JP6066202B2 - 磁性粒子 - Google Patents
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Description
1.超常磁性ナノ粒子と、疎水性ポリマーと、下記構造単位(a)〜(c)を有する共重合体Aとを含む磁性粒子:
(a)下記一般式(1)で表される構造単位:
(b)下記一般式(2)で表される構造単位:
(c)下記一般式(3)で表される構造単位:
(式中、R1aは水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、mは2〜6の整数である);
(式中、R1bは水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、R2bは水素原子又はOR(Rは脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す)基であり、nは2〜18の整数である);
(式中、R1cは水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、qは2〜10の整数であり、R2cは生体分子固定可能な官能基である)。
(a)下記一般式(1)で表される構造単位:
(b)下記一般式(2)で表される構造単位:
(c)下記一般式(3)で表される構造単位:
(式中、R1aは水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、mは2〜6の整数である);
(式中、R1bは水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、R2bは水素原子又はOR(Rは脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す)基であり、nは2〜18の整数である);
(式中、R1cは水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、qは2〜10の整数であり、R2cは生体分子固定可能な官能基である);
得られた乳化液から水と溶け合わない溶媒を除去して得られる磁性粒子。
本発明の磁性粒子は上記の通り、超常磁性ナノ粒子と、疎水性ポリマーと、特定の構造単位(a)〜(c)を有する共重合体Aとを含む。以下、これら各成分及び本発明の磁性粒子の製造方法等について説明する。
超常磁性ナノ粒子としては、粒径20nm以下、好ましくは粒径5〜20nmの酸化鉄を含有する微粒子が代表的であり、より具体的な例としては、MFe2O4(M=Co、Ni、Mg、Cu、Li0.5Fe0.5等)で表されるフェライト、Fe3O4で表されるマグネタイト、あるいはγ−Fe2O3が挙げられる。これらの中でも、飽和磁化が強く、かつ残留磁化が少ないγ−Fe2O3及びFe3O4から選択される少なくとも1種のナノ粒子が好ましい。さらにこのような磁性体は、チタンカップリング剤、シランカップリング剤若しくは高級脂肪酸等の公知の疎水化処理剤により処理されたものであってもよい。
疎水性ポリマーは、水性溶媒との親和性に乏しいポリマーであり、疎水性ポリマーをコアに用いることにより、本発明の磁性粒子に機械的強度や耐熱性を付与することができる。疎水性ポリマーを構成するモノマーとしては、例えば、スチレン、α―メチルスチレン、ジビニルベンゼン等の芳香族ビニルモノマー、(メタ)アクリロニトリル等のニトリル基含有モノマー、炭素数4以上のアルキル基を有するメタクリル酸エステル、エチレン及びプロピレン等のα−オレフィン類、ブタジエン等のジエン類等が挙げられる。好ましくは、スチレン、ジビニルベンゼン又はそれらの混合物である。疎水性ポリマーは、一種のモノマーからなるホモポリマーであっても、二種以上のモノマーからなるコポリマーであってもよい。
本発明の磁性粒子は、上記特定の構造単位(a)〜(c)を有する共重合体Aを含む。
前記構造単位(a)中の、ホスホリルコリン構造が非特異的吸着の低減をもたらし、
前記構造単位(b)は前記共重合体Aに疎水性を付与して、本発明の磁性粒子の製造の際に、共重合体Aが超常磁性ナノ粒子や疎水性ポリマーと相互作用して、これら三成分の複合体である本発明の磁性粒子が形成されやすくし、
前記構造単位(c)は生体分子固定可能な官能基を有しており、本発明の磁性粒子に生体分子捕捉能力を付与することができる。以下、これら各構造単位について説明する。
構造単位(a)は下記一般式(1)で表される:
構造単位(b)は下記一般式(2)で表される:
構造単位(c)は下記一般式(3)で表される:
本発明に使用される共重合体Aは、以上説明した各種構造単位(a)〜(c)を有する共重合体であって、これらのブロック共重合体であってもランダム共重合体であってもよい。
本発明に使用される共重合体Aは、以上説明した構造単位(a)〜(c)を形成するモノマー化合物を、好ましくは上記した構造単位の構成割合となる量で混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により製造することができる。前記共重合体Aをラジカル重合により製造する場合、たとえば、アルゴン等の不活性ガス雰囲気にて、30〜90℃で溶液重合を行うことができる。
本発明の磁性粒子は、例えば以下のような方法により製造することができる。
例えば上記のごとく乳化を利用して得られる本発明の磁性粒子において、エマルションを形成する際、共重合体Aは親水性の構造単位(a)を外側に、疎水性の構造単位(b)を内側にしたミセルを形成していると考えられる。本発明で得られる磁性粒子では、共重合体Aの構造単位(a)が表面又はその近傍に配置され、構造単位(b)は疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子と相互作用しており、共重合体Aが疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子の少なくとも一部を被覆した粒子の形態をなしているものと考えられる。
本発明の磁性粒子は、磁性粒子の表面又はその近傍には共重合Aの構造単位(c)に生体分子固定可能な官能基を有することから、生体分子を固定化することができる。この生体分子固定官能な官能基は、標的となる生体分子に特異的に相互作用する基であれば特に制限されない。前記特異的な相互作用は物理的な相互作用であっても化学的な相互作用であってもよい。また、前記生体分子固定可能な官能基で固定化した生体分子がさらに別の生体分子に特異的に相互作用する分子であれば、前記固定化した生体分子を介して、さらに別の生体分子を固定化することができる。
以下の実施例で使用した共重合体A1及びA2は、以下の通りにして製造した。
溶媒としてエタノール15mLを含むガラス管において、アルゴン置換を行った後、モノマーである2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)、n-ブチルメタクリレート(BMA)及びp-ニトロフェニルオキシカルボニル-ポリオキシエチレンメタクリレート(MEONP、オキシエチレン基の繰り返し単位数は平均値4.5)を仕込み、ラジカル重合開始剤(アゾビスイソブチロニトリル(AIBN))を添加して、60℃で24時間、ラジカル重合を行った。
MEONPをN−スクシンイミジルオキシカルボニルジ(エチレングリコール)メタクリレート(N−succinimidyloxycarbonyldi(ethylenegylcol)methacrylate、PENHS)に変更し、ラジカル重合における全モノマー濃度を1.0mol/L(MPC:3.5890g,BMA:0.2152g,PENHS:0.4694g)に、開始剤濃度を0.005mol/L(AIBN:12.1mg)に変更した以外は、上記共重合体A1の製造と同様にして共重合体A2を製造した。
以下に示す方法により、実施例1の磁性粒子を製造した。
ポリスチレンの使用量を200.0mgに変更し、さらに共重合体A1を共重合体A2に変更した以外は実施例1と同様にして、実施例2の磁性粒子を製造した。
比較例1の磁性粒子として、Dynabeads(MyOneCarboxylic Acid、Life Technologies Co.、親水性ポリマー被覆磁性粒子)を用意した。
(実施例1及び2の磁性粒子へのプロテインAの結合)
実施例1及び2の磁性粒子2mgをそれぞれ1.2M リン酸水素二カリウム緩衝液(pH8.5)に分散させ、磁性粒子を磁気分離により回収して上澄みを除去し、再度1.2M リン酸水素二カリウム緩衝液(pH8.5)に分散、磁気分離による回収・上清除去を2回繰り返した。
比較例1の磁性粒子2mgを15mM MES−NaOH緩衝液(pH6.0)に分散させ、磁性粒子を磁気分離により回収して上澄みを除去し、再度15mM MES−NaOH緩衝液(pH6.0)に分散、磁気分離による回収・上清除去を2回繰り返した。
上記処理(磁性粒子へのプロテインAの結合)を行った実施例1及び2の磁性粒子、並びに比較例1の磁性粒子を磁気分離にて回収、上清を除去後、その磁性粒子に5倍希釈したウサギ血清(VECTOR LABORATRIES.INC.seiSerum,Rabbit,NormalをPBS(0.02%Tween20含有)で希釈したもの。ウサギ抗体IgGを含んでいる)を加え、室温で回転攪拌機にて1時間攪拌した。
さらに、上記<特異的捕捉の評価>にて、実施例1及び2の磁性粒子並びに比較例1の磁性粒子について得られた各反応液5μLとサンプルバッファー(4%SDS,20%グリセロール,100mM DTT,0.01% BPB,0.125M Tris−HCl,pH6.8)5μLをボルテックスミキサーにてよく混合し、チューブヒーターにて90℃で3分間加熱した。株式会社バイオクラフト製スラブ電気泳動装置、和光純薬株式会社製プレキャストポリアクリルアミドゲル「スーパーセップTMエース、12.5%、17ウェル」、および泳動バッファー(Tris 3g,グリシン14.3g,SDS 1gを純水で1Lに希釈したもの)を用いて、ゲル1レーンあたり10μlをアプライし、電気泳動を行った。染色は一般的なCBB(クマシーブリリアントブルー)染色法で行った。染色されたゲルをスキャナーでスキャンして画像化した。
実施例1および2の磁性粒子、並びに比較例1の磁性粒子各2mgをPBS緩衝液1mLに分散させ、磁石を近づけてから、液の色が透明になるまでの時間(磁性粒子を完全に回収するまでの時間)を測定した。結果を下記表1に示す。磁石としては、表面磁力密度約4300ガウスのネオジム−鉄−ボロン磁石を用いた。
Claims (16)
- 水と、超常磁性ナノ粒子と、疎水性ポリマーと、下記構造単位(a)〜(c)を有する共重合体Aとを含む磁性粒子:
(a)下記一般式(1)で表される構造単位:
(b)下記一般式(2)で表される構造単位:
(c)下記一般式(3)で表される構造単位:
(式中、R1aは水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、mは2〜6の整数である);
(式中、R1bは水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、R2bは水素原子又はOR(Rは脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す)基であり、nは2〜18の整数である);
(式中、R1cは水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、qは2〜10の整数であり、R2cは生体分子固定可能な官能基である)
であって、
共重合体Aが構造単位(a)を水の側に、構造単位(b)を疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子の側にしたミセルを形成していることを特徴とする
磁性粒子。 - 疎水性ポリマーが超常磁性ナノ粒子の少なくとも一部を被覆している、請求項1に記載の磁性粒子。
- 共重合体Aが疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子の少なくとも一部を被覆している、請求項1又は2に記載の磁性粒子。
- 超常磁性ナノ粒子が、酸化鉄を含有する微粒子である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の磁性粒子。
- 超常磁性ナノ粒子が、Fe 3 O 4 及びγ−Fe 2 O 3 から選択される少なくとも1種のナノ粒子を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の磁性粒子。
- 超常磁性ナノ粒子が疎水性コートされている、請求項1〜5のいずれか一項に記載の磁性粒子。
- 疎水性ポリマーを構成するモノマーが、スチレン、ジビニルベンゼン又はそれらの混合物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の磁性粒子。
- 共重合体Aにおける構造単位(a)の構成割合が35〜95モル%であり、構造単位(b)の構成割合が1〜50モル%であり、構造単位(c)の構成割合が1〜30モル%である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の磁性粒子。
- 生体分子固定可能な官能基が、カルボキシル基若しくはその活性エステル基、エポキシ基、トシル基、アミノ基、チオール基又はブロモアセトアミド基である、請求項1〜8のいずれかに記載の磁性粒子。
- 疎水性ポリマー及び超常磁性ナノ粒子を含み、水と溶け合わない溶媒と、下記構造単位(a)〜(c)を有する共重合体Aを含む水とを乳化させる工程:
(a)下記一般式(1)で表される構造単位:
(b)下記一般式(2)で表される構造単位:
(c)下記一般式(3)で表される構造単位:
(式中、R 1a は水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、mは2〜6の整数である);
(式中、R 1b は水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、R 2b は水素原子又はOR(Rは脂肪族炭化水素基又は芳香族炭化水素基を表す)基であり、nは2〜18の整数である);
(式中、R 1c は水素原子又は炭素数1〜4のアルキル基であり、qは2〜10の整数であり、R 2c は生体分子固定可能な官能基である);及び
得られた乳化液から水と溶け合わない溶媒を除去する工程
を含む、磁性粒子の製造方法。 - 水と溶け合わない溶媒が、疎水性ポリマーを溶解する、請求項10に記載の磁性粒子の製造方法。
- 乳化工程において、超常磁性ナノ粒子100重量部に対して、疎水性ポリマー0.01〜2000重量部と共重合体A 2〜2000重量部とを使用する、請求項10又は11に記載の磁性粒子の製造方法。
- 乳化液が水中油型(O/W型)エマルションである、請求項10〜12のいずれか一項に記載の磁性粒子の製造方法。
- 水と溶け合わない溶媒を除去する工程が、水の少なくとも一部を残存させる蒸発処理により行われる、請求項10〜13のいずれか一項に記載の磁性粒子の製造方法。
- 磁性粒子が請求項1〜9のいずれか一項に記載の磁性粒子である、請求項10〜14のいずれか一項に記載の磁性粒子の製造方法。
- 請求項10〜14のいずれか一項に記載の磁性粒子の製造方法で得られる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の磁性粒子。
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