JP6083577B2 - 大腸癌細胞の存否を判定する方法および遺伝子マーカー - Google Patents
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Description
本発明は、生体試料中の大腸癌細胞の存否を判定する方法、およびその方法に用いられる遺伝子マーカーに関する。
高等真核生物の染色体ＤＮＡでは、ＤＮＡを構成する塩基のうち、Ｃ（シトシン）の５位がメチル化修飾を受けることがある。この高等真核生物におけるＤＮＡのメチル化は、遺伝情報の発現抑制機構として機能している。例えば、ある遺伝子のプロモーター領域によく見られるＣｐＧ配列を多く含む領域（ＣｐＧアイランド、ＣＧ島）がメチル化されていると、その遺伝子の転写が抑制される。これに対して、ＣｐＧアイランドがメチル化を受けていないと、プロモーター領域に転写因子が結合可能となり、遺伝子が転写可能な状態になる。
このように、ＤＮＡのメチル化は遺伝子発現の制御機構の１つである。そのため、ＤＮＡのメチル化は、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、哺乳動物に特徴的な現象である遺伝子刷り込みやＸ染色体の不活性化、染色体の安定化、ＤＮＡ複製のタイミングなどの様々な生理的および病理的な現象に重要な役割を果たしている。
さらに近年、ＤＮＡのメチル化による遺伝子のサイレンシングが癌の発生や進行に関与することが明らかになってきている（非特許文献１および２）。
さらに近年、ＤＮＡのメチル化による遺伝子のサイレンシングが癌の発生や進行に関与することが明らかになってきている（非特許文献１および２）。
一方、医療分野において、癌の治療方針を決定するためには早期発見のみならず、手術後の癌の再発または転移の可能性あるいは手術後のある一定期間の患者の生存率の予測、すなわち、予後の判定方法を確立することも重要である。従来、手術や生検などにより得られた腫瘍組織の分化度の評価から予後を判定する方法が存在するが、分化度が独立した予後因子であるか否かは不明であった。また、組織学的分化度の判定は観察者の主観に依存するため、予後判定が不正確になる傾向があった。
特に大腸癌は高分化腺癌が多く、中分化および低分化腺癌が少ないことから、予後判定には組織像自体はあまり考慮されない。また、大腸癌には分化度の評価が困難である例が存在するので組織診断が曖昧になるなどの問題があるので、予後判定は困難であった（特許文献１および２）。
特に大腸癌は高分化腺癌が多く、中分化および低分化腺癌が少ないことから、予後判定には組織像自体はあまり考慮されない。また、大腸癌には分化度の評価が困難である例が存在するので組織診断が曖昧になるなどの問題があるので、予後判定は困難であった（特許文献１および２）。
Feinberg AP.およびTycko B.，Nat Rev Cancer Vol.４，１４３−１５３（２００４）
Jones PA.およびBaylin SB.，Cell Vol.１２８，６８３−６９２（２００７）
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、生体試料中のあるＤＮＡのメチル化状態を解析することにより簡便に癌細胞の存否を判定する方法および癌患者の予後を判定する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、癌患者と癌に罹患していない対象とのゲノムＤＮＡのＣｐＧ部位のメチル化状態を解析して比較することにより、癌患者のゲノムＤＮＡに特異的に認められるメチル化状態の遺伝子を探索し、同定された遺伝子を癌の遺伝子マーカーとして用いることができるのではないかと考えた。
本発明者らはまず、株化細胞から得られたゲノムＤＮＡからプロモーター領域にメチル化が認められる遺伝子を同定した。
次いで、本発明者らは、プロモーター領域にメチル化されているこれらの遺伝子について、上記の細胞での発現量が低いかまたは発現が認められない遺伝子をサイレンシング遺伝子として同定した。
さらに、本発明者らは、上記のサイレンシング遺伝子の癌組織および正常組織でのメチル化の状態を解析し、これらの組織間でメチル化の程度が異なる遺伝子を、生体試料中の癌細胞の存否を判定するためのマーカー遺伝子として用い得ることを見出して、本発明を完成した。
次いで、本発明者らは、プロモーター領域にメチル化されているこれらの遺伝子について、上記の細胞での発現量が低いかまたは発現が認められない遺伝子をサイレンシング遺伝子として同定した。
さらに、本発明者らは、上記のサイレンシング遺伝子の癌組織および正常組織でのメチル化の状態を解析し、これらの組織間でメチル化の程度が異なる遺伝子を、生体試料中の癌細胞の存否を判定するためのマーカー遺伝子として用い得ることを見出して、本発明を完成した。
また、本発明者らは、上記のサイレンシング遺伝子のうちのいくつかの遺伝子がメチル化している大腸癌患者において、その大腸癌がマイクロサテライト不安定性（以下、「ＭＳＩ」ともいう）の高い症例であることも見出した。一般にＭＳＩが高い症例の大腸癌患者は、予後が良好であることが知られている（Popat S.ら，J Clin Oncol，vol.２３，６０９‐６１３（２００５）参照）。本発明者らは、これらの遺伝子を大腸癌患者の予後を判定するためのマーカー遺伝子として用い得ることを見出して、本発明を完成した。
すなわち、本発明によれば、
被験者から採取した生体試料からＤＮＡを抽出する抽出工程と、
抽出工程で得られたＤＮＡに含まれるコラーゲンタイプＩＶアルファ２（collagen, typeIV, alpha 2：ＣＯＬ４Ａ２）、アルデヒドオキシダーゼ１（aldehyde oxidase 1：ＡＯＸ１）、二重特異性ホスファターゼ（dual specificity phosphatase 26：ＤＵＳＰ２６）、ＥＧＦ様反復およびディスコイディン１様ドメイン３（EGF-like repeats and discoidin 1-like domains 3：ＥＤＩＬ３）、ＥＦハンドドメインファミリーメンバーＤ１（EF-hand domain family, member D1：ＥＦＨＤ１）、呑食および細胞運動性１（engulfment and cell motility 1：ＥＬＭＯ１）、ストークヘッドボックス２（storkhead box 2：ＳＴＯＸ２）およびジンクフィンガープロテイン４４７（zinc finger protein 447：ＺＮＦ４４７）の遺伝子群から選択される少なくとも1つの遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の状態を解析する解析工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する判定工程と
を含む生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法が提供される。
被験者から採取した生体試料からＤＮＡを抽出する抽出工程と、
抽出工程で得られたＤＮＡに含まれるコラーゲンタイプＩＶアルファ２（collagen, typeIV, alpha 2：ＣＯＬ４Ａ２）、アルデヒドオキシダーゼ１（aldehyde oxidase 1：ＡＯＸ１）、二重特異性ホスファターゼ（dual specificity phosphatase 26：ＤＵＳＰ２６）、ＥＧＦ様反復およびディスコイディン１様ドメイン３（EGF-like repeats and discoidin 1-like domains 3：ＥＤＩＬ３）、ＥＦハンドドメインファミリーメンバーＤ１（EF-hand domain family, member D1：ＥＦＨＤ１）、呑食および細胞運動性１（engulfment and cell motility 1：ＥＬＭＯ１）、ストークヘッドボックス２（storkhead box 2：ＳＴＯＸ２）およびジンクフィンガープロテイン４４７（zinc finger protein 447：ＺＮＦ４４７）の遺伝子群から選択される少なくとも1つの遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の状態を解析する解析工程と、
解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する判定工程と
を含む生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法が提供される。
また、本発明によれば、
大腸癌患者から採取した生体試料からＤＮＡを抽出する抽出工程と、
抽出工程で得られたＤＮＡに含まれるＤＮＡ結合インヒビター４ドミナントネガティブ ヘリックス・ループ・ヘリックスタンパク質（inhibitor of DNA binding 4, dominant negative helix-loop-helix protein：ＩＤ４）、リシルオキシダーゼ（lysyl oxidase：ＬＯＸ）およびミオカルディン（myocardin：ＭＹＯＣＤ）の遺伝子群から選択される少なくとも1つの遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の状態を解析する解析工程と
解析工程で得られた解析結果に基づいて、大腸癌患者の予後を判定する判定工程と、
を含む大腸癌患者の予後を判定する方法が提供される。
大腸癌患者から採取した生体試料からＤＮＡを抽出する抽出工程と、
抽出工程で得られたＤＮＡに含まれるＤＮＡ結合インヒビター４ドミナントネガティブ ヘリックス・ループ・ヘリックスタンパク質（inhibitor of DNA binding 4, dominant negative helix-loop-helix protein：ＩＤ４）、リシルオキシダーゼ（lysyl oxidase：ＬＯＸ）およびミオカルディン（myocardin：ＭＹＯＣＤ）の遺伝子群から選択される少なくとも1つの遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の状態を解析する解析工程と
解析工程で得られた解析結果に基づいて、大腸癌患者の予後を判定する判定工程と、
を含む大腸癌患者の予後を判定する方法が提供される。
さらに、本発明によれば、ＡＯＸ１、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＵＳＰ２６、ＥＤＩＬ３、ＥＦＨＤ１、ＥＬＭＯ１、ＳＴＯＸ２およびＺＮＦ４４７の遺伝子群から選択される、メチル化解析を用いた癌細胞の存否の判定のためのマーカー遺伝子が提供される。
また、本発明によれば、ＩＤ４、ＬＯＸおよびＭＹＯＣＤの遺伝子群から選択される、メチル化解析を用いた大腸癌患者の予後の判定のためのマーカー遺伝子も提供される。
本発明の生体試料中の癌細胞の存否を判定する方法（以下、「本発明の方法１」ともいう）および大腸癌患者の予後を判定する方法（以下、「本発明の方法２」ともいう）によれば、被験者および大腸癌患者から採取した生体試料から抽出したＤＮＡについて、それぞれ本発明の癌細胞の存否判定用マーカー遺伝子および予後判定用マーカー遺伝子のメチル化状態を解析することにより、癌細胞の存否の判定および大腸癌患者の予後の判定を簡便に行うことができる。
本明細書において「ＣｐＧ部位」とは、塩基配列中のシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）とが５’から３’への方向にこの順序で隣り合った配列を有する部位を意味する。なお、ＣｐＧの「ｐ」の文字はシトシンとグアニンとの間のホスホジエステル結合を表わす。
哺乳類のゲノムＤＮＡでは、ＣｐＧ部位においてメチル化修飾が行われることが知られている。また、ＣｐＧ部位は遺伝子のプロモーター領域に多く存在することが知られているが、本明細書において「ＣｐＧ部位」は、目的の遺伝子の塩基配列および該遺伝子のプロモーター領域を含め、該遺伝子の発現に関わる領域に存在する全てのＣｐＧ部位を含むことを意図する。
哺乳類のゲノムＤＮＡでは、ＣｐＧ部位においてメチル化修飾が行われることが知られている。また、ＣｐＧ部位は遺伝子のプロモーター領域に多く存在することが知られているが、本明細書において「ＣｐＧ部位」は、目的の遺伝子の塩基配列および該遺伝子のプロモーター領域を含め、該遺伝子の発現に関わる領域に存在する全てのＣｐＧ部位を含むことを意図する。
本明細書において「メチル化状態を解析する」とは、あるマーカー遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧ部位のメチル化の有無を解析すること、または該マーカー遺伝子の全ＣｐＧ部位または任意のＣｐＧ部位に対するメチル化ＣｐＧ部位の割合、すなわちメチル化率を解析することを意図する。
また、後述するＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）によってＤＮＡのメチル化状態を解析する場合、メチル化率はあるマーカー遺伝子のＤＮＡ断片を解析して得られるメチル化断片由来のピークと非メチル化断片由来のピークとの面積比から算出される値も意味する。なお、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析において、該ＤＮＡ断片中に含まれるＣｐＧ部位が複数である場合は、それらを「ＣｐＧユニット」としてひとまとめにして解析され、得られる各ピークの面積比からメチル化率が算出される。
また、後述するＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）によってＤＮＡのメチル化状態を解析する場合、メチル化率はあるマーカー遺伝子のＤＮＡ断片を解析して得られるメチル化断片由来のピークと非メチル化断片由来のピークとの面積比から算出される値も意味する。なお、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析において、該ＤＮＡ断片中に含まれるＣｐＧ部位が複数である場合は、それらを「ＣｐＧユニット」としてひとまとめにして解析され、得られる各ピークの面積比からメチル化率が算出される。
本明細書において「大腸癌患者の予後を判定する」とは、大腸癌患者の生命予後を判定することを意図する。また、「大腸癌患者の予後が良い」とは、大腸癌患者の生命予後、好ましくは確定診断後もしくは手術後の該患者の一定期間（好ましくは５〜１０年間）の生存率または無再発生存率が良好であることを意図する。
「マイクロサテライト」（microsatellite）とは、細胞の核およびオルガネラのゲノム上に存在する反復配列であって、特に数塩基程度の単位配列の繰り返しからなる配列を意味する。
腫瘍細胞においては、ＤＮＡ複製の制御機構、特にミスマッチ修復経路が損なわれているので、マイクロサテライトの数は腫瘍細胞が有糸分裂するたびに高頻度で増加または減少する。このようなマイクロサテライトの数の不安定性を「マイクロサテライト不安定性（microsatellite instability：ＭＳＩ）」という。
腫瘍細胞においては、ＤＮＡ複製の制御機構、特にミスマッチ修復経路が損なわれているので、マイクロサテライトの数は腫瘍細胞が有糸分裂するたびに高頻度で増加または減少する。このようなマイクロサテライトの数の不安定性を「マイクロサテライト不安定性（microsatellite instability：ＭＳＩ）」という。
ＭＳＩの判定は、ＮＣＩ（National Cancer Institute）ワークショップにより推奨された５つのＭＳＩマーカー（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ２Ｓ１２３およびＤ１７Ｓ２５０）の塩基配列を解析することにより行うことができる（Boland C.R.ら，Cancer Res，vol.５８，５２４８−５２５７（１９９８）参照）。
上記の５つのマーカーのうち、２つ以上のマーカーでＭＳＩを認める場合を高ＭＳＩ（MSI-High：ＭＳＩ−Ｈ）、１つのマーカーでＭＳＩを認める場合を低ＭＳＩ（MSI-Low：ＭＳＩ−Ｌ）、いずれのマーカーでもＭＳＩを認めない場合を安定ＭＳ（microsatellite stable：ＭＳＳ)と判定する。
上記の５つのマーカーのうち、２つ以上のマーカーでＭＳＩを認める場合を高ＭＳＩ（MSI-High：ＭＳＩ−Ｈ）、１つのマーカーでＭＳＩを認める場合を低ＭＳＩ（MSI-Low：ＭＳＩ−Ｌ）、いずれのマーカーでもＭＳＩを認めない場合を安定ＭＳ（microsatellite stable：ＭＳＳ)と判定する。
本発明の方法１で用いられる癌細胞の存否の判定のためのマーカー遺伝子は、ＣＯＬ４Ａ２、ＡＯＸ１、ＤＵＳＰ２６、ＥＤＩＬ３、ＥＦＨＤ１、ＥＬＭＯ１、ＳＴＯＸ２およびＺＮＦ４４７である。
上記のマーカー遺伝子は大腸癌由来の生体試料から同定されたものであるが、悪性腫瘍でメチル化される遺伝子においては、その多くが単一の悪性腫瘍だけではなく他の悪性腫瘍でも共通してメチル化の異常が見られることがEsteller M.により報告されている（Nature Review Genetics、Vol.８、２８６−２９８（２００７）参照）。
したがって、上記のマーカー遺伝子についても種々の癌腫においてメチル化される可能性がある。よって、これらのマーカー遺伝子を用いた本発明の方法１は、大腸癌のみならず、胃癌、肺癌、乳癌、口腔癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、白血病などの癌細胞の存否も判定し得ると期待できる。
上記のマーカー遺伝子は大腸癌由来の生体試料から同定されたものであるが、悪性腫瘍でメチル化される遺伝子においては、その多くが単一の悪性腫瘍だけではなく他の悪性腫瘍でも共通してメチル化の異常が見られることがEsteller M.により報告されている（Nature Review Genetics、Vol.８、２８６−２９８（２００７）参照）。
したがって、上記のマーカー遺伝子についても種々の癌腫においてメチル化される可能性がある。よって、これらのマーカー遺伝子を用いた本発明の方法１は、大腸癌のみならず、胃癌、肺癌、乳癌、口腔癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、白血病などの癌細胞の存否も判定し得ると期待できる。
本発明の方法１の抽出工程では、被験者から採取した生体試料からＤＮＡを抽出する。
上記の生体試料としては、被験者のＤＮＡを含むものであれば特に限定されないが、好ましくはゲノムＤＮＡを含むもの、例えば臨床検体を用い得る。臨床検体として具体的には、血液、血清、リンパ球、尿、乳頭分泌液、手術や生検により採取した組織などが挙げられる。
上記の生体試料としては、被験者のＤＮＡを含むものであれば特に限定されないが、好ましくはゲノムＤＮＡを含むもの、例えば臨床検体を用い得る。臨床検体として具体的には、血液、血清、リンパ球、尿、乳頭分泌液、手術や生検により採取した組織などが挙げられる。
生体試料からのＤＮＡの抽出は、公知の抽出法により行うことができ、例えば、細胞や組織を可溶化する界面活性剤（コール酸ナトリウムやドデシル硫酸ナトリウムなど）を含む処理液と生体試料とを混合した後、物理的処理（撹拌、ホモジナイズ、超音波破砕など）を施して生体試料に含まれるＤＮＡを溶液中に遊離させ、該溶液を遠心分離して上清を回収し、この上清をフェノール／クロロホルム抽出することによって行うことができる。得られたＤＮＡは、公知の方法によりさらに精製してもよい。生体試料からのＤＮＡの抽出および精製は、市販のキットを用いて行うこともできる。
抽出工程には、抽出したＤＮＡを断片化する工程をさらに含むことが好ましい。生体試料に含まれるＤＮＡを適当な長さに断片化しておくことにより、次のメチル化状態を解析する工程において後述するＭｅＤＩＰ法およびバイサルファイト処理を行う場合、これらの処理を効率よく行うことができる。
ＤＮＡの断片化は、超音波処理、アルカリ処理または制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、水酸化ナトリウムを用いてアルカリ処理を行なう場合は、ＤＮＡ溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度０．１〜１．０Ｎとなるよう添加し、１０〜４０℃で５〜１５分間インキュベートすることによりＤＮＡを断片化できる。また、制限酵素処理を行う場合、用いる酵素はＤＮＡの塩基配列に基づいて適宜選択でき、例えば、ＭｓｅＩやＢａｍＨＩなどを用い得る。
ＤＮＡの断片化は、超音波処理、アルカリ処理または制限酵素処理などにより行うことができる。例えば、水酸化ナトリウムを用いてアルカリ処理を行なう場合は、ＤＮＡ溶液に水酸化ナトリウム溶液を終濃度０．１〜１．０Ｎとなるよう添加し、１０〜４０℃で５〜１５分間インキュベートすることによりＤＮＡを断片化できる。また、制限酵素処理を行う場合、用いる酵素はＤＮＡの塩基配列に基づいて適宜選択でき、例えば、ＭｓｅＩやＢａｍＨＩなどを用い得る。
本発明の方法１の解析工程では、抽出したＤＮＡに含まれる遺伝子のうち、ＣＯＬ４Ａ２、ＡＯＸ１、ＤＵＳＰ２６、ＥＤＩＬ３、ＥＦＨＤ１、ＥＬＭＯ１、ＳＴＯＸ２およびＺＮＦ４４７の遺伝子群から選択される少なくとも1つの遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の状態を解析する。
解析工程は、上記のマーカー遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧ部位のメチル化の有無を解析する工程であってもよい。この場合、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のＣｐＧ部位のメチル化の有無を解析することが好ましい。
また、解析工程は、上記のマーカー遺伝子のメチル化率を解析する工程であってもよい。
なお、解析対象のマーカー遺伝子は、上記の９つの遺伝子のうちのいずれか１つであってもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のマーカー遺伝子について解析することが好ましい。
また、解析工程は、上記のマーカー遺伝子のメチル化率を解析する工程であってもよい。
なお、解析対象のマーカー遺伝子は、上記の９つの遺伝子のうちのいずれか１つであってもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のマーカー遺伝子について解析することが好ましい。
上記のマーカー遺伝子の塩基配列自体は公知である。これらの塩基配列は、例えばUnigene（米国国立医学図書館の国立生物情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）により提供されるデータベース）などの公知のデータベースから知ることができる。上記のマーカー遺伝子のUnigeneコード、ＮＣＢＩコードおよび配列番号を、表１に示す。
遺伝子のＣｐＧ部位のメチル化の状態を解析する方法としては、種々の方法が公知である。解析工程ではいずれの解析方法を用いるかは特に限定されないが、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別する工程と、ＤＮＡを増幅する工程と、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを分離して検出する工程とを含むことが好ましい。
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別する工程としては、メチル化感受性制限酵素処理、ＭｅＤＩＰ法またはバイサルファイト処理などが挙げられる。
ＤＮＡを増幅する工程としては、ＰＣＲ増幅法、定量的ＰＣＲ増幅法、ＩＶＴ（in vitro transcription）増幅法、ＳＰＩＡ（商標）増幅法などが挙げられる。
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを分離して検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法などが挙げられる。
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別する工程としては、メチル化感受性制限酵素処理、ＭｅＤＩＰ法またはバイサルファイト処理などが挙げられる。
ＤＮＡを増幅する工程としては、ＰＣＲ増幅法、定量的ＰＣＲ増幅法、ＩＶＴ（in vitro transcription）増幅法、ＳＰＩＡ（商標）増幅法などが挙げられる。
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを分離して検出する工程としては、電気泳動法、シークエンス解析法、マイクロアレイ解析法、質量分析法などが挙げられる。
上記の「ＭｅＤＩＰ法」とは、抗メチル化シトシン抗体もしくは抗メチル化シチジン抗体、またはメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を特異的に認識する抗体を用いる免疫沈降により、試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮する方法である。この濃縮したメチル化ＤＮＡをＰＣＲ増幅法やＩＶＴ増幅法により増幅した後に、マイクロアレイを用いたＤＮＡメチル化状態の解析を行うことができる。この方法は、ＭｅＤＩＰ−ｃｈｉｐ法と呼ばれる。
上記の「バイサルファイト処理」とは、亜硫酸水素のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの亜硫酸水素塩（バイサルファイト（bisulfite））を溶媒に溶解した溶液を、ＤＮＡの溶液に添加して、該ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシン（Ｃ）を脱アミノ化反応によりウラシル（Ｕ）に変換する処理である。
一方、バイサルファイトはメチル化シトシンには作用せず、上記のような塩基の変換は起こらない。したがって、ＤＮＡのメチル化状態の違いは、バイサルファイト処理によって塩基配列の違い（ＣおよびＵ）に変換される。
一方、バイサルファイトはメチル化シトシンには作用せず、上記のような塩基の変換は起こらない。したがって、ＤＮＡのメチル化状態の違いは、バイサルファイト処理によって塩基配列の違い（ＣおよびＵ）に変換される。
このバイサルファイト処理によってＤＮＡ中の非メチル化シトシンをウラシルに変換して、該ＤＮＡのシークエンス解析をすることにより塩基配列の違いを検出し、ＤＮＡのメチル化状態を解析できる。この方法はバイサルファイトシークエンス法と呼ばれる。
また、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとで異なる塩基配列の部位について、それぞれに特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物の有無によりＤＮＡのメチル化状態を解析できる。この方法はメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法と呼ばれる。
上記の方法以外に、バイサルファイト処理を利用したメチル化ＤＮＡの解析方法としては、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）法、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Methylation-sensitive Single-Nucleotide Primer Extention）法、定量的ＭＳＰ法、パイロシークエンス法などが知られる。
また、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとで異なる塩基配列の部位について、それぞれに特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ産物の有無によりＤＮＡのメチル化状態を解析できる。この方法はメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）法と呼ばれる。
上記の方法以外に、バイサルファイト処理を利用したメチル化ＤＮＡの解析方法としては、ＣＯＢＲＡ（Combined Bisulfite Restriction Analysis）法、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Methylation-sensitive Single-Nucleotide Primer Extention）法、定量的ＭＳＰ法、パイロシークエンス法などが知られる。
上記のバイサルファイト処理によって非メチル化シトシンをウラシルに変換したＤＮＡを鋳型として、目的の遺伝子の塩基配列に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した後、得られたＰＣＲ産物をさらにＩＶＴ増幅することにより、メチル化シトシンおよびウラシルは、それぞれグアニン（Ｇ）およびアデニン（Ａ）となる。得られたＩＶＴ産物をＲＮａｓｅＡで切断し、得られた核酸断片間におけるＧとＡとの質量差（１６ｋＤａ）をＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化−飛行時間）型質量分析装置を用いて検出することにより、ＤＮＡのメチル化状態を解析できる。この方法はＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析と呼ばれる（図１のＡおよびＢ参照）。
例えば、試料中のＤＮＡ断片が有するＣｐＧ部位の１か所がメチル化していた場合、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）で得られるピークは、高質量側（右側）に１６ｋＤａシフトする（図１のＣの左パネル参照）。複数のＣｐＧ部位を有するＤＮＡ断片の解析では、例えば該断片のＣｐＧ部位が２か所メチル化していた場合は３２ｋＤａシフトし（図１のＣの右パネル参照）、３か所メチル化していた場合は４８ｋＤａシフトする。
なお、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析では、上記のように解析対象のＤＮＡ断片が複数のＣｐＧ部位を有する場合、該複数のＣｐＧ部位は「ＣｐＧユニット」としてひとまとめにして解析されるので、いずれの部位がメチル化しているか特定できない。
例えば、試料中のＤＮＡ断片が有するＣｐＧ部位の１か所がメチル化していた場合、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）で得られるピークは、高質量側（右側）に１６ｋＤａシフトする（図１のＣの左パネル参照）。複数のＣｐＧ部位を有するＤＮＡ断片の解析では、例えば該断片のＣｐＧ部位が２か所メチル化していた場合は３２ｋＤａシフトし（図１のＣの右パネル参照）、３か所メチル化していた場合は４８ｋＤａシフトする。
なお、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析では、上記のように解析対象のＤＮＡ断片が複数のＣｐＧ部位を有する場合、該複数のＣｐＧ部位は「ＣｐＧユニット」としてひとまとめにして解析されるので、いずれの部位がメチル化しているか特定できない。
ＰＣＲ増幅法を利用した解析を行なう場合、増幅用プライマーは目的の遺伝子の塩基配列に応じて当業者が適宜設計し得るが、定量的メチル化解析を行うために、該プライマーにはＣｐＧ部位を含まないか、または５’側に１つだけ含めて設計することが好ましい。なお、増幅用プライマーには必要に応じてタグ配列、Ｔ７プロモーター配列などを付加してもよい。
マイクロアレイを用いてマーカー遺伝子のメチル化を解析する場合、用いるマイクロアレイは、該マーカー遺伝子の塩基配列に相補的な核酸プローブ１種以上を当該技術において公知の方法により基板上に固定化して作製できる。また、市販のマイクロアレイを用いてもよい。
マイクロアレイによる解析では、上記の生体試料中に含まれるＤＮＡは当該技術において公知の標識物質により標識されていることが好ましい。よって、本発明の方法１は、抽出したＤＮＡを標識する工程をさらに含むことが好ましい。この標識工程は生体試料中の全てのＤＮＡを標識できるので、ＤＮＡを増幅する工程の後に行われるのが有利である。
標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）、ＦＩＴＣなどが挙げられる。このように解析対象のＤＮＡを標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。なお、ＤＮＡを上記の標識物質で標識する方法は当該技術において公知である。
標識物質としては、蛍光物質、ビオチンなどのハプテン、放射性物質などが挙げられる。蛍光物質としては、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）、ＦＩＴＣなどが挙げられる。このように解析対象のＤＮＡを標識することにより、マイクロアレイ上のプローブからのシグナルの測定が容易になる。なお、ＤＮＡを上記の標識物質で標識する方法は当該技術において公知である。
上記のシグナルは、マイクロアレイの種類に応じて適切なシグナルであり得る。そのようなシグナルは、例えばマイクロアレイの各プローブとハイブリダイズしたＤＮＡ断片が存在する場合に発生する電気的シグナルであってもよいし、上記のように解析対象のＤＮＡが標識されている場合は、標識物質から生じる蛍光、発光などのシグナルであってもよい。
上記の各シグナルの検出は、通常のマイクロアレイ測定装置に備えられたスキャナーにより行うことができる。スキャナーとしては、例えばGeneChip（登録商標）Scanner３０００ ７G（Affymetrix社）などが挙げられる。
本発明の方法１の判定工程では、解析工程で得られた解析結果に基づいて、生体試料中の癌細胞の存否を判定する。この判定工程では、マーカー遺伝子にメチル化されたＣｐＧ部位が有るという解析結果が得られた場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得る。この場合、該マーカー遺伝子に存在する１つのＣｐＧ部位の解析結果から判定してもよいが、判定の精度を向上させるために複数のＣｐＧ部位の解析結果から判定することが好ましい。
また、判定工程では、解析工程で得られたマーカー遺伝子のメチル化率が所定のカットオフ値より高い場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得る。該カットオフ値は特に限定されず、適宜設定できるが、好ましくは１〜４０％の範囲から決定される。
また、判定工程では、解析工程で得られたマーカー遺伝子のメチル化率が所定のカットオフ値より高い場合に、被験者から採取した生体試料中に癌細胞が存在すると判定し得る。該カットオフ値は特に限定されず、適宜設定できるが、好ましくは１〜４０％の範囲から決定される。
本発明の方法２の抽出工程では、大腸癌患者から採取した生体試料からＤＮＡを抽出する。上記の大腸癌患者は術前または術後の患者であってもよく、また化学療法を受けているか、もしくは受けていた患者であってもよい。
上記の生体試料としては、大腸癌患者のＤＮＡを含むものであれば特に限定されないが、好ましくはゲノムＤＮＡを含むもの、例えば臨床検体を用い得る。臨床検体として具体的には、血液、血清、リンパ球、尿、乳頭分泌液、手術や生検により採取した組織などが挙げられる。
また、採取した生体試料が組織である場合、該組織は癌細胞を含むものが好ましい。
上記の生体試料としては、大腸癌患者のＤＮＡを含むものであれば特に限定されないが、好ましくはゲノムＤＮＡを含むもの、例えば臨床検体を用い得る。臨床検体として具体的には、血液、血清、リンパ球、尿、乳頭分泌液、手術や生検により採取した組織などが挙げられる。
また、採取した生体試料が組織である場合、該組織は癌細胞を含むものが好ましい。
上記の抽出工程における生体試料からのＤＮＡの抽出は、本発明の方法１の抽出工程において述べたことと同様にして行うことができる。
また、該抽出工程は、本発明の方法１の抽出工程と同様に、超音波処理、アルカリ処理または制限酵素処理などによるＤＮＡ断片化工程をさらに含むことが好ましい。
また、該抽出工程は、本発明の方法１の抽出工程と同様に、超音波処理、アルカリ処理または制限酵素処理などによるＤＮＡ断片化工程をさらに含むことが好ましい。
本発明の方法２の解析工程では、抽出工程で得られたＤＮＡに含まれるＩＤ４、ＬＯＸおよびＭＹＯＣＤの遺伝子群から選択される少なくとも1つの遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の状態を解析する。
解析工程は、上記のマーカー遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧ部位のメチル化の有無を解析する工程であってもよい。この場合、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のＣｐＧ部位のメチル化の有無を解析することが好ましい。
また、解析工程は、上記のマーカー遺伝子のメチル化率を解析する工程であってもよい。
なお、解析対象のマーカー遺伝子は上記の３つの遺伝子のうちのいずれか１つであってもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のマーカー遺伝子について解析することが好ましい。
また、解析工程は、上記のマーカー遺伝子のメチル化率を解析する工程であってもよい。
なお、解析対象のマーカー遺伝子は上記の３つの遺伝子のうちのいずれか１つであってもよいが、後の判定工程での判定精度を向上させるため、複数のマーカー遺伝子について解析することが好ましい。
上記の３つの遺伝子の塩基配列自体は公知であり、これらは上記のUnigeneなどの公知のデータベースから知ることができる。上記の３つのマーカー遺伝子のUnigeneコードを、表１に示す。
本発明の方法２の解析工程は、本発明の方法１の解析工程において述べたことと同様にして行うことができる。該解析工程として、いずれの解析方法を用いるかは特に限定されないが、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別する工程と、ＤＮＡを増幅する工程と、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを分離して検出する工程とを含むことが好ましい。
本発明の方法２の判定工程では、解析工程で得られた解析結果に基づいて、癌患者の予後を判定する。
この判定工程では、マーカー遺伝子にメチル化されたＣｐＧ部位が有るという解析結果が得られた場合に、大腸癌患者の予後が良いと判定し得る。この場合、該マーカー遺伝子に存在する１つのＣｐＧ部位の解析結果から判定してもよいが、判定の精度を向上させるために複数のＣｐＧ部位の解析結果から判定することが好ましい。
また、判定工程では、解析工程で得られたマーカー遺伝子のメチル化率が所定のカットオフ値より高い場合に、大腸癌患者の予後が良いと判定し得る。該カットオフ値は特に限定されず、適宜設定できるが、好ましくは１〜４０％の範囲から決定される。
この判定工程では、マーカー遺伝子にメチル化されたＣｐＧ部位が有るという解析結果が得られた場合に、大腸癌患者の予後が良いと判定し得る。この場合、該マーカー遺伝子に存在する１つのＣｐＧ部位の解析結果から判定してもよいが、判定の精度を向上させるために複数のＣｐＧ部位の解析結果から判定することが好ましい。
また、判定工程では、解析工程で得られたマーカー遺伝子のメチル化率が所定のカットオフ値より高い場合に、大腸癌患者の予後が良いと判定し得る。該カットオフ値は特に限定されず、適宜設定できるが、好ましくは１〜４０％の範囲から決定される。
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）ＭｅＤＩＰ−ｃｈｉｐ法によるマーカー候補遺伝子の探索
本発明者らは、遺伝子転写開始点から上下１ｋｂ以内に存在するメチル化ＣｐＧ部位が遺伝子の発現に重要であり、上記の領域にメチル化候補部位（candidate methylation site：ＣＭＳ）が存在する遺伝子がマーカーとなり得ると考え、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を用いてＭｅＤＩＰ−ｃｈｉｐ法により、そのような遺伝子を探索した。
実施例１における具体的な操作手順は、各キットおよび試薬類に添付のマニュアルならびにHayashi H.ら，Hum Genet.，vol.120，７０１−７１１（２００７）の記載に従って行った。
（１）ＭｅＤＩＰ法
大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６からゲノムＤＮＡをQIAamp DNA Microキット（QIAGEN）を用いて、添付マニュアルに従って抽出した。次いで、得られたゲノムＤＮＡ（６μｇ）を超音波処理装置ＵＤ−２０１（トミー精工社製）で２０秒間処理して、ゲノムＤＮＡを２００〜８００ｂｐに断片化した。そして、断片化ＤＮＡを９５℃で１０分間加熱して変性させた後、４℃まで急冷して一本鎖ゲノムＤＮＡを得た。
本発明者らは、遺伝子転写開始点から上下１ｋｂ以内に存在するメチル化ＣｐＧ部位が遺伝子の発現に重要であり、上記の領域にメチル化候補部位（candidate methylation site：ＣＭＳ）が存在する遺伝子がマーカーとなり得ると考え、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を用いてＭｅＤＩＰ−ｃｈｉｐ法により、そのような遺伝子を探索した。
実施例１における具体的な操作手順は、各キットおよび試薬類に添付のマニュアルならびにHayashi H.ら，Hum Genet.，vol.120，７０１−７１１（２００７）の記載に従って行った。
（１）ＭｅＤＩＰ法
大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６からゲノムＤＮＡをQIAamp DNA Microキット（QIAGEN）を用いて、添付マニュアルに従って抽出した。次いで、得られたゲノムＤＮＡ（６μｇ）を超音波処理装置ＵＤ−２０１（トミー精工社製）で２０秒間処理して、ゲノムＤＮＡを２００〜８００ｂｐに断片化した。そして、断片化ＤＮＡを９５℃で１０分間加熱して変性させた後、４℃まで急冷して一本鎖ゲノムＤＮＡを得た。
上記で得られた変性ゲノムＤＮＡ（１μｇ）を３００μｌの免疫沈降用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で希釈した後、これらにProtein A Sepharoseビーズ（GEヘルスケア）の懸濁液１０３μｌを添加して、４℃で３０分間ローテーションし、プレクリアー処理を行った。そして、遠心分離後に上清を回収した。
なお、上記のビーズ懸濁液の組成は以下のとおりである。
免疫沈降用緩衝液 ５０μｌ
５０％ Protein A Sepharoseビーズ ５０μｌ
ＢＳＡ溶液（シグマ社） １μｌ
ｔＲＮＡ溶液（シグマ社） １μｌ
プロテアーゼ阻害剤（シグマ社） １μｌ
なお、上記のビーズ懸濁液の組成は以下のとおりである。
免疫沈降用緩衝液 ５０μｌ
５０％ Protein A Sepharoseビーズ ５０μｌ
ＢＳＡ溶液（シグマ社） １μｌ
ｔＲＮＡ溶液（シグマ社） １μｌ
プロテアーゼ阻害剤（シグマ社） １μｌ
次いで、回収した上清に、あらかじめ４℃で３０分間ローテーションした抗メチル化シトシン抗体ＢＩ−ＭＥＣＹ−０５００（Eurogentec社）の溶液を加えて、４℃で３時間ローテーションした。
なお、上記の抗体溶液の組成は以下のとおりである。
免疫沈降用緩衝液 ４５０μｌ
５０％ Protein A Sepharoseビーズ ５０μｌ
抗メチル化シトシン抗体 １０μｇ
ＢＳＡ溶液 １μｌ
ｔＲＮＡ溶液 １μｌ
プロテアーゼ阻害剤 １μｌ
なお、上記の抗体溶液の組成は以下のとおりである。
免疫沈降用緩衝液 ４５０μｌ
５０％ Protein A Sepharoseビーズ ５０μｌ
抗メチル化シトシン抗体 １０μｇ
ＢＳＡ溶液 １μｌ
ｔＲＮＡ溶液 １μｌ
プロテアーゼ阻害剤 １μｌ
そして、遠心分離によりビーズを回収し、これを免疫沈降用緩衝液で２回洗浄し、さらに、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））で３回洗浄した後、溶出用緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および０．５％ ＳＤＳ）を用いて溶出し、抗メチル化シトシン抗体とビーズとの複合体により沈降されたメチル化ゲノムＤＮＡを得た。
上記のようにして得たメチル化ゲノムＤＮＡ溶液にＤＴＴを終濃度２５０ｎＭとなるように添加して、室温で３０分間ローテーションした後、６５℃で１５分間インキュベートした。次いで、該溶液をフェノール／クロロホルム法およびエタノール沈殿法を用いて精製して、ＨＣＴ１１６細胞由来のメチル化ゲノムＤＮＡを得た。
上記のようにして得たメチル化ゲノムＤＮＡ溶液にＤＴＴを終濃度２５０ｎＭとなるように添加して、室温で３０分間ローテーションした後、６５℃で１５分間インキュベートした。次いで、該溶液をフェノール／クロロホルム法およびエタノール沈殿法を用いて精製して、ＨＣＴ１１６細胞由来のメチル化ゲノムＤＮＡを得た。
（２）ＩＶＴ増幅
上記（１）で得たメチル化ゲノムＤＮＡにＣＩＰ（Calf intestine phosphatase；New England Biolab社）を用いてＤＮＡ末端の脱リン酸化処理を行った後、ＴｄＴ（Terminal transfer；ROCHE社）を用いて、該ＤＮＡの３’末端にｄＴＴＰを付加した。
次いで、このＤＮＡにＴ７−ポリＡプライマーをアニールさせて、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Invitrogen社）を用いて２本鎖ＤＮＡを合成した。以下にＴ７−ポリＡプライマーの配列を示す。
5'-GCATTAGCGGCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG(A)18B-3'（配列番号８３）
上記（１）で得たメチル化ゲノムＤＮＡにＣＩＰ（Calf intestine phosphatase；New England Biolab社）を用いてＤＮＡ末端の脱リン酸化処理を行った後、ＴｄＴ（Terminal transfer；ROCHE社）を用いて、該ＤＮＡの３’末端にｄＴＴＰを付加した。
次いで、このＤＮＡにＴ７−ポリＡプライマーをアニールさせて、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Invitrogen社）を用いて２本鎖ＤＮＡを合成した。以下にＴ７−ポリＡプライマーの配列を示す。
5'-GCATTAGCGGCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG(A)18B-3'（配列番号８３）
上記で得たＴ７プロモーター配列を付加した２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（MEGAscript（登録商標）T7キット；Ambion社）による線形増幅を行った後、RNeasy Miniキット（QIAGEN社）を用いて精製して、ｃＲＮＡを得た。
次いで、該ｃＲＮＡを鋳型として、SuperScript（商標）II RT（Invitrogen社）およびランダムプライマー（Invitrogen社）を用いてｃＤＮＡを得た。
さらに、該ｃＤＮＡにＴ７−ポリＡプライマーをアニールさせ、ＤＮＡポリメラーゼＩと反応させた後、さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（NEB社）と反応させて、２本鎖ＤＮＡを合成した。
次いで、該ｃＲＮＡを鋳型として、SuperScript（商標）II RT（Invitrogen社）およびランダムプライマー（Invitrogen社）を用いてｃＤＮＡを得た。
さらに、該ｃＤＮＡにＴ７−ポリＡプライマーをアニールさせ、ＤＮＡポリメラーゼＩと反応させた後、さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（NEB社）と反応させて、２本鎖ＤＮＡを合成した。
上記のＴ７プロモーター配列を付加した２本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（MEGAscript（登録商標）T7キット）による線形増幅を行った後、RNeasy Miniキットを用いて精製し、ｃＲＮＡを得た。
次いで、該ｃＲＮＡを鋳型として、SuperScript（商標）II RT（Invitrogen社）およびランダムプライマー（Invitrogen社）を用いてｃＤＮＡを得た。
さらに、該ｃＤＮＡにＤＮＡポリメラーゼＩ、E.Coli ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen社）およびRNase H（Ambion社）を用いて反応させて、２本鎖ＤＮＡを合成した。
上記の２本鎖ＤＮＡをRNase HおよびRNaseカクテル（Ambion社）と反応させてＲＮＡを分解した後、QIAquick Purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製して、２本鎖ＤＮＡを得た。
（３）マイクロアレイ解析
上記（２）のようにして、ＨＣＴ１１６細胞由来のメチル化ゲノムＤＮＡから増幅して得た２本鎖ＤＮＡをDNaseI（Invitrogen社）によって５０〜１００ｂｐに断片化した後、Biotin-N11-ddATP（Perkin Elmer社）を用いてビオチン標識をした。
ビオチン標識されたＤＮＡ断片をGeneChip（登録商標）Human Promoter 1.0R Array（Affymetrix社）に接触させて、マイクロアレイのプローブとのハイブリダイゼーションを行った。接触後の染色、洗浄およびスキャン（シグナルの測定）は、Affymetrix社から提供されるマニュアルに従って行った。
上記で得られたシグナル測定値について５５０ｂｐのウィンドウでウィルコクソン順位和検定を行い、得られた有意確率が０．０１より小さい（ｐ＜０．０１）の領域は、マイクロアレイのプローブとメチル化ＤＮＡ断片とが特異的結合をした領域であると判断し、該領域をメチル化候補部位（ＣＭＳ）とした。
その結果、ＨＣＴ１１６細胞において、遺伝子転写開始点から上下１ｋｂ以内にＣＭＳが存在する遺伝子は、３８１４遺伝子であった。
次いで、該ｃＲＮＡを鋳型として、SuperScript（商標）II RT（Invitrogen社）およびランダムプライマー（Invitrogen社）を用いてｃＤＮＡを得た。
さらに、該ｃＤＮＡにＤＮＡポリメラーゼＩ、E.Coli ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen社）およびRNase H（Ambion社）を用いて反応させて、２本鎖ＤＮＡを合成した。
上記の２本鎖ＤＮＡをRNase HおよびRNaseカクテル（Ambion社）と反応させてＲＮＡを分解した後、QIAquick Purificationキット（QIAGEN社）を用いて精製して、２本鎖ＤＮＡを得た。
（３）マイクロアレイ解析
上記（２）のようにして、ＨＣＴ１１６細胞由来のメチル化ゲノムＤＮＡから増幅して得た２本鎖ＤＮＡをDNaseI（Invitrogen社）によって５０〜１００ｂｐに断片化した後、Biotin-N11-ddATP（Perkin Elmer社）を用いてビオチン標識をした。
ビオチン標識されたＤＮＡ断片をGeneChip（登録商標）Human Promoter 1.0R Array（Affymetrix社）に接触させて、マイクロアレイのプローブとのハイブリダイゼーションを行った。接触後の染色、洗浄およびスキャン（シグナルの測定）は、Affymetrix社から提供されるマニュアルに従って行った。
上記で得られたシグナル測定値について５５０ｂｐのウィンドウでウィルコクソン順位和検定を行い、得られた有意確率が０．０１より小さい（ｐ＜０．０１）の領域は、マイクロアレイのプローブとメチル化ＤＮＡ断片とが特異的結合をした領域であると判断し、該領域をメチル化候補部位（ＣＭＳ）とした。
その結果、ＨＣＴ１１６細胞において、遺伝子転写開始点から上下１ｋｂ以内にＣＭＳが存在する遺伝子は、３８１４遺伝子であった。
（４）発現マイクロアレイ解析
上記の３８１４遺伝子のうち、ＨＣＴ１１６細胞での発現が低いか、または認められない遺伝子を探索する目的でマイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイとして、上記の３８１４遺伝子を含む３８５００種の遺伝子に対するプローブを搭載したGeneChip（登録商標）Human Genome U133 Plus 2.0 Array（Affymetrix社）を用いた。
TRIzol（Invitrogen社）を用いてＨＣＴ１１６細胞からｍＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡについて発現解析を行った。該解析から得られたGeneChip（登録商標）スコアが７０未満であった遺伝子を、ＨＣＴ１１６細胞のサイレンシング遺伝子とした。
その結果、サイレンシング遺伝子は、２４１０遺伝子であった。
上記の３８１４遺伝子のうち、ＨＣＴ１１６細胞での発現が低いか、または認められない遺伝子を探索する目的でマイクロアレイ解析を行った。マイクロアレイとして、上記の３８１４遺伝子を含む３８５００種の遺伝子に対するプローブを搭載したGeneChip（登録商標）Human Genome U133 Plus 2.0 Array（Affymetrix社）を用いた。
TRIzol（Invitrogen社）を用いてＨＣＴ１１６細胞からｍＲＮＡを抽出し、該ｍＲＮＡについて発現解析を行った。該解析から得られたGeneChip（登録商標）スコアが７０未満であった遺伝子を、ＨＣＴ１１６細胞のサイレンシング遺伝子とした。
その結果、サイレンシング遺伝子は、２４１０遺伝子であった。
（実施例２）ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析によるマーカー候補遺伝子の探索
本発明者らは、実施例１で得られた２４１０遺伝子から無作為に４１遺伝子を抽出し、これらの遺伝子をマーカー候補遺伝子とした。そして、大腸癌組織と正常大腸粘膜組織におけるマーカー候補遺伝子のメチル化状態をＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析（以下、「質量分析」ともいう）により解析した。
なお、表２にこれら４１のマーカー候補遺伝子を示す。
また、実施例２における具体的な操作手順は、各キットおよび試薬類に添付のマニュアル、ならびにEhrich M.ら，Proc Natl Acad Sci USA，vol. 102，１５７８５−１５７９０（２００５）およびCoolen MW.ら，Nucleic Acids Res，vol. 35，１１９（２００７）の記載に従って行った。
本発明者らは、実施例１で得られた２４１０遺伝子から無作為に４１遺伝子を抽出し、これらの遺伝子をマーカー候補遺伝子とした。そして、大腸癌組織と正常大腸粘膜組織におけるマーカー候補遺伝子のメチル化状態をＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析（以下、「質量分析」ともいう）により解析した。
なお、表２にこれら４１のマーカー候補遺伝子を示す。
また、実施例２における具体的な操作手順は、各キットおよび試薬類に添付のマニュアル、ならびにEhrich M.ら，Proc Natl Acad Sci USA，vol. 102，１５７８５−１５７９０（２００５）およびCoolen MW.ら，Nucleic Acids Res，vol. 35，１１９（２００７）の記載に従って行った。
（１）検体試料および対照試料の作製
以下のようにして、大腸癌組織および正常大腸粘膜組織由来のゲノムＤＮＡから、それぞれCRC（colorectal cancer）検体試料およびNormal検体試料を作製した。また、質量分析での検量線を作成するために、対照ゲノムＤＮＡとしてヒト末梢血リンパ球ゲノムＤＮＡを用いて、０％、２５％、５０％、７５％および１００％メチル化対照試料を作製した。
（i）大腸癌組織と正常大腸粘膜組織からのＤＮＡの抽出
大腸癌患者から採取した大腸癌組織（１１２検体）および正常大腸粘膜組織（９検体）のそれぞれから、QIAamp DNA Microキット（QIAGEＮ社）を用いて各ゲノムＤＮＡを抽出し、Bioruptor（COSMO BIO社製）により超音波切断した。なお、上記の大腸癌検体は、その切片を病理組織学的に観察した結果、該検体中の癌細胞含有率が４０％以上のものである。
以下のようにして、大腸癌組織および正常大腸粘膜組織由来のゲノムＤＮＡから、それぞれCRC（colorectal cancer）検体試料およびNormal検体試料を作製した。また、質量分析での検量線を作成するために、対照ゲノムＤＮＡとしてヒト末梢血リンパ球ゲノムＤＮＡを用いて、０％、２５％、５０％、７５％および１００％メチル化対照試料を作製した。
（i）大腸癌組織と正常大腸粘膜組織からのＤＮＡの抽出
大腸癌患者から採取した大腸癌組織（１１２検体）および正常大腸粘膜組織（９検体）のそれぞれから、QIAamp DNA Microキット（QIAGEＮ社）を用いて各ゲノムＤＮＡを抽出し、Bioruptor（COSMO BIO社製）により超音波切断した。なお、上記の大腸癌検体は、その切片を病理組織学的に観察した結果、該検体中の癌細胞含有率が４０％以上のものである。
（ii）０％、２５％、５０％、７５％および１００％メチル化ＤＮＡの作製
ヒト末梢血リンパ球ゲノムＤＮＡをGenomiPhi v2 DNA amplificationキット（GEヘルスケアライフサイエンス社）により増幅した。この増幅産物は、非メチル化ＤＮＡからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor（COSMO BIO社製）により超音波切断し、ＤＮＡ断片（０％メチル化ＤＮＡ）を得た。また、該ＤＮＡ断片の一部を分取して、これにSssIメチラーゼ（New England Biolab社）を反応させることにより全てのシトシンをメチル化させて、メチル化ＤＮＡ断片（１００％メチル化ＤＮＡ）を得た。そして、０％メチル化ＤＮＡと１００％メチル化ＤＮＡとを所定の割合で混合して、２５％、５０％および７５％メチル化ＤＮＡを得た。
ヒト末梢血リンパ球ゲノムＤＮＡをGenomiPhi v2 DNA amplificationキット（GEヘルスケアライフサイエンス社）により増幅した。この増幅産物は、非メチル化ＤＮＡからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor（COSMO BIO社製）により超音波切断し、ＤＮＡ断片（０％メチル化ＤＮＡ）を得た。また、該ＤＮＡ断片の一部を分取して、これにSssIメチラーゼ（New England Biolab社）を反応させることにより全てのシトシンをメチル化させて、メチル化ＤＮＡ断片（１００％メチル化ＤＮＡ）を得た。そして、０％メチル化ＤＮＡと１００％メチル化ＤＮＡとを所定の割合で混合して、２５％、５０％および７５％メチル化ＤＮＡを得た。
（iii）バイサルファイト処理
上記の（i）および（ii）で得た各ＤＮＡ（１μｇ）を１９μｌの水に希釈し、これらに６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１μｌ添加して終濃度０．３Ｎとし、３７℃で１５分間インキュベーションして変性させた。
そして、上記の各ＤＮＡ溶液に３．６Ｍ重亜硫酸ナトリウム／０．６Ｍヒドロキノン溶液を１２０μｌ添加した後、９５℃で３０秒および５０℃で１５分を１サイクルとして、これを１５サイクル繰り返すことにより、バイサルファイト処理をした。そして、各反応液をWizard（登録商標）DNA Clean-up System（Promega社）により脱塩し、ＴＥ緩衝液５０μｌで溶出し、非メチル化シトシンをウラシルに変換した各ＤＮＡ溶液を得た。
上記の各ＤＮＡ溶液に３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を５μｌ添加して、室温で５分間インキュベーションした後、エタノール沈殿法により各ＤＮＡを精製した。最終的に各ＤＮＡを８０μｌの水に溶解して、CRC検体試料およびNormal検体試料、ならびに０％、２５％、５０％、７５％および１００％メチル化対照試料を得た。
上記の（i）および（ii）で得た各ＤＮＡ（１μｇ）を１９μｌの水に希釈し、これらに６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１μｌ添加して終濃度０．３Ｎとし、３７℃で１５分間インキュベーションして変性させた。
そして、上記の各ＤＮＡ溶液に３．６Ｍ重亜硫酸ナトリウム／０．６Ｍヒドロキノン溶液を１２０μｌ添加した後、９５℃で３０秒および５０℃で１５分を１サイクルとして、これを１５サイクル繰り返すことにより、バイサルファイト処理をした。そして、各反応液をWizard（登録商標）DNA Clean-up System（Promega社）により脱塩し、ＴＥ緩衝液５０μｌで溶出し、非メチル化シトシンをウラシルに変換した各ＤＮＡ溶液を得た。
上記の各ＤＮＡ溶液に３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を５μｌ添加して、室温で５分間インキュベーションした後、エタノール沈殿法により各ＤＮＡを精製した。最終的に各ＤＮＡを８０μｌの水に溶解して、CRC検体試料およびNormal検体試料、ならびに０％、２５％、５０％、７５％および１００％メチル化対照試料を得た。
（２）ＰＣＲおよびＩＶＴ増幅
この工程では、上記のバイサルファイト処理によって非メチル化シトシンをウラシルに変換した各ＤＮＡについて、メチル化シトシンおよびウラシルをＰＣＲ増幅法およびＩＶＴ増幅法により、それぞれグアニン（Ｇ）およびアデニン（Ａ）に変換した。
なお、ＰＣＲ増幅法に用いるプライマーセットがメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡのいずれにも偏りなく増幅できることを上記で得た各対照試料を用いて、後述するＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析にて確認した。表３に各マーカー候補遺伝子に対するプライマーセットの配列（配列番号１〜８２）を示した。
この工程では、上記のバイサルファイト処理によって非メチル化シトシンをウラシルに変換した各ＤＮＡについて、メチル化シトシンおよびウラシルをＰＣＲ増幅法およびＩＶＴ増幅法により、それぞれグアニン（Ｇ）およびアデニン（Ａ）に変換した。
なお、ＰＣＲ増幅法に用いるプライマーセットがメチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡのいずれにも偏りなく増幅できることを上記で得た各対照試料を用いて、後述するＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）解析にて確認した。表３に各マーカー候補遺伝子に対するプライマーセットの配列（配列番号１〜８２）を示した。
なお、下記のＰＣＲ反応においては、後のＩＶＴ反応のために、上記のプライマーセットのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの５’末端に、それぞれ次のタグ配列およびＴ７プロモーター配列を付加したプライマーセットを用いた。
タグ配列 ：5'-AGGAAGAGAG-3'
Ｔ７プロモーター配列：5'-CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCT-3'
ＰＣＲ反応液は、下記の試薬類を混合して調製した。
１０x Hot Starバッファー（QIAGEN社） ０．５μｌ
２５ｍＭ dNTPミックス ０．０４μｌ
Hot Star Taq（５Ｕ／μｌ）（QIAGEN社） ０．０４μｌ
プライマーミックス ２μｌ
ＤＮＡ溶液 １μｌ
水 １．４２μｌ
トータル ５μｌ
タグ配列 ：5'-AGGAAGAGAG-3'
Ｔ７プロモーター配列：5'-CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCT-3'
ＰＣＲ反応液は、下記の試薬類を混合して調製した。
１０x Hot Starバッファー（QIAGEN社） ０．５μｌ
２５ｍＭ dNTPミックス ０．０４μｌ
Hot Star Taq（５Ｕ／μｌ）（QIAGEN社） ０．０４μｌ
プライマーミックス ２μｌ
ＤＮＡ溶液 １μｌ
水 １．４２μｌ
トータル ５μｌ
上記の反応液を用い、下記の条件でＰＣＲ反応を行った。
９４℃で１５分、
９４℃で２０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分を４５サイクル、
７２℃で３分。
９４℃で１５分、
９４℃で２０秒、５２℃で３０秒、７２℃で１分を４５サイクル、
７２℃で３分。
上記で得た各ＰＣＲ産物を、MassCLEAVE（商標）Reagentキット（SEQUENOM社）に含まれるＳＡＰ（Shrimp Alkaline Phosphatase）を用いて脱リン酸化処理した。次いで、これらに上記のキットを用いて調製した下記の反応液を添加し、３７℃で３時間インキュベーションして、ＩＶＴ反応およびウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）特異的切断反応を行った。そして、得られた各切断産物をClean Resin（SEQUENOM社）により精製し、質量分析用サンプルとした。
５x T7 R&DNAポリメラーゼバッファー ０．８９μｌ
T Cleavageミックス ０．２４μｌ
１００ｍＭ ＤＴＴ ０．２２μｌ
T7 R&DNAポリメラーゼ ０．４４μｌ
RNase A ０．０６μｌ
RNaseフリーの水 ３．１５μｌ
トータル ５μｌ
５x T7 R&DNAポリメラーゼバッファー ０．８９μｌ
T Cleavageミックス ０．２４μｌ
１００ｍＭ ＤＴＴ ０．２２μｌ
T7 R&DNAポリメラーゼ ０．４４μｌ
RNase A ０．０６μｌ
RNaseフリーの水 ３．１５μｌ
トータル ５μｌ
図１のＡに示すように、RNase AによってＩＶＴ産物が切断される部位は、任意の塩基と該塩基に隣接するウラシル（Ｕ）またはチミン（Ｔ）との間であることがあらかじめ知られている。したがって、上記のようにして得た各切断産物の塩基配列および質量は、マーカー候補遺伝子の塩基配列から予測することが可能である。これにより、下記の質量分析で得られた各ピークについて、マーカー候補遺伝子のどの塩基配列の部分に由来するものであるかを同定できる。
（３）質量分析機ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）（SEQUENOM社）による解析
（i）検量線の作成
上記（２）で得た各検体試料由来の質量分析用サンプルを２回ずつ独立に質量分析を行った。得られた解析結果より、プライマーセットごとの検量線を作成し、相関係数を算出した。そして、上記のプライマーセットで増幅した各対照試料の質量分析から線形の検量線が得られた。これにより、各プライマーセットは、メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡのいずれにも偏りなく増幅できることが確認できた。
（ii）各検体試料由来のサンプルの解析
上記（２）で得た各検体試料由来の質量分析用サンプルを用いて質量分析を行い、各切断産物のピークを得た。次いで、得られた各ピークがマーカー候補遺伝子のどの塩基配列の部分に由来するものであるかを同定した。そして、同一の塩基配列に由来する切断産物において、メチル化ＣｐＧ部位を含む切断産物のピークとメチル化ＣｐＧ部位を含まない切断産物のピークとの面積比からメチル化率を算出した。この計算について、図１のＣの左パネルを用いて例示すると、非メチル化切断産物のピーク（左）とメチル化切断産物のピーク（右）との面積比が１：３であった場合、この配列のＤＮＡ断片のメチル化率は、３／（１+３）＝０．７５より、７５％となる。このようなメチル化率の計算を各切断産物について行い、各切断産物のメチル化率を算出した。なお、メチル化率は理論上、切断産物が有する全てのＣｐＧ部位がメチル化している場合は１００％であり、全てのＣｐＧ部位が非メチル化状態である場合は０％である。
上記で得た各切断産物のメチル化率について、上記（i）で算出した相関係数が０．９より大きい切断産物についてのみ、以降のデータ解析に用いた。また、大腸癌組織の１１２検体のうち１０２検体（９０％）以上が解析されていない切断産物のメチル化率は除外した。
そして、各マーカー候補遺伝子が有するＣｐＧ部位数と、これら遺伝子の各切断産物に含まれるＣｐＧ部位数とを考慮するために、各マーカー候補遺伝子のメチル化率は、除外されなかった切断産物のメチル化率を加重平均して算出した。
（i）検量線の作成
上記（２）で得た各検体試料由来の質量分析用サンプルを２回ずつ独立に質量分析を行った。得られた解析結果より、プライマーセットごとの検量線を作成し、相関係数を算出した。そして、上記のプライマーセットで増幅した各対照試料の質量分析から線形の検量線が得られた。これにより、各プライマーセットは、メチル化ＤＮＡおよび非メチル化ＤＮＡのいずれにも偏りなく増幅できることが確認できた。
（ii）各検体試料由来のサンプルの解析
上記（２）で得た各検体試料由来の質量分析用サンプルを用いて質量分析を行い、各切断産物のピークを得た。次いで、得られた各ピークがマーカー候補遺伝子のどの塩基配列の部分に由来するものであるかを同定した。そして、同一の塩基配列に由来する切断産物において、メチル化ＣｐＧ部位を含む切断産物のピークとメチル化ＣｐＧ部位を含まない切断産物のピークとの面積比からメチル化率を算出した。この計算について、図１のＣの左パネルを用いて例示すると、非メチル化切断産物のピーク（左）とメチル化切断産物のピーク（右）との面積比が１：３であった場合、この配列のＤＮＡ断片のメチル化率は、３／（１+３）＝０．７５より、７５％となる。このようなメチル化率の計算を各切断産物について行い、各切断産物のメチル化率を算出した。なお、メチル化率は理論上、切断産物が有する全てのＣｐＧ部位がメチル化している場合は１００％であり、全てのＣｐＧ部位が非メチル化状態である場合は０％である。
上記で得た各切断産物のメチル化率について、上記（i）で算出した相関係数が０．９より大きい切断産物についてのみ、以降のデータ解析に用いた。また、大腸癌組織の１１２検体のうち１０２検体（９０％）以上が解析されていない切断産物のメチル化率は除外した。
そして、各マーカー候補遺伝子が有するＣｐＧ部位数と、これら遺伝子の各切断産物に含まれるＣｐＧ部位数とを考慮するために、各マーカー候補遺伝子のメチル化率は、除外されなかった切断産物のメチル化率を加重平均して算出した。
（iii）カットオフ値の設定およびメチル化頻度の算出
上記で算出したメチル化率から各検体に含まれるマーカー候補遺伝子がメチル化陽性か否かを判断するためのカットオフ値を３５％とした。したがって、ある遺伝子のメチル化率が３５％より大きい場合、その遺伝子はメチル化陽性であると判断される。なお、この値は、大腸癌検体の癌細胞含有率が４０％であることを考慮して決定された。
そして、大腸癌検体（１１２検体）および正常大腸粘膜検体（９検体）の各検体において、上記の４１の各マーカー候補遺伝子がメチル化陽性であるか否かを、該カットオフ値（３５％）および上記で算出したメチル化率に基づいて判断した。そして、各遺伝子についてメチル化陽性である検体数を大腸癌検体群および正常大腸粘膜検体群でそれぞれ計数し、全検体数に対するメチル化陽性検体の割合を次式より算出した。表４に得られた結果を示す。
メチル化陽性検体の割合（％）＝（各群のメチル化陽性検体数／各群の検体総数）x１００
上記で算出したメチル化率から各検体に含まれるマーカー候補遺伝子がメチル化陽性か否かを判断するためのカットオフ値を３５％とした。したがって、ある遺伝子のメチル化率が３５％より大きい場合、その遺伝子はメチル化陽性であると判断される。なお、この値は、大腸癌検体の癌細胞含有率が４０％であることを考慮して決定された。
そして、大腸癌検体（１１２検体）および正常大腸粘膜検体（９検体）の各検体において、上記の４１の各マーカー候補遺伝子がメチル化陽性であるか否かを、該カットオフ値（３５％）および上記で算出したメチル化率に基づいて判断した。そして、各遺伝子についてメチル化陽性である検体数を大腸癌検体群および正常大腸粘膜検体群でそれぞれ計数し、全検体数に対するメチル化陽性検体の割合を次式より算出した。表４に得られた結果を示す。
メチル化陽性検体の割合（％）＝（各群のメチル化陽性検体数／各群の検体総数）x１００
表４では、算出したメチル化陽性検体の割合に基づいて、上記の４１遺伝子をグループＡ〜Ｃの３つに分類した。グループＡは、正常大腸粘膜検体（Normal）のメチル化陽性検体の割合が０％で、かつ大腸癌検体（CRC）の該割合が１０％以上の遺伝子群であり、グループＢは、Normalのメチル化陽性検体の割合が０％より大きく、かつCRCとNormalとのメチル化陽性検体の割合の差が３０％以上の遺伝子群であり、グループＣは、Normalのメチル化陽性検体の割合が０％より大きく、かつCRCとNormalとのメチル化陽性検体の割合の差が３０％未満の遺伝子群である。
表４に示した４１遺伝子のうち、CRCとNormalとのメチル化陽性検体の割合の差が５０％以上の遺伝子をマーカーになり得る遺伝子として選択し、表４の遺伝子シンボルに＊を付して示した。
選択された遺伝子は、ＴＳＰＹＬ、ＣＯＬ４Ａ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＰＧ２０、ＴＭＥＦＦ２、ＣＩＤＥＢ、ＥＤＩＬ３、ＥＦＥＭＰ１、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＵＣＨＬ１、ＨＡＮＤ１、ＳＴＯＸ２、ＴＨＢＤ、ＥＬＭＯ１、ＩＧＦＢＰ７、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＦＲＰ１、ＣＤＯ１、ＦＢＮ２およびＺＮＦ４４７である。
表４に示した４１遺伝子のうち、CRCとNormalとのメチル化陽性検体の割合の差が５０％以上の遺伝子をマーカーになり得る遺伝子として選択し、表４の遺伝子シンボルに＊を付して示した。
選択された遺伝子は、ＴＳＰＹＬ、ＣＯＬ４Ａ２、ＡＤＡＭＴＳ１、ＳＰＧ２０、ＴＭＥＦＦ２、ＣＩＤＥＢ、ＥＤＩＬ３、ＥＦＥＭＰ１、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＵＣＨＬ１、ＨＡＮＤ１、ＳＴＯＸ２、ＴＨＢＤ、ＥＬＭＯ１、ＩＧＦＢＰ７、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＦＲＰ１、ＣＤＯ１、ＦＢＮ２およびＺＮＦ４４７である。
また、メチル化率のカットオフ値を１０％としてメチル化陽性の判断を行なった場合についても、各遺伝子のメチル化陽性検体の割合を算出した。この結果を表５に示す。この場合においても、CRCとNormalとのメチル化陽性検体の割合の差が５０％以上の遺伝子を選択し、表５の遺伝子シンボルに＊を付して示した。なお、グループＡ〜Ｃの定義は、上記と同じである。
選択された遺伝子は、ＥＦＨＤ１、ＳＴＯＸ２、ＥＬＭＯ１、ＣＨＦＲ、ＤＵＳＰ２６、ＭＹＯＣＤ、ＦＬＪ２３１９１、ＬＯＸ、ＥＰＨＢ１、ＴＬＥ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＧ２０、ＥＤＩＬ３、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＦＢＮ２、ＡＯＸ１およびＺＮＦ４４７である。
選択された遺伝子は、ＥＦＨＤ１、ＳＴＯＸ２、ＥＬＭＯ１、ＣＨＦＲ、ＤＵＳＰ２６、ＭＹＯＣＤ、ＦＬＪ２３１９１、ＬＯＸ、ＥＰＨＢ１、ＴＬＥ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＧ２０、ＥＤＩＬ３、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＦＢＮ２、ＡＯＸ１およびＺＮＦ４４７である。
したがって、上記の２つのメチル化率のカットオフ値より選択されたマーカーになり得る遺伝子は、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＯＸ１、ＣＤＯ１、ＣＨＦＲ、ＣＩＤＥＢ、ＣＯＬ４Ａ２、ＤＵＳＰ２６、ＥＤＩＬ３、ＥＦＥＭＰ１、ＥＦＨＤ１、ＥＬＭＯ１、ＥＰＨＢ１、ＦＢＮ２、ＦＬＪ２３１９１、ＨＡＮＤ１、ＩＧＦＢＰ７、ＬＯＸ、ＭＹＯＣＤ、ＰＰＰ１Ｒ１４Ａ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｃ、ＳＦＲＰ１、ＳＴＯＸ２、ＴＨＢＤ、ＴＬＥ４、ＴＭＥＦＦ２、ＳＰＧ２０、ＴＳＰＹＬ、ＵＣＨＬ１およびＺＮＦ４４７である。
上記の遺伝子のうち、以下の表６に示すものは、文献によりある種の癌細胞でメチル化することが既に報告されているものである。
よって、本発明者らは、表６に示す遺伝子を除く、ＣＯＬ４Ａ２、ＡＯＸ１、ＤＵＳＰ２６、ＥＤＩＬ３、ＥＦＨＤ１、ＥＬＭＯ１、ＳＴＯＸ２およびＺＮＦ４４７を、癌細胞の存否を判定するために用い得るマーカー遺伝子として新たに同定した。
（実施例３）マーカー遺伝子のメチル化とＭＳＩとの相関の解析
ＭＳＩと大腸癌患者の予後との相関はこれまでにいくつもの報告があり、一般にＭＳＩが高い症例と良好な予後とは相関すると言われている。さらに、３２報の既報データ（計７６４２症例のうちＭＳＩ症例１２７７例）をまとめたPopat S.らの報告（J Clin Oncol、Vol.２３、６０９‐６１３（２００５））によって、大腸癌のＭＳＩが高い症例の患者が統計学的に有意に良好な予後を示すことが知られている。
そこで、本発明者らは、上記の４１遺伝子について、あるマーカー遺伝子のメチル化陽性検体の割合とＭＳＩとの相関関係があるか否かを検討した。
ＭＳＩと大腸癌患者の予後との相関はこれまでにいくつもの報告があり、一般にＭＳＩが高い症例と良好な予後とは相関すると言われている。さらに、３２報の既報データ（計７６４２症例のうちＭＳＩ症例１２７７例）をまとめたPopat S.らの報告（J Clin Oncol、Vol.２３、６０９‐６１３（２００５））によって、大腸癌のＭＳＩが高い症例の患者が統計学的に有意に良好な予後を示すことが知られている。
そこで、本発明者らは、上記の４１遺伝子について、あるマーカー遺伝子のメチル化陽性検体の割合とＭＳＩとの相関関係があるか否かを検討した。
（１）ＭＳＩの判定
実施例２の（１）の（i）で得た大腸癌組織（１１２検体）のゲノムＤＮＡを用いてＭＳＩを解析するために、上記のＮＣＩワークショップにより推奨された５つのＭＳＩマーカー（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ２Ｓ１２３およびＤ１７Ｓ２５０）についてシークエンス解析をした。
各検体のゲノムＤＮＡに含まれる上記の５つのマーカーの塩基配列をALF express DNAシークエンサー（Pharmacia Biotech社製）およびAllele Linksソフトウェア（Pharmacia Biotech社製）により解析した。
５つのマーカーのうち２つ以上のマーカーでＭＳＩを認める検体をＭＳＩ−Ｈ、１つのマーカーでＭＳＩを認める検体をＭＳＩ−Ｌ、いずれのマーカーでもＭＳＩを認めない検体をＭＳＳと判定した。なお、ＭＳＩを認めたマーカーについては少なくとも２回の解析を行った。
実施例２の（１）の（i）で得た大腸癌組織（１１２検体）のゲノムＤＮＡを用いてＭＳＩを解析するために、上記のＮＣＩワークショップにより推奨された５つのＭＳＩマーカー（ＢＡＴ２５、ＢＡＴ２６、Ｄ５Ｓ３４６、Ｄ２Ｓ１２３およびＤ１７Ｓ２５０）についてシークエンス解析をした。
各検体のゲノムＤＮＡに含まれる上記の５つのマーカーの塩基配列をALF express DNAシークエンサー（Pharmacia Biotech社製）およびAllele Linksソフトウェア（Pharmacia Biotech社製）により解析した。
５つのマーカーのうち２つ以上のマーカーでＭＳＩを認める検体をＭＳＩ−Ｈ、１つのマーカーでＭＳＩを認める検体をＭＳＩ−Ｌ、いずれのマーカーでもＭＳＩを認めない検体をＭＳＳと判定した。なお、ＭＳＩを認めたマーカーについては少なくとも２回の解析を行った。
（２）マーカー遺伝子のメチル化とＭＳＩとの相関の解析
実施例２における各マーカー遺伝子がメチル化陽性である群とＭＳＩ−Ｈの群とが相関するか否かを、フィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）により解析した。
解析の結果、以下のとおり、ＩＤ４、ＬＯＸおよびＭＹＯＣＤのマーカー遺伝子がメチル化している群がＭＳＩ−Ｈの群と強い相関を示した。なお、Pは上記の検定から算出された有意確率である。この結果を表７に示す。
実施例２における各マーカー遺伝子がメチル化陽性である群とＭＳＩ−Ｈの群とが相関するか否かを、フィッシャーの正確確率検定（Fisher's exact test）により解析した。
解析の結果、以下のとおり、ＩＤ４、ＬＯＸおよびＭＹＯＣＤのマーカー遺伝子がメチル化している群がＭＳＩ−Ｈの群と強い相関を示した。なお、Pは上記の検定から算出された有意確率である。この結果を表７に示す。
ＩＤ４では、メチル化検体２０例のうち１５例がＭＳＩ‐Ｈであり、非メチル化検体９２例のうち３例がＭＳＩ‐Ｈであった（P = 6.9 x 10-12）。
ＬＯＸでは、メチル化検体１６例のうち１５例がＭＳＩ‐Ｈであり、非メチル化検体９６例のうち３例がＭＳＩ‐Ｈであった（P = 8.1 x 10-15）。
ＭＹＯＣＤでは、メチル化検体１６例のうち１４例がＭＳＩ‐Ｈであり、非メチル化検体９６例のうち４例がＭＳＩ‐Ｈであった（P = 1.4 x 10-12）。
上記の結果より、大腸癌患者においてＩＤ４、ＬＯＸおよびＭＹＯＣＤいずれか１つがメチル化している場合、ＭＳＩが高い傾向にあり、すなわち、予後が良好である可能性が高いと考えられる。よって、これらの３つのマーカー遺伝子のメチル化状態を解析することにより、大腸癌患者の予後を予測し得ると考えられる。
ＬＯＸでは、メチル化検体１６例のうち１５例がＭＳＩ‐Ｈであり、非メチル化検体９６例のうち３例がＭＳＩ‐Ｈであった（P = 8.1 x 10-15）。
ＭＹＯＣＤでは、メチル化検体１６例のうち１４例がＭＳＩ‐Ｈであり、非メチル化検体９６例のうち４例がＭＳＩ‐Ｈであった（P = 1.4 x 10-12）。
上記の結果より、大腸癌患者においてＩＤ４、ＬＯＸおよびＭＹＯＣＤいずれか１つがメチル化している場合、ＭＳＩが高い傾向にあり、すなわち、予後が良好である可能性が高いと考えられる。よって、これらの３つのマーカー遺伝子のメチル化状態を解析することにより、大腸癌患者の予後を予測し得ると考えられる。
（実施例４）メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）による大腸癌細胞の検出
（１）検体試料の作製
以下のようにして、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６とＤＬＤ−１、大腸癌患者から採取した大腸癌組織1〜7、および正常大腸粘膜組織由来のゲノムＤＮＡから、それぞれＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、ＣＲＣ検体試料1〜7およびNormal検体試料を作製した。
以下のようにして、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６とＤＬＤ−１、大腸癌患者から採取した大腸癌組織1〜7、および正常大腸粘膜組織由来のゲノムＤＮＡから、それぞれＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、ＣＲＣ検体試料1〜7およびNormal検体試料を作製した。
（i）大腸癌細胞株、大腸癌組織および正常大腸粘膜組織からのＤＮＡの抽出
ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１、大腸癌組織１〜７、および正常大腸粘膜組織のそれぞれから、ＤＮＡをQIAmp DNA Microキット（QIAGEＮ社）を用いて添付マニュアルに従って抽出した。抽出した大腸癌細胞株、大腸癌組織および正常大腸粘膜組織のゲノムを含む各ゲノムＤＮＡをBioruptor（COSMO BIO社製）により超音波切断した。
ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１、大腸癌組織１〜７、および正常大腸粘膜組織のそれぞれから、ＤＮＡをQIAmp DNA Microキット（QIAGEＮ社）を用いて添付マニュアルに従って抽出した。抽出した大腸癌細胞株、大腸癌組織および正常大腸粘膜組織のゲノムを含む各ゲノムＤＮＡをBioruptor（COSMO BIO社製）により超音波切断した。
（ii）バイサルファイト処理
上記の（i）で得た各ＤＮＡ（１μｇ）を１９μｌの水に希釈し、これらに６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１μｌ添加して終濃度０．３Ｎとし、３７℃で１５分間インキュベーションして変性させた。そして、上記の各ＤＮＡ溶液に３．６Ｍ重亜硫酸ナトリウム／０．６Ｍヒドロキノン溶液を１２０μｌ添加した後、９５℃で３０秒および５０℃で１５分を１サイクルとして、これを１５サイクル繰り返すことにより、バイサルファイト処理をした。そして、各反応液をWizard（登録商標）DNA Clean-up System（Promega社）により脱塩し、ＴＥ緩衝液５０μｌで溶出し、非メチル化シトシンをウラシルに変換した各ＤＮＡ溶液を得た。
上記の（i）で得た各ＤＮＡ（１μｇ）を１９μｌの水に希釈し、これらに６Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を１μｌ添加して終濃度０．３Ｎとし、３７℃で１５分間インキュベーションして変性させた。そして、上記の各ＤＮＡ溶液に３．６Ｍ重亜硫酸ナトリウム／０．６Ｍヒドロキノン溶液を１２０μｌ添加した後、９５℃で３０秒および５０℃で１５分を１サイクルとして、これを１５サイクル繰り返すことにより、バイサルファイト処理をした。そして、各反応液をWizard（登録商標）DNA Clean-up System（Promega社）により脱塩し、ＴＥ緩衝液５０μｌで溶出し、非メチル化シトシンをウラシルに変換した各ＤＮＡ溶液を得た。
上記の各ＤＮＡ溶液に３Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を５μｌ添加して、室温で５分間インキュベーションした後、エタノール沈殿法により各ＤＮＡを精製した。最終的に各ＤＮＡを８０μｌの水に溶解して、ＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、CRC検体試料１〜７、およびNormal検体試料を得た。
（２）対照試料の作製
（i）０％および１００％メチル化ＤＮＡの作製
ヒト末梢血リンパ球ゲノムＤＮＡをGenomiPhi v2 DNA amplificationキット（GEヘルスケアライフサイエンス社）により増幅した。この増幅産物は、非メチル化ＤＮＡからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor（COSMO BIO社製）により超音波切断し、ＤＮＡ断片（０％メチル化ＤＮＡ）を得た。また、該ＤＮＡ断片の一部を分取して、これにSssIメチラーゼ（New England Biolab社）を反応させることにより全てのシトシンをメチル化させて、メチル化ＤＮＡ断片（１００％メチル化ＤＮＡ）を得た。
（i）０％および１００％メチル化ＤＮＡの作製
ヒト末梢血リンパ球ゲノムＤＮＡをGenomiPhi v2 DNA amplificationキット（GEヘルスケアライフサイエンス社）により増幅した。この増幅産物は、非メチル化ＤＮＡからなる。次いで、該増幅産物をBioruptor（COSMO BIO社製）により超音波切断し、ＤＮＡ断片（０％メチル化ＤＮＡ）を得た。また、該ＤＮＡ断片の一部を分取して、これにSssIメチラーゼ（New England Biolab社）を反応させることにより全てのシトシンをメチル化させて、メチル化ＤＮＡ断片（１００％メチル化ＤＮＡ）を得た。
（ii）バイサルファイト処理
上述の検体試料の作製におけるバイサルファイト処理と同様に、０％メチル化ＤＮＡおよび１００％メチル化ＤＮＡを処理し、０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を得た。
上述の検体試料の作製におけるバイサルファイト処理と同様に、０％メチル化ＤＮＡおよび１００％メチル化ＤＮＡを処理し、０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を得た。
（３）メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）
上記（１）および（２）で得られた検体試料および対照試料（バイサルファイト処理後のＤＮＡ）を用いて、ＭＳＰを行った。ＭＳＰで用いたＰＣＲ試薬の組成、プライマーセットおよびＰＣＲの反応条件を以下に示す。
上記（１）および（２）で得られた検体試料および対照試料（バイサルファイト処理後のＤＮＡ）を用いて、ＭＳＰを行った。ＭＳＰで用いたＰＣＲ試薬の組成、プライマーセットおよびＰＣＲの反応条件を以下に示す。
＜ＰＣＲ試薬＞
DDW（滅菌水） １５．２５μｌ
10×PCR buffer with MgCl2（Roche社） ２．５μｌ
1.25 mM dNTP mix ４μｌ
10μMセンスプライマー １μｌ
10μMアンチセンスプライマー １μｌ
Faststart Taq polymerase（Roche社） ０．２５μｌ
検体試料 １μｌ
トータル ２５μｌ
DDW（滅菌水） １５．２５μｌ
10×PCR buffer with MgCl2（Roche社） ２．５μｌ
1.25 mM dNTP mix ４μｌ
10μMセンスプライマー １μｌ
10μMアンチセンスプライマー １μｌ
Faststart Taq polymerase（Roche社） ０．２５μｌ
検体試料 １μｌ
トータル ２５μｌ
＜プライマーセット＞
上記のＭＳＰで用いたプライマーセットを表８に示す。なお、表８の三列目の欄における「Ｍ」はメチル化検出用プライマーを示し、「Ｕ」は非メチル化検出用プライマーを示す。
上記のＭＳＰで用いたプライマーセットを表８に示す。なお、表８の三列目の欄における「Ｍ」はメチル化検出用プライマーを示し、「Ｕ」は非メチル化検出用プライマーを示す。
＜ＰＣＲ反応条件＞
９５℃で６分、
９５℃で３０秒、Ｘ℃で３０秒、７２℃で３０秒をＹサイクル、
７２℃で７分、
１６℃で放置。
９５℃で６分、
９５℃で３０秒、Ｘ℃で３０秒、７２℃で３０秒をＹサイクル、
７２℃で７分、
１６℃で放置。
なお、上記の反応条件において「Ｘ」および「Ｙ」はそれぞれ、表８に示されるアニーリング温度およびサイクル数を表す。
（３）メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）の結果解析
上述のＭＳＰで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。また、アガロースゲル電気泳動の写真を画像処理ソフト（ImageJ）で解析することにより各バンドの強度を定量した。バンドの強度は、目的のバンドの強度から同じレーンのバックグラウンドの強度を差し引いた値とした。なお、後述のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図およびバンド強度のグラフを示す図における符号を、以下に説明する。
上述のＭＳＰで得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認した。また、アガロースゲル電気泳動の写真を画像処理ソフト（ImageJ）で解析することにより各バンドの強度を定量した。バンドの強度は、目的のバンドの強度から同じレーンのバックグラウンドの強度を差し引いた値とした。なお、後述のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図およびバンド強度のグラフを示す図における符号を、以下に説明する。
Ｍ： メチル化検出用プライマー
Ｕ： 非メチル化検出用プライマー
０％： ０％メチル化対照試料
１００％： １００％メチル化対照試料
ＨＣＴ１１６： ＨＣＴ１１６試料
ＤＬＤ１： ＤＬＤ−１試料
Ｎ： Normal検体試料
１： CRC検体試料１
２： CRC検体試料２
３： CRC検体試料３
４： CRC検体試料４
５： CRC検体試料５
６： CRC検体試料６
７： CRC検体試料７
Ｕ： 非メチル化検出用プライマー
０％： ０％メチル化対照試料
１００％： １００％メチル化対照試料
ＨＣＴ１１６： ＨＣＴ１１６試料
ＤＬＤ１： ＤＬＤ−１試料
Ｎ： Normal検体試料
１： CRC検体試料１
２： CRC検体試料２
３： CRC検体試料３
４： CRC検体試料４
５： CRC検体試料５
６： CRC検体試料６
７： CRC検体試料７
＜ＣＯＬ４Ａ２＞
ＣＯＬ４Ａ２のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図２に示す。また、ＣＯＬ４Ａ２のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図３に示す。
ＣＯＬ４Ａ２のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図２に示す。また、ＣＯＬ４Ａ２のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図３に示す。
図２および図３から、１００％メチル化対照試料、ＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、CRC検体試料１〜４では、非メチル化検出用プライマーよりもメチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料およびNormal検体試料では、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化の状態を、ＭＳＰにより解析することで、大腸癌細胞を検出できることが明らかとなった。
＜ＡＯＸ１＞
ＡＯＸ１のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図４に示す。また、ＡＯＸ１のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図５に示す。
ＡＯＸ１のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図４に示す。また、ＡＯＸ１のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図５に示す。
図４および図５から、１００％メチル化対照試料、ＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、CRC検体試料２〜４および検体試料７では、非メチル化検出用プライマーよりもメチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料およびNormal検体試料では、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＡＯＸ１遺伝子のメチル化の状態をＭＳＰにより解析することで、大腸癌細胞を検出できることが明らかとなった。
＜ＤＵＳＰ２６＞
ＤＵＳＰ２６のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図６に示す。また、ＤＵＳＰ２６のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図７に示す。
ＤＵＳＰ２６のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図６に示す。また、ＤＵＳＰ２６のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図７に示す。
図６および図７から、１００％メチル化対照試料、ＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、CRC検体試料１、検体試料３、検体試料５および検体試料６では、非メチル化検出用プライマーよりもメチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料およびNormal検体試料では、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＤＵＳＰ２６遺伝子のメチル化の状態をＭＳＰにより解析することで、大腸癌細胞を検出できることが明らかとなった。
＜ＥＬＭ０１＞
ＥＬＭ０１のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図８に示す。また、ＥＬＭ０１のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図９に示す。
ＥＬＭ０１のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図８に示す。また、ＥＬＭ０１のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図９に示す。
図８および図９から、１００％メチル化対照試料、ＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、CRC検体試料１、検体試料３、検体試料５および検体試料６では、非メチル化検出用プライマーよりも、メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料およびNormal検体試料では、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＥＬＭ０１遺伝子のメチル化の状態をＭＳＰにより解析することで、大腸癌細胞を検出できることが明らかとなった。
＜ＳＴＯＸ２＞
ＳＴＯＸ２のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１０に示す。また、ＳＴＯＸ２のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１１に示す。
ＳＴＯＸ２のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１０に示す。また、ＳＴＯＸ２のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１１に示す。
図１０および図１１から、１００％メチル化対照試料、ＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、CRC検体試料１、検体試料２、検体試料５および検体試料６では、非メチル化検出用プライマーよりもメチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料およびNormal検体試料では、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＳＴＯＸ２遺伝子のメチル化の状態をＭＳＰにより解析することで、大腸癌細胞を検出できることが明らかとなった。
＜ＥＤＩＬ３＞
ＥＤＩＬ３のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１２に示す。また、ＥＤＩＬ３のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１３に示す。
ＥＤＩＬ３のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１２に示す。また、ＥＤＩＬ３のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１３に示す。
図１２および図１３から、１００％メチル化対照試料、ＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、CRC検体試料１、検体試料２、検体試料５および検体試料６では、非メチル化検出用プライマーよりもメチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料およびNormal検体試料では、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＥＤＩＬ３遺伝子のメチル化の状態をＭＳＰにより解析することで、大腸癌細胞を検出できることが明らかとなった。
＜ＺＮＦ４４７＞
ＺＮＦ４４７のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１４に示す。また、ＺＮＦ４４７のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲの、アガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１５に示す。
ＺＮＦ４４７のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１４に示す。また、ＺＮＦ４４７のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲの、アガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１５に示す。
図１４および図１５から、１００％メチル化対照試料、ＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、CRC検体試料１、検体試料２、検体試料３および検体試料５では、非メチル化検出用プライマーよりも、メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料およびNormal検体試料では、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＺＮＦ４４７遺伝子のメチル化の状態をＭＳＰにより解析することで、大腸癌細胞を検出できることが明らかとなった。
＜ＥＦＨＤ１＞
ＥＦＨＤ１のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１６に示す。また、ＥＦＨＤ１のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１７に示す。
ＥＦＨＤ１のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１６に示す。また、ＥＦＨＤ１のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１７に示す。
図１６および図１７から、１００％メチル化対照試料、ＨＣＴ１１６試料、ＤＬＤ−１試料、およびCRC検体試料７では、非メチル化検出用プライマーよりもメチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料およびNormal検体試料では、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＥＦＨＤ１遺伝子のメチル化の状態を、ＭＳＰにより解析することで、大腸癌細胞を検出できることが明らかとなった。
（実施例５）メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）による乳癌細胞の検出
（１）検体試料の作製
市販されている二つのヒト正常乳腺上皮組織由来のゲノムＤＮＡを、それぞれBioruptor（ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ社製）を用いて超音波処理した。超音波処理した各ヒト正常乳腺上皮組織由来のゲノムＤＮＡを、実施例４と同様のバイサルファイト処理を行うことで正常乳腺上皮組織検体試料ＡおよびＢを作製した。また、市販されているヒト乳癌組織由来のゲノムＤＮＡを同様に処理して乳癌検体試料Ｃを作製した。
市販されている二つのヒト正常乳腺上皮組織由来のゲノムＤＮＡを、それぞれBioruptor（ＣＯＳＭＯ ＢＩＯ社製）を用いて超音波処理した。超音波処理した各ヒト正常乳腺上皮組織由来のゲノムＤＮＡを、実施例４と同様のバイサルファイト処理を行うことで正常乳腺上皮組織検体試料ＡおよびＢを作製した。また、市販されているヒト乳癌組織由来のゲノムＤＮＡを同様に処理して乳癌検体試料Ｃを作製した。
（２）対照試料の作製
実施例４の対照試料の作製と同様の操作により、０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を作製した。
実施例４の対照試料の作製と同様の操作により、０％メチル化対照試料および１００％メチル化対照試料を作製した。
（３）メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）
上記（１）および（２）で得られた検体試料および対照試料を用いてＭＳＰを行った。ＭＳＰで用いたＰＣＲ試薬の組成およびＰＣＲの反応条件は、実施例４と同様である。また、プライマーは表８に示されるＣＯＬ４Ａ２、ＡＯＸ１およびＳＴＯＸ２のプライマーを用いた。
上記（１）および（２）で得られた検体試料および対照試料を用いてＭＳＰを行った。ＭＳＰで用いたＰＣＲ試薬の組成およびＰＣＲの反応条件は、実施例４と同様である。また、プライマーは表８に示されるＣＯＬ４Ａ２、ＡＯＸ１およびＳＴＯＸ２のプライマーを用いた。
（３）メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）の結果解析
実施例４と同様に、アガロースゲル電気泳動およびバンドの強度を用い、増幅産物を解析した。なお、後述のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図およびバンド強度のグラフを示す図における符号を、以下に説明する。
実施例４と同様に、アガロースゲル電気泳動およびバンドの強度を用い、増幅産物を解析した。なお、後述のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図およびバンド強度のグラフを示す図における符号を、以下に説明する。
Ｍ： メチル化検出用プライマー
Ｕ： 非メチル化検出用プライマー
０％： ０％メチル化対照試料
１００％： １００％メチル化対照試料
Ａ： 正常乳腺上皮組織検体試料Ａ
Ｂ： 正常乳腺上皮組織検体試料Ｂ
Ｃ： 乳癌検体試料Ｃ
Ｕ： 非メチル化検出用プライマー
０％： ０％メチル化対照試料
１００％： １００％メチル化対照試料
Ａ： 正常乳腺上皮組織検体試料Ａ
Ｂ： 正常乳腺上皮組織検体試料Ｂ
Ｃ： 乳癌検体試料Ｃ
＜ＣＯＬ４Ａ２＞
ＣＯＬ４Ａ２のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１８に示す。また、ＣＯＬ４Ａ２のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１９に示す。
ＣＯＬ４Ａ２のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図１８に示す。また、ＣＯＬ４Ａ２のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図１９に示す。
図１８および図１９から、１００％メチル化対照試料および乳癌検体試料Ｃでは、非メチル化検出用プライマーよりもメチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料、正常乳腺上皮組織検体試料Ａおよび正常乳腺上皮組織検体試料Ｂでは、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化の状態をＭＳＰにより解析することで、乳癌細胞を検出できることが明らかとなった。
＜ＡＯＸ１＞
ＡＯＸ１のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図２０に示す。また、ＡＯＸ１のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図２１に示す。
ＡＯＸ１のプライマーセットを用いたＭＳＰのアガロースゲル電気泳動の結果を図２０に示す。また、ＡＯＸ１のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図２１に示す。
図２０および図２１から、１００％メチル化対照試料および乳癌検体試料Ｃでは、非メチル化検出用プライマーよりもメチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料、正常乳腺上皮組織検体試料Ａおよび正常乳腺上皮組織検体試料Ｂでは、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＡＯＸ１遺伝子のメチル化の状態をＭＳＰにより解析することで、乳癌細胞を検出できることが明らかとなった。
＜ＳＴＯＸ２＞
ＳＴＯＸ２のプライマーセットを用いたＭＳＰの、アガロースゲル電気泳動の結果を図２２に示す。また、ＳＴＯＸ２のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図２３に示す。
ＳＴＯＸ２のプライマーセットを用いたＭＳＰの、アガロースゲル電気泳動の結果を図２２に示す。また、ＳＴＯＸ２のプライマーセットを用いたメチル化特異的ＰＣＲのアガロースゲル電気泳動のバンド強度のグラフを図２３に示す。
図２２および図２３から、１００％メチル化対照試料および乳癌検体試料Ｃでは、非メチル化検出用プライマーよりも、メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。一方、０％メチル化対照試料、正常乳腺上皮検体試料Ａおよび正常乳腺上皮組織検体試料Ｂでは、メチル化検出用プライマーよりも非メチル化検出用プライマーを用いたＰＣＲにおいて強いバンドが検出された。この結果から、生体試料中のＳＴＯＸ２遺伝子のメチル化の状態をＭＳＰにより解析することで、乳癌細胞を検出できることが明らかとなった。
本出願は、２００９年７月３日に出願された日本国特許出願特願２００９−１５８８７３号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面および要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
Claims (2)
- 被験者から採取した大腸細胞からＤＮＡを抽出する抽出工程と、
抽出工程で得られたＤＮＡに含まれるＣＯＬ４Ａ２遺伝子における少なくとも１つのＣｐＧ部位のメチル化の有無を解析する解析工程と、
解析工程において、メチル化されたＣｐＧ部位が有るという解析結果が得られた場合に、前記被験者の大腸に大腸癌細胞が存在すると判定する判定工程と
を含む大腸癌細胞の存否を判定する方法。 - 被験者から採取した大腸細胞からＤＮＡを抽出する抽出工程と、
抽出工程で得られたＤＮＡに含まれるＣＯＬ４Ａ２遺伝子のメチル化率を解析する解析工程と、
解析工程で得た遺伝子のメチル化率が所定のカットオフ値より高い場合に、前記被験者の大腸に大腸癌細胞が存在すると判定する判定工程と
を含む大腸癌細胞の存否を判定する方法。
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| JP2009158873 | 2009-07-03 | ||
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