション法が挙げられる (例えば、Appl. Environ. Microbiol., 67; 2538-2544 (2001)；Methods Mol. Biol., 274; 325-340 (2004)；低温科学, 67: 575-582 (2009)などを参照)。 By introducing the above targeting vector into the target BChle-producing bacterium, the vector can be incorporated into the bciD locus of the target BChle-producing bacterium by homologous recombination. The gene introduction method is not particularly limited as long as it is a method applicable to the target BChle-producing bacterium, and any method known per se may be used, but natural transformation method or electroporation method is preferable. (See, eg, Appl. Environ. Microbiol., 67; 2538-2544 (2001); Methods Mol. Biol., 274; 325-340 (2004); Cryogenic Science, 67: 575-582 (2009)).
薬剤耐性遺伝子を含むターゲッティングベクターを用いた場合、遺伝子導入処理した菌体を薬剤含有固形培地上で培養して耐性コロニーを選択することにより、形質転換体を取得することができる。ここで用いられる培地としては、対象BChl e産生菌の生育に適した任意の培地を用いることができる。例えば、BChl e産生菌を保存しているカルチャーコレクションが推奨する培地を用いることができる。具体的には、例えば、DSMZが提供するPfenning’s培地II (medium No. 29) やNBRCが提供するGreen Sulfur Bacterium Medium (medium NO. 855) 等が挙げられる。対象BChl e産生菌が電子供与体としてチオ硫酸塩を利用可能な場合は、チオ硫酸塩を培地に添加することが望ましい。例えば、チオ硫酸塩を含む固形培地として、後述の実施例で使用されるCPプレート (Appl. Environ. Microbiol., 67; 2538-2544 (2001)) 等が好ましく用いられる。培地に添加される選択剤の濃度は、抗生物質の種類、菌株の種類によって異なるが、例えばRK-j-1株の場合には、それぞれ50μg/mL ゲンタマイシン、100 μg/mL ストレプトマイシン、150 μg/mL スペクチノマイシンの終濃度となるように、培地に添加することができる。遺伝子導入処理から3-7日間程度非選択培地で培養した後に、菌体を選択培地にプレーティングして薬剤選択を開始するのが望ましい。 When a targeting vector containing a drug resistance gene is used, a transformant can be obtained by culturing a bacterial cell subjected to gene transfer treatment on a drug-containing solid medium and selecting resistant colonies. As the medium used here, any medium suitable for the growth of the target BChle-producing bacterium can be used. For example, a medium recommended by a culture collection that stores BChl e-producing bacteria can be used. Specific examples include Pfenning's medium II (medium No. 29) provided by DSMZ, Green Sulfur Bacterium Medium (medium NO. 855) provided by NBRC, and the like. When the target BChl e producing bacterium can use thiosulfate as an electron donor, it is desirable to add thiosulfate to the medium. For example, as a solid medium containing thiosulfate, a CP plate (Appl. Environ. Microbiol., 67; 2538-2544 (2001)) used in Examples described later is preferably used. The concentration of the selective agent added to the medium varies depending on the type of antibiotic and the type of strain. It can be added to the medium to a final concentration of mL spectinomycin. After culturing in a non-selective medium for about 3-7 days after the gene transfer treatment, it is desirable to start drug selection by plating the cells on a selective medium.
培養は、通常20-40℃、好ましくは25-30℃の温度で、偏性嫌気条件下、光照射下で行われる。但し、BChl e産生菌が好熱菌の場合など、40-50℃で培養することが好ましい場合もある。Bergey’s Manualなどを参照してその種の至適温度に合わることが望ましい。厳密な嫌気条件の実現には嫌気性チャンバーの使用が理想的であるが、多少とも酸素耐性のある菌株なら、Gas Pack（BD BBL）、アネロパック（三菱ガス化学）などの嫌気ジャーを用いたシステムを利用するか、食品用の脱気密封システムを使ってプレートをエージレスなどの脱酸素剤と共にディスポーザブルの袋に密封して（しばらく暗中に置いて）明条件に置くこともできる。光源としては通常タングステンランプが用いられる。タングステンランプは熱線も強いので、培養は光源から離すか水層を隔てて光照射する必要がある。熱発生の少ない近赤外LEDを光源として使用してもよい。緑色硫黄細菌は本来あまり明るくない環境で生育しているので、微弱な光を照射する方がむしろ好ましい場合が多い。 Culturing is usually carried out at 20-40 ° C., preferably 25-30 ° C., under obligate anaerobic conditions and under light irradiation. However, it may be preferable to culture at 40-50 ° C., such as when the BChle-producing bacterium is a thermophilic bacterium. It is desirable to match the optimum temperature of that kind with reference to Bergey ’s Manual. The use of an anaerobic chamber is ideal for achieving strict anaerobic conditions, but if it is a strain that is somewhat oxygen resistant, a system using anaerobic jars such as Gas Pack (BD BBL) and Anero Pack (Mitsubishi Gas Chemical) Alternatively, the plate can be sealed in a disposable bag with an oxygen scavenger such as Ageless using a food degassing and sealing system (in the dark for some time) and placed in light conditions. A tungsten lamp is usually used as the light source. Tungsten lamps have strong heat rays, so it is necessary to cultivate the culture light away from the light source or through a water layer. Near-infrared LEDs that generate less heat may be used as the light source. Since green sulfur bacteria originally grow in an environment that is not very bright, it is often preferable to irradiate weak light.
通常、選択開始から約1-2週間程度で耐性コロニーが得られる。得られた耐性クローン (形質転換体) が相同組み換え体 (bciD遺伝子欠損変異体) であることは、bciD遺伝子領域のゲノミックPCR及び/又はシークエンス解析により確認することができる。
得られた変異株は、5% DMSO又は15% グリセロールを含有する培地中で、凍結保存 (-70又は80℃以下) する。
Usually, resistant colonies are obtained in about 1-2 weeks from the start of selection. It can be confirmed by genomic PCR and / or sequence analysis of the bciD gene region that the resulting resistant clone (transformant) is a homologous recombinant (bciD gene-deficient mutant).
The obtained mutant strain is cryopreserved (−70 or 80 ° C. or lower) in a medium containing 5% DMSO or 15% glycerol.
このようにして得られたBChl e産生菌由来のbciD遺伝子欠損変異株は、クロリン骨格のC7位をホルミル化する能力を消失しているため、BChl eのC7位にメチル基を有するBChl cを産生する (図１を参照)。しかも、意外にも、このBChl c産生変異株は、親株であるBChl e産生菌におけるBChl e同族体の組成にかかわらず、C82位及びC121位のメチル化度の高い、高級BChl c分子種を高生産する。ここで「高級BChl c分子種」とは、C8位にイソブチル基又はネオペンチル基を有し、且つC12位にエチル基を有するBChl c同族体を意味する。尚、高級BChl c分子種はC31位におけるいずれの立体異性体 (R型又はS型) も包含される。また、C17位上の長鎖エステル基は、通常ファルネシル基であるが、フィチル基、ゲラニルゲラニル基、ジヒドロゲラニル基又はテトラヒドロゲラニル基であってもよい。 Since the bciD gene-deficient mutant derived from BChl e-producing bacteria thus obtained has lost the ability to formylate C7 position of the chlorin skeleton, BChl c having a methyl group at C7 position of BChl e Produce (see FIG. 1). Moreover, surprisingly, this BChl c-producing mutant is a higher BChl c molecule with a high degree of methylation at the C8 2 and C12 1 positions, regardless of the composition of the BChl e homologue in the parent BChl e producing bacterium. High production of seeds. Here, the “higher BChl c molecular species” means a BChl c homolog having an isobutyl group or a neopentyl group at the C8 position and an ethyl group at the C12 position. Incidentally, higher BChl c species are all stereoisomers at C3 1-position (R-type or S-type) are also encompassed. The long-chain ester group on the C17 position is usually a farnesyl group, but may be a phytyl group, a geranylgeranyl group, a dihydrogeranyl group, or a tetrahydrogeranyl group.
好ましくは、本発明のBChl c産生変異株は、C8位にイソブチル基を有し、且つC12位にエチル基を有するBChl c同族体 ([I,E]BChl c)、より好ましくはC31位におけるいずれの立体異性がS型である該BChl c同族体(S[I,E]BChl c) を主成分として産生する。本発明のBChl c産生変異株が産生する高級BChl c分子種の、クロロソームを構成するBChl全体に占める割合 (組成比) は、従来公知の天然にBChl cを産生するいずれの緑色硫黄細菌におけるそれよりも顕著に高い。高級BChl c分子種は、微弱光な培養条件において増量する色素であることから、クロロソームの光エネルギー捕集または伝達を効率化していると考えられており、人工光合成などへの応用において有用な素材となりうる。従って、本発明のBChl c産生変異株から高級BChl c分子種を単離することにより、従来よりも極めて効率よく、高級BChl c分子種及びそれらの自己会合体であるクロロソームを提供することができる。 Preferably, the BChl c producing mutant of the present invention has a BChl c homologue ([I, E] BChl c) having an isobutyl group at the C8 position and an ethyl group at the C12 position, more preferably the C3 1 position. The BChl c homologue (S [I, E] BChl c) in which any stereoisomer is in the S form is produced as the main component. The ratio (composition ratio) of the higher BChl c molecular species produced by the BChl c-producing mutant strain of the present invention to the total BChl constituting the chlorosome is the same as that in any conventionally known green sulfur bacterium producing BChl c. Remarkably higher than. High-grade BChl c molecular species are dyes that increase in low-light conditions, and are considered to be efficient in capturing or transmitting light energy of chlorosomes and are useful materials for applications such as artificial photosynthesis It can be. Therefore, by isolating the higher BChl c molecular species from the BChl c-producing mutant strain of the present invention, it is possible to provide the higher BChl c molecular species and chlorosomes that are self-associates thereof extremely efficiently than before. .
従って、本発明はまた、本発明のBChl c産生変異株を培地中で培養し、得られる培養物からBChl cを回収することを含む、BChl cの製造方法、並びに、前記培養物からクロロソームを回収することを含む、天然のBChl c産生緑色硫黄細菌由来のクロロソームと比較して高級BChl c分子種の組成比が高いクロロソームの製造方法を提供する。 Accordingly, the present invention also provides a method for producing BChl c, comprising culturing the BChl c-producing mutant strain of the present invention in a medium and recovering BChl c from the resulting culture, and chlorosomes from the culture. The present invention provides a method for producing chlorosomes having a higher composition ratio of higher BChl c molecular species as compared with chlorosomes derived from natural BChl c-producing green sulfur bacteria.
BChl c産生変異株の培養は、固形培地に代えて液体培地を用いる以外は、上記bciD遺伝子欠損変異株の選抜において用いたのと同様の方法により行うことができる。例えば、チオ硫酸塩を含む液体培地として、後述の実施例で使用されるCL培地 (Appl. Environ. Microbiol., 67; 2538-2544 (2001)) 等が好ましく用いられる。bciD遺伝子欠損変異株の選抜の際に用いた選択剤の添加は必須ではないが、導入された薬剤耐性遺伝子の脱落を防ぐために添加しておくことが望ましい。但し、選択剤の濃度は選択培地で用いたよりも低濃度とすることもできる。 The BChl c production mutant can be cultured by the same method as that used in the selection of the bciD gene-deficient mutant except that a liquid medium is used instead of the solid medium. For example, as a liquid medium containing thiosulfate, CL medium (Appl. Environ. Microbiol., 67; 2538-2544 (2001)) used in Examples described later is preferably used. Although it is not essential to add a selection agent used in selecting a bciD gene-deficient mutant, it is desirable to add it to prevent the introduced drug resistance gene from falling off. However, the concentration of the selective agent may be lower than that used in the selective medium.
本発明のBChl c産生変異株からのBChl cの抽出は、例えば、以下のようにして行うことができるが、当該技術分野で周知のいかなる方法も同様に使用可能である。
まず培養したBChl c産生変異株の菌体を、濾過もしくは遠心分離により回収する。窒素ガスを通気した嫌気的雰囲気下で、菌体にアセトン/メタノール混合溶媒を加えて攪拌した後、液相を回収し、色素が抽出されなくなるまで、残渣に対して同様の抽出操作を繰り返す。得られた抽出液を集め、エーテルと水で分液・洗浄した後、エーテル層を飽和食塩水で脱水・洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えてさらに脱水する。ロータリーエバポレーターで溶媒を留去する。残渣は窒素ガスを封入して冷凍保存したり、ジエチルエーテルやアセトンを溶媒として冷凍保存したりすることができる。いずれの場合も容器は遮光しておく。遮光、温度管理、嫌気状態の維持を徹底すれば、年単位の保存も可能である。
上記抽出操作で得られた色素から、カラムクロマトグラフィーや再結晶等によりカロテノイド色素を分離除去し、BChlを単離精製する。カラムとしてはSepharoseやセルロースを用いることができるが、Sepharoseの方が分離能は高い。BChl cはヘキサン等の無極性溶媒への溶解度が低いので、再結晶により容易に単離精製することができる。
Extraction of BChl c from the BChl c-producing mutant strain of the present invention can be performed, for example, as follows, but any method known in the art can be used as well.
First, the cultured cells of the BChlc-producing mutant strain are collected by filtration or centrifugation. Under an anaerobic atmosphere in which nitrogen gas is passed, an acetone / methanol mixed solvent is added to the cells and stirred, and then the liquid phase is recovered, and the same extraction operation is repeated on the residue until no pigment is extracted. The obtained extract is collected, separated and washed with ether and water, and then the ether layer is dehydrated and washed with saturated brine, and further dehydrated by adding anhydrous sodium sulfate. The solvent is distilled off on a rotary evaporator. The residue can be stored frozen by filling with nitrogen gas, or can be stored frozen using diethyl ether or acetone as a solvent. In either case, the container is shielded from light. If light shielding, temperature control, and maintenance of anaerobic conditions are thoroughly implemented, yearly storage is possible.
The carotenoid pigment is separated and removed from the pigment obtained by the above extraction operation by column chromatography, recrystallization or the like, and BChl is isolated and purified. Sepharose or cellulose can be used as the column, but Sepharose has a higher resolution. Since BChl c has low solubility in nonpolar solvents such as hexane, it can be easily isolated and purified by recrystallization.
上記のようにして単離されたBChl cは、例えば、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）等の分離技術を用いて、同族体の各分子種を分離・同定することができる。まず、抽出・単離したBChl cを，HPLCで使用する移動相溶媒に置換し、フィルター濾過した後、HPLCに注入する。濾過フィルター以外にも多種の前処理カートリッジが市販されており、カロテノイド色素の除去も同時に行うこともできる。移動相溶媒としては、メタノール：水 (90:10, v/v) やアセトニトリル：アセトン：水 (65:15:20, v/v/v) の混合溶媒等が用いられる。例えば、オクタデシルシリル（ODS）カラムを固定相とした逆相HPLCにより、C82位及びC121位におけるメチル化度の異なる一連のBChl c同族体を分離することができる。メチル化度が高い化合物ほど、その脂溶性が高くなるので、逆相HPLCでは溶出が遅くなる。また、31位における光学異性体も分離ができ、R型配置の方が溶出は早い。 BChl c isolated as described above can separate and identify homologous molecular species using, for example, a separation technique such as high performance liquid chromatography (HPLC). First, the extracted and isolated BChl c is replaced with a mobile phase solvent used in HPLC, filtered, and injected into HPLC. In addition to the filter, various pretreatment cartridges are commercially available, and carotenoid pigments can be removed at the same time. As the mobile phase solvent, a mixed solvent of methanol: water (90:10, v / v) or acetonitrile: acetone: water (65:15:20, v / v / v) is used. For example, a series of BChl c homologues having different degrees of methylation at C8 2- position and C12 1- position can be separated by reversed-phase HPLC using an octadecylsilyl (ODS) column as a stationary phase. A compound with a higher degree of methylation has higher fat solubility, and thus elution is delayed in reverse phase HPLC. Further, 3 optical isomer at position 1 can also be separated, who R type arrangement elution earlier.
光合成細菌に含まれるBChlは、それらに固有の吸収帯を有しているので、吸収スペクトルから容易に同定が行える。BChl c/d/eではQy帯の強度が低いので、ソーレー帯による識別が有効である。BChl cにおけるソーレー帯の吸収波長は435 nm前後 (溶媒の種類により多少変動する) であるため、当該波長における吸光度を測定することにより、HPLCで分離した各BChl c同族体を検出することができる。一方、BChl eにおけるソーレー帯の吸収波長は465 nm前後である。
高級BChl c分子種の各ピークに対応するフラクションを回収することにより、単一の高級BChl c分子種を取得することができる。
Since BChl contained in photosynthetic bacteria has an absorption band specific to them, it can be easily identified from the absorption spectrum. In BChl c / d / e, since the strength of the Qy band is low, discrimination by the Soray band is effective. Since the absorption wavelength of the Soret band in BChl c is around 435 nm (varies somewhat depending on the type of solvent), each BChl c homologue separated by HPLC can be detected by measuring the absorbance at that wavelength. . On the other hand, the absorption wavelength of the Soret band in BChle is around 465 nm.
By collecting the fraction corresponding to each peak of the higher BChl c molecular species, a single higher BChl c molecular species can be obtained.
一方、本発明のBChl c産生変異株のクロロソームは、該変異株の培養物から濾過もしくは遠心分離により回収した菌体を、例えば、フレンチプレス、リゾチーム処理、浸透圧ショック、超音波処理等により破砕し、遠心分離により未破砕細胞や大きな膜断片を除去した後、上清をショ糖密度勾配超遠心にかけ (例えば、40，42.5，45，47.5，50% (w/v) の段階勾配に上清をロードし、200,000×gで26-24時間の超遠心処理)、淡緑色の光合成膜画分のすぐ上層にある濃緑色の層を回収することにより、単離することができる (例えば、Arch. Microbiol., 124: 21 (1980) を参照)。
あるいは、上記のようにして単離したBChl c同族体の1種もしくは2種以上の分子種を、インビトロでクロロソームに再構成することができる。クロロソームの生体外の再構成は、BChl cの自己会合能力によって行うことできる。即ち、これらの色素を菌体から抽出した後に、低極性有機溶媒、水-有機溶媒の混合溶液、あるいは界面活性剤を有する水溶性中に置くことで、色素が自己集積してクロロソームが再構築される。
On the other hand, the chlorosome of the BChl c producing mutant strain of the present invention crushes the cells recovered from the mutant culture by filtration or centrifugation, for example, by French press, lysozyme treatment, osmotic shock, ultrasonic treatment, etc. After removing unbroken cells and large membrane fragments by centrifugation, the supernatant is subjected to sucrose density gradient ultracentrifugation (for example, to a step gradient of 40, 42.5, 45, 47.5, 50% (w / v)). Can be isolated by loading the Kiyo, ultracentrifugation at 200,000 xg for 26-24 hours) and collecting the dark green layer immediately above the pale green photosynthetic membrane fraction (e.g. Arch. Microbiol., 124: 21 (1980)).
Alternatively, one or more molecular species of BChl c homologs isolated as described above can be reconstituted into chlorosomes in vitro. In vitro reconstitution of chlorosomes can be performed by the self-association ability of BChl c. That is, after these pigments are extracted from the cells, they are placed in a low-polar organic solvent, water-organic solvent mixed solution, or water-soluble with a surfactant, so that the pigments self-assemble and chlorosomes are reconstructed. Is done.
既報のとおり、本発明者らは遺伝子改変可能なBChl e産生菌RK-j-1株を親株として、クロリン骨格のC20位のメチル化酵素をコードするbchU遺伝子を欠損させ、天然には見出されていないBChl fを産生する変異株を作製することに成功した。当該変異株は、Chlorobaculum limnaeum dbchU株と命名され、2012年1月12日付で、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、受託番号NITE P-1203として寄託されている。
Scientific Rep. (2012) 2: DOI: 10.1038/srep00671に示されるとおり、Cba. limnaeum dbchU株におけるBChl f同族体の組成は、親株であるRK-j-1株におけるBChl e同族体の組成と比較して、S[I,E]体こそ増加傾向にはあるものの、R[E,E]やR[P,E]といった低級BChl f分子種が依然として主成分であり、本発明のbciD遺伝子欠損株で観察されるような、顕著な同族体組成の高級分子種へのシフトは認められない。
図１に示すように、bciD遺伝子とbchU遺伝子とを欠損させた二重欠損変異株を作製すれば (本発明のbciD遺伝子欠損株を親株として、Scientific Rep. (2012) 2: DOI: 10.1038/srep00671に記載の方法に従い、bchU遺伝子を欠損させるか、あるいは、Cba. limnaeum dbchU株を親株として、上記の方法に従ってbciD遺伝子を欠損させることにより作製することができる)、BChl e産生菌を親株として、BChl d産生変異株が得られることになる。即ち、1つのBChl e産生菌株を基にして、BChl c/d/fの各産生変異株を作製することができる。ここで、bchU遺伝子の欠損によっては、BChlの同族体組成は大きく変動しないことから、BChl e産生菌のbciD/bchU二重欠損変異によるBChl d産生変異株もまた、本発明のBChl e産生変異株と同様、高級BChl d分子種が主成分となるように、同族体組成がシフトしていると考えられる。
従って、本発明はまた、天然のBChl d産生緑色硫黄細菌よりも効率よく、高級BChl d分子種を製造する方法、並びに、天然のBChl d産生緑色硫黄細菌由来のクロロソームよりも、高級BChl d分子種の組成比が高いクロロソームの製造方法を提供する。ここで「高級BChl d分子種」の定義は、BChl c同族体におけるそれと同様である。
As already reported, the present inventors made the genetically modified BChle-producing RK-j-1 strain a parent strain, deleted the bchU gene encoding the methylation enzyme at the C20 position of the chlorin skeleton, and found it in nature. We have succeeded in producing a mutant that produces BChl f. The mutant strain was named Chlorobaculum limnaeum dbchU strain, and on January 12, 2012, the National Institute for Product Evaluation Technology Patent Microorganisms Deposit Center (2-5-8 Kazusa Kamashika, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan) The deposit number is NITE P-1203.
Scientific Rep. (2012) 2: As shown in DOI: 10.1038 / srep00671, the composition of the BChl f homologue in the Cba. Limnaeum dbchU strain is compared with the composition of the BChl e homologue in the parent strain RK-j-1. Although the S [I, E] body tends to increase, the lower BChl f molecular species such as R [E, E] and R [P, E] are still the main components, and the bciD gene deficiency of the present invention There is no noticeable shift to higher molecular species of homologous composition as observed in strains.
As shown in FIG. 1, if a double-deficient mutant strain in which the bciD gene and the bchU gene are deleted is prepared (Scientific Rep. (2012) 2: DOI: 10.1038 / srep00671 in accordance with the method described in srep00671, or the Cba.limnaeum dbchU strain can be used as a parent strain, and the bciD gene can be deleted in accordance with the method described above) BChl d production mutants will be obtained. That is, each BChl c / d / f production mutant can be prepared based on one BChl e-producing strain. Here, since the homolog composition of BChl does not vary greatly depending on the deficiency of the bchU gene, the BChl d-producing mutant due to the bciD / bchU double-deficient mutation of the BChl e-producing bacterium is also a BChl e-producing mutation of the present invention. Like the strain, the homologue composition is thought to have shifted so that the higher BChl d molecular species are the main component.
Accordingly, the present invention also provides a method for producing higher BChl d molecular species more efficiently than natural BChl d producing green sulfur bacteria, as well as higher BChl d molecules than chlorosomes derived from natural BChl d producing green sulfur bacteria. A method for producing a chlorosome having a high composition ratio of species is provided. Here, the definition of “higher BChl d molecular species” is the same as that in the BChl c homologue.
以下、実施例により本発明をさらに説明するが、本発明はいかなる意味においてもこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention further, this invention is not limited to these in any meaning.
以下の参考例及び実施例において、緑色硫黄細菌の培養は、下記組成のCL培地及びCPプレートを用いて行った。
・CL 培地 (液体培地):
1 Lあたり20 mLの塩類A (0.64 g Na2EDTA・2H2O, 10 g MgSO4・7H2O, 2.5 g CaCl2・2H2O, 20 g NaCl / 1 L)、20 mLの塩類B (25 g CH3COONH4, 20 g NH4Cl, 115 g Na2S2O3・5H2O / 1 L)、20 mLのCL/CPバッファー (25 g KH2PO4, 115 g MOPS［3-{N-モルフォリノ}プロパンスルホン酸］/ 1 L)、1 mLの微量元素溶液(5.2 g 2Na・EDTA, 0.19 g CoCl2・6H2O, 0.1 g MnCl2・4H2O, 1.5 g FeCl2・4H2O, 0.006 g H3BO3, 0.017 g CuCl2・2H2O, 0.188 g Na2MoO4・2H2O, 0.025 g NiCl2・6H2O, 0.07 g ZnCl2, 0.03 g VOSO4, 0.002 g Na2WO4・2H2O, 0.002 g Na2HSeO3 / 1 L)、50 μLのレサズリン (10 mg/mL)、20 μLのビタミンB12（1 mg/mL）を加え、蒸留水で1 Lにメスアップする。121℃で約20分間オートクレーブした後、濾過滅菌した50 mLのNa2S 9H2O/NaHCO3溶液 (0.6 g Na2S 9H2O, 2.0g NaHCO3/ 50 mL)を加え、pHを6.9-7.0に調整する。
・CP プレート（固形培地）：
1 Lあたり20 mLの塩類A、20 mLの塩類B、1 mLの微量元素溶液、50 μLの10 mg/mL レサズリン、20 μLのビタミンB12および0.36 ｇのL-システインを加え、10 M NaOHでpHを7.6に調整し、15ｇの寒天（Bacto AgarTM）を加えて121℃で約20分間オートクレーブし、50℃に冷却して培養皿に分注・固化した後、嫌気性チャンバー内に移動させる（L-システインの過剰な酸化を防ぐため、オートクレーブ後60分以内に操作する）。
In the following Reference Examples and Examples, green sulfur bacteria were cultured using a CL medium and a CP plate having the following composition.
・ CL medium (liquid medium):
20 mL of salt A (0.64 g Na 2 EDTA · 2H 2 O, 10 g MgSO 4 · 7H 2 O, 2.5 g CaCl 2 · 2H 2 O, 20 g NaCl / 1 L) per liter, 20 mL of salt B (25 g CH 3 COONH 4 , 20 g NH 4 Cl, 115 g Na 2 S 2 O 3・ 5H 2 O / 1 L), 20 mL CL / CP buffer (25 g KH 2 PO 4 , 115 g MOPS [ 3- {N-morpholino} propanesulfonic acid] / 1 L), 1 mL trace element solution (5.2 g 2Na · EDTA, 0.19 g CoCl 2 · 6H 2 O, 0.1 g MnCl 2 · 4H 2 O, 1.5 g FeCl 2・ 4H 2 O, 0.006 g H 3 BO 3 , 0.017 g CuCl 2・ 2H 2 O, 0.188 g Na 2 MoO 4・ 2H 2 O, 0.025 g NiCl 2・ 6H 2 O, 0.07 g ZnCl 2 , 0.03 g VOSO 4, 0.002 g Na 2 WO 4 · 2H 2 O, 0.002 g Na 2 HSeO 3/1 L), of 50 [mu] L resazurin (10 mg / mL), 20 μL of vitamin B 12 the (1 mg / mL) was added, Make up to 1 L with distilled water. After autoclaving approximately 20 minutes at 121 ° C., filter sterilized 50 mL of Na 2 S 9H 2 O / NaHCO 3 solution (0.6 g Na 2 S 9H 2 O, 2.0g NaHCO 3/50 mL) was added and the pH 6.9 Adjust to -7.0.
・ CP plate (solid medium):
Add 20 mL salt A, 20 mL salt B, 1 mL trace element solution, 50 μL 10 mg / mL resazurin, 20 μL vitamin B 12 and 0.36 g L-cysteine per liter, and add 10 M NaOH Adjust the pH to 7.6, add 15 g of agar (Bacto Agar TM ), autoclave at 121 ° C for about 20 minutes, cool to 50 ° C, dispense into a culture dish and solidify, then move into an anaerobic chamber (Operate within 60 minutes after autoclaving to prevent excessive oxidation of L-cysteine).
参考例１ Chlorobaculum limnaeum RK-j-1株の作製
BChl eを産生Chlorobaculum limnaeum 1549株（立命館大学薬学部生物有機化学研究室を経由し、久留米大学医学部医化学講座で保存されている株）を約10年間継代培養を繰り返すことで、積極的に自発的な変異を促した。培養はスクリューキャップ付きの試験管中にCL培地を入れ、30℃、光照射下において行った。十分な生育に達した後に、室温暗所に置いた。3-6か月の周期で継代し、1年間ほどの間隔でCPプレート上にて生育させて、コロニーを形成させた。なお、プレート培養は嫌気ジャー内でH2/CO2発生ガスパック等を用いて行った。
該継代培養物から、他のコロニーよりも生育が早いものを2種類選抜し、それぞれをRK-j-1株およびRK-j-2株と命名した。これら2つの株に対して、自然形質転換法(natural transformation)を行い、遺伝子操作可能な株の選抜を行った。遺伝子改変領域として、BChl eのC20位にメチル基を転移すると考えられた酵素遺伝子bchUを選んだ。Chlorobaculum limnaeum 1549株からクローニングしたbchUの大部分を、aacC1と入れ替えたプラスミドpUSbchUGm (Scientific Rep. (2012) 2: DOI: 10.1038/srep00671) をRK-j-1株またはRK-j-2株と混合し、薬剤添加なしのCPプレートにスポットして、嫌気ジャー内で３０℃で3-7日間生育させた。そのスポットを掻きとってCL液体培地に懸濁し、ゲンタマイシンが添加されたプレート（最終濃度50μg/mL）にスプレッドした。7-14日後プレートを確認したところ、RK-j-1株とplasmidを混ぜたものだけにコロニーの形成が確認された。そのコロニーをゲンタマイシンが添加されたCL液体培地（最終濃度50μg/mL）で培養を行い、ゲノムDNAを抽出してPCR法によってbchU遺伝子を含む周辺遺伝子の増幅を行った。PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、bchU遺伝子領域に、aacC1が挿入されていると考えられるサイズのバンドが検出された。
以上より、Chlorobaculum limnaeum 1549株の長期継代培養により得られたRK-j-1株は、遺伝子改変可能な新菌株であることが確認された。RK-j-1株は、下記の条件にて培養、長期保存が可能である。
(1) 培養条件
嫌気性チャンバー内、30℃の温度で、純窒素置換した偏性嫌気条件下で培養する。
(2) 長期保存条件
5% DMSO又は15% グリセロールを含有する培地中で、凍結保存 (-80℃以下) する。
Reference Example 1 Preparation of Chlorobaculum limnaeum RK-j-1 strain
BChl e producing Chlorobaculum limnaeum strain 1549 (strained by Biomedical Chemistry Laboratory, Ritsumeikan University School of Medicine, Kurume University School of Medicine) Urged mutation. Culturing was performed by placing CL medium in a test tube with a screw cap and irradiating at 30 ° C. with light. After reaching full growth, it was left in the dark at room temperature. The cells were subcultured at a cycle of 3-6 months and grown on a CP plate at intervals of about one year to form colonies. The plate culture was performed in an anaerobic jar using an H 2 / CO 2 generating gas pack or the like.
From the subculture, two types that grew faster than the other colonies were selected and named RK-j-1 strain and RK-j-2 strain, respectively. These two strains were subjected to natural transformation to select strains that can be genetically manipulated. As the gene modification region, the enzyme gene bchU, which was thought to transfer a methyl group to the C20 position of BChle, was selected. Plasmid pUSbchUGm (Scientific Rep. (2012) 2: DOI: 10.1038 / srep00671), in which most of bchU cloned from Chlorobaculum limnaeum 1549 was replaced with aacC1, was mixed with RK-j-1 or RK-j-2 Then, it was spotted on a CP plate with no drug added, and grown in an anaerobic jar at 30 ° C. for 3-7 days. The spots were scraped and suspended in a CL liquid medium and spread on a plate (final concentration 50 μg / mL) containing gentamicin. After 7 to 14 days, the plate was checked, and only the mixture of RK-j-1 strain and plasmid was confirmed to form colonies. The colonies were cultured in CL liquid medium (final concentration 50 μg / mL) supplemented with gentamicin, genomic DNA was extracted, and surrounding genes including the bchU gene were amplified by PCR. As a result of agarose gel electrophoresis of the PCR product, a band having a size considered to have aacC1 inserted in the bchU gene region was detected.
From the above, it was confirmed that the RK-j-1 strain obtained by long-term subculture of Chlorobaculum limnaeum strain 1549 is a new strain that can be genetically modified. The RK-j-1 strain can be cultured and stored for a long time under the following conditions.
(1) Culture conditions Culture in anaerobic chamber at 30 ° C under obligate anaerobic conditions with pure nitrogen substitution.
(2) Long-term storage conditions
Store in a medium containing 5% DMSO or 15% glycerol frozen (-80 ° C or lower).
実施例１ BChl e産生菌におけるC7位ホルミル化に関与する遺伝子bciDの同定
ゲノム情報が公開されているBChl eを有する緑色硫黄細菌、Chlorobium phaeobacteroides BS-1、Chlorobium phaeobacteroides DSM266およびPelodictyon phaeoclathratiforme BU-1と、その他の緑色硫黄細菌を含めた光合成細菌の数種類の配列情報をもとに、比較ゲノム解析プログラムCCCT (H. Ito et al. (2008) J. Biol. Chem., 283: 9002-9011) を用いて、BChl eをもつ緑色硫黄細菌にのみ特有の遺伝子の候補をいくつか見出した。その中で、ラジカルSAMファミリーに属する酵素をコードすると目される遺伝子に着目した。この遺伝子をbciDと命名した。一方で、Cba. limnaeum RK-j-1株のゲノムの解読を行い、ドラフト状態のヌクレオチド配列情報を得た。この配列の中から、上記のbciDと相同性のある遺伝子を検索した結果、配列番号１に示されるORFが見出された。
Example 1 Identification of a gene bciD involved in C7-formylation in BChl e-producing bacteria Based on the sequence information of several types of photosynthetic bacteria including other green sulfur bacteria, the comparative genome analysis program CCCT (H. Ito et al. (2008) J. Biol. Chem., 283: 9002-9011) Using it, we found several candidate genes that are unique only to green sulfur bacteria with BChl e. Among them, we focused on genes that are expected to encode enzymes belonging to the radical SAM family. This gene was named bciD. On the other hand, the genome of the Cba. Limnaeum RK-j-1 strain was decoded to obtain nucleotide sequence information in the draft state. As a result of searching for a gene having homology with the above bciD from this sequence, the ORF shown in SEQ ID NO: 1 was found.
実施例２ ターゲッティングプラスミドの作製
Cba. limnaeum RK-j-1株のbciD領域の大部分を、遺伝子改変法による相同組み換えで欠損させるために、変異導入用のプラスミドpTAbciDSmを、以下のように構築した。
最初に、ストレプトマイシンとスペクチノマイシンの耐性遺伝子aadAを含む領域を、pHP45Ωプラスミド (P. Prentki and H.M. Krisch (1984) Gene, 29: 303-313) をテンプレートとしてPCRによって増幅した。この時、aadA-Fプライマー (5’-CTGTTCGGTTCGTAAGCTGT-3’；配列番号３) とaadA-Rプライマー (5’-CGTCGGCTTGAACGAATTGT-3’；配列番号４) を用いた。
次にCba. limnaeum RK-j-1株のゲノムDNAをテンプレートとし、(i) bciD-F (5’-TCACTGTTATGTTGTCGGGTA-3’；配列番号５) と(ii) bciD-R (5’-GGTAAGCACCTATGCCGAAA-3’；配列番号６) のプライマーセットを用いたPCRによって、bciD遺伝子領域を含む1.99 kbpの増幅DNA断片を得た。その断片を、T-ベクターであるpTA2 (TOYOBO, Japan)のTAクローニングサイトにクローニングし、pTA2-bciDプラスミドを得た。このpTA2-bciDプラスミドのbciDの内側の大部分を取り除くため、このプラスミドをテンプレートとしたPCRを、(iii) bciD-inf-Fプライマー (5’-TCGTTCAAGCCGACGTCTTGCCAAGGATCATCGTC-3’；配列番号７) と、(iv) bciD-inf-Rプライマー (5’-TTACGAACCGAACAGTTGTTAACCGTCACCTTGGC-3’；配列番号８) とを用いて行った (プライマーの方向は図２Ａを参照)。これらのプライマー配列のアンダーラインは、引き続き行うIn-Fusionクローニングのために、上記のaadA-RプライマーとaadA-Fプライマーの配列とそれぞれオーバーラップするように設計した。よって、結果として増幅されたPCR断片と、上述のaadA-FとaadA-Rにて増幅したaadA遺伝子を含む断片とを、In-Fusion (登録商標) HD Cloning Kit (Clontech, USA)を用いてライゲーションを行い、pTAbciDSmプラスミドを完成させた。
Example 2 Preparation of targeting plasmid
In order to delete most of the bciD region of the Cba. Limnaeum RK-j-1 strain by homologous recombination by a genetic modification method, a plasmid pTAbciDSm for mutagenesis was constructed as follows.
First, a region containing the streptomycin and spectinomycin resistance genes aadA was amplified by PCR using a pHP45Ω plasmid (P. Prentki and HM Krisch (1984) Gene, 29: 303-313) as a template. At this time, an aadA-F primer (5′-CTGTTCGGTTCGTAAGCTGT-3 ′; SEQ ID NO: 3) and an aadA-R primer (5′-CGTCGGCTTGAACGAATTGT-3 ′; SEQ ID NO: 4) were used.
Next, using the genomic DNA of Cba. Limnaeum RK-j-1 strain as a template, (i) bciD-F (5'-TCACTGTTATGTTGTCGGGTA-3 '; SEQ ID NO: 5) and (ii) bciD-R (5'-GGTAAGCACCTATGCCGAAA- A 1.99 kbp amplified DNA fragment containing the bciD gene region was obtained by PCR using the primer set of 3 ′; SEQ ID NO: 6). The fragment was cloned into the TA cloning site of the T-vector pTA2 (TOYOBO, Japan) to obtain the pTA2-bciD plasmid. In order to remove most of the inside of bciD of this pTA2-bciD plasmid, PCR using this plasmid as a template was performed by (iii) bciD-inf-F primer (5′- TCGTTCAAGCCGACG TCTTGCCAAGGATCATCGTC-3 ′; SEQ ID NO: 7), (iv) bciD-inf-R primer (5′- TTACGAACCGAACAG TTGTTAACCGTCACCTTGGC-3 ′; SEQ ID NO: 8) was used (refer to FIG. 2A for primer orientation). The underlines of these primer sequences were designed to overlap with the sequences of the aadA-R and aadA-F primers, respectively, for subsequent In-Fusion cloning. Therefore, the amplified PCR fragment and the fragment containing the aadA gene amplified by the above-mentioned aadA-F and aadA-R were used with In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Clontech, USA). Ligation was performed to complete the pTAbciDSm plasmid.
Cba. limnaeum RK-j-1株の遺伝子破壊は、Scientific Rep. (2012) 2: DOI: 10.1038/srep00671に記載の方法に従い行った。制限酵素EcoRIにて消化したpTAbciDSmを100 μg用いて自然形質転換法を実施し、相同組み換えによりbciD遺伝子が欠損した株のコロニーを、100 μg/mLのストレプトマイシンと150 μg/mLのスペクチノマイシンを含む選択CPプレート培地を用いて得た。変異導入の確認は、(v) bciD-comf-Fプライマー (5’-CATCATAGGGGGGCAATAGA-3’；配列番号９) と、(vi) bciD-comf-R プライマー (5’-CTTGCCCGGAGAAGGATTAT-3’；配列番号１０) とを用いたPCRによって行った。薬剤耐性コロニーをCL培地にて培養し、ゲノムDNAを抽出してPCR法によってbciD遺伝子を含む周辺遺伝子の増幅を行った。PCR産物のアガロースゲル電気泳動を行った結果、野生株では、PCR産物はEcoRVサイトをもつため、切断されて1.36と0.78 kbpのサイズのDNAバンドが検出されたが (図２Ｂ、レーン2)(野生株のPCR産物の未処理のサイズは2.14 kbpである (レーン1))、bciD遺伝子欠損株のものはEcoRVサイトが無いため、消化されずにもとと同じ2.22 kbpのDNAバンドが検出された (レーン3, 4)。従って、形質転換体のbciD遺伝子領域に、aadAが挿入されていることが予想された。さらなる変異導入の確認のために、そのPCR増幅配列を、DNAシークエンサーABI PRISM (登録商標) 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) を用いて決定し、aadA遺伝子の挿入を確認した。 The gene disruption of Cba. Limnaeum RK-j-1 strain was performed according to the method described in Scientific Rep. (2012) 2: DOI: 10.1038 / srep00671. A natural transformation method was performed using 100 μg of pTAbciDSm digested with the restriction enzyme EcoRI, and a colony of a strain deficient in the bciD gene by homologous recombination was transformed into 100 μg / mL streptomycin and 150 μg / mL spectinomycin. Obtained using selective CP plate medium containing. Confirmation of mutagenesis was carried out by (v) bciD-comf-F primer (5'-CATCATAGGGGGGCAATAGA-3 '; SEQ ID NO: 9) and (vi) bciD-comf-R primer (5'-CTTGCCCGGAGAAGGATTAT-3'; SEQ ID NO: 10). Drug-resistant colonies were cultured in CL medium, genomic DNA was extracted, and surrounding genes including bciD gene were amplified by PCR. As a result of agarose gel electrophoresis of the PCR product, since the PCR product has an EcoRV site in the wild strain, it was cleaved and DNA bands of 1.36 and 0.78 kbp in size were detected (FIG. 2B, lane 2) ( The untreated size of the wild-type PCR product is 2.14 kbp (lane 1)), and the bciD gene-deficient strain has no EcoRV site, so the same 2.22 kbp DNA band is detected without digestion. (Lanes 3, 4). Therefore, it was predicted that aadA was inserted into the bciD gene region of the transformant. For further confirmation of mutagenesis, the PCR amplification sequence was determined using the DNA sequencer ABI PRISM (registered trademark) 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) to confirm the insertion of the aadA gene.
実施例４ HPLCによるbciD遺伝子欠損株の色素組成分析
実施例３で得られたbciD遺伝子欠損株から常法にて色素を抽出し、HPLCによって分析した。使用したHPLCの装置及び条件は以下の通りである。
カラム：Cosmosil 5C18-AR-II (4.6 f x 150 mm, Nacalai Tesque, Japan)
溶媒：アセトニトリル:アセトン:水 (65:15:20, v/v/v)
流速：1.0 mL/min
検出波長：415及び435 nm (BChl c), 465 nm (BChl e)
機器：SCL-10Avp system controller, LC-10ADvp pump, and SPD-M10Avp photodiode-array detector (Shimadzu, Japan)
その結果、野生株のBChl eとは異なる位置に色素のピーク群が検出された (図３Ａ、(b)及び(c))。さらに、BChl cを有するCba. tepidumからの抽出色素を分析して比較した結果、欠損株の色素のピーク群はCba. tepidumのBChl c同族体のピーク群 (図３Ａ、(a))と一致し、R型/C-8位エチル/C-12位エチル(R[E,E]) BChl c (ピーク2)、S型/C-8位エチル/C-12位エチル(S[E,E]) BChl c (ピーク3)、R型/C-8位プロピル/C-12位エチル(R[P,E]) BChl c (ピーク4)、S型/C-8位プロピル/C-12位エチル(S[P,E]) BChl c (ピーク5)、R型/C-8位イソブチル/C-12位エチル(R[I,E]) BChl c (ピーク6) 並びにS型/C-8位イソブチル/C-12位エチル(S[I,E]) BChl c (ピーク7) であるこが分かった (図３Ａ、(b))。このことから、bciD遺伝子欠損株はBChl cを合成していることが確認されたが、その組成はCba. tepidumとは大きく異なり、Cba. tepidumではR[E,E]BChl c (ピーク2；図３Ｂ左) が主成分であり、S[I,E]BChl c (ピーク7；図３Ｂ右) は微量成分であるのに対して、欠損株はS[I,E]BChl cが主成分であるという特徴を示した。また、bciD欠損株からはBChl eが一切検出されなかった。これらのことから、bciDはBChl eのC7位のホルミル化に関与する遺伝子であることが実証された。
Example 4 Dye composition analysis of bciD gene deficient strain by HPLC Dye was extracted from the bciD gene deficient strain obtained in Example 3 by a conventional method and analyzed by HPLC. The HPLC equipment and conditions used are as follows.
Column: Cosmosil 5C18-AR-II (4.6 fx 150 mm, Nacalai Tesque, Japan)
Solvent: Acetonitrile: Acetone: Water (65:15:20, v / v / v)
Flow rate: 1.0 mL / min
Detection wavelength: 415 and 435 nm (BChl c), 465 nm (BChl e)
Equipment: SCL-10Avp system controller, LC-10ADvp pump, and SPD-M10Avp photodiode-array detector (Shimadzu, Japan)
As a result, a pigment peak group was detected at a position different from the wild-type BChle (FIGS. 3A, (b) and (c)). Furthermore, as a result of analyzing and comparing the extracted pigment from Cba. Tepidum having BChl c, the peak group of the pigment of the deficient strain is identical to the peak group of the BChl c homologue of Cba. Tepidum (FIG. 3A, (a)). R type / C-8 position ethyl / C-12 position ethyl (R [E, E]) BChl c (peak 2), S type / C-8 position ethyl / C-12 position ethyl (S [E, E]) BChl c (Peak 3), R type / C-8 position propyl / C-12 position ethyl (R [P, E]) BChl c (Peak 4), S type / C-8 position propyl / C- 12-position ethyl (S [P, E]) BChl c (peak 5), R-type / C-8-position isobutyl / C-12-position ethyl (R [I, E]) BChl c (peak 6) and S-type / C-8 position isobutyl / C-12 position ethyl (S [I, E]) BChl c (peak 7) was found (FIG. 3A, (b)). From this, it was confirmed that the bciD gene-deficient strain synthesized BChl c, but its composition was significantly different from that of Cba. Tepidum. In Cba. Tepidum, R [E, E] BChl c (peak 2; Fig. 3B left) is the main component, S [I, E] BChl c (peak 7; Fig. 3B right) is a minor component, whereas the deficient strain has S [I, E] BChl c as the main component. It showed the feature of being. Further, no BChl e was detected from the bciD-deficient strain. These facts demonstrated that bciD is a gene involved in formylation at position C7 of BChl e.
本発明によれば、BChl eを産生する緑色硫黄細菌を親株としてBChl c/d/fを産生する変異株を遺伝子改変により容易に作製することが可能となる。これらの変異株は、親株と同様の培養条件にて培養することができるので、一定の培養条件でクロリン骨格を有する4種のBChlを一括して産生させることができ、様々な機能を持つクロロソームを容易に形成させることが可能である。かかるクロロソームを生体外に取り出して利用することで、光エネルギーの捕獲、光エネルギーの利用の分野での貢献が期待される。このような観点から、クロロソームを対象とした緑色硫黄細菌の利用は、ナノサイエンス、ナノテクノロジーの現実的で、かつ利用価値の高い実験系を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to easily produce a mutant strain producing BChl c / d / f by genetic modification with a green sulfur bacterium producing BChl e as a parent strain. Since these mutant strains can be cultured under the same culture conditions as the parent strain, it is possible to produce 4 types of BChl with a chlorin skeleton under certain culture conditions, and chlorosomes with various functions. Can be easily formed. By taking out and using such chlorosomes outside the living body, contributions in the fields of light energy capture and light energy utilization are expected. From this point of view, the utilization of green sulfur bacteria targeting chlorosomes can provide a realistic and highly useful experimental system for nanoscience and nanotechnology.
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の特許請求の範囲の精神及び範囲に包含されるすべての変更を含むものである。 While the invention has been described with emphasis on preferred embodiments, it will be apparent to those skilled in the art that the preferred embodiments can be modified. The present invention contemplates that the present invention may be practiced otherwise than as specifically described herein. Accordingly, this invention includes all modifications encompassed within the spirit and scope of the appended claims.
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。 The contents of all publications, including the patents and patent application specifications mentioned herein, are hereby incorporated by reference herein to the same extent as if all were expressly cited. .
Claims (7)
(a) 該緑色硫黄細菌がクロロバキュラム・リムナエウム（Chlorobaculum limnaeum）RK-j-1株（受託番号：NITE BP-1202）の場合、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を含む遺伝子
(b) 該緑色硫黄細菌がクロロバキュラム・リムナエウムRK-j-1株以外の菌株の場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子であり、かつ欠損させた場合に該菌株がBChl cを産生する、遺伝子 A BChl c producing mutant strain in which the following gene is deleted in a green sulfur bacterium producing BChl e.
(a) a gene comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 when the green sulfur bacterium is Chlorobaculum limnaeum RK-j-1 strain (accession number: NITE BP-1202)
(b) a gene encoding an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 when the green sulfur bacterium is a strain other than the chlorobacrum rimnaeum RK-j-1 strain And the gene that produces the strain BChl c when deleted.
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