KR102163257B1 - Novel microalgae having high productivity for violaxanthin - Google Patents

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KR102163257B1
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김희식
이용재
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조대현
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한국생명공학연구원
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Abstract

The present invention relates to novel Chlorella sp. HS-V microalgae having a faster growth rate and an increased productivity of violaxanthin compared to other existing microalgae known to be capable of producing violaxanthin. The novel Chlorella sp. HS-V microalgae can be cultured in both seawater and freshwater conditions with high productivity of biomass. It is also possible to increase a high content of violaxanthin with high efficiency by using the Chlorella sp. HS-V microalgae of the present invention, which can be used for industrial mass production of violaxanthin.

Description

비올라잔틴 생산성이 높은 신규 미세조류{Novel microalgae having high productivity for violaxanthin}Novel microalgae having high productivity for violaxanthin {Novel microalgae having high productivity for violaxanthin}

본 발명은 성장속도가 빠르고, 높은 비올라잔틴 함량을 특징으로 하는 신규한 클로렐라 속 미세조류에 관한 것이다.The present invention relates to a novel chlorella genus microalgae characterized by a fast growth rate and a high violaxanthin content.

비올라잔틴(violaxanthin)은 카로테노이드 계열 색소의 일종으로, 오렌지색을 나타내며 주로 고등한 동식물계에 포함되어 있거나, 녹조류, 규조류에 널리 분포되어 있다. 카로테노이드 색소는 C-40 이소프레노이드 화합물로, 항산화 활성을 갖는 것으로 알려져 있으며 인체 내에서 비타민 A의 전구체로 기능할 수 있다. 또한, 산화 방지 효과, 유해산소의 제거, 암의 증식이나 발생을 억제하는 효과가 있음이 알려져 있는데, 상기와 같은 카로테노이드 색소 중에서도 비올라잔틴은 항염증 효과나 피부탄력을 개선하여 피부의 주름을 개선하는 효능이 있다.Violaxanthin (violaxanthin) is a kind of carotenoid-based pigment, it has an orange color and is mainly included in the higher animal and plant world, or is widely distributed in green algae and diatoms. The carotenoid pigment is a C-40 isoprenoid compound, known to have antioxidant activity, and can function as a precursor of vitamin A in the human body. In addition, it is known that it has an antioxidant effect, removal of harmful oxygen, and an effect of inhibiting the proliferation or occurrence of cancer. Among the carotenoid pigments, violaxanthin is an anti-inflammatory effect or improves skin elasticity to improve skin wrinkles. It is effective.

상업적으로 판매되는 카로테노이드 색소의 경우 대부분 화학적인 방법을 통해 합성되고 있으며, 생물학적 방법을 통해 일부 당근과 같은 식물로부터 유래하는 카로테노이드의 생산이 이루어지기도 하나 이러한 방법에 의해 생산된 카로테노이드는 가격이 매우 비싼 단점이 있다.Most commercially sold carotenoid pigments are synthesized through chemical methods, and some carotenoids derived from plants such as carrots are produced through biological methods, but carotenoids produced by these methods are very expensive. There is this.

한편, 미세조류는 종마다 세포벽 내부에 특유의 생리활성 물질을 함유하고 있어 배양 환경을 조절함에 따라 특정 물질의 대량 생산이 가능한 특성이 있는데, 이러한 미세조류를 이용한 특정 물질들의 생산 방법에 관한 연구가 진행되어 오고 있으며, 미세조류를 이용한 유용물질의 산업적 생산 시도가 계속되고 있다. 상기에서 설명한 것과 같이 다양한 용도로 이용될 수 있는 비올라잔틴의 경우에도, 비올라잔틴을 생성할 수 있는 특성이 있는 몇몇 미세조류 종들이 밝혀져 있으며, 이들로부터 생물학적 방법을 통해 비올라잔틴을 합성하여 이용할 수 있다. 종래에는 대표적으로 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.)의 미세조류가 비올라잔틴을 생산하는 것으로 알려져 있으며, Myrmecia bisecta, 클로렐라 속 HS2(기탁번호 KCTC 13108BP) 등의 미세조류가 비올라잔틴 생산성을 가지는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기와 같은 기존의 비올라잔틴 생산 미세조류의 경우 세포의 성장속도가 느리며 대량 배양 과정의 어려움이 존재하므로, 비올라잔틴을 산업적 목적으로 대량 생산하기 위해 상기 미세조류들을 이용하는 것은 불가능하다는 문제점이 있다.On the other hand, microalgae contain unique physiologically active substances inside the cell wall for each species, so it is possible to mass-produce specific substances by controlling the culture environment. Research on the production method of specific substances using these microalgae Progress has been made, and attempts to industrially produce useful substances using microalgae are continuing. In the case of violaxanthin, which can be used for various purposes, as described above, several microalgal species having the property of producing violaxanthin have been discovered, and violaxanthin can be synthesized and used from them through biological methods. . Conventionally, it is known that microalgae of the genus Nannochloropsis sp. typically produce violaxanthin, and microalgae such as Myrmecia bisecta and HS2 of the genus Chlorella (accession number KCTC 13108BP) have violaxanthin productivity. Is known. However, in the case of conventional violaxanthin-producing microalgae as described above, the growth rate of cells is slow and there is a difficulty in mass culturing, so there is a problem that it is impossible to use the microalgae to mass-produce violaxanthin for industrial purposes. .

미세조류를 이용한 비올라잔틴의 생산 과정에 상기와 같은 문제점이 존재하는바, 다양한 배양 조건에서도 빠른 성장속도를 가지고 성장할 수 있어 배양이 쉽고 바이오매스 생산성이 우수하면서도, 카로테노이드 색소 중에서도 비올라잔틴의 생산성이 우수한 새로운 미세조류의 개발이 필요한 실정이다. 또한, 산업적 목적으로 미세조류를 이용하기 위해서는 반복적이고 지속적인 배양 과정을 거치더라도 미세조류들이 일정 수준의 세포 수를 유지하거나 증가하여 성장할 수 있는 특성이 있어야 하는바, 비올라잔틴을 생물학적 방법을 통해 대량으로 생산하기 위해서는 상기와 같은 특징들이 모두 포함된 미세조류가 이용되어야 한다.The above problems exist in the production process of violaxanthin using microalgae.Since it can be grown with a fast growth rate under various culture conditions, it is easy to cultivate and biomass productivity is excellent, while violaxanthin has excellent productivity among carotenoid pigments. There is a need to develop new microalgae. In addition, in order to use microalgae for industrial purposes, the microalgae must maintain or increase the number of cells at a certain level to grow even through repeated and continuous cultivation processes. Violaxanthin is used in large quantities through biological methods. In order to produce, microalgae containing all of the above characteristics must be used.

한편, 클로렐라 속(Chlorella sp.)의 미세조류는 녹조류로 분류되며 광합성 능력이 우수하여 성장과 증식속도가 빠른 특성이 있는 것으로, 클로렐라 세포에는 단백질, 지방 성분들이나 색소, 미네랄, 비타민 성분 등 유용한 성분이 다량 함유되어 있으므로, 사람이 영양소의 섭취를 위해 이용하거나 동물의 먹이로 이용되는 등 대표적인 식용 미세조류에 해당한다. 특히, 클로렐라는 바이오디젤을 생산하기 위한 용도로 이용될 수 있고, 인체에 유용한 루테인과 같은 색소를 포함하는 유용물질들을 생산할 수 있는 미세조류에 해당하므로, 성장속도가 빠른 클로렐라 속 미세조류를 이용한 유용 물질의 대량 생산 시도 및 연구도 활발히 진행되어 오고 있다.On the other hand, microalgae of the genus Chlorella sp. are classified as green algae, and have excellent photosynthetic ability and thus have a fast growth and proliferation rate. Chlorella cells contain useful ingredients such as proteins, fats, pigments, minerals, and vitamins. Since it is contained in a large amount, it corresponds to a representative edible microalgae, such as being used by humans for intake of nutrients or used as food for animals. In particular, chlorella can be used for the purpose of producing biodiesel, and it corresponds to microalgae that can produce useful substances including pigments such as lutein that are useful for the human body, so it is useful using microalgae in the genus chlorella, which has a fast growth rate. Attempts and studies for mass production of substances have been actively conducted.

그러나, 비올라잔틴을 고함량으로 생산할 수 있는 생산능을 가지면서 다양한 환경에서도 성장속도가 빨라 배양이 용이하며, 산업적 이용을 위한 반연속적 배양이 가능한 클로렐라 속 미세조류에 대해서는 아직까지 밝혀진 바가 없고 이에 따라 상기와 같은 특성을 갖는 신규한 클로렐라 속 미세조류를 발굴하거나 개발한다면, 비올라잔틴의 대량 생산에 있어 높은 효율성을 담보하여 비올라잔틴의 생산 단가와 소비 가격을 낮출 수 있을 것으로 예상된다.However, it is easy to cultivate because of its high growth rate in various environments while having the production ability to produce violaxanthin in a high content, and microalgae in the chlorella genus that can be cultured semi-continuously for industrial use have not been identified yet. If a novel chlorella genus microalgae having the above characteristics is discovered or developed, it is expected that the production cost and consumption price of violaxanthin can be reduced by ensuring high efficiency in mass production of violaxanthin.

본 발명은 항염증, 피부탄력 개선 효능이 있는 것으로 알려진 비올라잔틴을 생산할 수 있으며, 특히 종래 알려져 있는 미세조류와 비교하여 비올라잔틴의 생산성이 더 높은 신규한 클로렐라 속 미세조류를 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a novel chlorella genus microalgae that can produce violaxanthin, which is known to have anti-inflammatory and skin elasticity improvement effects, and in particular, has a higher productivity of violaxanthin compared to conventionally known microalgae. .

또한, 본 발명은 상기와 같은 미세조류를 배양하여, 카로테노이드 색소, 특히 비올라잔틴을 고함량으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.In addition, an object of the present invention is to provide a method of culturing microalgae as described above to produce a carotenoid pigment, particularly violaxanthin, in a high content.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 측면은 기탁번호 KCTC 13850BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 제공한다.In order to achieve the above object, one aspect of the present invention provides a HS-V microalgae of the genus Chlorella deposited with accession number KCTC 13850BP.

본 발명의 다른 측면은 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 빛이 주어지는 조건에서 배양하는 단계; 및 상기 미세조류의 배양액으로부터 추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 카로테노이드 색소 생산 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention is the step of culturing the HS-V microalgae of the genus Chlorella in light conditions; And it provides a method for producing a carotenoid pigment comprising; obtaining an extract from the culture medium of the microalgae.

본 발명에서 제공하는 신규한 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 기존에 비올라잔틴을 생산하는 것으로 알려진 미세조류들과 비교할 때 성장속도가 빨라 바이오매스의 생산성이 높으며, 카로테노이드 색소의 생산성이 우수하고 특히 높은 함량의 비올라잔틴을 생산할 수 있는바, 성장속도가 느리고 대량 배양에 어려움이 있던 종래의 미세조류를 이용한 비올라잔틴 생산 공정을 대체하여, 높은 효율로 비올라잔틴을 생산할 수 있는 효과가 있다. The novel chlorella genus HS-V microalgae provided by the present invention has a high growth rate compared to microalgae known to produce violaxanthin, so the productivity of biomass is high, and the productivity of carotenoid pigments is excellent and particularly high. Violaxanthin of a content can be produced, replacing the conventional violaxanthin production process using microalgae, which has a slow growth rate and difficulty in mass cultivation, and has an effect of producing violaxanthin with high efficiency.

또한, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 해수, 담수 및 기수에서 모두 빠르게 성장이 가능한 특징이 있는 것이므로 배양 과정에서 사용되는 물의 종류를 선택적으로 이용할 수 있어 유리한 측면이 있으며, 반연속적 배양이 가능한 미세조류임을 확인하였는바 산업적으로 비올라잔틴을 생산하기 위한 시스템을 구축하기 위해 유용하게 이용될 수 있는 새로운 미세조류를 제공할 수 있다.In addition, the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention is characterized by rapid growth in seawater, freshwater, and brackish water, so it is advantageous to selectively use the type of water used in the cultivation process, and semi-continuous cultivation is possible. As it has been confirmed that it is possible microalgae, it is possible to provide a new microalgae that can be usefully used to build a system for producing violaxanthin industrially.

다만, 본 발명의 효과는 상기에서 언급한 효과로 제한되지 아니하며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 하기의 기재로부터 당업자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.However, the effects of the present invention are not limited to the above-mentioned effects, and other effects that are not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

도 1은 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류(그림의 '변이체 (HS-V)') 및 야생형 클로렐라 속 HS2 미세조류(그림의 '야생형 (HS2)')를 빛을 차단한 종속영양 조건에서 고체 YM(yeast extract-malt extract) 배지에서 배양한 결과(왼쪽 그림)와, 액체 YM 배지에서 반복적으로 계대 배양한 결과(오른쪽 그림)를 비교한 것이다.
도 2는 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 담수 조건의 BG11 배지 및 해수 조건의 F/2 배지에서 광독립영양 배양 조건으로 8일 동안 배양하여 세포의 수를 측정한 성장곡선이다.
도 3a는 BG11 배지에서 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류(Mt-BG11) 및 야생형 클로렐라 속 HS2 미세조류(WT-BG11)를 빛이 주어지는 광독립영양 배양 조건으로 10일 동안 배양하여 세포의 수를 측정한 성장곡선이고, 도 3b는 YM 배지에서 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류(Mt-YM) 및 야생형 클로렐라 속 HS2 미세조류(WT-YM)를 빛을 차단한 종속영양 배양 조건으로 배양하여 세포의 수를 측정한 성장곡선이다.
도 4는 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류(Mutant) 및 야생형 클로렐라 속 HS2 미세조류(Wild type)를 광독립영양 조건(Photo), 혼합영양 조건(Mixo)으로 배양한 다음 동결건조시켜 색소를 추출시킨 다음 비올라잔틴의 함량을 분석한 HPLC 수행 결과이다.
도 5는 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 5L의 배양기에서 3L의 작업량으로 희석비율을 0.33/day로 하여 반연속 배양한 후 측정한 세포의 수 변화(위의 그래프) 및 배양액 내 포함된 유기 탄소원의 양 변화를 측정한 결과(아래의 그래프)를 나타낸 것이다.
도 6a는 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류(MT) 및 야생형 클로렐라 속 HS2 미세조류(WT)를 대상으로 시퀀싱을 수행하여 얻은 서열 정보를 비교하여 SNP 다형성(polymorphic SNP)을 확인한 결과를 나타낸 것으로, 빨간색으로 표시된 스캐폴드 넘버가 유의미한 차이가 있는 SNP 다형성을 의미한다.
도 6b는 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류(MT) 및 야생형 클로렐라 속 HS2 미세조류(WT)를 대상으로 시퀀싱을 수행하여 얻은 서열 정보를 비교하여 삽입되거나 결실된 변이(In/Del) 차이를 확인한 결과를 나타낸 것으로, 빨간색으로 표시된 스캐폴드 넘버가 유의미한 차이가 있는 In/Del 차이를 의미한다.1 is a heterotrophic condition in which light is blocked for HS-V microalgae of the genus Chlorella ('mutant (HS-V)' in the figure) and HS2 microalgae of the genus chlorella ('wild type (HS2)' in the figure) of the present invention. The results of culturing in solid YM (yeast extract-malt extract) medium (left picture) and the results of repeated passage in liquid YM medium (right picture) were compared.
Figure 2 is a growth curve measuring the number of cells by culturing the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention in BG11 medium under freshwater conditions and F/2 medium under seawater conditions for 8 days under photoindependent culture conditions.
Figure 3a is a chlorella genus HS-V microalgae of the present invention (Mt-BG11) and wild-type chlorella genus HS2 microalgae (WT-BG11) of the present invention in BG11 medium cultured for 10 days under photoindependent nutrient culture conditions in which light is given to It is a growth curve measuring the number, and Figure 3b is a heterotrophic culture condition of blocking light of HS-V microalgae (Mt-YM) and wild-type chlorella genus HS2 microalgae (WT-YM) of the present invention in YM medium It is a growth curve obtained by measuring the number of cells in culture.
Figure 4 is a pigment of the present invention by cultivating HS-V microalgae (Mutant) and wild-type chlorella genus HS2 microalgae (Wild type) in photoindependent nutritional conditions (Photo) and mixed nutritional conditions (Mixo) of the present invention and then freeze-dried This is the HPLC result of analyzing the content of violaxanthin after extracting.
Figure 5 shows the change in the number of cells measured after semi-continuous culturing of the HS-V microalgae of Chlorella genus of the present invention at a working volume of 3 L in a 5 L incubator at a working volume of 0.33/day (the graph above) and inclusion in the culture medium. It shows the result of measuring the change in the amount of organic carbon source (the graph below).
Figure 6a shows the result of confirming the SNP polymorphism (polymorphic SNP) by comparing the sequence information obtained by performing sequencing targeting the HS-V microalgae (MT) of the genus Chlorella and the HS2 microalgae (WT) of the genus Chlorella of the present invention. As a result, the scaffold number indicated in red indicates SNP polymorphism with significant differences.
Figure 6b is a comparison of the sequence information obtained by performing sequencing on HS-V microalgae (MT) of the genus Chlorella and HS2 microalgae of the genus Chlorella (WT) of the present invention, and inserted or deleted mutation (In/Del) difference It shows the result of confirming, and the scaffold number indicated in red means the In/Del difference with a significant difference.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

1. 신규 클로렐라 속 미세조류1. New chlorella genus microalgae

본 발명의 일 측면은 신규 클로렐라 속 미세조류를 제공한다.One aspect of the present invention provides a novel chlorella genus microalgae.

본 발명의 상기 신규 미세조류는 기탁번호 KCTC 13850BP로 기탁된 클로렐라 속 HS-V(Chlorella sp. HS-V)이다.The novel microalgae of the present invention is the Chlorella sp. HS-V deposited under the accession number KCTC 13850BP.

상기 클로렐라 속 HS-V는 클로렐라 속 HS2 미세조류(기탁번호 KCTC 13108BP)에 무작위적인 돌연변이를 유도하고, 이들로부터 구축한 미세조류의 랜덤 라이브러리로부터 종속영양 조건에서 배양 시 야생형 HS2 미세조류의 색상에 비해 탈색된 특징이 있는 미세조류를 선별한 것이다(도 1). 상기와 같이 선별된 본 발명의 클로렐라 속 HS-V는 비올라잔틴의 생산성이 야생형 클로렐라 속 HS2 미세조류보다 더 향상된 특징이 있다. 본 발명의 클로렐라 속 HS-V의 개량을 위한 모균주로 이용되었던 상기 클로렐라 속 HS2 미세조류는 다양한 탄소원이 주어진 환경이나 담수, 해수 및 기수 환경에서도 높은 성장속도를 나타내고 바이오매스, 색소, 지질 생산성이 우수한 특징이 있는 것이며, 상기와 같은 HS2 미세조류로부터 돌연변이를 유도하여 개량한 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 역시 상기 HS2 미세조류의 장점과 특성을 나타낼 수 있다. The HS-V of the genus Chlorella induces random mutations in HS2 microalgae of the genus Chlorella (accession number KCTC 13108BP), and compared to the color of wild-type HS2 microalgae when cultured under heterotrophic conditions from a random library of microalgae constructed therefrom. Microalgae with bleached characteristics were selected (Fig. 1). The HS-V of the genus Chlorella of the present invention selected as described above has the characteristics that the productivity of violaxanthin is more improved than that of the wild type chlorella genus HS2 microalgae. The HS2 microalgae of the genus Chlorella, which was used as a parent strain for the improvement of HS-V of the genus Chlorella of the present invention, exhibits a high growth rate in an environment given a variety of carbon sources or in freshwater, seawater, and brackish water, and biomass, pigment, and lipid productivity It has excellent characteristics, and HS-V of the genus Chlorella of the present invention improved by inducing mutations from the HS2 microalgae as described above can also exhibit the advantages and characteristics of the HS2 microalgae.

상기 클로렐라 속 HS-V는 담수, 해수 및 기수 조건에서 빠른 속도로 성장이 가능하며, 빛을 차단한 종속영양 조건, 빛이 주어지고 유기 탄소원이 제공되지 않는 광독립영양 조건 및 빛과 유기탄소를 모두 제공하는 혼합배양 조건에서 모두 성장 및 배양이 가능한 특징이 있다.HS-V of the chlorella genus can grow rapidly in freshwater, seawater and brackish water conditions, and the heterotrophic conditions that block light, the photoindependent nutrient conditions in which light is given and no organic carbon source is provided, and light and organic carbon It has the characteristic that it is possible to grow and cultivate both in the mixed culture conditions provided for both.

상기 클로렐라 속 HS-V는 빛이 주어지지 않는 조건에서 배양하였을 때의 성장속도가 우수한 특징이 있으며, 구체적으로 동일하게 빛이 없는 조건에서 배양한 클로렐라 속 HS2 또는 클로렐라 엘립소이데아보다 성장속도가 더 향상된 것인바, 바이오매스의 생산성과 유용성분의 생산성 역시 더 향상된 것이다.The chlorella genus HS-V has an excellent growth rate when cultivated in a condition where no light is applied, and specifically, the growth rate is higher than that of the chlorella genus HS2 or chlorella ellipsoidea cultivated in the same condition without light. It is an improvement, and the productivity of biomass and the productivity of useful ingredients are also improved.

상기 클로렐라 속 HS-V는 카로테노이드 색소를 생산하여 세포 내에 축적하거나, 세포 외부로 방출할 수 있으며, 상기 카로테노이드 색소는 비올라잔틴, 루테인 및 베타카로틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 색소를 포함하나 이에 한정하지 않는다. 구체적으로 상기 클로렐라 속 HS-V는 비올라잔틴, 루테인 및 베타카로틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 색소를 생산하여 세포 내에 축적하는 것일 수 있다.The chlorella genus HS-V can produce a carotenoid pigment and accumulate in the cell or release it to the outside of the cell, and the carotenoid pigment includes any one or more pigments selected from the group consisting of violaxanthin, lutein, and beta-carotene. Not limited. Specifically, HS-V of the genus Chlorella may be one that produces at least one pigment selected from the group consisting of violaxanthin, lutein, and beta-carotene and accumulates it in cells.

상기 클로렐라 속 HS-V는 바이오매스 및 유용성분의 생산성이 향상됨에 따라 카로테노이드 색소를 높은 함량으로 생산할 수 있으며, 특히 카로테노이드 색소 중에서 비올라잔틴을 높은 함량으로 생산할 수 있는 특징이 있다. 상기 클로렐라 속 HS-V는 종래 비올라잔틴을 생산할 수 있는 것으로 알려진 야생형의 클로렐라 속 HS2, 클로렐라 엘립소이데아, Myrmecia bisecta 및 Nannochloropsis sp. 보다 비올라잔틴의 생산성이 더 우수하다. 따라서 본 발명의 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 이용하여 비올라잔틴을 생산함으로써, 느린 성장속도와 낮은 비올라잔틴 생산 수율을 나타내는 상기와 같은 기존의 비올라잔틴 생산 미세조류를 이용하는 비올라잔틴 생산 공정이나 시스템을 대체할 수 있다.The chlorella genus HS-V can produce a carotenoid pigment in a high content as the productivity of biomass and useful ingredients is improved, and in particular, it is characterized in that it can produce violaxanthin in a high content among carotenoid pigments. The chlorella genus HS-V is a wild-type chlorella genus HS2, chlorella ellipsoidea , Myrmecia bisecta, and Nannochloropsis sp. The productivity of violaxanthin is better than that. Therefore, by producing violaxanthin using the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention, a violaxanthin production process or system using the existing violaxanthin producing microalgae as described above exhibiting a slow growth rate and a low violaxanthin production yield. Can be replaced.

구체적으로, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V는 광량 120 μmol photons/m2/s 의 빛을 조사하여 광독립영양의 조건으로 배양하였을 때의 비올라잔틴 함량이 클로렐라 속 HS-V 건조중량의 0.050% 내지 0.100%인 것일 수 있고, 예를 들면 0.060% 내지 0.095%, 0.070% 내지 0.090%, 0.075% 내지 0.085% 또는 0.080% 내지 0.085%인 것일 수 있다. 또한, 상기 클로렐라 속 HS-V는 혼합영양의 조건으로 배양하였을 때의 비올라잔틴 함량이 클로렐라 속 HS-V 건조중량의 0.50% 내지 1.00%인 것일 수 있고, 예를 들면 0.55% 내지 0.90%, 0.60% 내지 0.85%, 0.65% 내지 0.80% 또는 0.65% 내지 0.75%인 것일 수 있다. 또한, 상기 클로렐라 속 HS-V는 클로렐라 속 HS2 미세조류와 비교할 때, 빛이 주어지는 광독립영양 조건에서 배양하는 경우 비올라잔틴의 함량이 10배 이상, 15배 이상, 18배 이상 또는 20배 이상 증가된 것일 수 있고, 빛과 유기 탄소원이 모두 제공되는 혼합영양 조건에서 배양하는 경우 비올라잔틴의 함량이 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상 또는 5배 이상 증가된 것일 수 있다. 나아가, 상기 클로렐라 속 HS-V는 클로렐라 엘립소이데아와 비교할 때, 같은 광독립배양의 조건에서 세포 생산성이 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상 또는 5배 이상 증가된 것일 수 있고, 비올라잔틴 생산성이 1.2배 이상, 1.5배 이상, 1.7배 이상 또는 2배 이상 증가된 것일 수 있다. 또한, 혼합영양 조건으로 배양한 클로렐라 속 HS-V는 광독립영양 조건으로 배양한 클로렐라 엘립소이데아와 비교할 때, 세포 생산성이 25배 이상, 30배 이상, 40배 이상 또는 50배 이상 증가된 것일 수 있고, 비올라잔틴 생산성이 7배 이상, 9배 이상, 10배 이상 또는 12배 이상 증가된 것일 수 있다.Specifically, the chlorella genus HS-V of the present invention has a violaxanthin content of 0.050% of the dry weight of the chlorella genus HS-V when cultivated under conditions of photoindependent nutrition by irradiating light of 120 μmol photons/m 2 /s. To 0.100%, for example, 0.060% to 0.095%, 0.070% to 0.090%, 0.075% to 0.085%, or 0.080% to 0.085%. In addition, the chlorella genus HS-V may have a violaxanthin content of 0.50% to 1.00% of the dry weight of chlorella genus HS-V when cultured under mixed nutritional conditions, for example 0.55% to 0.90%, 0.60 % To 0.85%, 0.65% to 0.80%, or 0.65% to 0.75%. In addition, The HS-V of the genus Chlorella, compared with the HS2 microalgae of the genus Chlorella, when cultivated under photoindependent nutritional conditions in which light is given, the content of violaxanthin is increased by 10 times, 15 times, 18 times, or 20 times. In the case of culturing under mixed nutrient conditions in which both light and organic carbon source are provided, the content of violaxanthin may be increased by 2 times, 3 times or more, 4 times or more, or 5 times or more. Furthermore, the HS-V of the genus Chlorella may have increased cell productivity by 2 times or more, 3 times or more, 4 times or more or 5 times or more under the same conditions of photoindependent culture, compared to Chlorella ellipsoidea, and violaxanthine The productivity may be increased by 1.2 times or more, 1.5 times or more, 1.7 times or more, or 2 times or more. In addition, HS-V of the genus Chlorella cultured under mixed nutritional conditions has increased cell productivity by 25 times or more, 30 times or more, 40 times or more, or 50 times or more when compared to Chlorella ellipsoidea cultured under photoindependent nutritional conditions. It may be, and violaxanthin productivity may be increased by 7 times or more, 9 times or more, 10 times or more, or 12 times or more.

본 발명의 상기 클로렐라 속 HS-V는 CRTISO 유전자가 결실되는 돌연변이가 발생한 것일 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-V의 유전체 정보를 클로렐라 속 HS2 미세조류의 유전체 정보와 비교하여 유의미한 SNP 상의 차이를 분석하였을 때 CRTISO 유전자가 결실된 특징을 갖는 것일 수 있다. 상기 CRTISO는 카로테노이드의 합성 과정의 최종 전구체 물질인 라이코펜(lycopene)을 합성하는 효소이며, 상기 CRTISO 유전자가 결실되어 있더라도 빛이 주어지는 조건에서는 빛에 의하여 라이코펜이 생성될 수 있다. 따라서 상기와 같은 CRTISO 유전자가 결실된 본 발명의 클로렐라 속 HS-V는 빛이 차단된 배양 조건에서는 CRTISO 효소가 발현되지 못함에 따라 라이코펜 및 카로테노이드 색소를 합성할 수 없지만, 빛이 주어지는 조건(광독립영양 또는 혼합영양 조건)이 되면 CRTISO 유전자가 결실되어 있더라도 카로테노이드 색소의 합성이 가능하다. 상기 클로렐라 속 HS-V는 CRTISO 유전자의 결실 돌연변이로 인해 빛이 차단된 조건에서는 라이코펜 및 카로테노이드 색소를 합성하지 못하다가, 빛이 주어지게 되면 급격하게 라이코펜을 다량으로 합성하게 되고 이로 인하여 최종적으로 생성되는 카로테노이드 색소의 구성 비율이 변화하여 비올라잔틴을 더 많은 양 생성하게 될 수 있다.The HS-V of the genus Chlorella of the present invention may have a mutation in which the CRTISO gene is deleted. When the genomic information of HS-V of the genus Chlorella is compared with the genomic information of the HS2 microalgae of the genus Chlorella and a significant difference in SNP is analyzed, the CRTISO gene may be deleted. The CRTISO is an enzyme that synthesizes lycopene, which is a final precursor material in the process of synthesizing carotenoids, and even if the CRTISO gene is deleted, lycopene may be produced by light under light conditions. Therefore, HS-V of the genus Chlorella of the present invention in which the CRTISO gene is deleted as described above cannot synthesize lycopene and carotenoid pigments as the CRTISO enzyme cannot be expressed under light-blocked culture conditions, but under the conditions of light (photoindependent Nutritional or mixed nutrition), carotenoid pigments can be synthesized even if the CRTISO gene is deleted. HS-V of the genus Chlorella cannot synthesize lycopene and carotenoid pigments under light blocked conditions due to a deletion mutation of the CRTISO gene, but when light is given, it rapidly synthesizes a large amount of lycopene, which is finally produced. The composition ratio of the carotenoid pigment may change, resulting in a greater amount of violaxanthin being produced.

또한, 상기 클로렐라 속 HS-V는 리신 tRNA 리가아제(lysine tRNA ligase) 유전자의 돌연변이가 더 발생한 것일 수 있다. 상기 리신 tRNA 리가아제는 단백질의 번역 과정에서 리신을 운반하는 역할을 하는 tRNA와 리신 사이에 ATP 에너지를 이용해 결합을 형성하는 반응을 촉매하는 활성이 있으며, 상기 리신 tRNA 리가아제 유전자에 돌연변이가 발생한 본 발명의 클로렐라 속 HS-V에서 상기와 같은 유전자의 돌연변이는 라이코펜 및 카로테노이드 색소의 합성 과정에서 카로테노이드 색소 중 비올라잔틴의 비율을 높여 비올라잔틴 생산성을 높일 수 있도록 하는 것일 수 있다.In addition, HS-V of the genus Chlorella may have a lysine tRNA ligase gene mutation. The lysine tRNA ligase has an activity to catalyze the reaction of forming a bond using ATP energy between tRNA and lysine, which plays a role in transporting lysine in the process of protein translation, and mutations in the lysine tRNA ligase gene In the chlorella genus HS-V of the present invention, the mutation of the gene as described above may increase violaxanthin productivity by increasing the ratio of violaxanthin among carotenoid pigments during the synthesis of lycopene and carotenoid pigments.

본 발명의 상기 클로렐라 속 HS-V는 반연속 배양(semi-continuous cultivation)이 가능하다. 구체적으로 상기 클로렐라 속 HS-V는 계속적인 배양에 따라 기간이 경과하여 유기 탄소원 및 질소원이 감소하더라도 지속적인 성장이 가능한 특징이 있으며, 상기와 같이 반연속 배양이 가능하므로 생산하고자 하는 비올라잔틴 및 다른 카로테노이드 색소의 지속적인 생산을 위해 산업적으로 이용할 수 있는 특징이 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 클로렐라 속 HS-V를 5L의 배양기(fermenter)에서 3L의 작업량(working volume)으로 희석 비율을 0.33/day로 하여 배양하였을 때, 기간이 경과하여 탄소원 및 질소원이 감소하였음에도 불구하고 점차 세포의 수가 증가하는 방향으로 지속적인 성장을 함을 확인하였는바(도 5), 비올라잔틴의 산업적 생산을 위한 용도로 이용될 수 있는 미세조류임을 확인할 수 있었다.The chlorella genus HS-V of the present invention is capable of semi-continuous cultivation. Specifically, HS-V of the genus Chlorella is characterized by continuous growth even if the organic carbon source and nitrogen source decrease over a period of time according to continuous culture, and because semi-continuous culture is possible as described above, violaxanthin and other carotenoids to be produced There are features that can be used industrially for the continuous production of pigments. In a specific embodiment of the present invention, when the chlorella genus HS-V is cultured with a dilution ratio of 0.33/day in a 5L fermenter with a 3L working volume, the carbon source and the nitrogen source are Despite the decrease, it was confirmed that the cells continued to grow in the direction of increasing the number of cells (FIG. 5), and it was confirmed that they are microalgae that can be used for industrial production of violaxanthin.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 클로렐라 속 HS-V 세포주는 야생형의 클로렐라 속 HS2 미세조류를 대상으로 40 mM 농도의 EMS(ethyl methanesulfonate)를 처리하여 무작위적인 돌연변이를 유도하고, 이에 의해 형성된 랜덤 라이브러리를 빛을 차단한 종속영양 배양 조건에서 계대 배양하여 야생형 HS2 미세조류의 색상과 비교하여 더 탈색된 특징이 있는 세포주를 선별한 것이다. 상기와 같은 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 탈색된 특징은 빛이 없는 조건에서는 색소의 생산성이 감소됨에 따라 나타나는 결과로, 카로테노이드 색소의 합성 경로가 돌연변이에 의해 변화함에 따라 빛이 주어지는 조건에서 급격하게 다량의 카로테노이드를 생산할 수 있고 그 과정에서 비올라잔틴의 구성 비율이 증가됨으로써 종래 비올라잔틴 생산 미세조류와 비교할 때 높은 비올라잔틴 생산성을 나타내는 신규한 미세조류를 확보할 수 있었다.In a specific embodiment of the present invention, the HS-V cell line of the genus Chlorella is treated with a 40 mM concentration of ethyl methanesulfonate (EMS) targeting wild-type HS2 microalgae of the genus Chlorella to induce random mutations, and a random library formed thereby is It was subcultured under light-blocking heterotrophic culture conditions, and compared with the color of wild-type HS2 microalgae, cell lines with more bleached characteristics were selected. The bleached characteristic of HS-V microalgae of the genus Chlorella as described above is a result of the decrease in the productivity of the pigment in the absence of light.As the synthesis pathway of the carotenoid pigment changes by mutation, it is rapidly A large amount of carotenoids could be produced, and the composition ratio of violaxanthin was increased in the process, thereby securing novel microalgae exhibiting high violaxanthin productivity compared to conventional violaxanthin-producing microalgae.

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류와 야생형 클로렐라 속 HS2를 각각 광독립영양 조건 및 종속영양 조건에서 배양하여 성장속도를 비교하여, 종속영양 조건에서 배양하는 경우 클로렐라 속 HS-V의 성장속도가 더 향상된 것임을 확인함으로써 본 발명의 미세조류가 바이오매스 생산성 및 유용성분의 생산성이 증대된 특징을 갖는 것임을 확인할 수 있었다.In addition, in a specific embodiment of the present invention, the chlorella genus HS-V microalgae and the wild-type chlorella genus HS2 of the present invention are cultivated under photoautotrophic conditions and heterotrophic conditions, respectively, to compare the growth rates, and cultured under heterotrophic conditions. In the case, by confirming that the growth rate of HS-V in Chlorella genus was further improved, it was confirmed that the microalgae of the present invention had the characteristics of increased biomass productivity and productivity of useful ingredients.

나아가, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류와 야생형 클로렐라 속 HS2를 각각 광독립영양 조건 및 혼합영양 조건에서 배양하여 비올라잔틴의 함량을 측정한 결과, 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 HS2 미세조류에 비해 광독립영양 조건에서는 약 20배 이상 비올라잔틴의 함량이 증가하였고, 혼합영양 조건에서는 약 5배 정도 비올라잔틴의 함량이 증가함을 확인할 수 있었고, 종래 비올라잔틴을 생산하는 것으로 알려진 클로렐라 속 HS2, 클로렐라 엘립소이데아, Myrmecia bisecta 및 Nannochloropsis sp.와 바이오매스 및 비올라잔틴 생산량을 비교하였을 때, 본 발명의 HS-V 미세조류는 다른 미세조류들보다 바이오매스 생산성이 현저하게 증가하였으며 비올라잔틴 생산성 역시 더 우수한 것임을 확인하여(표 1), 기존의 비올라잔틴 생산 세포주들을 효과적으로 대체할 수 있는 것임을 확인할 수 있었다.Further, in a specific embodiment of the present invention, as a result of measuring the content of violaxanthin by culturing the HS-V microalgae of the genus Chlorella and HS2 of the genus wild-type Chlorella of the present invention, respectively, under photoautotrophic conditions and mixed nutritional conditions, the content of violaxanthin was measured. -V microalgae, compared with HS2 microalgae, increased the content of violaxanthin by about 20 times or more under photoindependent nutritional conditions, and about 5 times that of violaxanthin in mixed nutritional conditions, and conventional violaxanthin. When comparing the production of biomass and violaxanthin with HS2, Chlorella ellipsoidea , Myrmecia bisecta, and Nannochloropsis sp., which are known to produce, the HS-V microalgae of the present invention has a higher biomass productivity than other microalgae. It was remarkably increased, and it was confirmed that the violaxanthin productivity was also superior (Table 1), and it was confirmed that it can effectively replace the existing violaxanthin-producing cell lines.

2. 카로테노이드 색소의 생산 방법2. Production method of carotenoid pigment

본 발명의 또 다른 측면은 카로테노이드 색소를 생산하는 방법을 제공한다.Another aspect of the present invention provides a method of producing a carotenoid pigment.

상기 카로테노이드 색소의 생산 방법은 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 빛이 주어지는 조건에서 배양하는 단계; 및 상기 미세조류의 배양액으로부터 추출물을 얻는 단계;를 포함한다. 상기 카로테노이드 색소는 비올라잔틴, 루테인 및 베타카로틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않으며, 구체적으로 비올라잔틴을 포함하는 것일 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 바이오매스 및 비올라잔틴의 생산성이 우수한 것인바, 상기 미세조류를 배양하는 단계를 거친 배양액에는, 다른 종류의 비올라잔틴 생산 미세조류의 배양액과 비교할 때 비올라잔틴을 더 많은 양으로 함유할 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 상기 '1. 신규 클로렐라 속 미세조류' 항목에서 설명한 미세조류와 동일한바, 구체적인 설명은 위 '1. 신규 클로렐라 속 미세조류' 항목을 원용하고, 이하에서는 카로테노이드 색소 생산 방법에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.The production method of the carotenoid pigment comprises the steps of culturing the HS-V microalgae of the genus Chlorella under conditions of light; And obtaining an extract from the culture medium of the microalgae. The carotenoid pigment may include any one or more selected from the group consisting of violaxanthin, lutein, and beta-carotene, but is not limited thereto, and specifically, may include violaxanthin. The HS-V microalgae of the chlorella genus has excellent productivity of biomass and violaxanthin, and the culture medium subjected to the step of culturing the microalgae contains more violaxanthin when compared to the culture medium of other types of violaxanthin-producing microalgae. Can contain in large amounts. HS-V microalgae of the genus Chlorella is described in '1. It is the same as the microalgae described in the section'New chlorella genus microalgae'. 'New chlorella genus microalgae' is used, and hereinafter, only the configuration specific to the carotenoid pigment production method will be described.

상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 빛이 주어지는 조건에서 배양하는 단계는, 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 빛을 차단하고 유기 탄소원을 제공하는 조건에서 먼저 배양한 이후에 수행되는 것일 수 있으며, 유기 탄소원은 상기 빛이 주어지는 조건과 동시에 제공되는 것일 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 빛과 유기 탄소원이 모두 제공되는 조건에서 카로테노이드 색소의 생산성, 특히 비올라잔틴의 생산성이 높은 특징이 있다. The step of culturing the HS-V microalgae of the chlorella genus under a condition where light is applied may be performed after first culturing the HS-V microalgae of the chlorella genus under conditions of blocking light and providing an organic carbon source, The organic carbon source may be provided simultaneously with the conditions in which the light is applied. HS-V microalgae of the genus Chlorella are characterized by high productivity of carotenoid pigments, particularly violaxanthin, under conditions where both light and organic carbon sources are provided.

상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 질소원 및 무기염을 더 포함하는 배지에서 배양하는 것일 수 있으며, 상기 질소원은 질산염, 요소 또는 암모늄 클로라이드일 수 있고 상기 무기염은 Na+, K+, Mg2+ 또는 Ca2+일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 배지는 BG11 배지일 수 있다. 또한 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 효모 추출액(yeast extract) 또는 포도당 성분을 더 포함하는 배지에서 배양하는 것일 수 있다.The HS-V microalgae of the genus Chlorella may be cultured in a medium further containing a nitrogen source and an inorganic salt, and the nitrogen source may be nitrate, urea or ammonium chloride, and the inorganic salts are Na + , K + , Mg 2+ Or it may be Ca 2+ , but is not limited thereto. The medium may be a BG11 medium. In addition, the HS-V microalgae of the genus Chlorella may be cultured in a medium further containing a yeast extract or a glucose component.

상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 배양하기 위한 배지에 포함되는 물은 해수, 기수 또는 담수일 수 있으며, 예를 들면 담수일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 배지에 포함되는 물의 종류는 카로테노이드 색소를 생산하기 위한 공정, 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 배양 조건 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다.The water included in the medium for culturing HS-V microalgae of the genus Chlorella may be seawater, brackish water, or fresh water, and may be fresh water, but is not limited thereto. The type of water contained in the medium may be appropriately selected in consideration of a process for producing a carotenoid pigment, a culture condition of HS-V microalgae of Chlorella genus, and the like.

상기 미세조류를 빛이 주어지는 조건에서 배양하는 단계는 조사되는 빛의 광량이 100 내지 140 μmol photons/m2/s, 온도가 28 내지 32 ℃이고 담수 조건에서 배양하는 것을 포함한다. 또한, 상기 미세조류를 빛이 주어지는 조건에서 배양하는 단계는 배지 내의 질소원이 질산염, 요소 또는 암모늄 클로라이드 중 하나 이상이고, 탄소원이 포도당인 조건에서 배양하는 것을 포함한다. 상기와 같은 조건으로 클로렐라 속 HS-V를 배양할 경우 상기 HS-V 미세조류의 비올라잔틴 생산성이 가장 우수하므로 비올라잔틴의 생산량을 증가시킬 수 있다.The step of culturing the microalgae in a condition where light is applied includes culturing in fresh water conditions with an amount of irradiated light of 100 to 140 μmol photons/m 2 /s and a temperature of 28 to 32°C. In addition, the step of culturing the microalgae in a light-applied condition includes culturing under a condition in which the nitrogen source in the medium is at least one of nitrate, urea, or ammonium chloride, and the carbon source is glucose. When HS-V of the genus Chlorella is cultured under the above conditions, the violaxanthin productivity of the HS-V microalgae is the most excellent, and thus the production amount of violaxanthin can be increased.

상기와 같이 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 배양한 배양액은 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 미세조류의 세포를 제거한 배양 여액(여과액 또는 원심분리한 상등액), 상기 배양액에 초음파를 처리하거나 상기 배양액에 용해효소(lysozyme)를 처리하여 수득한 세포 파쇄액 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 않는다.The culture medium obtained by culturing HS-V microalgae in Chlorella genus as described above is the culture solution obtained by culturing the HS-V microalgae in Chlorella genus in a liquid medium, and the culture filtrate in which the cells of the microalgae are removed by filtration or centrifugation (filtration Solution or centrifuged supernatant), a cell lysate obtained by treating the culture solution with ultrasonic waves or treating the culture solution with a lysozyme, etc., but is not limited thereto.

상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 배양한 배양액은 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 1 g/L 내지 60 gL의 농도로 포함할 수 있으며, 예를 들면, 2 g/L 내지 50 g/L, 5 g/L 내지 40 g/L, 7 g/L 내지 35 g/L 또는 10 g/L 내지 30 g/L의 농도로 포함할 수 있다. 상기 배양액 내 클로렐라 속 HS-V 미세조류가 1 g/L 미만의 농도로 포함될 경우 비올라잔틴의 생산량이 감소하여 최종적으로 수득되는 비올라잔틴의 양이 감소될 수 있고, 60 g/L 초과의 농도로 포함될 경우 배양액 내 포함된 영양소의 고갈로 인해 클로렐라 속 HS-V의 성장 및 비올라잔틴 생산 효율이 감소될 수 있다.The culture medium obtained by culturing HS-V microalgae of the genus Chlorella may contain HS-V microalgae of the genus Chlorella at a concentration of 1 g/L to 60 gL, for example, 2 g/L to 50 g/L, 5 g/L to 40 g/L, 7 g/L to 35 g/L, or 10 g/L to 30 g/L. When HS-V microalgae of Chlorella genus in the culture medium is included at a concentration of less than 1 g/L, the production amount of violaxanthin may decrease, thereby reducing the amount of violaxanthin finally obtained, and at a concentration of more than 60 g/L. If included, the growth of HS-V and violaxanthin production efficiency of chlorella genus may be reduced due to depletion of nutrients contained in the culture medium.

상기 미세조류의 배양액으로부터 추출물을 얻는 단계는 당업자에게 공지된 임의의 추출 방법을 이용하여 추출될 수 있으며, 추출용매로는 헥산, 벤젠, 톨루엔, 디에틸에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 메틸렌 클로라이드, 1,4-디옥산, 테트라하이드로퓨란, 아세톤, 아세토니트릴, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 아세트산 및 메탄올, 에탄올, 프로필렌글라이콜, 프로필알코올, 부틸렌글라이콜, 부틸알코올, 글리세린 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올류 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않으며, 예를 들어 에탄올을 이용하여 추출되는 것일 수 있다. 에탄올을 이용하여 추출물을 얻는 경우, 미세조류의 배양액으로부터 미세조류 세포를 분리하여 동결건조한 후, 에탄올과 부피비 1:5 이상으로 현탁한 상태에서, 물리적 충격을 가하여 추출하는 방법을 이용할 수 있다.The step of obtaining the extract from the culture medium of the microalgae can be extracted using any extraction method known to those skilled in the art, and the extraction solvent is hexane, benzene, toluene, diethyl ether, chloroform, ethyl acetate, methylene chloride, 1 ,4-dioxane, tetrahydrofuran, acetone, acetonitrile, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetic acid and methanol, ethanol, propylene glycol, propyl alcohol, butylene glycol, butyl alcohol, glycerin, etc. Alcohols having 1 to 4 carbon atoms may be used, but are not limited thereto, and may be, for example, extracted using ethanol. In the case of obtaining an extract using ethanol, the microalgal cells are separated from the microalgal culture solution, lyophilized, and then suspended in a volume ratio of 1:5 or more with ethanol, and then extracted by physical shock.

상기 카로테노이드 색소 생산 방법은 미세조류의 배양액으로부터 추출물을 얻는 단계 이후에 카로테노이드 색소를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리하는 단계는 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 추출물의 용매를 증발시켜 카로테노이드 색소를 분리해 낼 수 있으며, 카로테노이드 색소 중에서도 특정 색소만을 선택적으로 분리하기 위해서는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The carotenoid pigment production method may further include the step of separating the carotenoid pigment after the step of obtaining an extract from the culture medium of microalgae. The separating step may be performed using any method known in the art. For example, the solvent of the extract may be evaporated to separate the carotenoid pigment. In order to selectively separate only a specific pigment among the carotenoid pigments, high performance liquid chromatography ( HPLC) may be used, but is not limited thereto.

상기 카로테노이드 색소의 생산 방법은 처음 빛을 조사한 이후로 9일 이상 카로테노이드 색소를 생산할 수 있는 것일 수 있으며, 구체적으로 10일 이상, 11일 이상, 13일 이상 또는 15일 이상 카로테노이드 색소를 생산할 수 있다. 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 지속적인 배양 과정에서 유기 탄소원 및 질소원이 감소하더라도 반연속 배양(semi-continuous cultivation)이 가능한 미세조류이므로, 처음 빛을 조사하여 카로테노이드 색소를 생산하기 시작한 이후 상기와 같은 범위의 기간이 경과하더라도 지속적인 성장이 가능한바, 카로테노이드 색소의 지속적 생산이 가능하며 비올라잔틴을 비롯한 카로테노이드 색소를 산업적으로 생산하기 위하여 이용될 수 있다.The production method of the carotenoid pigment may be one capable of producing a carotenoid pigment for at least 9 days after irradiation with light for the first time, and specifically, it may produce a carotenoid pigment for at least 10 days, at least 11 days, at least 13 days, or at least 15 days. The HS-V microalgae of the genus Chlorella are microalgae capable of semi-continuous cultivation even if the organic carbon source and nitrogen source decrease in the continuous culturing process, so after the initial irradiation of light to produce carotenoid pigments, the above Since continuous growth is possible even after the lapse of a range of periods, continuous production of carotenoid pigments is possible and can be used to industrially produce carotenoid pigments including violaxanthin.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되지 아니한다.However, the following examples specifically illustrate the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

[실시예 1] 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 개량[Example 1] Improvement of HS-V microalgae in Chlorella genus

일반적인 클로렐라 속 미세조류와는 달리, 해수, 담수 및 기수 환경에서 모두 성장과 배양이 가능한 특징이 있으며, 성장속도가 우수하면서 종래 비올라잔틴을 생산하는 것으로 알려진 다른 미세조류와 비교할 때 비올라잔틴의 생산성이 증대된 특징이 있는 신규한 미세조류를 만들기 위하여, 야생형의 클로렐라 속 미세조류에 돌연변이를 유도하여 개량된 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 만들었다. Unlike general chlorella genus microalgae, it has the characteristics of being able to grow and cultivate in seawater, freshwater and brackish water environments, and has excellent growth rate and productivity of violaxanthin compared to other microalgae known to produce violaxanthin. In order to create a novel microalgae with enhanced characteristics, an improved HS-V microalgae of the genus Chlorella was made by inducing a mutation in the wild-type chlorella genus microalgae.

개량을 위한 모균주로는 다양한 탄소원이 주어진 환경이나 담수, 해수 및 기수 환경에서도 높은 성장속도를 나타내고 바이오매스, 색소, 지질 생산성이 우수한 특징이 있는 미세조류인 클로렐라 속 HS2 미세조류(기탁번호 KCTC 13108BP)를 이용하였다. 상기 HS2 미세조류에 무작위적인 돌연변이를 유도하고 빛을 차단하여 배양시켰을 때 콜로니의 색상이 야생형에 비해 탈색된 것들을 선별하였다. 이는 빛이 주어지지 않는 환경에서는 색소를 합성하지 못하다가 빛이 주어지면 급격하게 카로테노이드를 생산하는 특징을 가지는 미세조류를 선별함으로써, 최종적인 카로테노이드 색소들의 생성 비율이 변경되어 비올라잔틴의 생산성이 특히 우수한 미세조류를 만들어내기 위함이다.As the parent strain for improvement, HS2 microalgae of the genus Chlorella, a microalgae of the genus Chlorella, which exhibits high growth rates even in environments given various carbon sources or in freshwater, seawater and brackish water environments, and has excellent biomass, pigment, and lipid productivity (Accession No. KCTC 13108BP. ) Was used. When the HS2 microalgae was cultured by inducing a random mutation and blocking the light, those whose colonies were bleached compared to the wild type were selected. This is because the production rate of carotenoid pigments is changed and the productivity of violaxanthin is particularly excellent by selecting microalgae that have the characteristics of producing carotenoids rapidly when light is given to them. It is to produce microalgae.

구체적으로, 클로렐라 속 HS2에 무작위적인 돌연변이를 유도하기 위하여, EMS(ethyl methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. M0880)를 40 mM의 농도로 1 시간 동안 처리하여 준 다음, EMS의 화학적 활성을 다시 제거하기 위하여 10%의 싸이오황산 나트륨(sodium thiosulfate, Sigma-Aldrich, Cat. No. 563188)을 첨가하고, 세포를 재배양하여 무작위적 돌연변이가 일어난 미세조류들의 랜덤 라이브러리를 구축하였다. 상기 클로렐라 속 HS2 랜덤 라이브러리를 대상으로 빛을 차단한 종속영양 조건으로 고체 YM 배지(yeast extract-malt extract; BD DifcoTM YM broth, Cat. No. 271120, BD BactoTM Agar, Cat. No. 214010)에서 배양하였고, 콜로니의 색상이 야생형 HS2 미세조류의 색상과 비교할 때 더 탈색된 것들만을 선별하였다. 상기와 같이 선별된 각 콜로니를 종속영양 조건의 액체 YM 배지(BD DifcoTM YM broth, Cat. No. 271120)에 접종하여 배양시키고 1달 간격으로 4회 이상 반복적으로 계대 배양하였다. 계대 배양을 수행함에 따라 탈색된 상태가 유지되는 변이체 1종을 선별하였고(도 1), 선별된 변이체의 18S rRNA 서열을 시퀀싱하여 분석한 결과, 클로렐라 속 HS2의 18S rRNA 서열과 일치하여 클로렐라 속으로 분류하였으며, 이를 신규한 클로렐라 속 HS-V로 명명하였다.Specifically, in order to induce a random mutation in HS2 of Chlorella genus, EMS (ethyl methanesulfonate, Sigma-Aldrich, Cat. No. M0880) was treated at a concentration of 40 mM for 1 hour, and then the chemical activity of EMS was again reactivated. To remove, 10% sodium thiosulfate (sodium thiosulfate, Sigma-Aldrich, Cat. No. 563188) was added, and cells were rearranged to construct a random library of microalgae with random mutations. Solid YM medium (yeast extract-malt extract; BD Difco TM YM broth, Cat. No. 271120, BD Bacto TM Agar, Cat. No. 214010) under light-blocking heterotrophic conditions for the HS2 random library of the genus Chlorella. Was cultured in, and when the color of the colonies was compared with the color of wild-type HS2 microalgae, only those that were more bleached were selected. Each colony selected as described above was inoculated and cultured in liquid YM medium (BD Difco TM YM broth, Cat. No. 271120) under heterotrophic conditions, and passaged repeatedly at least 4 times at 1 month intervals. As the subculture was performed, one variant that remained in a depigmented state was selected (Fig. 1), and as a result of sequencing and analysis of the 18S rRNA sequence of the selected variant, it was in accordance with the 18S rRNA sequence of HS2 of Chlorella genus and into Chlorella. It was classified and named as the novel Chlorella genus HS-V.

[실시예 2] 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 담수 및 해수 조건에서의 성장 여부 확인[Example 2] Confirmation of growth of HS-V microalgae in Chlorella genus in freshwater and seawater conditions

본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 배양 조건 중에서, 담수 및 해수 조건에서 모두 성장이 가능한지 여부를 확인하기 위하여, 담수 성분의 배지와 해수 성분의 배지에서 각각 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 배양하고 세포의 수를 측정하여 미세조류의 성장 속도를 확인하였다. 담수 조건의 BG11 배지(Cyanobacteria BG-11 Freshwater Solution 50x, Sigma-Aldrich, Cat. No. C3061)와 해수 조건의 F/2 배지(Sigma-Aldrich, Cat. No. G9903)를 각각 이용하여 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 광량 온도 30 ℃, 광량 120 μmol photons/m2/s의 광독립영양 조건에서 배양하여, hemocytometer(C-chip disposable hemocytometer, iNCYTO, Cat. No. DHC-N01)를 이용하여 광학현미경으로 통해 관찰하고 제조사의 hemocytometer 제조사의 사용방법에 따라 계산하여 세포의 수를 측정하였다.Among the culture conditions of the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention, HS-V microalgae of the genus Chlorella are cultured in a medium containing a freshwater component and a medium containing a seawater component in order to determine whether growth is possible in both freshwater and seawater conditions. And the number of cells was measured to confirm the growth rate of microalgae. BG11 medium in freshwater conditions (Cyanobacteria BG-11 Freshwater Solution 50x, Sigma-Aldrich, Cat. No. C3061) and F/2 medium in seawater conditions (Sigma-Aldrich, Cat. No. G9903) of the present invention, respectively, are used. HS-V microalgae of the genus Chlorella were cultivated under photoindependent nutritional conditions of 30°C light intensity and 120 μmol photons/m 2 /s light intensity, and a hemocytometer (C-chip disposable hemocytometer, iNCYTO, Cat. No. DHC-N01) was used. Using an optical microscope, the number of cells was measured by observation through an optical microscope and counting according to the manufacturer's hemocytometer manufacturer's method of use.

그 결과, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 세포 수가 담수 배지에서는 배양 6일차에 2.49×108 cells/ml에 도달하였고, 해수 배지에서는 배양 6일차에 5.04×107 cells/ml에 도달하였다(도 2). 따라서, 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 담수 및 해수 조건에서 모두 성장이 가능함을 확인할 수 있었고, 담수 조건에서의 성장 속도가 더 빠른 것을 알 수 있었다. 통상적인 다른 종의 클로렐라 속 미세조류들과는 달리, 클로렐라 속 HS-V는 담수와 해수 조건에서 모두 성장 및 배양이 가능하므로, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 이용하는 경우, 카로테노이드 색소를 생산하기 위한 공정이나 배양 조건 등을 고려하여 담수 또는 해수 조건을 선택적으로 적용할 수 있는 장점이 있다. 또한, 다른 종류의 미세조류가 성장하지 못하는 배양액을 사용함으로써 클로렐라 속 HS-V 미세조류가 성장하는 과정에서 경쟁적으로 작용할 수 있는 다른 종의 미세조류를 배제시킬 수 있고, 배양액 내에 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류만이 포함되어 있는지 여부를 확인하는 과정이나 선별하는 과정을 생략할 수 있어 공정 상의 경제성과 효율성을 담보할 수 있는 효과가 있다.As a result, the number of cells of HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention reached 2.49×10 8 cells/ml on the 6th day of culture in freshwater medium, and 5.04×10 7 cells/ml on the 6th day of culture in seawater medium. (Fig. 2). Therefore, it was confirmed that HS-V microalgae of the genus Chlorella can grow in both freshwater and seawater conditions, and that the growth rate in freshwater conditions is faster. Unlike common other species of chlorella genus microalgae, Chlorella genus HS-V can grow and cultivate in both freshwater and seawater conditions, so when using the chlorella genus HS-V microalgae of the present invention, it is possible to produce carotenoid pigments. There is an advantage of being able to selectively apply freshwater or seawater conditions in consideration of the process or culture conditions for this. In addition, by using a culture medium in which other types of microalgae cannot grow, other species of microalgae that can compete competitively in the process of growth of HS-V microalgae of the genus Chlorella can be excluded. As the process of checking whether only HS-V microalgae is included or the process of screening can be omitted, there is an effect that can guarantee the economy and efficiency of the process.

[실시예 3] 본 발명의 HS-V 미세조류의 빠른 성장속도 확인[Example 3] Checking the fast growth rate of HS-V microalgae of the present invention

<3-1> 배양 조건에 따른 HS-V 미세조류와 HS2 미세조류의 성장속도 비교<3-1> Comparison of growth rate of HS-V microalgae and HS2 microalgae according to culture conditions

상기 실시예 1을 통해 확보한 개량된 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 배양 조건에 따른 성장 양상을 확인하기 위하여, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류와 야생형의 클로렐라 HS2 미세조류를 대상으로 다양한 조건에서 성장속도를 측정하여 비교하였다.In order to confirm the growth pattern of the improved chlorella genus HS-V microalgae obtained through Example 1 according to the culture conditions, various targets for the chlorella genus HS-V microalgae and wild-type chlorella HS2 microalgae of the present invention The growth rate was measured and compared under conditions.

본 발명의 클로렐라 속 HS-V와 야생형 클로렐라 속 HS2를 희석시킨 BG11 배지(Cyanobacteria BG-11 Freshwater Solution 50x, Sigma-Aldrich, Cat. No. C3061) 및 YM 배지(BD DifcoTM YM broth, Cat. No. 271120)에서 배양하였고, 각각 광독립영양 조건(photoautotrophic, 빛이 주어지는 배양 조건) 및 종속영양 조건(heterotrophic, 빛을 차단한 배양 조건)에서 배양하여 1일 간격으로 hemocytometer(C-chip disposable hemocytometer, iNCYTO, Cat. No. DHC-N01)를 이용하여 광학현미경으로 통해 관찰하고 제조사의 hemocytometer 제조사의 사용방법에 따라 계산하여 세포의 수를 측정하였다. 상기 광독립영양 조건의 배양은 30℃의 온도에서 빛을 120 μmol photons/m2/s로 조사하고, 120 rpm으로 교반하여 50 mL T-플라스크에 10 mL 부피만큼 배양한 것이다. 상기 종속영양 조건의 배양은 광독립영양 조건과 동일하나, 빛을 차단시킨 조건으로 배양하였다.BG11 medium (Cyanobacteria BG-11 Freshwater Solution 50x, Sigma-Aldrich, Cat. No. C3061) and YM medium (BD Difco TM YM broth, Cat. No. C3061) and YM medium (BD Difco TM YM broth, Cat. No. C3061) diluted with HS2 of the genus Chlorella and HS2 of the genus Chlorella of the present invention 271120), and incubated in photoautotrophic conditions (photoautotrophic, culture conditions in which light is given) and heterotrophic conditions (heterotrophic, culture conditions in which light is blocked), respectively, and cultured in a hemocytometer (C-chip disposable hemocytometer, respectively) at 1-day intervals. iNCYTO, Cat. No. DHC-N01) was used to observe through an optical microscope, and the number of cells was measured according to the manufacturer's hemocytometer manufacturer's method of use. In the cultivation of the photoindependent nutritional conditions, light was irradiated at a temperature of 30° C. at 120 μmol photons/m 2 /s, stirred at 120 rpm, and cultured in a 50 mL T-flask by a volume of 10 mL. The cultivation of the heterotrophic condition was the same as that of the photoindependent nutritional condition, but was cultured under the condition of blocking light.

그 결과, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 야생형 클로렐라 속 HS2 미세조류와 비교할 때, BG11 배지에서 광독립영양 조건으로 배양한 경우에는 비슷한 수준의 성장속도를 보인 반면(도 3a), YM 배지에서 종속영양 조건으로 배양한 경우에는 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 성장속도가 HS2 미세조류와 비교할 때 더 향상되어 증가되었다(도 3b).As a result, the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention showed a similar level of growth rate when cultured in BG11 medium under photoindependent nutrient conditions as compared to the wild type chlorella genus HS2 microalgae (Fig. 3a), YM When cultured in a medium under heterotrophic conditions, the growth rate of HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention was further improved and increased as compared with the HS2 microalgae (FIG. 3b).

상기와 같은 결과로 볼 때, 본 발명의 클로렐라 HS-V 미세조류를 빛을 차단시킨 종속영양 조건으로 배양시키는 경우 종래의 야생형 클로렐라 HS2 미세조류보다 성장속도가 더 우수하여 최종 수율이 향상된 바이오매스 및 유용성분의 생산이 가능한 효과가 있음을 확인할 수 있었다.From the above results, when the chlorella HS-V microalgae of the present invention is cultured under light-blocking heterotrophic conditions, the biomass and biomass with improved final yield have better growth rates than the conventional wild-type chlorella HS2 microalgae. It was confirmed that there is a possible effect of producing useful ingredients.

<3-2> 배양 조건에 따른 HS-V 미세조류와 클로렐라 엘립소이데아 미세조류의 성장속도 비교<3-2> Comparison of growth rates of HS-V microalgae and chlorella ellipsoidea microalgae according to culture conditions

본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류와, 종래 비올라잔틴을 생산할 수 있는 것으로 알려진 클로렐라 엘립소이데아의 성장속도를 확인하여 비교하였다. 본 발명의 클로렐라 속 HS-V는 광독립영양 조건 및 혼합영양 조건에서 배양하였다. 상기 광독립영양 조건의 배양은 30℃의 온도에서 빛을 120 μmol photons/m2/s로 조사하고 120 rpm으로 교반하여 5L의 배양기(fermenter)에서 배양한 것이다. 상기 혼합영양 조건의 배양은 상기 광독립영양 조건과 동일하게 빛을 조사하고, 유기탄소원으로 포도당이 추가적으로 포함된 배지에서 배양한 것이며, 5L 배양기에서 배양하였다. 배양된 HS-V 미세조류에서 배양액을 제거하고 균체만을 수득하여 4 ℃ 에서 분당 10,000 rpm의 속도로 3분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전된 균체만을 동결건조하였다. 그리고 동결건조된 HS-V 미세조류의 바이오매스의 양을 측정하여, 문헌 상의 클로렐라 엘립소이데아의 바이오매스 생산성과 비교하였다. 상기 클로렐라 엘립소이데아의 바이오매스 생산성은 'S.K. Wang et al., Bioresour Technol., 156, 117-122 (2014)'의 데이터를 참고한 것이다.The growth rate of the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention and the chlorella ellipsoidea known to be capable of producing violaxanthin in the prior art was confirmed and compared. HS-V of the genus Chlorella of the present invention was cultured in photoindependent nutritional conditions and mixed nutritional conditions. The cultivation under the conditions of photoindependent nutrition was cultured in a 5L fermenter by irradiating light at a temperature of 30°C at 120 μmol photons/m 2 /s and stirring at 120 rpm. The cultivation of the mixed nutritional condition was conducted in a medium containing additionally glucose as an organic carbon source, irradiated with light in the same manner as the photoindependent nutritional condition, and cultured in a 5L incubator. The culture medium was removed from the cultured HS-V microalgae, and only the cells were obtained, centrifuged for 3 minutes at 10,000 rpm per minute at 4° C. to discard the supernatant, and only the precipitated cells were lyophilized. And the amount of biomass of lyophilized HS-V microalgae was measured, and compared with the biomass productivity of chlorella ellipsoidea in literature. The biomass productivity of the chlorella ellipsoidea is based on the data of'SK Wang et al ., Bioresour Technol ., 156, 117-122 (2014)'.

그 결과, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 바이오매스 생산 수율은 광독립영양 조건의 경우 4.1 g/L, 혼합영양 조건의 경우 38.6 g/L이었다. 또한, 하루를 기준으로 생산되는 바이오매스 생산성은 광독립영양 조건의 경우 1.15 g/L/day, 혼합영양 조건의 경우 9.5 g/L/day 로 나타났다(하기 표 1에 정리).As a result, the biomass production yield of HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention was 4.1 g/L in the case of photoindependent nutritional conditions and 38.6 g/L in the case of mixed nutritional conditions. In addition, the productivity of biomass produced on a daily basis was 1.15 g/L/day in the case of photoautotrophic conditions and 9.5 g/L/day in the case of mixed nutritional conditions (summarized in Table 1 below).

이에 비해, 클로렐라 엘립소이데아를 광독립영양 조건으로 배양한 바이오매스 생산 수율은 0.77 g/L, 바이오매스 생산성은 0.048 g/L/day인 것으로 확인되는바(하기 표 1에 정리), 동일한 광독립영양 조건을 기준으로 할 때 본 발명의 HS-V 미세조류의 바이오매스 생산 수율이 5.3배 높으며, 단위시간 당 바이오매스 생산성은 24배 더 높은 것을 확인하였다.In contrast, it was confirmed that the biomass production yield obtained by culturing Chlorella ellipsoidea under photoindependent nutritional conditions was 0.77 g/L, and the biomass productivity was 0.048 g/L/day (summarized in Table 1 below), and the same light Based on autotrophic conditions, it was confirmed that the biomass production yield of the HS-V microalgae of the present invention was 5.3 times higher, and the biomass productivity per unit time was 24 times higher.

상기와 같은 결과로 볼 때, 본 발명의 클로렐라 HS-V는 종래 비올라잔틴을 생산하는 미세조류로 알려진 클로렐라 엘립소이데아와 비교할 때, 광독립영양 조건 및 혼합영양 조건에서 모두 성장속도가 현저하게 빠르고 바이오매스의 생산 수율 및 단위시간 당 생산성이 매우 우수한 특성이 있는 미세조류임을 확인할 수 있었다.From the above results, the chlorella HS-V of the present invention has a significantly faster growth rate in both photoindependent nutritional and mixed nutritional conditions as compared to chlorella ellipsoidea known as microalgae producing violaxanthin. It was confirmed that the biomass production yield and productivity per unit time were very excellent.

[실시예 4] 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 비올라잔틴 생산성 향상 효과 확인[Example 4] Confirmation of violaxanthin productivity improvement effect of HS-V microalgae in Chlorella genus

<4-1> 본 발명의 HS-V 미세조류와 야생형 HS2 미세조류의 비올라잔틴 생산성 비교<4-1> Comparison of violaxanthin productivity between HS-V microalgae and wild type HS2 microalgae of the present invention

본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류로부터 생산되는 비올라잔틴의 생산량을 확인하기 위하여, HS-V 미세조류의 비올라잔틴 함량을 측정하고 이를 야생형의 HS2 미세조류 내 비올라잔틴의 함량과 비교하였다.In order to confirm the production amount of violaxanthin produced from HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention, the violaxanthin content of HS-V microalgae was measured and compared with the content of violaxanthin in the wild-type HS2 microalgae.

구체적으로, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류와 야생형 HS2 미세조류의 바이오매스에 포함된 비올라잔틴의 함량을 비교하여 분석하기 위하여, 상기 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 광독립영양 조건과 혼합영양 조건으로 배양하였고, 상기 야생형 HS2 미세조류는 혼합영양 조건으로 배양하였다. 상기 광독립영양 조건의 배양은, 복합비료(High N S-feed, 팜한농)를 1 g/L의 농도로 담수에 첨가하여 배양액을 만들고 온도 30 ℃, 광량 120 μmol photons/m2/s, 분당 120 rpm으로 교반하여 배양한 것이다. 상기 혼합영양 조건의 배양은, 복합비료(High N S-feed, 팜한농)를 1 g/L, 효모 추출물(yeast extract, BD BactoTM Yeast extract, Cat. No. 212750)를 1 g/L, 포도당(Sigma-Aldrich, Cat. No. G7021)을 20 g/L의 농도로 담수에 첨가하여 온도 30 ℃, 광량 120 μmol photons/m2/s, 분당 120 rpm으로 교반하여 배양한 것이다. 상기와 같이 배양된 HS-V 및 HS2 미세조류에서 배양액을 제거하고 균체만을 수득하여 4 ℃ 에서 분당 10,000 rpm의 속도로 3분간 원심분리하여 상등액을 버리고 침전된 균체만을 동결건조하였다. 상기와 같이 동결건조된 균체 1 g 에 100 mL 에탄올을 처리하여 색소를 추출하고 일부를 취해 HPLC 분석을 수행하였다. 상기 HPLC는 시그마에서 판매하는 비올라잔틴 HPLC 분석용 표준품을 이용하였고, HPLC에서 ODS(RP-C18) 컬럼을 이용하여 작성한 정량선을 바탕으로 상기 각 미세조류들의 바이오매스에 함유된 비올라잔틴의 함량을 분석하였다.Specifically, in order to compare and analyze the content of violaxanthin contained in the biomass of HS-V microalgae of the genus Chlorella and wild-type HS2 microalgae of the present invention, HS-V microalgae of the genus Chlorella are mixed with photoindependent nutritional conditions. Cultured under nutrient conditions, and the wild-type HS2 microalgae were cultured under mixed nutrient conditions. In the cultivation of the photoindependent nutrient conditions, a complex fertilizer (High N S-feed, Farm Hannong) was added to fresh water at a concentration of 1 g/L to make a culture solution, and the temperature was 30°C and the amount of light was 120 μmol photons/m 2 /s, It was cultured by stirring at 120 rpm per minute. In the culture of the mixed nutritional conditions, 1 g/L of complex fertilizer (High N S-feed, Farm Hannong), 1 g/L of yeast extract (BD Bacto TM Yeast extract, Cat.No. 212750), Glucose (Sigma-Aldrich, Cat. No. G7021) was added to fresh water at a concentration of 20 g/L and cultured by stirring at a temperature of 30° C., an amount of light of 120 μmol photons/m 2 /s, and 120 rpm per minute. The culture medium was removed from the HS-V and HS2 microalgae cultured as described above, and only the cells were obtained, centrifuged at 4° C. at a rate of 10,000 rpm per minute for 3 minutes to discard the supernatant, and only the precipitated cells were lyophilized. As described above, 1 g of the lyophilized cells were treated with 100 mL ethanol to extract the pigment, and a portion of the lyophilized cells were subjected to HPLC analysis. For the HPLC, a violaxanthin HPLC analysis standard sold by Sigma was used, and the content of violaxanthin contained in the biomass of each of the microalgae was determined based on a quantification curve prepared using an ODS (RP-C18) column in HPLC. Analyzed.

그 결과, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 광독립영양 조건에서는 비올라잔틴 함량이 건조중량의 0.0835%로 측정되어 야생형의 클로렐라 속 HS2 미세조류와 비교할 때 약 20배 이상 비올라잔틴의 함량이 증가하였고, 혼합영양 조건에서는 비올라잔틴 함량이 건조중량의 0.069%로 측정되어 HS2 미세조류에 비해 약 5배 증가하여 생산성이 향상된 것을 확인할 수 있었다(도 4).As a result, in the chlorella genus HS-V microalgae of the present invention, the violaxanthin content was measured to be 0.0835% of the dry weight under the photoindependent nutritional conditions, and the violaxanthin content was about 20 times higher than that of the wild-type chlorella genus HS2 microalgae. In the mixed nutritional condition, the violaxanthin content was measured as 0.069% of the dry weight, and it was confirmed that the productivity was increased by about 5 times compared to the HS2 microalgae (FIG. 4).

상기와 같은 비올라잔틴 함량 측정 결과 및 상기 실시예 3의 결과로 볼 때, 본 발명의 신규한 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 높은 성장속도를 보이며 다량의 바이오매스를 생산할 수 있으면서도, 빛이 주어지는 환경에서 비올라잔틴의 생산성이 종래의 야생형 클로렐라 HS2 미세조류에 비해 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있는바, 많은 양의 비올라잔틴을 생산할 수 있는 특성을 갖는 것임을 알 수 있었다.As a result of the measurement of violaxanthin content as described above and the result of Example 3, the novel HS-V microalgae of Chlorella genus of the present invention exhibits a high growth rate and can produce a large amount of biomass, while in an environment where light is provided. It can be seen that the productivity of violaxanthin is significantly increased compared to the conventional wild-type chlorella HS2 microalgae, and it was found that it has a characteristic capable of producing a large amount of violaxanthin.

<4-2> 종래의 비올라잔틴 생산 미세조류와 본 발명의 미세조류의 색소 생산성 비교<4-2> Comparison of pigment productivity between conventional violaxanthin-producing microalgae and microalgae of the present invention

상기 실시예 <4-1>의 결과에 더하여 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 색소 생산성 향상 효과를 추가로 확인하기 위하여, 본 발명 미세조류의 색소 생산량과 종래 비올라잔틴을 생산하는 것으로 알려진 미세조류의 색소 생산량을 비교하였다.In addition to the results of Example <4-1>, in order to further confirm the effect of improving the pigment productivity of the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention, it is known that the production amount of the pigment of the microalgae of the present invention and the conventional violaxanthin are produced. The pigment production amount of microalgae was compared.

구체적으로, 종래 비올라잔틴을 생산하는 것으로 알려진 Myrmecia bisecta, Nannochloropsis sp., 클로렐라 엘립소이데아 및 상기에서 이용했던 것과 같은 클로렐라 속 HS2 미세조류의 비올라잔틴 함량 및 생산성을 본 발명의 클로렐라 속 HS-V와 비교하였다. 상기 Nannochloropsis sp.는 광독립영양 조건, 클로렐라 속 HS2는 혼합영양 조건으로 배양하여, 비올라잔틴의 함량을 측정하였으며, 각 미세조류에 적합한 배양 조건에 따라 Nannochloropsis sp.는 BG11 배지에서 온도 25℃, 광량 60-70 μmol photons/m2/s의 조건으로, 클로렐라 속 HS2는 BG11 배지에서 포도당을 탄소원으로 하여 온도 30 ℃, 광량 120 μmol photons/m2/s의 조건으로 배양하였다. 상기 Myrmecia bisecta 및 클로렐라 엘립소이데아의 바이오매스 및 색소 생산량은 종래 알려진 데이터를 이용하였으며, 광독립영양 조건으로 배양하였을 때의 데이터를 바탕으로 비교하였다. 상기 Myrmecia bisecta의 데이터는 'F. Wang et al., Marine Drugs, 16,190 (2018)'의 데이터를 참고하였고, 상기 클로렐라 엘립소이데아의 데이터는 'S.K. Wang et al., Bioresour Technol., 156, 117-122 (2014)'및 'W. Soontornchaiboon et al., Biol Pharm Bull. 35(7), 1137-1144 (2012)'의 데이터를 참고하였다. 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 상기 실시예 4-1과 동일한 조건으로 광독립영양 및 혼합영양 조건에서 배양하여 상기와 같은 다른 미세조류와 바이오매스 및 색소의 생산성을 비교하여 하기 표 1에 나타내었다.Specifically, the violaxanthin content and productivity of Myrmecia bisecta , Nannochloropsis sp., Chlorella ellipsoidea , and HS2 microalgae of the genus Chlorella as used above, which are known to produce violaxanthin, were compared with HS-V of the genus Chlorella of the present invention. Compared. The Nannochloropsis sp. was cultured under photoindependent nutritional conditions, and Chlorella genus HS2 was cultured under mixed nutritional conditions, and the content of violaxanthin was measured. According to the culture conditions suitable for each microalgae, Nannochloropsis sp. was at 25°C and light intensity in BG11 medium. Under the condition of 60-70 μmol photons/m 2 /s, HS2 of the genus Chlorella was cultured in BG11 medium under the conditions of a temperature of 30° C. and an amount of light of 120 μmol photons/m 2 /s using glucose as a carbon source. The biomass and pigment production amounts of Myrmecia bisecta and Chlorella ellipsoidea were compared based on data obtained when cultured under photoautotrophic conditions using known data. The data of Myrmecia bisecta is'F . Wang et al ., Marine Drugs, 16,190 (2018)' data were referenced, and the data of the chlorella ellipsoidea was'SK Wang et al ., Bioresour Technol. , 156, 117-122 (2014)'and'W. Soontornchaiboon et al ., Biol Pharm Bull . 35(7), 1137-1144 (2012)' data were referenced. The HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention were cultured under the same conditions as in Example 4-1 in photoindependent nutrition and mixed nutrition, and the productivity of biomass and pigment was compared with other microalgae as described in Table 1 below. Shown in.

StrainStrain 배양조건Culture conditions 바이오매스 생산 수율(g/L)Biomass production yield (g/L) 바이오매스 생산성 (g/L/day)Biomass productivity (g/L/day) 비올라잔틴 함량(%)Violaxanthin content (%) 비올라잔틴 생산성 (mg/L/day)Violaxanthin productivity (mg/L/day) Myrmecia bisectaMyrmecia bisecta 광독립Light independence 2.92.9 0.290.29 0.380.38 1.11.1 Nannochloropsis sp. Nannochloropsis sp. 광독립Light independence 1.851.85 0.0930.093 0.390.39 0.360.36 클로렐라 엘립소이데아Chlorella Ellipsoidea 광독립Light independence 0.770.77 0.0480.048 ≤1≤1 ≤0.48≤0.48 클로렐라 속 HS2Chlorella HS2 혼합mix 3737 9.29.2 0.0210.021 1.931.93 클로렐라 속 HS-VChlorella genus HS-V 광독립Light independence 4.14.1 1.151.15 0.0820.082 0.940.94 혼합mix 38.638.6 9.59.5 0.0610.061 5.795.79

그 결과, 상기 표 1과 같이, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 종래 비올라잔틴을 생산하는 것으로 알려져 있던 Myrmecia bisecta, Nannochloropsis sp., 클로렐라 엘립소이데아 및 클로렐라 속 HS2 미세조류들과 비교할 때 바이오매스의 생산성이 증가되었으며, 비올라잔틴의 함량 비율 자체는 Myrmecia bisecta, Nannochloropsis sp. 및 클로렐라 엘립소이데아에 비해 더 낮았으나 성장속도가 더 높아 단위시간 당 비올라잔틴의 생산성은 현저하게 향상되었다. 클로렐라 엘립소이데아의 비올라잔틴 함량의 경우, 'W. Soontornchaiboon et al., Biol Pharm Bull. 35(7), 1137-1144 (2012)'에서 클로렐라 엘립소이데아의 비올라잔틴 함량이 다른 클로렐라에 비해 높고 HPLC 분석 결과 전체 카로테노이드 색소의 86% 이상을 차지한다는 점에 대해 기재되어 있고, 'J. A. Del Campo et al., J Biotechnol. 76:51-59 (2000)'를 통해 클로렐라를 포함한 다수의 녹색조류에서 비올라잔틴의 함량이 0.16%를 넘지 않는다는 점을 바탕으로, 클로렐라 엘립소이데아의 비올라잔틴 함량이 최대 1% 이하일 것으로 추론한 값이다. 클로렐라 엘립소이데아의 비올라잔틴 생산성의 경우, 상기와 같은 최대 1%의 비올라잔틴 함량을 기준으로, 바이오매스 생산성에 대한 데이터를 바탕으로 계산한 값이다.As a result, as shown in Table 1, when comparing HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention with Myrmecia bisecta , Nannochloropsis sp., Chlorella ellipsoidea and HS2 microalgae of the genus Chlorella, which were known to produce violaxanthin. The productivity of biomass was increased, and the ratio of violaxanthin content itself was Myrmecia bisecta , Nannochloropsis sp. And chlorella ellipsoidea, but the growth rate was higher, and the productivity of violaxanthin per unit time was remarkably improved. For the violaxanthin content of chlorella ellipsoidea,'W. Soontornchaiboon et al ., Biol Pharm Bull . 35(7), 1137-1144 (2012)' describes that the violaxanthin content of Chlorella ellipsoidea is higher than that of other chlorella and accounts for more than 86% of the total carotenoid pigment as a result of HPLC analysis. Campo et al ., J Biotechnol. 76:51-59 (2000)', based on the fact that the content of violaxanthin in many green algae including chlorella does not exceed 0.16%, it was deduced that the violaxanthin content of chlorella ellipsoidea would be at most 1% or less. Value. In the case of violaxanthin productivity of chlorella ellipsoidea, it is a value calculated based on data on biomass productivity based on the maximum violaxanthin content of 1% as described above.

상기와 같은 결과로 볼 때, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 성장속도가 빨라 바이오매스 생산성이 우수하며, 이에 따라 생산되는 비올라잔틴의 생산성도 우수하므로 종래 비올라잔틴을 생산할 수 있는 것으로 알려졌던 미세조류들과 비교할 때, 비올라잔틴을 비롯한 색소의 생산성이 현저하게 증대된 효과가 있는 것임을 알 수 있었다.From the above results, it is known that the HS-V microalgae of Chlorella genus of the present invention has a high growth rate and is excellent in biomass productivity, and thus the productivity of the produced violaxanthin is also excellent, so that conventional violaxanthin can be produced. Compared with the lost microalgae, it was found that the productivity of pigments including violaxanthin was remarkably increased.

[실시예 5] 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 산업적 생산 가능성 확인[Example 5] Confirmation of industrial production possibility of HS-V microalgae in Chlorella genus

본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류가 비올라잔틴을 비롯한 각종 색소를 산업적으로 생산할 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명의 HS-V 미세조류가 장기간 동안 계속적으로 배양이 가능한 특성을 갖는지 여부를 확인하였다. 5L의 배양기(fermenter)에서 3L의 작업량(working volume)으로 희석 비율을 0.33/day로 하였고, 복합비료(High N S-feed, 팜한농)를 1 g/L, 효모 추출물(yeast extract, BD BactoTM Yeast extract, Cat. No. 212750)를 1 g/L, 포도당(Sigma-Aldrich, Cat. No. G7021)을 20 g/L의 농도로 담수에 첨가하여 온도 30 ℃, 광량 120 μmol photons/m2/s, 분당 120 rpm으로 교반하여 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류를 배양하였다.In order to confirm whether the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention can industrially produce various pigments, including violaxanthin, it was confirmed whether the HS-V microalgae of the present invention has the property that can be continuously cultured for a long period of time. . In a 5L fermenter, the dilution ratio was 0.33/day with 3L working volume, 1 g/L of complex fertilizer (High N S-feed, Farm Hannong), yeast extract (BD Bacto) TM Yeast extract, Cat.No. 212750) was added to fresh water at a concentration of 1 g/L and glucose (Sigma-Aldrich, Cat. No. G7021) at a concentration of 20 g/L, and the temperature was 30°C and the amount of light was 120 μmol photons/m. By stirring at 2 / s, 120 rpm per minute, HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention were cultured.

그 결과, 상기와 같은 조건에서 배양시킨 본 발명의 HS-V 미세조류는 기간이 경과함에 따라 유기 탄소원과 질소원이 감소하더라도 점차 세포의 수가 증가하는 방향으로 지속적인 성장을 하는 것을 확인하였다(도 4). 이와 같은 배양 결과는 본 발명의 HS-V 미세조류의 반연속 배양(semi-continuous cultivation)이 성공하였음을 의미하는 것으로, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 반복적인 배양을 통해 생산하고자 하는 비올라잔틴 및 다른 색소들을 지속적으로 생산할 수 있는 것인바, 산업적인 생산에 이용할 수 있는 가능성이 있는 미세조류임을 확인할 수 있었다. As a result, it was confirmed that the HS-V microalgae of the present invention cultured under the above conditions continued to grow in the direction of gradually increasing the number of cells even if the organic carbon source and nitrogen source decreased as the period elapsed (FIG. 4). . Such culture results indicate that the semi-continuous cultivation of the HS-V microalgae of the present invention was successful, and the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention is intended to be produced through repeated culture. Violaxanthin and other pigments can be continuously produced, and it was confirmed that it is a microalgae that can be used for industrial production.

[실시예 6] 클로렐라 속 HS-V 미세조류의 유전적 변이 분석[Example 6] Analysis of genetic variation of HS-V microalgae in Chlorella genus

상기 실시예 1에 기재된 것과 같이, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 야생형의 클로렐라 속 HS2 미세조류에 무작위적인 돌연변이를 유도하여 선별된 것이다. 따라서 구체적으로 본 발명의 HS-V 미세조류의 어떤 유전자에 돌연변이가 발생하여 야생형 HS2 미세조류와 유전적 차이가 있는지 여부를 확인하였다. 상기 HS-V 및 HS2 미세조류의 유전체를 대상으로 일루미나 시퀀싱(Illumina sequencing)을 각각 3번씩 반복하여 수행하였고, 이를 통해 얻은 서열 정보를 기존의 클로렐라 속 HS2 미세조류의 레퍼런스 게놈(reference genome) 정보와 비교하여 본 발명의 HS-V 미세조류와 모균주인 야생형 HS2의 차이를 비교하여 분석하였다.As described in Example 1, the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention were selected by inducing a random mutation in the HS2 microalgae of the genus Chlorella of the present invention. Therefore, in detail, it was confirmed whether a gene of the HS-V microalgae of the present invention has a genetic difference from that of the wild-type HS2 microalgae due to a mutation. Illumina sequencing was repeated three times each for the genomes of the HS-V and HS2 microalgae, and the sequence information obtained through this was used as reference genome information of the existing HS2 microalgae of Chlorella genus. In comparison, the difference between the HS-V microalgae of the present invention and the wild-type HS2 parent strain was compared and analyzed.

구체적으로, 상기와 같이 HS-V 미세조류 및 HS2 미세조류를 3번씩 시퀀싱한 서열 결과 샘플 6개의 데이터를 대상으로 서열 전처리 과정을 거쳐 'cleaned reads'를 선별하고 BWA (0.6.1-r104) 프로그램을 이용하여 레퍼런스 게놈 서열에 맵핑(mapping)을 수행하였다. 그 다음, 상기 맵핑 데이터를 바탕으로 SAMtools (0.1.16) 프로그램을 통해 레퍼런스 게놈과 HS2 미세조류의 샘플 3개, HS-V 미세조류의 샘플 3개를 비교하여 SNP, In/Del 매트릭스를 작성하고, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V와 기존의 클로렐라 속 HS2의 차이를 분석하였다.Specifically, as described above,'cleaned reads' were selected through a sequence pretreatment process for the data of 6 samples of the sequence result of sequencing HS-V microalgae and HS2 microalgae three times, and the BWA (0.6.1-r104) program. Mapping was performed on the reference genome sequence using. Then, based on the above mapping data, the reference genome and 3 samples of HS2 microalgae and 3 samples of HS-V microalgae were compared with the SAMtools (0.1.16) program to create SNP and In/Del matrices. , The difference between HS-V and HS2 of Chlorella genus of the present invention was analyzed.

먼저, 3개의 HS-V 미세조류 샘플 간의 공통 변이, 3개의 HS2 미세조류 샘플 간의 공통 변이를 선발하고, 상기 각 미세조류 샘플들의 공통 변이 좌(loci)를 비교하여, 두 미세조류 간의 SNP 다형성(polymorphic SNP)을 확인하였다. 그 결과, 야생형 HS2 미세조류의 공통 변이 SNP 좌는 4,999개, 본 발명의 HS-V 미세조류의 공통 변이 SNP 좌는 5,310개로 확인되었으며, 그 중에서 두 미세조류의 비교가 가능한 3,664개의 SNP 중에서 9개의 SNP 다형성을 확인할 수 있었다. 상기 9개의 SNP 다형성이 확인된 SNP 좌 중에서 8개의 경우에는, 예를 들어 G, C 염기가 C 염기로 변이되거나 A 염기가 A, T로 변이되는 등 allele의 다양성이 증가된 것에 불과하였으나, 본 발명의 HS-V 미세조류 샘플의 scf7180000002035|quiver의 1142413 위치에서는 G 염기가 T 염기로 변이되어 분명한 차이가 있는 것임을 확인하였다(도 6a). 상기 scf7180000002035|quiver는 시퀀싱 소프트웨어에 의해 부여된 시퀀싱 서열 내 특정 스캐폴드(scaffold)의 넘버 중 하나이다.First, a common mutation between three HS-V microalgae samples and a common mutation between three HS2 microalgae samples were selected, and the common loci of each microalgal sample were compared, and the SNP polymorphism between the two microalgae ( polymorphic SNP) was confirmed. As a result, it was confirmed that 4,999 common mutant SNP loci of wild-type HS2 microalgae and 5,310 common mutant SNP loci of the HS-V microalgae of the present invention were identified, of which 9 out of 3,664 SNPs that can be compared between two microalgae SNP polymorphism could be confirmed. In the case of 8 of the SNP loci in which the 9 SNP polymorphisms were confirmed, for example, G and C bases were changed to C bases, or A bases were changed to A and T, and the diversity of allele was only increased. At the position 1142413 of scf7180000002035|quiver of the HS-V microalgal sample of the present invention, it was confirmed that the G base was mutated to the T base, and there was a clear difference (FIG. 6A ). The scf7180000002035|quiver is one of the numbers of a specific scaffold in the sequencing sequence given by the sequencing software.

또한, 상기 SNP 다형성을 비교한 것과 마찬가지로, 두 미세조류 간에 삽입되거나 결실된 변이(In/Del) 차이를 확인하였다. 그 결과, 야생형 HS2 미세조류의 공통 변이 In/Del은 2,376개, 본 발명의 HS-V 미세조류의 공통 변이 In/Del은 2,572개로 확인되었으며, 그 중에서 두 미세조류의 비교가 가능한 2,006개의 In/Del 중에서 2개의 In/Del 차이를 확인할 수 있었다. 그 중에서, 본 발명의 HS-V 미세조류 샘플의 scf7180000001725|quiver의 141568 위치에서는 12개의 염기서열(GGTCCTGCCCGA)이 결실되어 분명한 차이가 있음을 확인하였다(도 6b). 상기 scf7180000001725|quiver는 시퀀싱 소프트웨어에 의해 부여된 시퀀싱 서열 내 특정 스캐폴드(scaffold)의 넘버 중 하나이다.In addition, similar to the comparison of the SNP polymorphism, the difference (In/Del) inserted or deleted between the two microalgae was confirmed. As a result, it was confirmed that the common mutation In/Del of wild-type HS2 microalgae was 2,376, and the common mutation In/Del of the HS-V microalgae of the present invention was 2,572. Among them, 2,006 In/Del that can be compared between two microalgae were confirmed. Among Del, two In/Del differences could be confirmed. Among them, it was confirmed that 12 nucleotide sequences (GGTCCTGCCCGA) were deleted at the position 141568 of scf7180000001725|quiver of the HS-V microalgal sample of the present invention, and there was a clear difference (FIG. 6b ). The scf7180000001725|quiver is one of the numbers of a specific scaffold in the sequencing sequence given by the sequencing software.

상기와 같은 분석을 통해, 레퍼런스 게놈과 상기 두 미세조류의 유전체 사이에 유의미한 차이가 있는 SNP를 최종적으로 선별하였고, 상기 스캐폴드 넘버와 유전자의 위치 정보를 기반으로, 상기 두 유전자에 대해 클로렐라 속 HS2의 게놈 브라우저에서 각 SNP의 전사체 서열을 추출하였고, 이는 인트론 서열이 제외된 CDS(cDNA sequence)에 해당하는바 NCBI의 블라스트(BLAST)에 이용할 수 있다. 상기와 같이 추출된 전사체 서열을 블라스트(BLAST)를 통해 대조 과정을 거친 결과, 상기 SNP 좌의 변이가 있는 유전자는 리신 tRNA 리가아제(lysine tRNA ligase) 유전자이고, 상기 결실이 일어난 유전자는 CRTISO 유전자임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 클로렐라 속 HS-V 미세조류는 야생형 클로렐라 속 HS2 미세조류와 비교할 때, CRTISO 유전자가 결실되어 있으며, 리신 tRNA 리가아제 유전자에 변이가 발생한 것임을 확인할 수 있었다. 상기 CRTISO는 카로테노이드의 합성 과정의 최종 전구체 물질인 라이코펜(lycopene)을 합성하는 효소이며, 빛이 주어지는 조건에서는 상기 CRTISO 유전자가 결실되어 있더라도 상기 효소의 역할을 대신하여 라이코펜이 생성될 수 있는 특성이 있다. 본 발명의 HS-V 미세조류는 상기와 같은 CRTISO 유전자가 결실되어 있는 것임을 확인하였으며, 이에 따라 빛이 공급되지 않는 종속영양 조건에서는 CRTISO 효소가 발현되지 못하여 라이코펜 및 카로테노이드 색소가 생성되지 않지만, 빛이 주어지는 조건의 광독립영양 및 혼합영양 조건에서는 CRTISO 유전자가 결실되어 있더라도 빛에 의하여 카로테노이드를 생산할 수 있다. Through the analysis as described above, SNPs having a significant difference between the reference genome and the genomes of the two microalgae were finally selected, and based on the scaffold number and the location information of the gene, the two genes were of the genus Chlorella HS2. The transcript sequence of each SNP was extracted from the genome browser of, and this corresponds to the CDS (cDNA sequence) excluding the intron sequence, and can be used for NCBI's BLAST. As a result of the comparison process of the extracted transcript sequence through BLAST, the gene having the mutation at the SNP locus is a lysine tRNA ligase gene, and the gene in which the deletion has occurred is a CRTISO gene. Was confirmed. Therefore, it was confirmed that the HS-V microalgae of the genus Chlorella of the present invention had a deletion of the CRTISO gene and a mutation occurred in the lysine tRNA ligase gene when compared with the wild-type chlorella genus HS2 microalgae. The CRTISO is an enzyme that synthesizes lycopene, which is a final precursor material in the process of synthesizing carotenoids, and under light conditions, even if the CRTISO gene is deleted, lycopene can be produced instead of the role of the enzyme. . The HS-V microalgae of the present invention confirmed that the CRTISO gene as described above was deleted, and accordingly, the CRTISO enzyme was not expressed in a heterotrophic condition in which light was not supplied, so that lycopene and carotenoid pigments were not produced, but light was In the photoindependent and mixed nutritional conditions of the given conditions, carotenoids can be produced by light even if the CRTISO gene is deleted.

상기와 같은 CRTISO 유전자의 결실 때문에, 실시예 1에서와 같이 본 발명의 클로렐라 속 HS-V는 종속영양 조건에서 배양할 경우 야생형의 HS2 미세조류와 비교할 때 색소의 생성이 적어 탈색되는 결과가 나타나는 것으로 예상된다. 또한, CRTISO 유전자의 돌연변이로 인해 빛이 주어지지 않는 조건에서는 라이코펜 및 카로테노이드 색소를 합성하지 못하다가, 빛이 주어지게 되면 급격하게 라이코펜을 합성하게 되고 이로 인하여 최종적으로 생성되는 카로테노이드 색소의 구성 비율이 변화하여 비올라잔틴을 더 많은 양 생성할 수 있는 특성을 갖게 된 것으로 예상되며, 리신 tRNA 리가아제 유전자의 변이도 위와 같은 과정에 중요한 요인 중 하나로 작용할 것으로 예상된다.Because of the deletion of the CRTISO gene as described above, as in Example 1, HS-V of the genus Chlorella of the present invention produced less pigment than that of wild-type HS2 microalgae when cultured under heterotrophic conditions, resulting in decolorization. Expected. In addition, due to the mutation of the CRTISO gene, lycopene and carotenoid pigments cannot be synthesized under conditions where light is not applied, but when light is given, lycopene is rapidly synthesized, and the composition ratio of the carotenoid pigment finally produced is changed. As a result, it is expected to have a characteristic capable of producing a greater amount of violaxanthin, and mutations in the lysine tRNA ligase gene are also expected to act as one of the important factors in the above process.

이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.In the above, the present invention has been described in detail only with respect to the described embodiments, but it is obvious to those skilled in the art that various modifications and modifications are possible within the scope of the technical idea of the present invention, and it is natural that such modifications and modifications belong to the appended claims.

한국생명공학연구원 생물자원센터Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Biological Resource Center KCTC13850BPKCTC13850BP 2019052120190521

Claims (10)

기탁번호 KCTC 13850BP로 기탁된 클로렐라 속(Chlorella sp.) HS-V 미세조류.
 Chlorella sp. HS-V microalgae deposited with accession number KCTC 13850BP.
 청구항 1에 있어서,
상기 미세조류는 클로렐라 속 HS2 미세조류에 비해 비올라잔틴 생산성이 향상된 것인, HS-V 미세조류.
The method according to claim 1,
The microalgae is that the productivity of violaxanthin is improved compared to HS2 microalgae of the genus Chlorella, HS-V microalgae.
 청구항 1에 있어서,
상기 미세조류는 빛이 없는 조건에서 클로렐라 속 HS2 미세조류에 비해 성장속도가 향상된 것인, HS-V 미세조류.
The method according to claim 1,
The microalgae is that the growth rate is improved compared to the HS2 microalgae of the genus Chlorella in the absence of light conditions, HS-V microalgae.
 청구항 1에 있어서,
상기 미세조류는 CRTISO 유전자가 결실되는 돌연변이가 발생하고, 리신 tRNA 리가아제(lysine tRNA ligase) 유전자의 돌연변이가 더 발생한 것인, HS-V 미세조류.
The method according to claim 1,
In the microalgae, a mutation in which the CRTISO gene is deleted occurs, and a mutation in the lysine tRNA ligase gene is further generated, HS-V microalgae.
 청구항 1에 따른 미세조류를 빛이 주어지는 조건에서 배양하는 단계; 및
상기 미세조류의 배양액으로부터 추출물을 얻는 단계;를 포함하는, 카로테노이드 색소의 생산 방법.
Culturing the microalgae according to claim 1 in a condition where light is applied; And
A method for producing a carotenoid pigment comprising; obtaining an extract from the culture medium of the microalgae.
 청구항 5에 있어서,
상기 카로테노이드 색소는 비올라잔틴, 루테인 및 베타카로틴으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인, 카로테노이드 색소의 생산 방법.
The method of claim 5,
The carotenoid pigment is a method for producing a carotenoid pigment comprising any one or more selected from the group consisting of violaxanthin, lutein, and beta-carotene.
 청구항 5에 있어서,
상기 미세조류를 빛이 주어지는 조건에서 배양하는 단계는 유기 탄소원이 함께 제공되는 것인, 카로테노이드 색소의 생산 방법.
The method of claim 5,
The step of culturing the microalgae in a condition in which light is given is provided with an organic carbon source, a method for producing a carotenoid pigment.
 청구항 5에 있어서,
상기 미세조류를 빛이 주어지는 조건에서 배양하는 단계는 조사되는 빛의 광량이 100 내지 140 μmol photons/m2/s, 온도가 28 내지 32 ℃인 조건에서 배양하는 것인, 카로테노이드 색소의 생산 방법.
The method of claim 5,
The step of culturing the microalgae in the condition where light is applied is to cultivate the microalgae under conditions of 100 to 140 μmol photons/m 2 /s and a temperature of 28 to 32 °C.
 청구항 5에 있어서,
상기 미세조류의 배양액으로부터 추출물을 얻는 단계 이후에 상기 추출물에서 카로테노이드 색소를 분리하는 단계를 더 포함하는, 카로테노이드 색소의 생산 방법.
The method of claim 5,
After the step of obtaining the extract from the culture medium of the microalgae, further comprising the step of separating the carotenoid pigment from the extract, carotenoid pigment production method.
 청구항 5에 있어서,
상기 카로테노이드 색소의 생산 방법은 처음 빛을 조사한 이후로 15일 이상 카로테노이드 색소를 생산할 수 있는 것인, 카로테노이드 색소의 생산 방법.The method of claim 5,
The method for producing a carotenoid pigment is that the carotenoid pigment can be produced for 15 days or more after irradiation with light for the first time.
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