JP7157617B2 - Lipid manufacturing method - Google Patents
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Description
本発明は、藻類を用いた脂質の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing lipid using algae.
脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとエステル結合をしてトリアシルグリセロール等の脂質を構成し、多くの動植物においてエネルギー源として貯蔵され利用される物質である。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質（油脂）は、食用又は工業用として広く利用されている。
例えば、炭素数１２～１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として、また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として、いずれも洗浄剤又は殺菌剤として利用されている。同じく高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩等のカチオン性界面活性剤は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤として、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。また、植物油脂はバイオディーゼル燃料の原料としても利用されている。
このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたる。そのため、植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。
Fatty acids are one of the main constituents of lipids, form lipids such as triacylglycerols by ester bonding with glycerol in vivo, and are stored and utilized as energy sources in many animals and plants. BACKGROUND ART Fatty acids and lipids (oils and fats) stored in animals and plants are widely used for food or industrial purposes.
For example, higher alcohol derivatives obtained by reducing higher fatty acids having around 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. Alkyl sulfates, alkylbenzene sulfonates, etc. are used as anionic surfactants, and polyoxyalkylene alkyl ethers, alkyl polyglycosides, etc. are used as nonionic surfactants, both of which are used as detergents or disinfectants. ing. Similarly, cationic surfactants such as alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary amine salts, which are derivatives of higher alcohols, are used as fiber treatment agents, hair rinse agents or disinfectants, and benzalkonium-type quaternary ammonium salts are used as disinfectants and disinfectants. It is routinely used as a preservative. Vegetable oils and fats are also used as raw materials for biodiesel fuel.
In this way, fatty acids and lipids are used in a wide variety of ways. Therefore, attempts have been made to improve the in vivo productivity of fatty acids and lipids in plants and the like.
近年、持続可能な社会の実現に向けて再生可能エネルギーに関する研究が推し進められている。特に光合成微生物は、二酸化炭素の削減効果に加えて、穀物と競合しないバイオ燃料生物として期待されている。
特に近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
In recent years, research on renewable energy has been promoted for the realization of a sustainable society. In particular, photosynthetic microorganisms are expected as biofuel organisms that do not compete with grains, in addition to the effect of reducing carbon dioxide.
Especially in recent years, algae have attracted attention as being useful for biofuel production. Algae are attracting attention as a next-generation biomass resource because they can produce lipids that can be used as biodiesel fuel through photosynthesis and do not compete with food. There are also reports that algae have higher lipid production and accumulation capacity than plants.
一方で、藻類は硬い細胞壁や細胞外層に覆われているため、藻体内からの脂質の回収効率は一般的に低い。そのため、藻類を用いて脂質を製造する際には、細胞壁を物理的ないし化学的に破壊することが必要である。しかし現状では、藻類の細胞壁の十分な破壊が達成できているわけではない。そのため、藻体内からの脂質の回収効率がより優れた脂質の製造方法の開発に需要がある。例えば、イカダモ（Scenedesmus）属に属する微細藻類の湿藻体を、全質量に対して５質量％から９６質量％の水分を含むように調整し、湿藻体中の藻類の細胞壁を破壊処理し、処理物から油脂類を抽出する工程を含む、油脂類を抽出する方法が報告されている（特許文献１）。
しかしながら藻体の形質を分子遺伝学的に改質させることにより、藻体内からの脂質の回収効率を向上させることについては報告がない。
On the other hand, since algae are covered with hard cell walls and outer layers, the recovery efficiency of lipids from algal cells is generally low. Therefore, when producing lipids using algae, it is necessary to destroy the cell walls physically or chemically. However, at present, sufficient destruction of the cell walls of algae has not been achieved. Therefore, there is a demand for the development of a method for producing lipids with higher lipid recovery efficiency from algal cells. For example, wet algal bodies of microalgae belonging to the genus Scenedesmus are adjusted to contain 5% by mass to 96% by mass of water relative to the total mass, and the cell walls of the algae in the wet algal bodies are destroyed. , a method for extracting fats and oils, including a step of extracting fats and oils from a processed product, has been reported (Patent Document 1).
However, there is no report on the improvement of lipid recovery efficiency from alga bodies by molecularly modifying the traits of alga bodies.
本発明は、脂質の生産性に優れる、脂質の製造方法の提供を課題とする。
また本発明は、藻体内からの脂質の回収効率に優れる、脂質の回収方法の提供を課題とする。
An object of the present invention is to provide a lipid production method with excellent lipid productivity.
Another object of the present invention is to provide a method for recovering lipids that is highly efficient in recovering lipids from algal bodies.
ナンノクロロプシスは分子生物学的にも研究が進んでおり、相同組換えやゲノム編集が可能である（Oliver Kilian et al., PNAS, 2011 December, 108(52) p.21265-21269；Qintao Wang et al., the Plant Journal, 2016 August, 88, p.1071-1081）。このような状況の下、本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねた。
藻類は細胞壁に覆われており、さらに藻類の一部はアルジナン層と呼ばれる硬い殻のような構造を持つ。ゆえに、これまで藻類から脂質を回収する際には、細胞壁及びアルジナン層を物理的又は化学的に破壊する必要があった。
Nannochloropsis has been studied in molecular biology, and homologous recombination and genome editing are possible (Oliver Kilian et al., PNAS, 2011 December, 108(52) p.21265-21269; Qintao Wang et al., the Plant Journal, 2016 August, 88, p.1071-1081). Under such circumstances, the present inventors have made earnest studies in view of the above problems.
Algae are covered with cell walls, and some algae have a hard shell-like structure called an arginan layer. Therefore, when recovering lipids from algae, it has been necessary to physically or chemically destroy the cell wall and arginan layer.
そこで発明者らは、細胞壁の構成成分であるセルロースを合成する酵素（以下、「セルロース合成酵素」、若しくは「CES」ともいう）をコードする遺伝子（以下、「セルロース合成酵素遺伝子」、若しくは「CES遺伝子」ともいう）又は、アルジナン層の構築に関与すると思われるポリケチド合成酵素（以下、「アルジナン合成に関与するPKS」ともいう）をコードする遺伝子（以下、「ポリケチド合成酵素遺伝子」、若しくは「PKS遺伝子」ともいう）を破壊した藻類を作出した。そして、当該藻類改変体を用いて脂質の回収を行ったところ、当該藻類改変体は野生株と比較して高い脂質の回収効率を示すことを見出した。
本発明はこれらの知見に基づき完成されるに至ったものである。
Therefore, the inventors found a gene (hereinafter referred to as "cellulose synthase gene" or "CES") that encodes an enzyme that synthesizes cellulose, which is a component of the cell wall (hereinafter also referred to as "cellulose synthase" or "CES"). Also referred to as "gene") or a gene encoding a polyketide synthase (hereinafter also referred to as "PKS involved in arginane synthesis") that is thought to be involved in the construction of the arginane layer (hereinafter referred to as "polyketide synthase gene" or "PKS (also called "gene") to create algae. When lipids were recovered using the modified algae, the inventors found that the modified algae exhibited higher lipid recovery efficiency than the wild strain.
The present invention has been completed based on these findings.
本発明は、CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類（以下、「藻類改変体」ともいう）を用いる、脂質の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing lipids using algae (hereinafter also referred to as "altered algae") in which the expression of at least one protein selected from the group consisting of CES and PKS involved in arginane synthesis is reduced or lost. .
また本発明は、CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を用いる、脂質の回収方法に関する。 The present invention also relates to a method for recovering lipids using algae in which the expression of at least one protein selected from the group consisting of CES and PKS involved in arginane synthesis is reduced or lost.
本発明で用いる藻類改変体は、藻体内からの脂質の回収効率に優れる。
よって、本発明の脂質の回収方法は、野生株の藻類を使用したときと比べて、効率よく脂質を回収できる。また、本発明の脂質の製造方法は、野生株の藻類を使用したときと比べて、脂質の回収が容易である。
The modified alga used in the present invention is excellent in efficiency of lipid recovery from algal cells.
Therefore, the method for collecting lipids of the present invention can collect lipids more efficiently than when wild-type algae are used. In addition, the method for producing lipids of the present invention makes it easier to recover lipids than when wild-type algae are used.
本明細書における「脂質」は、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド等の単純脂質；リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等の複合脂質；及びこれらの脂質から誘導される、脂肪酸（遊離脂肪酸）、アルコール類、炭化水素類等の誘導脂質を包含するものである。
一般に誘導脂質に分類される脂肪酸は、脂肪酸そのものを指し、「遊離脂肪酸」を意味する。本発明では単純脂質及び複合脂質分子中の脂肪酸部分を「脂肪酸残基」と表記する。そして、特に断りのない限り、「脂肪酸」は「遊離脂肪酸」と、塩又はエステル化合物等に含まれる「脂肪酸残基」の総称として用いる。
また本明細書において、「脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質」は、「遊離脂肪酸」と「当該脂肪酸残基を有する脂質」を総称して用いる。更に本明細書において、「脂肪酸組成」とは、前記遊離脂肪酸と脂肪酸残基とを合計した全脂肪酸（総脂肪酸）の重量に対する各脂肪酸の重量の割合を意味する。脂肪酸の重量（生産量）や脂肪酸組成は、実施例で用いた方法により測定できる。
なお、本明細書において、「脂肪酸」とは、脂肪族カルボン酸であれば特に制限はないが、好ましくはアシル基の炭素原子数が２以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下であることをいう。
さらに本明細書において、脂肪酸や、脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Cx:y」とあるのは、炭素原子数がxであり、二重結合の数がyであることを表す。「Cx」は炭素原子数がxの脂肪酸やアシル基を表す。
The term "lipid" used herein refers to neutral lipids (such as triacylglycerol), simple lipids such as waxes and ceramides; complex lipids such as phospholipids, glycolipids and sulfolipids; and fatty acids derived from these lipids. (free fatty acids), alcohols, hydrocarbons and other derived lipids.
Fatty acids, which are generally classified as derived lipids, refer to the fatty acids themselves, meaning "free fatty acids." In the present invention, fatty acid moieties in simple lipid and complex lipid molecules are referred to as "fatty acid residues". Unless otherwise specified, "fatty acid" is used as a generic term for "free fatty acid" and "fatty acid residue" contained in a salt, ester compound, or the like.
Moreover, in the present specification, "a fatty acid or a lipid having this as a constituent" is used as a generic term for "a free fatty acid" and "a lipid having the fatty acid residue". Furthermore, as used herein, the term "fatty acid composition" means the ratio of the weight of each fatty acid to the total weight of the total fatty acid (total fatty acid) including the free fatty acid and the fatty acid residue. The weight (production amount) and fatty acid composition of fatty acids can be measured by the methods used in the examples.
In the present specification, the term “fatty acid” is not particularly limited as long as it is an aliphatic carboxylic acid, preferably the acyl group has 2 to 22 carbon atoms, more preferably 4 to 22 The number of carbon atoms is preferably 6 or more and 22 or less, more preferably 8 or more and 22 or less, more preferably 10 or more and 22 or less, and still more preferably 12 or more and 20 or less. Say something.
Furthermore, in the present specification, "Cx:y" in the notation of fatty acids and acyl groups constituting fatty acids means that the number of carbon atoms is x and the number of double bonds is y. "Cx" represents a fatty acid or an acyl group having x carbon atoms.
本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning－A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook，David W．Russell.，Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
さらに明細書において、遺伝子の「上流」とは、翻訳開始点からの位置ではなく、対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示す。一方、遺伝子の「下流」とは、対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
As used herein, the identity of nucleotide sequences and amino acid sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol.227, p.1435-1441). Specifically, it is calculated by performing analysis using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win with a Unit size to compare (ktup) of 2.
In the present specification, "stringent conditions" include, for example, Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W.; Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]. For example, in a solution containing 6 x SSC (composition of 1 x SSC: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 x Denhardt and 100 mg/mL herring sperm DNA The conditions include incubating with the probe at 65° C. for 8 to 16 hours for hybridization.
Furthermore, in the specification, "upstream" of a gene does not refer to the position from the translation initiation point, but to the region following the 5' side of the gene or region of interest. On the other hand, "downstream" of a gene indicates a region following the 3' side of the gene or region of interest.
本発明において、藻類改変体として、CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を使用する。また、本発明で用いる藻類改変体は、CES及びアルジナン合成に関与するPKSの発現が共に低下又は喪失していることが好ましい。
本発明で用いる藻類改変体は、CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失している天然の藻類であってもよく、前記タンパク質の発現を低下又は喪失させた藻類を用いることもできる。
このような藻類においてCES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現の低下又は喪失は、該タンパク質をコードする遺伝子、又はその周辺の塩基配列を解析することで確認できる。
In the present invention, as modified algae, algae in which the expression of at least one protein selected from the group consisting of CES and PKS involved in arginane synthesis is reduced or lost is used. Moreover, in the modified algae used in the present invention, it is preferred that the expression of both CES and PKS involved in arginane synthesis is reduced or eliminated.
The modified algae used in the present invention may be natural algae in which the expression of at least one protein selected from the group consisting of CES and PKS involved in arginane synthesis is reduced or lost, and expression of the protein Algae with reduced or lost can also be used.
Decrease or loss of expression of PKS involved in CES or arginane synthesis in such algae can be confirmed by analyzing the gene encoding the protein or its surrounding nucleotide sequence.
CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現が低下又は喪失した前記藻類は、死滅することなく、若しくは生育性を大きく損なうことなく、セルロースの合成又はアルジナン合成が阻害される。その結果、このような藻類においては、セルロース由来の細胞壁又はアルジナン層の構築が阻害されるため、脂質の製造の過程において脂質の回収効率が向上する。
このように回収効率が向上した藻類改変体は、脂質の製造に好適に用いることができる。
Algae in which the expression of PKS involved in CES or arginane synthesis is reduced or lost, cellulose synthesis or arginane synthesis is inhibited without dying or significantly impairing viability. As a result, in such algae, the construction of the cellulose-derived cell wall or arginan layer is inhibited, so that the lipid recovery efficiency is improved in the process of lipid production.
The modified algae with improved recovery efficiency in this way can be suitably used for the production of lipids.
藻類の細胞は、細胞壁と呼ばれる構造に覆われており、セルロースがその主成分である。セルロースは複数のサブユニットからなるセルロース合成酵素複合体によって合成される。この複合体の活性部位は、サブユニットA（以下、「CESA」という）が担っていると考えられる。ゆえに、藻類においてCES（好ましくはCESを構成するいずれか１つのサブユニット、好ましくはCESA）の発現を低下又は喪失させることにより、セルロース合成が阻害されることで細胞壁構築が阻害され、物理的又は化学的処理による細胞破壊が容易となることから、藻体からの脂質の回収が容易である藻類を得ることができる。
本発明における「セルロース合成酵素」とは、CES遺伝子から発現したタンパク質からなる酵素(あるいは複合体)で、セルロースの生合成に関与する酵素のことをいう。
また、本明細書において、「セルロース合成活性」（以下、「CES活性」ともいう）とは、セルロース合成反応を触媒する活性を意味する。
Algae cells are covered with a structure called a cell wall, the main component of which is cellulose. Cellulose is synthesized by a multi-subunit cellulose synthase complex. The active site of this complex is thought to be borne by subunit A (hereinafter referred to as "CESA"). Therefore, by reducing or eliminating the expression of CES (preferably any one subunit constituting CES, preferably CESA) in algae, cell wall construction is inhibited by inhibiting cellulose synthesis, and physical or Since cell disruption by chemical treatment is facilitated, algae can be obtained from which lipids can be easily recovered from alga bodies.
The term "cellulose synthase" as used in the present invention refers to an enzyme (or complex) composed of a protein expressed from the CES gene and involved in cellulose biosynthesis.
Further, in the present specification, "cellulose synthesis activity" (hereinafter also referred to as "CES activity") means activity to catalyze a cellulose synthesis reaction.
また一部の藻類は、セルロース由来の細胞壁の外側に、難分解性のアルジナンを含む細胞壁を有する。セルロース由来の細胞壁に加えて、アルジナン由来の細胞壁（以下、「アルジナン層」ともいう）を有することで、藻類は非常に硬い殻のような構造を獲得している。このアルジナン生合成については知見が蓄積されていないが、PKSの関与が示唆されている。ゆえに、アルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失させることにより、アルジナン合成が阻害されることでアルジナン層構築が阻害され、物理的又は化学的処理による細胞破壊が容易となることが推定されることから、藻体からの脂質の回収が容易な藻類を得ることができると考えられる。 Some algae also have a cell wall containing persistent arginane outside the cellulose-derived cell wall. In addition to the cellulose-derived cell wall, algae have an arginan-derived cell wall (hereinafter, also referred to as an "arginan layer"), and thus acquire a very hard shell-like structure. Although knowledge has not been accumulated about this arginane biosynthesis, involvement of PKS is suggested. Therefore, it is presumed that by reducing or eliminating the expression of PKS involved in arginane synthesis, arginane synthesis is inhibited, thereby inhibiting arginane layer construction and facilitating cell destruction by physical or chemical treatment. Therefore, it is considered that algae from which lipids can be easily recovered from the algal bodies can be obtained.
本発明に用いる藻類改変体は、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現が低下又は喪失しているため、セルロース合成又はアルジナン合成が阻害されている。なお、藻類改変体において上記CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現が低下又は喪失されていることは、例えば後述の実施例に記載の方法によって確認することができる。 Cellulose synthesis or arginane synthesis is inhibited in the modified algae used in the present invention because the expression of PKS involved in CES or arginane synthesis is reduced or lost. It should be noted that whether the expression of PKS involved in CES or arginane synthesis is reduced or lost in the algae variant can be confirmed, for example, by the method described in Examples below.
本明細書において、培養物（ここで「培養物」とは、培養した後の培養液及び藻類改変体をいう）から常法に従い単離することで、脂質を回収することができる。
培養物から脂質を回収する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前述の培養物を熱処理、高圧処理、高温高圧処理、ビーズ等を用いた物理的破砕、ハンドプレス法等の圧搾、酸若しくはアルカリ処理、消化酵素等の化学的処理、等の方法により細胞を破砕した後に、ろ過、遠心分離、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、エタノール抽出法等により脂質成分を単離することで、脂質を回収することができる。
なお、より大規模な培養を行った場合は、培養物より油分を圧搾又は溶媒抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行うことで、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
As used herein, lipids can be recovered by isolating from a culture (herein, the term "culture" refers to culture medium and modified algae after culturing) according to a conventional method.
A method for recovering lipids from a culture can be appropriately selected from conventional methods. For example, the above-mentioned culture is subjected to heat treatment, high pressure treatment, high temperature and high pressure treatment, physical crushing using beads, etc., pressing such as hand press method, acid or alkali treatment, chemical treatment such as digestive enzyme, etc. After crushing, lipids can be recovered by isolating the lipid components by filtration, centrifugation, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method, ethanol extraction method, etc. can.
In the case of large-scale culture, after recovering the oil from the culture by squeezing or solvent extraction, general refining such as degumming, deacidification, decolorization, dewaxing, and deodorization can be performed to remove lipids. can be obtained. After isolating the lipid component in this manner, fatty acids can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid. Methods for isolating fatty acids from lipid components include, for example, a method of treatment in an alkaline solution at a high temperature of about 70° C., a method of lipase treatment, and a method of decomposition using high-pressure hot water.
本発明の製造方法において製造される脂質、及び本発明の回収方法によって得られる脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがより好ましく、炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。
脂質中に含まれる脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、TAGがさらにより好ましい。
From the viewpoint of usability, the lipid produced by the production method of the present invention and the lipid obtained by the recovery method of the present invention preferably contain a fatty acid or a fatty acid compound, and have 2 to 22 carbon atoms. More preferably, it contains a fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 4 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, and a fatty acid having 6 to 22 carbon atoms or more preferably contains a fatty acid ester compound thereof, more preferably containing a fatty acid having 8 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, a fatty acid having 10 to 22 carbon atoms or its More preferably, it contains a fatty acid ester compound, and more preferably contains a fatty acid having 12 to 20 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof.
From the viewpoint of productivity, the fatty acid ester compound contained in the lipid is preferably a simple lipid or a complex lipid, more preferably a simple lipid, and even more preferably TAG.
本発明の製造方法により得られる脂肪酸は、食用として用いる他、可塑剤、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。 In addition to being used as food, the fatty acid obtained by the production method of the present invention can be used as a plasticizer, an emulsifier for cosmetics, a cleaning agent such as soap or detergent, a fiber treatment agent, a hair rinse, or a bactericide or antiseptic. can be done.
本発明に用いる藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属の藻類、クロレラ属の藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属の藻類、又は真正眼点藻綱に属する藻類が好ましく、真正眼点藻綱に属する藻類がより好ましい。真正眼点藻綱に属する藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス属の藻類、モノドプシス（Monodopsis）属の藻類、ビスケリア（Vischeria）属の藻類、クロロボトリス（Chlorobotrys）属の藻類、ゴニオクロリス（Goniochloris）等が挙げられる。なかでも、ナンノクロロプシス属の藻類が好ましい。ナンノクロロプシス属の藻類の具体例としては、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ(Nannochloropsis
oculata)、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis
gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis
salina）、ナンノクロロプシス・リムネティカ（Nannochloropsis
limnetica）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis
granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis sp．）等が挙げられる。なかでも、ナンノクロロプシス・オセアニカ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オセアニカがより好ましい。
なお、ナンノクロロプシス・オセアニカ等の藻類は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することができる。例えば、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株は、国立環境研究所（NIES）から入手することができる。
Algae used in the present invention are algae belonging to the genus Chlamydomonas , algae belonging to the genus Chlorella, algae belonging to the genus Phaeodactylum, or eunotum algae, from the standpoint of well-established genetic recombination techniques. algae are preferred, and algae belonging to the class Eeculophyta are more preferred. Specific examples of algae belonging to the genus Eunotumphyta include algae belonging to the genus Nannochloropsis, algae belonging to the genus Monodopsis , algae belonging to the genus Vischeria , algae belonging to the genus Chlorobotrys , and algae belonging to the genus Goniochloris . is mentioned. Among them, algae belonging to the genus Nannochloropsis are preferred. Specific examples of algae belonging to the genus Nannochloropsis include Nannochloropsis oceanica, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gaditana , Nannochloropsis salina , and Nannochloropsis. Examples include Nannochloropsis limnetica , Nannochloropsis granulata , Nannochloropsis sp. Among them, Nannochloropsis oceanica or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oceanica is more preferable.
Algae such as Nannochloropsis oceanica can be obtained from preservation institutions such as private or public research institutes. For example, the strain Nannochloropsis oceanica NIES-2145 can be obtained from the National Institute for Environmental Studies (NIES).
藻類の培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。
培地に接種する藻類の量は適宜選択することができ、生育性の点から培地当り１～５０％（vol/vol）が好ましく、１～１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５～４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０～３５℃であり、より好ましくは１５～３０℃である。
また藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の光強度としては、藻類の生育促進、及び脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１～４，０００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１０～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１００～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２００～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２５０～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは３００～２，５００μmol/m2/sの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８～２４時間、より好ましくは１０～１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
また藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、及び脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）～１０％が好ましく、より好ましくは０．０５～５％、さらに好ましくは０．１～３％、よりさらに好ましくは０．３～１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進の観点から０．０１～５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５～２質量％、さらに好ましくは０．１～１質量％である。
培養時間は特に限定されず、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３～９０日間、より好ましくは７～３０日間、さらに好ましくは１４～２１日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、振とう培養が好ましい。
The algae medium may be based on natural seawater or artificial seawater, or may be a commercially available culture medium. Specific media include f/2 medium, ESM medium, Daigo IMK medium, L1 medium, MNK medium, and the like. Among them, f / 2 medium, ESM medium, or Daigo IMK medium is preferable, f / 2 medium or Daigo IMK medium is more preferable, and f / 2 medium is further preferable, from the viewpoint of improving lipid productivity and nutrient concentration. preferable. Nitrogen sources, phosphorus sources, metal salts, vitamins, trace metals, and the like can be appropriately added to the medium in order to promote the growth of algae and improve the productivity of fatty acids.
The amount of algae to be inoculated into the medium can be appropriately selected, and is preferably 1 to 50% (vol/vol), more preferably 1 to 10% (vol/vol) per medium in terms of growth. The culture temperature is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of algae, but is usually in the range of 5 to 40°C. From the viewpoints of promoting the growth of algae, improving productivity of fatty acids, and reducing production costs, the temperature is preferably 10 to 35°C, more preferably 15 to 30°C.
Moreover, it is preferable to culture algae under light irradiation so that photosynthesis can be performed. Light irradiation may be carried out under conditions that allow photosynthesis, and may be artificial light or sunlight. The light intensity at the time of light irradiation is preferably in the range of 1 to 4,000 μmol/m 2 /s, more preferably 10 to 2,500 μmol/m 2 from the viewpoint of promoting the growth of algae and improving productivity of fatty acids. /s, more preferably 100 to 2,500 μmol/m 2 /s, more preferably 200 to 2,500 μmol/m 2 /s, more preferably 250 to 2,500 μmol/m 2 /s , more preferably 300 to 2,500 μmol/m 2 /s. In addition, the interval of light irradiation is not particularly limited, but from the same viewpoint as above, it is preferable to carry out in a light-dark cycle. More preferably, it is 12 hours.
In addition, it is preferable to culture algae in the presence of a gas containing carbon dioxide or in a medium containing a carbonate such as sodium bicarbonate so that photosynthesis can be performed. The concentration of carbon dioxide in the gas is not particularly limited, but from the viewpoint of promoting growth and improving productivity of fatty acids, it is preferably 0.03 (same as atmospheric conditions) to 10%, more preferably 0.05 to 5%. , more preferably 0.1 to 3%, and even more preferably 0.3 to 1%. Although the concentration of carbonate is not particularly limited, for example, when sodium hydrogen carbonate is used, it is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 2% by mass, and still more preferably 0.1% from the viewpoint of promoting growth. ~1% by mass.
Cultivation time is not particularly limited, and may be carried out for a long period of time (for example, about 150 days). The culture period is preferably 3 to 90 days, more preferably 7 to 30 days, and still more preferably 14 to 21 days, from the viewpoints of promoting algae growth, improving productivity of fatty acids, and reducing production costs. The culture may be any of aeration and agitation culture, shaking culture, or stationary culture, and shaking culture is preferable from the viewpoint of improving aeration.
本発明で発現を低下又は喪失させるCESは、CES活性を示すタンパク質（酵素）であれば特に制限はない。
本発明で発現を低下又は喪失させるCESは、例えば、ゲノム情報を基にBlastで解析し、CESとアノテーションされたものを候補として選択できる。またはBlastpによってアミノ酸配列を解析し、CESとアノテーションされたものもまた候補として選択できる。更に選択したタンパク質をコードする遺伝子を破壊又は欠失させた藻類を培養し細胞壁のセルロース層への影響を調べることでタンパク質を確認してもよい。
CES whose expression is reduced or eliminated in the present invention is not particularly limited as long as it is a protein (enzyme) exhibiting CES activity.
CES whose expression is reduced or lost in the present invention can be selected as candidates by, for example, Blast analysis based on genome information and annotated as CES. Alternatively, those annotated as CES by analyzing the amino acid sequence by Blastp can also be selected as candidates. Furthermore, the protein may be confirmed by culturing algae in which the gene encoding the selected protein has been disrupted or deleted, and examining the effect on the cellulose layer of the cell wall.
本発明における好ましいCESとしては、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）が挙げられる。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつCES活性を有するタンパク質。
Preferred CES in the present invention include the following protein (A) or (B).
(A) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
(B) A protein consisting of an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of the protein (A) and having CES activity.
配列番号１のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ａ）は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のセルロース合成酵素複合体のサブユニットAを構成するタンパク質（以下、「CESA1」ともいう）である。本発明の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ａ））はCES活性を有する。 The protein (A) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a protein that constitutes subunit A of the cellulose synthase complex derived from the strain Nannochloropsis oceanica NIES-2145, an alga belonging to the genus Nannochloropsis (hereinafter referred to as , also called “CESA1”). The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 of the present invention (the protein (A)) has CES activity.
タンパク質（Ｂ）は、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつCES活性を有する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明で規定するタンパク質において、このようにCES活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質も包含する。
Protein (B) consists of an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of protein (A), and has CES activity.
In general, amino acid sequences encoding enzyme proteins do not necessarily exhibit enzymatic activity unless the sequence of the entire region is conserved. known to exist. In such regions that are not essential for enzymatic activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if mutations such as deletion, substitution, insertion or addition of amino acids are introduced. Among the proteins defined in the present invention, proteins in which the CES activity is retained and the amino acid sequence is partially mutated are also included.
前記タンパク質（Ｂ）において、CES活性の点から、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。 In the protein (B), the identity with the amino acid sequence of the protein (A) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, and 80% or more from the viewpoint of CES activity. More preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 94% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more preferable.
また、前記タンパク質（Ｂ）として、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上３００個以下、好ましくは１個以上２６３個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８８個以下、より好ましくは１個以上１５０個以下、より好ましくは１個以上１１２個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上７個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつCES活性を有するタンパク質が挙げられる。 In addition, as the protein (B), one or more (for example, 1 to 300, preferably 1 to 263, more preferably 1 to 225) is added to the amino acid sequence of the protein (A). , more preferably 1 to 188, more preferably 1 to 150, more preferably 1 to 112, more preferably 1 to 75, more preferably 1 to 60 , more preferably 1 to 45, more preferably 1 to 30, more preferably 1 to 15, still more preferably 1 to 7) amino acids are deleted, substituted, or inserted or added thereto and having CES activity.
前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）の発現を低下又は喪失させるために、前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子（CES遺伝子）の発現を抑制、あるいは遺伝子を欠失させることも好ましい。前記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードする遺伝子として、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子が挙げられる。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつCES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
In order to reduce or eliminate the expression of the protein (A) or (B), it is also preferable to suppress the expression of the gene (CES gene) encoding the protein (A) or (B) or to delete the gene. . Examples of the gene encoding the protein (A) or (B) include genes comprising the following DNA (a) or (b).
(a) DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:2.
(b) A DNA comprising a nucleotide sequence having 60% or more identity with the nucleotide sequence of the DNA (a) and encoding a protein having CES activity.
配列番号２で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ａ）は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のCESA1遺伝子である。 The DNA (a) consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and is the CESA1 gene derived from Nannochloropsis oceanica NIES-2145 strain.
前記ＤＮＡ（ｂ）において、CES活性の点から、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８５％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。 In terms of CES activity, the identity of the DNA (b) with the base sequence of the DNA (a) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, and 80% or more. More preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 94% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more preferable.
また前記ＤＮＡ（ｂ）として、配列番号２で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上９０３個以下、好ましくは１個以上７９０個以下、より好ましくは１個以上６７７個以下、より好ましくは１個以上５６４個以下、より好ましくは１個以上４５１個以下、より好ましくは１個以上３３８個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１３５個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、さらに好ましくは１個以上２２個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつＣＥＳ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｂ）として、前記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつCES活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
As the DNA (b), one or more (for example, 1 to 903, preferably 1 to 790, more preferably 1 to 677) in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 , more preferably 1 to 564, more preferably 1 to 451, more preferably 1 to 338, more preferably 1 to 225, more preferably 1 to 180 , more preferably 1 to 135, more preferably 1 to 90, more preferably 1 to 45, still more preferably 1 to 22) deletion, substitution, insertion , or added and genes encoding proteins with CES activity are also preferred.
Furthermore, as the DNA (b), a gene encoding a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA (a) or (b) and that has CES activity is also preferred.
また、本発明で発現を低下又は喪失させるPKSは、アルジナン合成に関与するタンパク質（酵素）であれば特に制限はない。
本発明で発現を低下又は喪失させるPKSは、例えば、ゲノム情報を基にBlastで解析し、PKSとアノテーションされたものを候補として選択できる。またはBlastpによってアミノ酸配列を解析し、PKSとアノテーションされたものも候補として選択できる。更に選択したタンパク質をコードする遺伝子を破壊又は欠失させた藻類を培養し、細胞壁のアルジナン層の影響を調べることでタンパク質を確認してもよい。
In addition, the PKS whose expression is reduced or eliminated in the present invention is not particularly limited as long as it is a protein (enzyme) involved in arginan synthesis.
PKS whose expression is reduced or lost in the present invention can be selected as a candidate by Blast analysis based on genomic information and annotated as PKS. Alternatively, those annotated as PKS can also be selected as candidates by analyzing the amino acid sequence with Blastp. Furthermore, the protein may be confirmed by culturing algae in which the gene encoding the selected protein has been disrupted or deleted, and examining the influence of the arginan layer on the cell wall.
本発明における好ましいPKSとしては、下記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）が挙げられる。
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質。
Preferred PKS in the present invention include the following protein (C) or (D).
(C) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:3.
(D) A protein consisting of an amino acid sequence having at least 60% identity with the amino acid sequence of the protein (C) and involved in arginane synthesis.
配列番号３のアミノ酸配列からなる前記タンパク質（Ｃ）は、ナンノクロロプシス属に属する藻類であるナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のPKSの１種（以下、「PKS3」ともいう）である。本発明の配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質（前記タンパク質（Ｃ））はアルジナン合成に関与する。 The protein (C) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is one type of PKS (hereinafter also referred to as "PKS3") derived from the strain Nannochloropsis oceanica NIES-2145, which is an alga belonging to the genus Nannochloropsis. . The protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (the protein (C)) of the present invention is involved in arginan synthesis.
タンパク質（Ｄ）は、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性が６０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアルジナン合成に関与する。
一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明で規定するタンパク質において、このように上記アルジナン合成に関与する性質が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質も包含する。
Protein (D) consists of an amino acid sequence having 60% or more identity with the amino acid sequence of protein (C), and participates in arginane synthesis.
In general, amino acid sequences encoding enzyme proteins do not necessarily exhibit enzymatic activity unless the sequence of the entire region is conserved. known to exist. In such regions that are not essential for enzymatic activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if mutations such as deletion, substitution, insertion or addition of amino acids are introduced. Among the proteins defined in the present invention, proteins that retain the properties involved in arginane synthesis as described above and partially mutated in the amino acid sequence are also included.
前記タンパク質（Ｄ）において、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８６％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。 In the protein (D), the identity with the amino acid sequence of the protein (C) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, 86% or more. is more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 94% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more.
また、前記タンパク質（Ｄ）として、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個（例えば１個以上１２０３個以下、好ましくは１個以上１０５３個以下、より好ましくは１個以上９０２個以下、より好ましくは１個以上７５２個以下、より好ましくは１個以上６０１個以下、より好ましくは１個以上４２１個以下、より好ましくは１個以上３００個以下、より好ましくは１個以上２４０個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１２０個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下）のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアルジナン合成に関与するタンパク質が挙げられる。 In addition, as the protein (D), one or more (for example, 1 or more and 1203 or less, preferably 1 or more and 1053 or less, more preferably 1 or more and 902 or less) in the amino acid sequence of the protein (C) , more preferably 1 to 752, more preferably 1 to 601, more preferably 1 to 421, more preferably 1 to 300, more preferably 1 to 240 , more preferably 1 to 180, more preferably 1 to 120, more preferably 1 to 60, still more preferably 1 to 30) amino acids are deleted, substituted, or inserted or attached and involved in arginane synthesis.
前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）の発現を低下又は喪失させるために、前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードする遺伝子（PKS遺伝子）の発現を抑制、あるいは遺伝子を欠失させることも好ましい。前記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）をコードする遺伝子として、下記ＤＮＡ（ｃ）又は（ｄ）からなる遺伝子が挙げられる。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上の塩基配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
In order to reduce or eliminate the expression of the protein (C) or (D), it is also preferable to suppress the expression of the gene (PKS gene) encoding the protein (C) or (D) or to delete the gene. . Examples of the gene encoding the protein (C) or (D) include genes consisting of the following DNA (c) or (d).
(c) DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:4.
(d) A DNA consisting of a nucleotide sequence having 60% or more identity with the nucleotide sequence of the DNA (c) and encoding a protein involved in arginane synthesis.
配列番号４で表される塩基配列からなる前記ＤＮＡ（ｃ）は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であり、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株由来のPKS3遺伝子である。 The DNA (c) consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 is a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and is the PKS3 gene derived from Nannochloropsis oceanica NIES-2145 strain.
前記ＤＮＡ（ｄ）において、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列との同一性は６５％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、７５％以上がより好ましく、８０％以上がより好ましく、８６％以上がより好ましく、９０％以上がより好ましく、９２％以上がより好ましく、９４％以上がより好ましく、９６％以上がより好ましく、９８％以上がより好ましく、９９％以上がさらに好ましい。 The identity of the DNA (d) with the base sequence of the DNA (c) is preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, and 86% or more. is more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 94% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more.
また前記ＤＮＡ（ｄ）として、配列番号４で表される塩基配列において、１又は複数個（例えば１個以上３６１２個以下、好ましくは１個以上３１６０個以下、より好ましくは１個以上２７０９個以下、より好ましくは１個以上２２５７個以下、より好ましくは１個以上１８０６個以下、より好ましくは１個以上１２６４個以下、より好ましくは１個以上９０３個以下、より好ましくは１個以上７２２個以下、より好ましくは１個以上５４１個以下、より好ましくは１個以上３６１個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、さらに好ましくは１個以上９０個以下）の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されており、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
さらに前記ＤＮＡ（ｄ）として、前記ＤＮＡ（ｃ）又は（ｄ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子も好ましい。
As the DNA (d), in the base sequence represented by SEQ ID NO: 4, one or more (for example, 1 or more and 3612 or less, preferably 1 or more and 3160 or less, more preferably 1 or more and 2709 or less) , more preferably 1 or more and 2257 or less, more preferably 1 or more and 1806 or less, more preferably 1 or more and 1264 or less, more preferably 1 or more and 903 or less, more preferably 1 or more and 722 or less , more preferably 1 to 541, more preferably 1 to 361, more preferably 1 to 180, still more preferably 1 to 90) deletion, substitution, insertion , or added and genes encoding proteins involved in arginane synthesis are also preferred.
Furthermore, as the DNA (d), a gene that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA (c) or (d) and that encodes a protein involved in arginane synthesis is also preferred. .
CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法を説明する。
本発明において、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失（一部若しくは全長）する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をダウンレギュレートする方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のプロモーターを改変する方法、アンチセンス、プロモーター競合などのゲノム編集技術を利用する方法、等が挙げられる。なかでも、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失、又はCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をダウンレギュレートすることにより、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失することが好ましい。
また、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法に代えて、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を不活性化する方法、CES又はアルジナン合成に関与するPKSタンパク自体の欠損や変異の導入、薬剤の添加などによるCES又はアルジナン合成に関与するPKSタンパク質の機能を弱化する方法等を適宜選択することもできる。これらの方法により得られる効果は、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法により得られる効果と同等である。
Methods for reducing or eliminating expression of PKSs involved in CES or arginane synthesis are described.
In the present invention, methods for reducing or eliminating the expression of PKS involved in CES or arginane synthesis can be appropriately selected from conventional methods. For example, a method of deleting (partially or full length) the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis, a method of downregulating the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis, a method of downregulating the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis Examples thereof include a method of modifying a gene promoter, a method of using genome editing technology such as antisense and promoter competition, and the like. Among others, the expression of CES or PKS involved in arginane synthesis is reduced or lost by deleting the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis or downregulating the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis. preferably.
In addition, instead of reducing or eliminating the expression of PKS involved in CES or arginane synthesis, a method of inactivating the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis, or a method of inactivating the PKS protein itself involved in CES or arginane synthesis. A method of weakening the function of the PKS protein involved in CES or arginane synthesis by deletion, introduction of mutation, addition of a drug, or the like can be selected as appropriate. The effects obtained by these methods are comparable to those obtained by methods of reducing or eliminating the expression of PKS involved in CES or arginane synthesis.
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化することにより、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法について説明する。
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化する方法としては、常法から適宜選択することができる。例えば、前記藻類自体が有する相同組換え能を利用した遺伝子破壊方法、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription activator-like effector nuclease、TALEN）やクリスパー（CRISPR、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）といったゲノム編集技術を利用した方法、突然変異等を利用した変異導入方法、など一般的な方法により、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化することができる。
具体的には、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の一部を含むDNA断片または適当なプラスミド（ベクター）にクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを藻類の細胞内に取り込ませ、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の一部領域における相同組換えによってゲノム上のCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の欠失や、これらを分断してCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を不活性化することが可能である。
また、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどの変異誘発剤の使用、紫外線やガンマ線等の照射によりCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の突然変異を誘発する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子中（例えば、CES又はアルジナン合成に関与するPKSを発現するために重要な部位）に部位特異的点突然変異（例えば、フレームシフト突然変異、インフレーム突然変異、終止コドンの挿入など）を誘発する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の全部又は一部を他の任意のDNA断片（例えば、任意の選択マーカー）で置換する方法、などによりCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をランダムに不活性化することができる。
本発明において、相同組換えにより、ゲノム上のCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化することが好ましい。
本発明において、相同組換えにより、ゲノム上のCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化することが好ましい。
A method for reducing or eliminating the expression of PKS involved in CES or arginane synthesis by deleting or inactivating the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis is described.
Methods for deleting or inactivating the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis can be appropriately selected from conventional methods. For example, gene disruption methods utilizing the homologous recombination ability of the algae themselves, genome editing techniques such as transcription activator-like effector nuclease (TALEN) and CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) A CES gene or a PKS gene involved in arginane synthesis can be deleted or inactivated by a general method such as a method using , a mutation introduction method using mutation or the like.
Specifically, a DNA fragment containing a portion of the CES gene or PKS gene involved in arginane synthesis, or a circular recombinant plasmid obtained by cloning into an appropriate plasmid (vector) is introduced into algae cells, causing CES. Deletion of the CES gene on the genome or the PKS gene involved in arginane synthesis by homologous recombination in a partial region of the gene or the PKS gene involved in arginane synthesis, or disruption of the CES gene or PKS involved in arginane synthesis It is possible to inactivate genes.
In addition, the use of mutagenesis agents such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, a method of inducing mutations in the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis by irradiation with ultraviolet rays, gamma rays, etc., CES gene or site-specific point mutations (e.g., frameshift mutations, in-frame mutations, terminating mutations, etc.) in PKS genes involved in arginane synthesis (e.g., CES or sites important for expressing PKS involved in arginane synthesis). codon insertion, etc.), a method of replacing all or part of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis with any other DNA fragment (e.g., any selection marker), etc. PKS genes involved in arginane synthesis can be randomly inactivated.
In the present invention, it is preferable to delete or inactivate the CES gene on the genome or the PKS gene involved in arginane synthesis by homologous recombination.
In the present invention, it is preferable to delete or inactivate the CES gene on the genome or the PKS gene involved in arginane synthesis by homologous recombination.
相同組換えによりCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化するときは、前記藻類に、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットを導入する。
ここで使用するCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットは、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の全部又は一部を標的領域とする。そして、標的領域をコードするゲノムの上流側の一部と相同的な塩基配列と、ゲノムの下流側の一部と相同的な塩基配列を有するプラスミド又はDNAカセットを構築し、これを前記藻類に導入することが好ましい。
相同組換えに必要なCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の上流及び下流の塩基配列の情報は、例えば国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information, NCBI）などから入手することができる。
When the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis is deleted or inactivated by homologous recombination, a plasmid for homologous recombination of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis or a plasmid for homologous recombination of the algae Introduce a DNA cassette.
The homologous recombination plasmid or DNA cassette for homologous recombination of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis used herein targets all or part of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis. Then, constructing a plasmid or DNA cassette having a nucleotide sequence homologous to a portion of the upstream genome encoding the target region and a nucleotide sequence homologous to a portion of the downstream genome, and applying this to the algae. It is preferable to introduce
Information on nucleotide sequences upstream and downstream of the CES gene required for homologous recombination or the PKS gene involved in arginane synthesis can be obtained from, for example, the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
また、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子が相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットと置換され、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子が欠失又は不活性化したことを確認するために、相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットに組み込まれる選択マーカーとして、通常用いられる選択マーカーから適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、及びハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子をマーカー遺伝子として使用することもできる。選択マーカーのベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の常法により行うことができる。 In addition, confirm that the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis was replaced with a plasmid for homologous recombination or a DNA cassette for homologous recombination, and that the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis was deleted or inactivated. Therefore, the selection marker incorporated into the plasmid for homologous recombination or the DNA cassette for homologous recombination can be appropriately selected from commonly used selection markers. Selection markers that can be preferably used in the present invention include ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S. drug resistance genes such as resistance genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, and hygromycin resistance genes; Furthermore, genes associated with auxotrophy can also be used as marker genes. Introduction of the selectable marker into the vector can be performed by conventional methods such as restriction enzyme treatment and ligation.
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子を欠失又は不活性化するために用いる、前記相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットは、通常用いられるプラスミド（ベクター）を使用して作製することができる。使用できるプラスミドとしては、例えば、pUC18（タカラバイオ社製）、pUC19（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas Center）、P-322（Chlamydomonas Center）、pPha-T1（Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、pUC18、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の欠失又は不活性化に用いる相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットのサイズは、藻類への導入効率や、相同組換え効率などを考慮し、適宜設定することができる。例えば、相同配列として用いる標的領域の上流又は下流塩基配列はそれぞれ300bp以上が好ましく、500bp以上がより好ましい。またその上限値は、2.5kbpが好ましく、2kbpがより好ましい。
The homologous recombination plasmid or homologous recombination DNA cassette used to delete or inactivate the CES gene or the PKS gene involved in arginan synthesis is prepared using a commonly used plasmid (vector). be able to. Plasmids that can be used include, for example, pUC18 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUC118 (manufactured by Takara Bio Inc.), P66 (Chlamydomonas Center), P-322 (Chlamydomonas Center), pPha-T1 ( Journal of Basic Microbiology, 2011, vol. 51, p. 666-672), or pJET1 (manufactured by Cosmo Bio). In particular, pUC18, pPha-T1, or pJET1 are preferably used.
The size of the homologous recombination plasmid or homologous recombination DNA cassette used for deletion or inactivation of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis should be determined in consideration of the efficiency of introduction into algae, the efficiency of homologous recombination, etc. , can be set as appropriate. For example, the nucleotide sequence upstream or downstream of the target region used as the homologous sequence is preferably 300 bp or more, more preferably 500 bp or more. Moreover, the upper limit thereof is preferably 2.5 kbp, more preferably 2 kbp.
前記相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットを藻類に導入する形質転換方法は、藻類の種類やCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットに応じて常法より適宜選択することができる。例えば、カルシウムイオンを用いる形質転換方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、エレクトロポレーション法、LP形質転換方法、アグロバクテリウムを用いた方法、パーティクルガン法等が挙げられる。また、本発明では、Randor Radakovits, et al.，Nature Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012等に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
また、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108(52)の記載の方法を参考にして、目的の遺伝子の上流の配列、プロモーター、選択マーカー遺伝子、ターミネーター、及び目的の遺伝子の下流の配列からなるＤＮＡ断片（遺伝子破壊カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。
The transformation method for introducing the plasmid for homologous recombination or the DNA cassette for homologous recombination into algae depends on the type of algae, the plasmid for homologous recombination of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis, or the DNA cassette for homologous recombination. It can be appropriately selected from conventional methods depending on the circumstances. Examples include transformation methods using calcium ions, general competent cell transformation methods, protoplast transformation methods, electroporation methods, LP transformation methods, methods using Agrobacterium, particle gun methods, and the like. . In the present invention, transformation can also be performed using the electroporation method described in Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI: 10.1038/ncomms1688, 2012 and the like.
Also, with reference to the method described in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol. 108 (52), the upstream sequence of the gene of interest, promoter, selection marker gene, terminator, A host can also be transformed using a DNA fragment (gene-disruption cassette) consisting of a sequence downstream of the gene of interest.
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子が欠失又は不活性化した藻類の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、薬剤耐性遺伝子が宿主細胞中に導入された結果、藻類が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムＤＮＡを鋳型としたPCR法等によって、目的DNA断片の導入を確認することもできる。 Algae in which the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis has been deleted or inactivated can be selected using a selection marker or the like. For example, drug resistance acquired by algae as a result of introduction of drug resistance genes into host cells can be used as an indicator. In addition, introduction of the target DNA fragment can be confirmed by a PCR method or the like using genomic DNA as a template.
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をダウンレギュレートして、CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する方法について説明する。
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の発現の抑制、又はCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の上流に位置するプロモーターを特定しこれを欠失若しくは不活性化することで、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の発現量が減少する（CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のダウンレギュレーション）。CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の発現量が減少すると、セルロース合成又はアルジナン合成に関与するCES又はアルジナン合成に関与するPKSタンパク質の発現が阻害される。その結果、前記藻類においてセルロース由来の細胞壁又はアルジナン層の構築が阻害されることが推定される。よって、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の発現量を減少させることで、物理的又は化学的処理による細胞破壊が容易となることから、藻体からの脂質の回収が容易である藻類を得ることができると考えられる。
Methods for downregulating CES genes or PKS genes involved in arginane synthesis to reduce or eliminate expression of CES or PKS involved in arginane synthesis are described.
By suppressing the expression of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis, or by identifying and deleting or inactivating the promoter located upstream of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis, the CES gene or Expression levels of PKS genes involved in arginane synthesis are reduced (downregulation of CES genes or PKS genes involved in arginane synthesis). When the expression level of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis is decreased, the expression of the CES protein involved in cellulose synthesis or arginane synthesis or the PKS protein involved in arginane synthesis is inhibited. As a result, it is presumed that the construction of the cellulose-derived cell wall or arginan layer is inhibited in the algae. Therefore, by reducing the expression level of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis, it becomes easier to destroy cells by physical or chemical treatment, so that algae from which lipids can be easily recovered can be obtained.
CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子をダウンレギュレートさせる方法は、常法より適宜選択することができる。例えば、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジンなどの変異誘発剤、ＵＶ、ガンマ線等の照射によりCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のプロモーターや転写・翻訳開始領域の突然変異を誘発する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のプロモーター配列や転写・翻訳開始領域中に他の任意のDNA断片（例えば、任意のリプレッサー、任意の選択マーカー等）を挿入する方法、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子のプロモーター配列や転写・翻訳開始領域の全部又は一部を他の任意のDNA断片（例えば、任意のリプレッサー、任意の選択マーカー等）で置換する方法、アンチセンス法、RNA干渉法、プロモーター競合等があげられる。 A method for down-regulating the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis can be appropriately selected from conventional methods. For example, mutagenesis such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, irradiation with UV, gamma rays, etc. can cause mutations in the promoter and transcription/translation initiation regions of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis. A method of inducing, a method of inserting any other DNA fragment (e.g., any repressor, any selection marker, etc.) into the promoter sequence or transcription/translation initiation region of the CES gene or PKS gene involved in arginan synthesis, A method of replacing all or part of the promoter sequence or transcription/translation initiation region of the CES gene or PKS gene involved in arginan synthesis with any other DNA fragment (e.g., any repressor, any selection marker, etc.), Examples include the antisense method, RNA interference method, promoter competition, and the like.
本発明は、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の塩基配列及びその上流の塩基配列からなる領域の上流側の一部と相同的な塩基配列と、ゲノム上のCES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の塩基配列及びその下流の塩基配列からなる領域の下流側の一部と相同的な塩基配列を有する、CES遺伝子又はアルジナン合成に関与するPKS遺伝子の相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットも提供する。この相同組換え用プラスミド又は相同組換え用DNAカセットは、前記CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失させた藻類の作製に好適に用いることができる。 The present invention relates to a nucleotide sequence homologous to a part of the upstream side of the region consisting of the nucleotide sequence of the PKS gene involved in CES gene or arginane synthesis and the nucleotide sequence upstream thereof, and the CES gene on the genome or involved in arginane synthesis. A plasmid for homologous recombination of the CES gene or the PKS gene involved in arginane synthesis, which has a nucleotide sequence homologous to a part of the downstream side of the region consisting of the nucleotide sequence of the PKS gene and its downstream nucleotide sequence, or homologous recombination We also provide DNA cassettes for This plasmid for homologous recombination or DNA cassette for homologous recombination can be suitably used for producing algae in which the expression of PKS involved in CES or arginan synthesis is reduced or eliminated.
上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の脂質の製造方法、及び脂質の回収方法を開示する。 Regarding the above-described embodiments, the present invention further discloses the following lipid production method and lipid recovery method.
＜１＞CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させ、
生産させた脂肪酸又は脂質を培養後の藻体から回収し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を得る、脂質の製造方法。
<1> culturing algae in which the expression of at least one protein selected from the group consisting of CES and PKS involved in arginane synthesis is reduced or lost to produce fatty acids or lipids containing these as constituents,
A method for producing a lipid, which comprises recovering the produced fatty acid or lipid from algal cells after culturing to obtain the fatty acid or a lipid having the same as a constituent.
＜２＞CES及びアルジナン合成に関与するPKSからなる群より選ばれる、少なくとも１つのタンパク質の発現が低下又は喪失した藻類を培養し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を生産させ、
生産させた脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を培養後の藻体から回収する、脂質の回収方法。
＜３＞前記CES又はアルジナン合成に関与するPKSをコードする遺伝子を欠失若しくは不活性化、又は前記CES又はアルジナン合成に関与するPKSをコードする遺伝子をダウンレギュレートすることにより、前記CES又はアルジナン合成に関与するPKSの発現を低下又は喪失する、前記＜１＞又は＜２＞項に記載の方法。
＜４＞前記CESの発現と、前記アルジナン合成に関与するPKSの発現がそれぞれ低下又は喪失している、前記＜１＞～＜３＞のいずれか１項記載の方法。
＜５＞前記藻類が、真正眼点藻綱に属する藻類である、前記＜１＞～＜４＞のいずれか１項記載の方法。
＜６＞前記真正眼点藻綱に属する藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類である、前記＜５＞項記載の方法。
＜７＞前記ナンノクロロプシス属に属する藻類が、ナンノクロロプシス・オセアニカ、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、ナンノクロロプシス・サリナ、ナンノクロロプシス・リムネティカ、ナンノクロロプシス・グラニュラータ、ナンノクロロプシス・エスピー、からなる群より選ばれる少なくとも１つの藻類、好ましくはナンノクロロプシス・ガディタナ、又はナンノクロロプシス・オセアニカである、前記＜６＞項記載の方法。
<2> culturing algae in which the expression of at least one protein selected from the group consisting of CES and PKS involved in arginane synthesis is reduced or lost to produce fatty acids or lipids containing these as constituents,
A method for recovering lipids, comprising recovering produced fatty acids or lipids composed of these fatty acids from cultured alga bodies.
<3> the CES or arginane by deleting or inactivating the gene encoding the PKS involved in CES or arginane synthesis, or downregulating the gene encoding the PKS involved in CES or arginane synthesis The method according to <1> or <2> above, wherein expression of PKS involved in synthesis is reduced or eliminated.
<4> The method according to any one of <1> to <3>, wherein the expression of CES and the expression of PKS involved in arginane synthesis are reduced or lost, respectively.
<5> The method according to any one of <1> to <4> above, wherein the algae belong to the class Elegantoptera.
<6> The method according to <5> above, wherein the algae belonging to the class Eophthalmophyceae are algae belonging to the genus Nannochloropsis.
<7> The algae belonging to the genus Nannochloropsis include Nannochloropsis oceanica, Nannochloropsis oculata, Nannochloropsis gadditana, Nannochloropsis salina, Nannochloropsis limnetica, Nannochloropsis granulata, The method according to <6> above, wherein at least one alga selected from the group consisting of Nannochloropsis sp., preferably Nannochloropsis gaditana or Nannochloropsis oceanica.
＜８＞前記CESが、下記タンパク質（Ａ）又は（Ｂ）である、前記＜１＞～＜７＞のいずれか１項記載の方法。
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつCES活性を有するタンパク質。
＜９＞前記タンパク質（Ｂ）が、前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上３００個以下、好ましくは１個以上２６３個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８８個以下、より好ましくは１個以上１５０個以下、より好ましくは１個以上１１２個以下、より好ましくは１個以上７５個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、より好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上７個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつCES活性を有するタンパク質、である、前記＜８＞項に記載の方法。
＜１０＞前記CESをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ａ）又は（ｂ）からなる遺伝子である、前記＜３＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
（ａ）配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつCES活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１１＞前記ＤＮＡ（ｂ）が、前記ＤＮＡ（ａ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上９０３個以下、好ましくは１個以上７９０個以下、より好ましくは１個以上６７７個以下、より好ましくは１個以上５６４個以下、より好ましくは１個以上４５１個以下、より好ましくは１個以上３３８個以下、より好ましくは１個以上２２５個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１３５個以下、より好ましくは１個以上９０個以下、より好ましくは１個以上４５個以下、さらに好ましくは１個以上２２個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加されており、かつCES活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつCES活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、である、前記＜１０＞項に記載の方法。
＜１２＞前記アルジナン合成に関与するPKSが、下記タンパク質（Ｃ）又は（Ｄ）である、前記＜１＞～＜１１＞のいずれか１項記載の方法。
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質。
＜１３＞前記タンパク質（Ｄ）が、前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列に、１又は複数個、好ましくは１個以上１２０３個以下、好ましくは１個以上１０５３個以下、より好ましくは１個以上９０２個以下、より好ましくは１個以上７５２個以下、より好ましくは１個以上６０１個以下、より好ましくは１個以上４２１個以下、より好ましくは１個以上３００個以下、より好ましくは１個以上２４０個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、より好ましくは１個以上１２０個以下、より好ましくは１個以上６０個以下、さらに好ましくは１個以上３０個以下、のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつアルジナン合成に関与するタンパク質、である、前記＜１２＞項に記載の方法。
＜１４＞前記アルジナン合成に関与するPKSをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ（ｃ）又は（ｄ）からなる遺伝子である、前記＜３＞～＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
（ｃ）配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列と同一性が６０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９４％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１５＞前記ＤＮＡ（ｄ）が、前記ＤＮＡ（ｃ）の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上３６１２個以下、好ましくは１個以上３１６０個以下、より好ましくは１個以上２７０９個以下、より好ましくは１個以上２２５７個以下、より好ましくは１個以上１８０６個以下、より好ましくは１個以上１２６４個以下、より好ましくは１個以上９０３個以下、より好ましくは１個以上７２２個以下、より好ましくは１個以上５４１個以下、より好ましくは１個以上３６１個以下、より好ましくは１個以上１８０個以下、さらに好ましくは１個以上９０個以下、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ（ａ）と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアルジナン合成に関与するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、である、前記＜１４＞項に記載の方法。
<8> The method according to any one of <1> to <7>, wherein the CES is the following protein (A) or (B).
(A) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
(B) 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% identity with the amino acid sequence of the protein (A) % or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 94% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more of the amino acid sequence , and a protein with CES activity.
<9> The protein (B) has 1 or more, preferably 1 to 300, preferably 1 to 263, more preferably 1 to 225 in the amino acid sequence of the protein (A) more preferably 1 to 188, more preferably 1 to 150, more preferably 1 to 112, more preferably 1 to 75, more preferably 1 to 60 1 or less, more preferably 1 or more and 45 or less, more preferably 1 or more and 30 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, still more preferably 1 or more and 7 or less amino acids are deleted or substituted , inserted or added, and having CES activity.
<10> The method according to any one of <3> to <9>, wherein the gene encoding CES is a gene consisting of the following DNA (a) or (b).
(a) DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:2.
(b) 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% identity with the base sequence of the DNA (a) % or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 94% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more of the base sequence. , and a DNA encoding a protein having CES activity.
<11> The DNA (b) has 1 or more, preferably 1 to 903, preferably 1 to 790, more preferably 1 to 677 in the base sequence of the DNA (a) or less, more preferably 1 or more and 564 or less, more preferably 1 or more and 451 or less, more preferably 1 or more and 338 or less, more preferably 1 or more and 225 or less, more preferably 1 or more and 180 1 or less, more preferably 1 or more and 135 or less, more preferably 1 or more and 90 or less, more preferably 1 or more and 45 or less, still more preferably 1 or more and 22 or less, deletion or substitution , inserted or added, and hybridizing under stringent conditions with a DNA consisting of a nucleotide sequence encoding a protein having CES activity, or a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA (a), The method according to item <10> above, wherein the DNA comprises a nucleotide sequence that encodes a protein having CES activity.
<12> The method according to any one of <1> to <11>, wherein the PKS involved in arginane synthesis is the following protein (C) or (D).
(C) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:3.
(D) 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% identity with the amino acid sequence of the protein (C) % or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 94% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more of the amino acid sequence , and proteins involved in arginan synthesis.
<13> The protein (D) has 1 or more, preferably 1 or more and 1203 or less, preferably 1 or more and 1053 or less, more preferably 1 or more and 902 in the amino acid sequence of the protein (C) or less, more preferably 1 or more and 752 or less, more preferably 1 or more and 601 or less, more preferably 1 or more and 421 or less, more preferably 1 or more and 300 or less, more preferably 1 or more and 240 or less 1 or less, more preferably 1 or more and 180 or less, more preferably 1 or more and 120 or less, more preferably 1 or more and 60 or less, still more preferably 1 or more and 30 or less amino acids are deleted or substituted. , inserted or added, and involved in arginane synthesis, the method according to item <12>.
<14> The method according to any one of <3> to <13>, wherein the gene encoding PKS involved in arginane synthesis is a gene consisting of DNA (c) or (d) below.
(c) DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO:4.
(d) 60% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, more preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% identity with the base sequence of the DNA (c) % or more, more preferably 90% or more, more preferably 92% or more, more preferably 94% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more of the base sequence. , and a DNA encoding a protein involved in arginan synthesis.
<15> The DNA (d) has 1 or more, preferably 1 or more and 3612 or less, preferably 1 or more and 3160 or less, more preferably 1 or more and 2709 in the base sequence of the DNA (c) or less, more preferably 1 or more and 2257 or less, more preferably 1 or more and 1806 or less, more preferably 1 or more and 1264 or less, more preferably 1 or more and 903 or less, more preferably 1 or more and 722 1 or less, more preferably 1 or more and 541 or less, more preferably 1 or more and 361 or less, more preferably 1 or more and 180 or less, still more preferably 1 or more and 90 or less, deletion or substitution , a DNA consisting of a nucleotide sequence inserted or added and encoding a protein involved in arginan synthesis, or a DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the DNA (a) under stringent conditions, and a DNA comprising a nucleotide sequence encoding a protein involved in arginan synthesis.
＜１６＞前記藻類を、光強度が１～４，０００μmol/m2/sの範囲、好ましくは１０～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは１００～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２００～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは２５０～２，５００μmol/m2/sの範囲、より好ましくは３００～２，５００μmol/m2/sの範囲、の条件で培養する、前記＜１＞～＜１５＞のいずれか１項記載の方法。
＜１７＞ｆ／２培地を用いて前記形質転換体を培養する、前記＜１＞～＜１６＞のいずれか１項記載の方法。
＜１８＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１＞～＜１７＞のいずれか１項記載の方法。
<16> The algae has a light intensity in the range of 1 to 4,000 μmol/m 2 /s, preferably in the range of 10 to 2,500 μmol/m 2 /s, more preferably 100 to 2,500 μmol/m 2 /s. s range, more preferably 200 to 2,500 μmol/m 2 /s, more preferably 250 to 2,500 μmol/m 2 /s, more preferably 300 to 2,500 μmol/m 2 /s The method according to any one of <1> to <15> above, wherein the culture is performed under conditions within the range.
<17> The method according to any one of <1> to <16>, wherein the transformant is cultured using f/2 medium.
<18> The lipid is a fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 2 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 4 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof , more preferably a fatty acid having 6 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 8 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably 10 to 22 carbon atoms The method according to any one of the above <1> to <17>, which contains a fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 to 20 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof.
＜１９＞脂質を製造するための、前記＜１＞～＜１５＞のいずれか１項記載の藻類の使用。
＜２０＞脂質を回収するための、前記＜１＞～＜１５＞のいずれか１項記載の藻類の使用。
＜２１＞前記脂質が、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素原子数が２以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が４以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が６以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が８以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素原子数が１０以上２２以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、さらに好ましくは炭素原子数が１２以上２０以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、を含む、前記＜１９＞又は＜２０＞項記載の使用。
<19> Use of the algae according to any one of <1> to <15> for producing lipids.
<20> Use of the algae according to any one of <1> to <15> for recovering lipids.
<21> The lipid is a fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 2 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 4 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof , more preferably a fatty acid having 6 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 8 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably 10 to 22 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 to 20 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, according to <19> or <20>.
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いたプライマーの塩基配列を表１に示す。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below based on examples, but the present invention is not limited to these. Here, Table 1 shows the nucleotide sequences of the primers used in this example.
作製例１ ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株におけるＣＥＳＡ１遺伝子破壊株の作製
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
ゼオシン耐性遺伝子（配列番号１０）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号１３及び配列番号１４のプライマー対を用いてゼオシン耐性遺伝子断片を増幅した。また、ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号１５と配列番号１６のプライマー対、及び配列番号１７と配列番号１８のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、VCP1プロモーター配列（配列番号９）及びVCP1ターミネーター配列（配列番号１１）を増幅した。さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製、配列番号３８）を鋳型として、表１に示す配列番号１９及び配列番号２０のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡株式会社製）にて処理し、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion HD Cloning Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現用プラスミドは、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
Production Example 1 Production of CESA1 gene-disrupted strain in Nannochloropsis oceanica NIES-2145 strain (1) Construction of plasmid for expression of zeocin-resistant gene A zeocin-resistant gene (SEQ ID NO: 10) was artificially synthesized. A zeocin-resistant gene fragment was amplified using the synthesized DNA fragment as a template and the primer pair of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 shown in Table 1. In addition, using the genomic DNA of Nannochloropsis oceanica NIES-2145 strain as a template, PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16 and the primer pair of SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 shown in Table 1. , the VCP1 promoter sequence (SEQ ID NO: 9) and the VCP1 terminator sequence (SEQ ID NO: 11) were amplified. Further, PCR was performed using a plasmid vector pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc., SEQ ID NO: 38) as a template and a primer pair of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 20 shown in Table 1 to amplify the plasmid vector pUC19. These four amplified fragments were each treated with restriction enzyme Dpn I (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and purified using High Pure PCR Product Purification Kit (manufactured by Roche Applied Science). Then, the obtained four fragments were fused using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech) to construct a zeocin-resistant gene expression plasmid.
This expression plasmid consists of an insert sequence and a pUC19 vector sequence, in which the VCP1 promoter sequence, zeocin resistance gene, and VCP1 terminator sequence are linked in this order.
（２）遺伝子破壊用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノム配列情報を基に、BLAST解析により、本発明で用いるCES候補遺伝子としてCESA1遺伝子（配列番号２）を、又アルジナン合成に関与するPKS候補遺伝子としてPKS3遺伝子（配列番号４）を同定した。
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号２１と配列番号２２のプライマー対、及び配列番号２３及び配列番号２４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、CESA1遺伝子上流の相同配列（配列番号５）及びCESA1遺伝子下流の相同配列（配列番号６）を増幅した。またプラスミドベクターｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製、配列番号３７）を鋳型として、表１に示す配列番号２５及び配列番号２６のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターｐＵＣ１１８を増幅した。さらに前記ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、配列番号２７及び配列番号２８のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列）を増幅した。これら4つの増幅断片を、前述と同様の方法にて融合し、CESA1遺伝子破壊用プラスミドを構築した。
なお、本プラスミドはCESA1遺伝子上流の相同配列、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、CESA1遺伝子下流の相同配列の順で連結したインサート配列とpUC118ベクター配列からなる。
(2) Construction of Plasmid for Gene Disruption Based on the genome sequence information of Nannochloropsis oceanica NIES-2145 strain, BLAST analysis was performed to identify the CESA1 gene (SEQ ID NO: 2) as a CES candidate gene used in the present invention, and to synthesize arginane. The PKS3 gene (SEQ ID NO: 4) was identified as a PKS candidate gene involved in .
Using the genomic DNA of Nannochloropsis oceanica NIES-2145 strain as a template, PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 and the primer pair of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 shown in Table 1. CESA1 A homologous sequence upstream of the gene (SEQ ID NO: 5) and a homologous sequence downstream of the CESA1 gene (SEQ ID NO: 6) were amplified. Using plasmid vector pUC118 (manufactured by Takara Bio Inc., SEQ ID NO: 37) as a template, PCR was performed using a primer pair of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 shown in Table 1 to amplify plasmid vector pUC118. Furthermore, using the zeocin-resistant gene expression plasmid as a template, PCR was performed using a primer pair of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 to amplify a zeocin-resistant gene expression cassette (VCP1 promoter sequence, zeocin-resistant gene, VCP1 terminator sequence). . These four amplified fragments were fused in the same manner as described above to construct a plasmid for disrupting the CESA1 gene.
This plasmid consists of an insert sequence and a pUC118 vector sequence, in which the homologous sequence upstream of the CESA1 gene, the VCP1 promoter sequence, the zeocin resistance gene, the VCP1 terminator sequence, and the homologous sequence downstream of the CESA1 gene are linked in this order.
（３）相同組換えによるCESA1遺伝子破壊株の作製
前記CESA1遺伝子破壊用プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号２１及び配列番号２４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、CESA1遺伝子相同組換え用ＤＮＡ断片（CESA1遺伝子上流の相同配列、VCP1プロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、CESA1遺伝子下流の相同配列）を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、High Pure PCR Product Purification Kit（Roche Applied Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
約１０９細胞のナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株を、３８４ｍＭのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したＤＮＡ断片を、約５００ｎｇずつ宿主細胞に混和し、５０μＦ、５００Ω、２，２００ｖ／２ｍｍの条件でエレクトロポレーションを行った。ｆ／２液体培地（ＮａＮＯ３ ７５ｍｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ６ｍｇ、ビタミンＢ１２ ０．５μｇ、ビオチン ０．５μｇ、チアミン １００μｇ、Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ １０ｍｇ、Ｎａ２ＥＤＴＡ・２Ｈ２Ｏ ４．４ｍｇ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ ３．１６ｍｇ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １２μｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２１μｇ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ １８０μｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ７μｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ７μｇ／人工海水１Ｌ）にて２４時間回復培養を行った後に、２μｇ／ｍＬのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーをCESA1遺伝子破壊株（以下、「ΔCESA1株」ともいう）として選抜した。なお相同組換えによるCESA1遺伝子の破壊の確認は、表１に示す配列番号２９及び配列番号１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片がCESA1遺伝子に挿入されていることを確認することで行った。
(3) Preparation of CESA1 gene-disrupted strain by homologous recombination Using the plasmid for CESA1 gene-disruption as a template, PCR is performed using the primer pair of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 24 shown in Table 1. DNA fragments (homologous sequence upstream of CESA1 gene, VCP1 promoter sequence, zeocin resistance gene, VCP1 terminator sequence, homologous sequence downstream of CESA1 gene) were amplified. The amplified DNA fragment was purified using High Pure PCR Product Purification Kit (manufactured by Roche Applied Science). For elution during purification, sterilized water was used instead of the elution buffer included in the kit.
Approximately 10 9 cells of Nannochloropsis oceanica strain NIES-2145 were washed with 384 mM sorbitol solution to completely remove salts and used as host cells for transformation. About 500 ng of the DNA fragment amplified above was mixed with host cells, and electroporation was performed under the conditions of 50 μF, 500 Ω, and 2,200 v/2 mm. f/ 2 liquid medium ( NaNO3 75 mg, NaH2PO4.2H2O 6 mg, vitamin B12 0.5 μg, biotin 0.5 μg, thiamine 100 μg, Na2SiO3.9H2O 10 mg, Na2EDTA.2H2 O 4.4 mg, FeCl3.6H2O 3.16 mg, CoSO4.7H2O 12 μg, ZnSO4.7H2O 21 μg, MnCl2.4H2O 180 μg, CuSO4.5H2O 7 μg , Na2MoO 4 ·2H 2 O 7 µg/1 L of artificial seawater) for 24 hours, then applied to f/2 agar medium containing 2 µg/mL of zeocin, 25 ° C., 0.3% CO 2 atmosphere, 12 h The cells were cultured for 2 to 3 weeks under light/dark conditions for 12h/12h. The resulting colony was selected as a CESA1 gene-disrupted strain (hereinafter also referred to as "ΔCESA1 strain"). To confirm the disruption of the CESA1 gene by homologous recombination, PCR is performed using the primer pair of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 14 shown in Table 1 to confirm that the target DNA fragment is inserted into the CESA1 gene. I went by
作製例２ ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株におけるPKS3遺伝子破壊株の作製
（１）パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
パロモマイシン耐性遺伝子（配列番号１２）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表１に示す配列番号３０及び配列番号３１のプライマー対を用いてパロモマイシン耐性遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。また、作製例１で作製したゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型に、表１に示す配列番号１６及び配列番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＶＣＰ１プロモーター、ＶＣＰ１ターミネーター及びｐＵＣ１９ベクター配列からなるＤＮＡ断片を増幅した。これら２つのＤＮＡ断片を作製例１と同様の方法にて融合し、パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
なお、本発現用プラスミドは、VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列の順に連結したインサート配列とpUC19ベクター配列からなる。
Production Example 2 Production of PKS3 gene-disrupted strain in Nannochloropsis oceanica NIES-2145 strain (1) Construction of plasmid for expression of paromomycin-resistant gene A paromomycin-resistant gene (SEQ ID NO: 12) was artificially synthesized. Using the synthesized DNA fragment as a template, the primer pair of SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31 shown in Table 1 was used to amplify the DNA fragment of the paromomycin resistance gene. In addition, using the zeocin-resistant gene expression plasmid prepared in Preparation Example 1 as a template, PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 17 shown in Table 1, consisting of the VCP1 promoter, VCP1 terminator and pUC19 vector sequence. A DNA fragment was amplified. These two DNA fragments were fused in the same manner as in Preparation Example 1 to construct a paromomycin-resistant gene expression plasmid.
This expression plasmid consists of an insert sequence and a pUC19 vector sequence, in which the VCP1 promoter sequence, the paromomycin resistance gene, and the VCP1 terminator sequence are linked in this order.
（２）遺伝子破壊用プラスミドの構築
ナンノクロロプシス・オセアニカNIES-2145株のゲノムＤＮＡを鋳型として、表１に示す配列番号３２と配列番号３３のプライマー対、及び配列番号３４と配列番号３５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、PKS3遺伝子上流の相同配列（配列番号７）及びPKS3遺伝子下流の相同配列（配列番号８）を増幅した。またプラスミドベクターｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）を鋳型として、表１に示す配列番号２５及び配列番号２６のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターｐＵＣ１１８を増幅した。さらに前記パロモマイシン耐性遺伝子発現用プラスミドを鋳型として、配列番号２７及び配列番号２８のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、パロモマイシン耐性遺伝子発現カセット（VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列）を増幅した。これら4つの増幅断片を、前述と同様の方法にて融合し、PKS3遺伝子破壊用プラスミドを構築した。
なお、本プラスミドはPKS3遺伝子上流の相同配列、VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、PKS3遺伝子下流の相同配列の順で連結したインサート配列とpUC118ベクター配列からなる。
(2) Construction of Plasmid for Gene Disruption Using the genomic DNA of Nannochloropsis oceanica strain NIES-2145 as a template, the primer pair of SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33 and the primer of SEQ ID NO: 34 and SEQ ID NO: 35 shown in Table 1 were used. PCR was performed using pairs to amplify the homologous sequence upstream of the PKS3 gene (SEQ ID NO: 7) and the homologous sequence downstream of the PKS3 gene (SEQ ID NO: 8). Using plasmid vector pUC118 (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template, PCR was performed using a primer pair of SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 shown in Table 1 to amplify plasmid vector pUC118. Furthermore, using the paromomycin-resistant gene expression plasmid as a template, PCR was performed using a primer pair of SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28 to amplify a paromomycin-resistant gene expression cassette (VCP1 promoter sequence, paromomycin-resistant gene, VCP1 terminator sequence). . These four amplified fragments were fused in the same manner as described above to construct a plasmid for disrupting the PKS3 gene.
This plasmid consists of an insert sequence and a pUC118 vector sequence, in which the homologous sequence upstream of the PKS3 gene, the VCP1 promoter sequence, the paromomycin resistance gene, the VCP1 terminator sequence, and the homologous sequence downstream of the PKS3 gene are linked in this order.
（３）相同組換えによるPKS3遺伝子破壊株の作製
前記PKS3遺伝子破壊用プラスミドを鋳型として、表１に示す配列番号３２及び配列番号３５のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、PKS3遺伝子相同組換え用断片（PKS3遺伝子上流の相同配列、VCP1プロモーター配列、パロモマイシン耐性遺伝子、VCP1ターミネーター配列、PKS3下流の相同配列）を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、作製例１と同様の方法で調製し、形質転換を行った。ｆ／２液体培地にて２４時間回復培養を行った後に、５００μｇ／ｍＬのパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーをPKS3遺伝子破壊株（以下、「ΔPKS3株」ともいう）として選抜した。なお相同組換えによるPKS3遺伝子の破壊の確認は、表１に示す配列番号３６及び配列番号１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片がPKS3の遺伝子に挿入されていることを確認することで行った。
(3) Preparation of PKS3 gene disruption strain by homologous recombination Using the plasmid for PKS3 gene disruption as a template, PCR is performed using the primer pair of SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 35 shown in Table 1. Fragments (homologous sequence upstream of PKS3 gene, VCP1 promoter sequence, paromomycin resistance gene, VCP1 terminator sequence, homologous sequence downstream of PKS3) were amplified. The amplified DNA fragment was prepared in the same manner as in Production Example 1 and transformed. After 24 hours of recovery culture in f/2 liquid medium, spread on f/2 agar medium containing 500 μg/mL paromomycin, 25° C., 0.3% CO 2 atmosphere, 12 h/12 h light and dark conditions. Cultured for 2-3 weeks. The resulting colony was selected as a PKS3 gene-disrupted strain (hereinafter also referred to as "ΔPKS3 strain"). To confirm the disruption of the PKS3 gene by homologous recombination, PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 14 shown in Table 1 to confirm that the target DNA fragment was inserted into the PKS3 gene. I went by
（４）CESA1遺伝子及びPKS3遺伝子の二重破壊株の作製
作製例１で作製したCESA1遺伝子破壊株を親株とし、PKS3遺伝子破壊株の作製と同様の方法で形質転換を行った。ｆ／２液体培地にて２４時間回復培養を行った後に、５００μｇ／ｍＬのパロモマイシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて２～３週間培養した。得られたコロニーをCESA1遺伝子及びPKS3遺伝子の二重破壊株（以下、「ΔCESA1/PKS3株」ともいう）として選抜した。なお相同組換えによるPKS3遺伝子の破壊の確認は、表１に示す配列番号３６及び配列番号１４のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片がPKS3の遺伝子に挿入されていることを確認することで行った。
(4) Preparation of Double Disruption Strain of CESA1 Gene and PKS3 Gene Using the CESA1 gene disruption strain prepared in Preparation Example 1 as a parent strain, transformation was performed in the same manner as in the preparation of the PKS3 gene disruption strain. After 24 hours of recovery culture in f/2 liquid medium, spread on f/2 agar medium containing 500 μg/mL paromomycin, 25° C., 0.3% CO 2 atmosphere, 12 h/12 h light and dark conditions. Cultured for 2-3 weeks. The resulting colony was selected as a strain with double disruption of the CESA1 gene and the PKS3 gene (hereinafter also referred to as "ΔCESA1/PKS3 strain"). To confirm the disruption of the PKS3 gene by homologous recombination, PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NO: 36 and SEQ ID NO: 14 shown in Table 1 to confirm that the target DNA fragment was inserted into the PKS3 gene. I went by
実施例１ 遺伝子破壊株の脂質抽出率評価
（１）ヘキサンによる脂質抽出
試料には、作製例１で作製したΔCESA1株と作製例２で作製したΔPKS3株及びΔCESA1/PKS3株、陰性対照株の野生型の藻体（以下、「野生株」若しくは「ＷＴ」ともいう）を使用した。藻体はｆ／２培地の窒素濃度を１５倍、リン濃度を５倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」ともいう）５０ｍＬに播種し、２５℃、０．３％ＣＯ２雰囲気下、１２ｈ／１２ｈ明暗条件にて３週間培養した。
培養液１ｍＬを試験管に採取し、ヘキサン２ｍＬ及び内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７－ペンタデカノン（Alfa Aesar社製）を５０μＬ添加して激しく撹拌した。その後３，０００rpmにて５分間遠心分離し、上層のヘキサン層をパスツールピペットにて回収した。得られたヘキサン層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、８０℃にて１０分恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
Example 1 Evaluation of lipid extraction rate of gene-disrupted strains (1) Lipid extraction with hexane type of algal body (hereinafter also referred to as "wild strain" or "WT") was used. The algal bodies were seeded in 50 mL of f/2 medium with a 15-fold increase in nitrogen concentration and a 5-fold increase in phosphorus concentration (hereinafter also referred to as "N15P5 medium"), and grown at 25°C in a 0.3% CO2 atmosphere. The cells were cultured for 3 weeks under 12h/12h light/dark conditions.
1 mL of the culture medium was collected in a test tube, 2 mL of hexane and 50 μL of 1 mg/mL 7-pentadecanone (manufactured by Alfa Aesar) as an internal standard were added and vigorously stirred. After that, the mixture was centrifuged at 3,000 rpm for 5 minutes, and the upper hexane layer was collected with a Pasteur pipette. The obtained hexane layer was dried by blowing nitrogen gas, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide/methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of 14% boron trifluoride solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept at 80° C. for 10 minutes. After that, 1 mL each of hexane and saturated saline was added, and the mixture was stirred vigorously.
また、試料中に含まれる総脂肪酸量の解析は以下の方法で行った。
培養液１ｍＬに、内部標準として１ｍｇ／ｍＬの７－ペンタデカノン（Alfa Aesar社製）を５０μＬ添加後、０．５ｍＬのクロロホルム、１ｍＬのメタノール及び１０μＬの２Ｎ塩酸を培養液に添加して激しく攪拌後３０分間放置し、その後さらに０．５ｍＬのクロロホルムおよび０．５ｍＬの１．５％ＫＣｌを添加して攪拌後、３，０００ｒｐｍ、１５分遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、０．５Ｎ水酸化カリウム／メタノール溶液０．７ｍＬを添加し、８０℃で３０分恒温した。続いて１ｍＬの１４％三フッ化ホウ素溶液（ＳＩＧＭＡ社製）を添加し、８０℃にて１０分恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各１ｍＬ添加し激しく撹拌し、室温にて３０分放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸エステルを得た。
In addition, analysis of the total fatty acid content in the sample was performed by the following method.
After adding 50 μL of 1 mg/mL 7-pentadecanone (manufactured by Alfa Aesar) as an internal standard to 1 mL of the culture solution, 0.5 mL of chloroform, 1 mL of methanol and 10 μL of 2N hydrochloric acid were added to the culture solution and vigorously stirred. Allow to stand for 30 minutes, then add 0.5 mL of chloroform and 0.5 mL of 1.5% KCl, stir, centrifuge at 3,000 rpm for 15 minutes, and remove the chloroform layer (lower layer) with a Pasteur pipette. recovered. The obtained chloroform layer was dried by blowing nitrogen gas, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide/methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of 14% boron trifluoride solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept at 80° C. for 10 minutes. After that, 1 mL each of hexane and saturated saline was added, and the mixture was stirred vigorously.
得られた脂肪酸エステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。ガスクロマトグラフィー解析は下記の条件で行った。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：Agilent technology 7890A
キャピラリーカラム：ＤＢ－１ ＭＳ ３０ｍ×２００μｍ×０．２５μｍ（J＆W Scientific）
移動層：高純度ヘリウム
カラム内流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
昇温プログラム：１００℃（１分間）→１０℃／ｍｉｎ→３００℃（５分間）
平衡化時間：１分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：１００：１）
圧力：１４．４９ｐｓｉ，１０４ｍＬ／ｍｉｎ
注入量：１μＬ
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：３００℃
The resulting fatty acid ester was subjected to gas chromatography analysis. Gas chromatography analysis was performed under the following conditions.
<Gas chromatography conditions>
Analyzer: Agilent technology 7890A
Capillary column: DB-1 MS 30 m x 200 µm x 0.25 µm (J&W Scientific)
Mobile bed: High-purity helium Flow rate in column: 1.0 mL/min
Heating program: 100°C (1 minute) → 10°C/min → 300°C (5 minutes)
Equilibration time: 1 minute Inlet: split injection (split ratio: 100:1)
Pressure: 14.49 psi, 104 mL/min
Injection volume: 1 μL
Wash vial: methanol/chloroform Detector temperature: 300°C
また、脂肪酸エステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である７－ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、各脂肪酸量を算出しその総和を総脂肪酸量とした。得られた総脂肪酸量を基に、ヘキサン抽出による抽出効率を以下の式で計算した。
抽出率（％）＝ヘキサン抽出により得られた総脂肪酸量／試料中の総脂肪酸量×１００
得られた抽出率を表２に示す。抽出率（％）は独立ラインの平均値±標準偏差（ＳＤ）の形式で表示した。なお、以下の表において、野生株は「ＷＴ」と記載し、遺伝子破壊株はそれぞれΔCESA1株を「ΔCES」、ΔPKS3株を「ΔPKS」、ΔCESA1/PKS3株を「ΔCP」と表記した。なお、本実施例でいう「総脂肪酸量」とは、C12:0量、C14:0量、C16:1量、C16:0量、C18:n量、C20:5量の合計を意味する。なお、Ｃｘ：ｙとあるのは炭素原子数がｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表す。また、Ｃ１８：ｎの「ｎ」は０～５の整数を表し、Ｃ１８：０、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２、Ｃ１８：３、Ｃ１８：４、及びＣ１８：５の脂肪酸の総和を表す。
The fatty acid ester was identified by subjecting the same sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions.
The amount of methyl ester of each fatty acid was quantified from the peak area of waveform data obtained by gas chromatography analysis. Each peak area was compared with the peak area of 7-pentadecanone, which is an internal standard, to correct between samples, and the amount of each fatty acid was calculated, and the total was taken as the total fatty acid amount. Based on the obtained total fatty acid amount, the extraction efficiency by hexane extraction was calculated by the following formula.
Extraction rate (%) = total fatty acid amount obtained by hexane extraction/total fatty acid amount in sample x 100
Table 2 shows the extraction rates obtained. The extraction rate (%) was displayed in the form of mean±standard deviation (SD) of independent lines. In the following tables, the wild strain is indicated as "WT", and the gene-disrupted strains are indicated as "ΔCES" for the ΔCESA1 strain, "ΔPKS" for the ΔPKS3 strain, and "ΔCP" for the ΔCESA1/PKS3 strain. The term "total fatty acid content" as used in the present examples means the total amount of C12:0, C14:0, C16:1, C16:0, C18:n and C20:5. Cx:y represents a fatty acid having x carbon atoms and y double bonds. Also, "n" in C18:n represents an integer of 0 to 5, and represents the sum of C18:0, C18:1, C18:2, C18:3, C18:4 and C18:5 fatty acids.
表２より明らかなように、ΔCESA1株、ΔPKS3株及びΔCESA1/PKS3株は、野生株と比較して高い抽出率を示した。特にΔCESA1/PKS3株では、大幅に抽出率が増加した。 As is clear from Table 2, the ΔCESA1 strain, the ΔPKS3 strain and the ΔCESA1/PKS3 strain showed higher extraction rates than the wild strain. Especially in the ΔCESA1/PKS3 strain, the extraction rate was significantly increased.
（２）ビーズ破砕による脂質抽出
前記藻体の培養液１ｍＬを１５，０００ｒｐｍにて遠心分離し、上清を捨てて細胞を回収した。破砕用ビーズ（０．５ｍｍ）を０．４ｍｇ使って、マルチビーズショッカー（安井機械製）１，０００ｒｐｍにて３０秒破砕を行った。
破砕後のサンプルを前述と同様の方法でヘキサン抽出し、抽出された総脂肪酸量を解析して、ビーズ破砕による脂質抽出効率を計算した。得られた抽出効率を表３に示す。抽出率（％）は独立ラインの平均値±標準偏差の形式で表示した。
(2) Lipid Extraction by Crushing Beads 1 mL of the alga body culture solution was centrifuged at 15,000 rpm, and the supernatant was discarded to recover the cells. Using 0.4 mg of crushing beads (0.5 mm), crushing was performed for 30 seconds with a multi-bead shocker (manufactured by Yasui Kikai Co., Ltd.) at 1,000 rpm.
The crushed sample was extracted with hexane in the same manner as described above, the total amount of extracted fatty acids was analyzed, and the efficiency of lipid extraction by bead crushing was calculated. Table 3 shows the extraction efficiencies obtained. The extraction rate (%) was displayed in the form of mean±standard deviation of independent lines.
表３より明らかなように、ΔCESA1株、ΔPKS3株及びΔCESA1/PKS3株は、野生株と比較して高い抽出率を示した。特にΔCESA1/PKS3株では、大幅に抽出率が増加した。 As is clear from Table 3, the ΔCESA1 strain, the ΔPKS3 strain and the ΔCESA1/PKS3 strain showed higher extraction rates than the wild strain. Especially in the ΔCESA1/PKS3 strain, the extraction rate was significantly increased.
（３）ハンドプレスによる脂質の圧搾抽出
前記藻体を遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分間）にて回収し、凍結乾燥させた。乾燥藻体５～１０ｍｇを２枚のプランクトンネット（孔径１μｍ）ではさみ、さらに外側を２枚のＮｏ．２ろ紙（アドバンテック社製）で挟んだ。次に、２枚のテフロン（登録商標）加工された鉄板ではさみ、ハンドプレス機ＴＭ－２６（東邦マシナリー社製）にセットして、８０℃、５０ＭＰａで１０分間加圧した。
加圧後のろ紙を回収し、ろ紙に染み出した脂質成分をクロロホルム10ｍＬで抽出した。抽出した脂質成分は前述と同様の方法で総脂肪酸量を解析し、ハンドプレスによる脂質抽出効率を計算した。得られた抽出効率を表４に示す。抽出率（％）は独立ラインの平均値±標準偏差の形式で表示した。
(3) Compression extraction of lipids by hand press The alga bodies were collected by centrifugation (3,000 rpm, 5 minutes) and freeze-dried. 5 to 10 mg of dry algal cells were sandwiched between two plankton nets (pore size: 1 μm), and the outer side was further screened with two No. 2 nets. 2 sandwiched between filter papers (manufactured by Advantech). Next, it was sandwiched between two Teflon (registered trademark) iron plates, set in a hand press machine TM-26 (manufactured by Toho Machinery Co., Ltd.), and pressurized at 80° C. and 50 MPa for 10 minutes.
The filter paper after pressurization was collected, and the lipid component exuded to the filter paper was extracted with 10 mL of chloroform. The extracted lipid components were analyzed for total fatty acid content in the same manner as described above, and the lipid extraction efficiency by hand pressing was calculated. Table 4 shows the extraction efficiencies obtained. The extraction rate (%) was displayed in the form of mean±standard deviation of independent lines.
表４より明らかなように、ΔCESA1株、ΔPKS3株及びΔCESA1/PKS3株は、野生株と比較して高い抽出率を示した。特にΔCESA1/PKS3株では、大幅に抽出率が増加した。 As is clear from Table 4, the ΔCESA1 strain, the ΔPKS3 strain and the ΔCESA1/PKS3 strain showed higher extraction rates than the wild strain. Especially in the ΔCESA1/PKS3 strain, the extraction rate was significantly increased.
以上のことから、CES及びアルジナン合成に関与するPKSの少なくとも１つの発現が低下又は喪失した本発明に用いる藻類改変体は、野生株と比較して、いずれの方法によっても脂質の回収が容易であることが明らかとなった。さらに、CES及びアルジナン合成に関与するPKSを両方欠失させた藻類改変体は、野生株と比べて、脂質の回収が特に容易であることが明らかとなった。 Based on the above, the modified alga used in the present invention in which the expression of at least one of PKS involved in CES and arginane synthesis is reduced or lost is easier to recover lipids by any method than the wild type. One thing became clear. Furthermore, it was revealed that algae mutants lacking both CES and PKS involved in arginane synthesis are particularly easy to recover lipids compared to wild strains.
Claims (4)
生産させた脂肪酸又は脂質を培養後の藻体から回収し、脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を得る、脂質の製造方法。 The expression of at least one protein selected from the group consisting of cellulose synthase and polyketide synthase involved in arginane synthesis is reduced or lost due to disruption or deletion of the gene encoding the protein. Culturing algae belonging to the genus Nannochloropsis to produce fatty acids or lipids containing these as constituents,
A method for producing a lipid, which comprises recovering the produced fatty acid or lipid from algal cells after culturing to obtain the fatty acid or a lipid having the same as a constituent.
生産させた脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を培養後の藻体から回収する、脂質の回収方法。 The expression of at least one protein selected from the group consisting of cellulose synthase and polyketide synthase involved in arginane synthesis is reduced or lost due to disruption or deletion of the gene encoding the protein. Culturing algae belonging to the genus Nannochloropsis to produce fatty acids or lipids containing these as constituents,
A method for recovering lipids, comprising recovering produced fatty acids or lipids composed of these fatty acids from cultured alga bodies.
（Ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）前記タンパク質（Ａ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつセルロース合成酵素活性を有するタンパク質。
（Ｃ）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｄ）前記タンパク質（Ｃ）のアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアルジナン合成に関与するタンパク質。 The method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the cellulose synthase is the following protein (A) or (B), and the polyketide synthase is the following protein (C) or (D).
(A) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
(B) A protein consisting of an amino acid sequence having 90 % or more identity with the amino acid sequence of the protein (A) and having cellulose synthase activity.
(C) A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:3.
(D) A protein consisting of an amino acid sequence having 90 % or more identity with the amino acid sequence of the protein (C) and participating in arginane synthesis.
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| Energies，2018年02月，Vol. 11: 450，p. 1-13 |
| Sci. Rep.，2017年，Vol. 7: 5264，p. 1-11 |
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