JP6066157B2

JP6066157B2 - バイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤、ならびにバイオフィルム形成抑制方法および／または除去方法

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Publication number: JP6066157B2
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Description

本発明は、バイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤、ならびにバイオフィルム形成抑制方法および／または除去方法に関する。より詳しくは、アントラニル酸もしくは特定のアントラニル酸誘導体、またはこれらの塩を有効成分とするバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤、ならびにバイオフィルム形成抑制方法および／または除去方法に関する。

バイオフィルム（Ｂｉｏｆｉｌｍ）とは、菌膜（きんまく）ともよばれ、細菌により形成される構造体をいう。バイオフィルムの形成は、次のように行われる。まず、基質に付着した細菌が、細胞外多糖やタンパク質などを分泌する。これらは、バリアーや運搬経路の役割を果たし、環境変化や化学物質から内部の細菌を守っている。細菌は、基質に対して付着と脱離を繰り返しながら、徐々に基質表面にバイオフィルムを形成していくと考えられている。
ところで、各種製品の製造工程や熱交換機等でのバイオフィルムの形成は、製品品質や生産性の劣化をもたらし、場合によっては、健康被害を生じる恐れがあることから、望ましいものではない。
このようなバイオフィルムの形成を抑制したり、あるいはいったん形成されたバイオフィルムを除去するために、従来、殺菌剤が使用されてきた。
殺菌剤によってバイオフィルムの形成を抑制するためには、望ましくは、細菌がバイオフィルムを形成する前の段階で、浮遊状態の細菌を殺滅もしくは増殖を抑制する必要がある。なぜなら、殺菌剤は浮遊状態の細菌の殺菌には有効であるが、いったんバイオフィルムを形成してしまった細菌は、細胞外多糖類に覆われたバイオフィルムの構造に起因するためか、殺菌剤に対して高い耐性を示す場合があるからである。
したがって、殺菌剤を使用してバイオフィルムの形成を抑制するためには、浮遊状態の防除対象の菌に対し、高濃度（例えば、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）もしくは最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）以上）で使用する必要がある。また、いったん形成されたバイオフィルムに対しては、さらに高濃度で殺菌剤を使用する必要がある。
高濃度の殺菌剤は、人体に有害な作用をもたらすおそれや、造水膜等のバイオフィルムの形成防除対象となる部材の変質や腐食を引き起こす懸念がある。また、殺菌剤を長期的に使用することにより、殺菌剤に耐性のあるバイオフィルム形成菌を選択的に残存させ、系内に濃縮してしまうという危険性もある。
また、殺菌剤の特徴として、ＭＩＣ未満においては、浮遊状態の細菌の殺滅作用および増殖抑制作用を有さないことから、バイオフィルムの形成抑制作用はもとより、バイオフィルムの除去作用も示さない。
したがって、殺菌剤によるバイオフィルムの形成抑制およびバイオフィルムの除去は必ずしも有効なものとはいえなかった。
以上より、殺菌剤により浮遊細菌を殺菌することでバイオフィルムの形成を抑制したり、あるいは、いったん形成されたバイオフィルム中の細菌を殺菌することでバイオフィルムを除去するのではなく、異なる作用でバイオフィルムの形成を抑制し、かつ、形成されてしまったバイオフィルムに対してはこれを除去できるような薬剤が望まれている。
従来のバイオフィルムに対する防除のための技術としては、特許文献１〜３に示す技術が知られている。
特許文献１には、安息香酸誘導体を有効成分とするバイオフィルムを形成する細菌に対する増殖抑制剤について記載されている。本文献には、安息香酸誘導体についての浮遊状態の細菌自体の増殖抑制活性について記載されているのみで、バイオフィルムの形成抑制作用や形成されたバイオフィルムの除去作用についての記載はない。
特許文献２には、アントラニル酸やその誘導体を有効成分とするレジオネラ菌に対する殺菌剤について、また、特許文献３には、安息香酸等の芳香族カルボン酸を有効成分とする抗菌剤について記載されている。
これらの文献には、あくまでも浮遊状態の細菌自体に対する殺菌作用、静菌作用、増殖抑制作用について記載されているのみで、やはり、バイオフィルムの形成抑制作用や形成されたバイオフィルムの除去作用についての記載はない。

特開平９−６７２１１号公報特開２０１２−２４６２２８号公報特表２００７−５１２３５６号公報

本発明は、安全性が高く、かつ、バイオフィルムの形成抑制能力および／または形成されたバイオフィルムの除去能力に優れた薬剤ならびにこれを用いたバイオフィルムの形成抑制方法および／またはバイオフィルム除去方法の提供を課題とする。

本発明者は、前記課題を解決するために様々な種類の化学物質について、多種類の異なる菌により形成される各バイオフィルムの形成抑制および／または除去の可能性について鋭意研究を行ってきた。
その結果、驚くべきことに、アントラニル酸もしくは特定のアントラニル酸誘導体、またはこれらの塩にバイオフィルムの形成抑制作用および／または除去作用があることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、以下の構成を有する。
[１] 下記一般式(１)で示されるアントラニル酸もしくはアントラニル酸誘導体、またはこれらの塩より選ばれる１種以上を有効成分として含有するバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤。

（式中、Ｒ_１〜Ｒ_４はそれぞれ独立に下記を表す。
Ｒ_１：Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボキシル基）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ_ｎＨ_２ｎ＋１（アルキルエステル：ｎ＝１〜４）
Ｒ_２，Ｒ_３：ハロゲン原子、ニトロ基、水素原子
Ｒ_４：水素原子、ＣＨ_３Ｃ（＝Ｏ）（アセチル基）、ＣＨ_３Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）（アセトアセチル基））
[２]有効成分が、バイオフィルム形成細菌に対して増殖抑制作用を実質的に示さない濃度（最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）未満）で使用される[１]に記載のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤。
[３]前記アントラニル酸誘導体が、アントラニル酸メチル、アントラニル酸エチル、アントラニル酸プロピル、アントラニル酸ブチル、４−クロロアントラニル酸、６−クロロアントラニル酸、４−フルオロアントラニル酸、６−フルオロアントラニル酸、４−ブロモアントラニル酸、６−ブロモアントラニル酸、Ｎ−アセチルアントラニル酸、Ｎ−アセトアセチルアントラニル酸、アントラニルアミド、４−ニトロアントラニル酸、６−ニトロアントラニル酸およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される[１]または[２]に記載のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤。
[４]バイオフィルム形成細菌が、製紙工程、分離膜、または冷却水工程に出現する細菌である[１]〜[３]のいずれか１項に記載のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤。
[５]バイオフィルム形成細菌が、アクチノバクテリア門に属するミクロバクテリウム属、デイノコッカス門に属するデイノコッカス属、プロテオバクテリア門に属するオクロバクテリウム属、アシドヴォラックス属、エロモナス属、クレブシエラ属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、シトロバクター属、ステノトロフモナス属、シュードモナス属、リゾビウム属、カプリアビダス属、に属する細菌から選ばれる１種以上である[１]〜[４]のいずれか1項に記載のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤。
[６]バイオフィルムの形成抑制方法および／または除去方法であって、以下のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤を、バイオフィルム形成細菌と接触させる工程を含む前記方法。
バイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤；
下記一般式（１）で示されるアントラニル酸もしくはアントラニル酸誘導体、またはこれらの塩より選ばれる１種以上を有効成分として含有するバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤。

（式中、Ｒ_１〜Ｒ_４はそれぞれ独立に下記を表す。
Ｒ_１：Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボキシル基）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ_ｎＨ_２ｎ＋１（アルキルエステル：ｎ＝１〜４）
Ｒ_２，Ｒ_３：ハロゲン原子、ニトロ基、水素原子
Ｒ_４：水素原子、ＣＨ_３Ｃ（＝Ｏ）（アセチル基）、ＣＨ_３Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）（アセトアセチル基））
[７]前記工程が、有効成分が、バイオフィルム形成細菌に対して増殖抑制作用を実質的に示さない濃度（最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）未満）でバイオフィルム形成細菌と接触させる工程である、[６]に記載のバイオフィルム形成抑制方法および／または除去方法。
[８]前記アントラニル酸誘導体が、アントラニル酸メチル、アントラニル酸エチル、アントラニル酸プロピル、アントラニル酸ブチル、４−クロロアントラニル酸、６−クロロアントラニル酸、４−フルオロアントラニル酸、６−フルオロアントラニル酸、４−ブロモアントラニル酸、６−ブロモアントラニル酸、Ｎ−アセチルアントラニル酸、Ｎ−アセトアセチルアントラニル酸、アントラニルアミド、４−ニトロアントラニル酸、６−ニトロアントラニル酸およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される[６]または[７]に記載のバイオフィルム形成抑制剤方法および／または除去方法。
[９]バイオフィルム形成細菌が、製紙工程、分離膜、または冷却水工程に出現する細菌である[６]〜[８]のいずれか1項に記載のバイオフィルム形成抑制方法および／または除去方法。
[１０]バイオフィルム形成細菌が、アクチノバクテリア門に属するミクロバクテリウム属、デイノコッカス門に属するデイノコッカス属、プロテオバクテリア門に属するオクロバクテリウム属、アシドヴォラックス属、エロモナス属、クレブシエラ属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、シトロバクター属、ステノトロフモナス属、シュードモナス属、リゾビウム属、カプリアビダス属、に属する細菌から選ばれる１種以上である[６]〜[９]のいずれか1項に記載のバイオフィルム形成抑制方法および／または除去方法。

本発明によれば、アントラニル酸もしくはアントラニル酸誘導体、またはこれらの塩を有効成分とする薬剤により、効率的にバイオフィルムの形成を抑制し、また、形成されたバイオフィルムを除去することができる。これらの有効成分は、従来の殺菌剤に比べて殺菌能力が非常に低いため、人体や環境に対する安全性が高い。また、これらの有効成分は、酸化剤のような高反応性の物質ではないため、適用対象となる部材等の劣化を引き起こし難く、ハンドリングもしやすいというメリットがある。

（バイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤）
本発明のバイオフィル形成抑制剤および／除去剤は、下記一般式(1)で示されるアントラニル酸もしくはアントラニル酸誘導体、またはこれらの塩より選ばれる1種以上を有効成分として含有する薬剤である。

（構造式中Ｒ_１〜Ｒ_４はそれぞれ独立に下記を表す。
Ｒ_１：Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボキシル基）、Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ_２、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ_ｎＨ_２ｎ＋１（アルキルエステル：ｎ＝１〜４）
Ｒ_２，Ｒ_３：ハロゲン原子、ニトロ基、水素原子
Ｒ_４：水素原子、ＣＨ_３Ｃ（＝Ｏ）（アセチル基）、ＣＨ_３Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）（アセトアセチル基））

Ｒ_２（ベンゼン環の４位の水素）は、ハロゲン原子、ニトロ基または水素原子であり、ハロゲン原子としては、塩素、フッ素、臭素が好ましく、塩素がより好ましい。
Ｒ_３（ベンゼン環の６位の水素）は、ハロゲン原子、ニトロ基または水素原子であり、ハロゲン原子としては、塩素、フッ素、臭素が好ましく、塩素がより好ましい。
本発明のアントラニル酸の誘導体の具体例としては、アントラニル酸メチル、アントラニル酸エチル、アントラニル酸プロピル、アントラニル酸ブチル、４−クロロアントラニル酸、６−クロロアントラニル酸、４−フルオロアントラニル酸、６−フルオロアントラニル酸、４−ブロモアントラニル酸、６−ブロモアントラニル酸、Ｎ−アセチルアントラニル酸、Ｎ−アセトアセチルアントラニル酸、アントラニルアミド、４−ニトロアントラニル酸、６−ニトロアントラニル酸等が挙げられる。

本発明において、バイオフィルム形成抑制剤とは、少なくともバイオフィルムの形成抑制作用を有する剤をいい、バイオフィルム除去剤とは、少なくともバイオフィルムの除去作用を有する剤をいう。したがって、これらはそれぞれほかに異なる作用を有してもよく、また、これらの両作用を有する場合も含まれるものとする。
特に、両作用を有する剤を、バイオフィル形成抑制剤および除去剤と表現することがあるが、一方の機能剤（例えばバイオフィルム形成抑制剤）をいう場合に他方の機能剤（バイオフィルム除去剤）を排除する意図で使用するものではない。
また、本願明細書中、バイオフィルム形成抑制および除去剤、バイオフィルム形成抑制作用および除去作用を有する剤、バイオフィル形成抑制剤および除去剤は、同義に用いるものとする。
本発明のバイオフィルム形成抑制作用とは、細菌によるバイオフィルムの形成を抑制する作用をいう。当該作用の有無を確認する方法としては、例えば、試験対象物質を含む培地で一定時間細菌を培養して得られたバイオフィルムの形成量と、試験対象物質を含まない培地で当該細菌培養して得られたバイオフィルムの形成量（コントロール）とを比較する方法などがある。この場合、バイオフィルム形成量がコントロールよりも少ない場合には、試験対象物質は、バイオフィルム形成抑制作用があると判断することができる。
本発明のバイオフィルム除去作用とは、細菌により形成されたバイオフィルムを除去する作用をいう。当該作用の有無を確認する方法としては、例えば、細菌を培養することにより形成されたバイオフィルムに、試験対象物質を一定時間接触させた後のバイオフィルムの形成量と、試験対象物質と接触させずに一定時間経過した後のバイオフィルム形成量（コントロール）とを比較する方法などがある。この場合、バイオフィルムの形成量がコントロールよりも少ない場合には、対象物質は、バイオフィルム除去作用があると判断することができる。
バイオフィルム形成抑制作用は、大きい方が望ましく、後述する試験例で算出されるバイオフィルム抑制率は、２０％以上が好ましい。他に好ましい抑制率としては、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上が挙げられる。
バイオフィルム除去作用は、大きい方が望ましく、後述する試験例で算出されるバイオフィルム除去率は、２０％以上が好ましい。他に好ましい除去率としては、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上が挙げられる。
本発明のバイオフィルム形成抑制剤は、前述のとおり、バイオフィルム形成抑制作用を有することを必須とするが、さらに使用目的に応じて他の作用も有していることが望ましく、バイオフィルム除去作用を有するものがより望ましい。
バイオフィルム形成抑制作用のほかに、バイオフィルム除去作用をも有する剤、すなわち、バイオフィルム形成抑制剤および除去剤を、すでにバイオフィルムが形成された環境下に投与すれば、バイオフィルムが除去され、かつ、その後バイオフィルムの形成が抑制され、恒常的にバイオフィルムが存在しない環境を維持することができるため、非常に有効である。

（アントラニル酸またはアントラニル酸誘導体の塩）
本発明のアントラニル酸の塩またはアントラニル酸誘導体の塩としては、薬学的に許容できる塩であって、バイオフィルムの形成抑制作用および／またはバイオフィルム除去作用があれば特に制限されないが、例えば、酸付加塩及び塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸及びリン酸等の無機酸との塩、酢酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸及びクエン酸等の有機酸、塩素との塩が挙げられる。塩基付加塩としては、ナトリウム及びカリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム及びマグネシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム及びトリエチルアミン等のアミン類との塩が挙げられる。

（使用可能なｐＨの範囲）
本発明のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤は、各薬剤の種類により当業者が適宜その効果に応じて設定することができるが、ｐＨ５．０〜ｐＨ９．０の領域で使用することが好ましい。本明細書中、「〜」は左右の数値を含む意味に用いる。他に好ましい範囲としては、ｐＨ５．０より大きくｐＨ９．０以下の領域、ｐＨ５．０より大きくｐＨ９．０未満の領域、ｐＨ５．５〜ｐＨ９．０、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．５、ｐＨ５．５〜８．０が挙げられる。

（バイオフィルム形成細菌）
本発明のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤が適用されるバイオフィルムの形成細菌は、バイオフィルムを形成する細菌のいずれも含まれる。このうちでも、アクチノバクテリア門に属するミクロバクテリウム属、デイノコッカス門に属するデイノコッカス属、プロテオバクテリア門に属するオクロバクテリウム属、アシドヴォラックス属、エロモナス属、クレブシエラ属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、シトロバクター属、ステノトロフモナス属、シュードモナス属、リゾビウム属、カプリアビダス属、に属する細菌が好ましい。なお、バイオフィルムの形成は２種以上の細菌で行われる場合がほとんどであり、上記各属に属する細菌が１種以上含まれているバイオフィルムが本発明の対象として望ましい。

（最小生育阻止濃度（ＭＩＣ））
本発明でいう最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）とは、抗生物質、殺菌剤が微生物の増殖を抑制する最小濃度（静菌、防腐効果）をいう。したがって、ＭＩＣ未満の濃度とは、バイオフィルム形成細菌に対して増殖抑制作用を実質的に示さない濃度と同義にとらえることができる。
ＭＩＣは、当業者にとって周知の方法によって求めることができ、例えば、埼玉県産業技術センター研究報告書第８巻（２０１０）、“抗菌剤の簡易評価法の開発”や、ＣＨＥＭＯＴＨＥＲＡＰＹ、ＪＡＮ．１９９０、ｐ１０２−１０５、抗菌製品技術協議会、試験法「（３）最小殺菌濃度測定法Ｉ（２０１２年度版）」などに記載されている方法が挙げられる。
本願では、バイオフィルム形成抑制効果および／またはバイオフィルム除去効果の有無を試す各薬剤について、あらかじめ、各バイオフィルム形成細菌のＭＩＣを求め、ＭＩＣ未満の濃度において、各バイオフィルム形成細菌が生育することを確認する試験を行った。
したがって、ＭＩＣ未満の各薬剤の濃度において、各バイオフィルム形成細菌の生育が確認でき、かつ、バイオフィルム形成抑制効果および／または除去効果が確認できた場合には、当該薬剤は、本発明の薬剤であると確認することができる。すなわち、本発明の薬剤は、バイオフィルム形成細菌の菌自体を殺菌したり、増殖を抑制することによりバイオフィルムの形成を抑制したり、除去をするのではなく、異なる作用機序にてバイオフィルムの形成を抑制したり、形成されたバイオフィルムを除去できる薬剤であることを確かめることができる。

（使用形態）
本発明のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤の使用量は用途、剤型により適宜決定することができるが、バイオフィルムへ作用させる場面においては、通常、水溶液の状態で用いられ、その濃度は、バイオフィルム形成細菌と接触する時点の有効成分の濃度としてバイオフィルム形成抑制作用および／またはバイオフィルム除去作用を示す濃度であればよい。
これらの濃度は、具体的には、バイオフィルムの除去作用、またはバイオフィルムの形成抑制作用がもっとも効果的に発揮されるような濃度が好ましく、作用させるバイオフィルムを構成する主要な原因菌種のＭＩＣ未満であることが好ましい。実際には、バイオフィルムの優先種をあらかじめ特定することにより、当該優先種のＭＩＣ未満で使用することが好ましい。そのうちでも、好ましい範囲としては例えば、０．００１〜１０重量％、０．０１〜５重量％、０．０５〜１重量％などが挙げられる。
バイオフィルム形成細菌と接触する時点の濃度とは、バイオフィルムの存在している水溶液中に添加されたときの当該水溶液中における有効成分の濃度をいう。
したがって、バイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤として有効成分が高濃度で調整されたものであって、使用時にバイオフィルムを含む水溶液中に添加することで希釈され、上記濃度範囲に入るようなものであってもよい。また、使用時にいったん適当な濃度まで希釈され、さらにバイオフィルムを含む水溶液中に添加されることで最終的に上記濃度範囲に入るようなものであってもよい。また、スポンジなどに含浸させてバイオフィルムを除去する場合、あるいはバイオフィルムの付着した膜を容器中に入れて、本発明のバイオフィルム形成抑制剤および除去剤を含む溶液に浸漬させて除去するような場合には、スポンジに含浸させる有効成分濃度や（有効成分が添加された後の）前記容器中における有効成分濃度が前記濃度範囲のものであればよいことになる。
また、さらに、本発明のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤の有効成分は、ＭＩＣ未満でも十分にバイオフィルム形成抑制および除去効果に優れるという性質を有しているため、環境への配慮等からなるべく低い濃度で使用されることが望ましく、バイオフィルム形成細菌と接触する時点の濃度として、ＭＩＣ未満の濃度がいっそう望ましい。
部分的に菌の生育を阻害、殺滅することは、長期的にはより強力なバイオフィルム形成細菌の出現を招く可能性がある。さらに、殺滅した菌の死骸から漏出した有機物がバイオフィルム形成細菌の増殖を促進したり、付着や堆積した菌の死骸そのものが適用対象の器壁表面において、更なるバイオフィルム形成のための足場になる場合がある。また、バイオフィルムを形成している菌を殺滅しても、既に形成されたバイオフィルム構造そのものを破壊することが出来るとは限らず、死滅した菌は薬剤や自律的な作用による分散応答を示さないため、結果としてバイオフィルムの形成を促進してしまうことさえある。
これらの見地からも、本発明のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤の有効成分の使用濃度が、バイオフィルム形成細菌の生育や生存性に影響を与えないＭＩＣ未満の濃度であることは望ましいと言える。

本発明のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤を作用させておく時間は、付着しているバイオフィルムの量、有効成分の濃度、作用温度、物理力の有無により異なるが、通常は数秒から数時間の範囲である。

本発明のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤の剤型としては、用途、目的に応じて、水、エタノール、イソプロパノールなどの溶剤に溶かした溶液、あるいは固体、ゲル状、乳化・分散状、粉末状、エアゾールなどが挙げられ、これらから適宜選択することができ、作用濃度に合わせた製品形態はもちろんのこと、高濃度の製品形態にしておき、使用場面において希釈して使用することも可能である。

本発明のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤は、本発明の目的を損なわない範囲で、増粘剤、粘度調整剤、ｐＨ調整剤、溶剤、香料、着色剤、酸化防止剤、防腐剤、蛍光剤、賦形剤、ソイルリリース剤、漂白剤、漂白活性化剤、粉末化剤、造粒剤、コーティング剤などを配合することができる。

本発明のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤は、バイオフィルムが形成され問題となるような広い分野に使用することが可能である。例えば、食品製造又は飲料製造プラント、台所、厨房、浴室、トイレ、キッチンなどの排水溝、排水管に応用できる。
また、産業用の冷却タワーなどの冷却水系、水処理膜、脱塩装置、製紙工場などの循環水系路に応用できる。また、バイオフィルムが形成しやすい医療機器、例えば内視鏡やカテーテル、人工透析機等の洗浄剤にも応用できる。更に、高い安全性を有することから、身体を対象とした洗浄剤、歯磨き剤、口腔ケア剤、入れ歯ケア剤、コンタクトレンズ洗浄剤などに使用することも可能である。
以下、本発明について実施例をもとに具体的に説明するが、本発明はなんらこれらに限定されるものではない。

〔試験例１〕ＭＩＣ（最小生育阻止濃度）の検討
各種のバイオフィルム形成細菌について、試験対象とする化合物のＭＩＣを求めた。
（１）供試菌
表１に示すバイオフィルム形成菌を用いた。これらの菌は、実際の製紙工場の各工程、分離膜、歯垢、海洋などから幅広く採取し分離した菌であり、（）内の菌株は、各菌種の同定に使用した菌株の寄託番号を示す。このうちPseudomonas aeruginosa PAO1 NBRC106052株は、バイオフィルム形成細菌の代表菌株である。
（２）評価対象物質
表１に示す化合物を評価対象物質とした。表１の化合物のうち、ＤＢＮＰＡ（２，３-ジブロモプロピオンアミド）は、有機系殺菌剤の１種であり、以下の試験において比較例として用いた。
各試薬の入手先は以下のとおりである。
アントラニル酸、アントラニル酸メチル：和光純薬（株）
アントラニルアミド、4-クロロアントラニル酸、4-フルオロアントラニル酸、4-ブロモアントラニル酸、6-クロロアントラニル酸、N-アセチルアントラニル酸、N-アセトアセチルアントラニル酸、エチルアントラニル酸：東京化成工業（株）
（３）試験方法
評価対象物質を感受性試験用ブイヨン培地で段階的に希釈し、合計１０ｍＬの希釈列（ただし目的濃度の１．１倍）を調製した。そこに各種供試菌株を１０^８ｃｆｕ／ｍＬに調製した菌液を２０μＬ添加し、９６穴マイクロプレートミキサーで３７℃、２４時間振とう培養（２，０００ｒｐｍ）した。目視で白濁しなかった希釈列のうち最も低い濃度をＭＩＣとした。
（４）試験結果
結果を表１に示す。表中、「＜数値」は、ＭＩＣが当該数値より小さいことを示し、「＞数値」は、ＭＩＣが当該数値より大きいことを示す。
以下のバイオフィルム形成抑制評価試験およびバイオフィルム除去評価試験は、評価対象物質の最終濃度がＭＩＣ未満となる濃度で行った。

〔試験例２〕バイオフィルム形成抑制評価試験
試験対象とする各種の化合物についてバイオフィルムの形成抑制作用を示すかどうか検討を行った。
（１）供試菌
表２に示す各種菌株を用いた。
（２）評価対象物質
表２に示す濃度の化合物を評価対象物質とした。当該濃度は、培地への添加後の最終濃度を示し、前記試験例１で求めたＭＩＣ未満の濃度に該当する。
（３）試験方法
（i）各供試菌は、TSB（Triptic Soy Broth, Bacto：Difco Laboratories）培地にグルコースを終濃度1%としたものを用い、120rpmの条件で前培養液を調整した。
（ii）各前培養液濃度が0.1%(v/v)となるように、それぞれの培地で希釈し、96穴プレートに150μL分注した。
（iii）評価対象物質を各濃度で培地に添加し、塩酸もしくは水酸化ナトリウムで培地pH=7.0に調整した。評価対象物質を含まないものをネガティブコントロールとした（pH=7.0）。
（iv）各種細菌を以下の条件で培養し、バイオフィルムの形成を行った。
（ａ）Ochrobacterium pseudointermedium、Klebsiella sp.、Acinetobacter baumanii、Citrobacter freundii 、Pseudomonas aeruginosa を、37℃、600rpmの条件で6時間培養し、バイオフィルムを形成させた。
（ｂ）Cupriavidus sp.、Pseudomonas plecoglossicida、Microbacterium hominisを、37℃、600rpmの条件で17時間培養し、バイオフィルムを形成させた。
（ｖ）各穴の培養液を除去し、それぞれ蒸留水で２回リンスした。
（ｖｉ）各穴内に付着しているバイオフィルムにクリスタルバイオレット水溶液（0.4w/v %, 20w/v %メタノール）250μLを加え、2分間静置、染色した後、蒸留水で三回リンスし、バイオフィルムに結合していないクリスタルバイオレット水溶液を除去した。
（vii）各穴に250μLのエタノールを添加、1時間静置し、染色されたバイオフィルムからクリスタルバイオレットを溶出させ、波長595nmで吸光度を測定した。
（viii）ネガティブコントロール測定値および各評価系列は5穴の平均値を測定値とし、下記計算式からバイオフィルムの抑制率を算出した。算出された値について、下記判定基準に基づいて評価した。
バイオフィルム抑制率（％）＝｛１−（評価対象測定値／ネガティブコントロール測定値）｝×１００
＜判定基準＞
◎ 抑制効果が高い（抑制率４０％以上）
○ 抑制効果がある（抑制率２０％以上４０％未満）
× 抑制効果がない（抑制率２０％未満）
（４）試験結果
結果を表２に示す。

〔試験例３〕バイオフィルム除去評価試験
試験対象とする各種の化合物について形成されたバイオフィルムの除去作用を示すかどうか検討を行った。
（１）供試菌
表３に示す各種菌株を用いた。
（２）評価対象物質
表３に示す濃度の化合物を評価対象物質とした。当該濃度は、培地への添加後の最終濃度を示し、前記試験例１で求めたＭＩＣ未満の濃度に該当する。
（３）試験方法
（i）各供試菌は、TSB（Triptic Soy Broth, Bacto：Difco Laboratories）培地にグルコースを終濃度1%としたものを用い、120rpmの条件で前培養液を調整した。
（ii）各前培養液濃度が0.1%(v/v)となるように、それぞれの培地で希釈し、96穴プレートに150μL分注した。
（iii）各種細菌を以下の条件で培養し、バイオフィルムの形成を行った。
Ochrobacterium pseudointermedium、Cupriavidus sp.、Klebsiella sp.、Acinetobacter baumanii、Citrobacter freundii、Pseudomonas aeruginosa 、Pseudomonas plecoglossicida、Microbacterium hominisを、37℃、600rpmの条件で17時間培養し、バイオフィルムを形成させた。
（iv）各穴の培養液を除去し、それぞれ蒸留水で２回リンスした。
（v）評価対象物質を各濃度で培地に添加し、塩酸もしくは水酸化ナトリウムで培地pH=7. 0に調整した。無菌培地（pH=7.0）を各穴に200μL添加したものをネガティブコントロールとした。
（vi）各菌は、前培養と同じ温度で3.5時間、600rpmで振盪し評価対象物質を含む培地とバイオフィルムを接触させた後、各穴の培地を除去し、蒸留水で二回リンスした。
（vii）各穴内に付着しているバイオフィルムにクリスタルバイオレット水溶液（0.4w/v %, 20w/v %メタノール）250μLを加え、2分間静置、染色した後、蒸留水で三回リンスし、バイオフィルムに結合していないクリスタルバイオレット水溶液を除去した。
（viii）各穴に250μLのエタノールを添加、1時間静置し、染色されたバイオフィルムからクリスタルバイオレットを溶出させ、波長595nmで吸光度を測定した。
（vix）ネガティブコントロール測定値および各評価系列は5穴の平均値を測定値とし、下記計算式からバイオフィルムの除去率を算出した。算出された値について、下記判定基準に基づいて評価した。
バイオフィルム除去率（％）＝｛１−（評価対象測定値／ネガティブコントロール測定値）｝×１００
＜判定基準＞
◎ 除去効果が高い（除去率４０％以上）
○ 除去効果がある（除去率２０％以上４０％未満）
× 除去効果がない（除去率２０％未満）
（４）試験結果
結果を表３に示す。

〔試験例４〕ｐＨによる違い
（１）供試菌
Pseudomonas aeruginosa PAO1 NBRC106052株を用いた。
（２）評価対象物質
表４に示す濃度の化合物を評価対象物質とした。当該濃度は、培地への添加後の最終濃度を示し、前記試験例１で求めたＭＩＣ未満の濃度に該当する。
（３）試験方法
試験例２の（３）試験方法の手順（iii）において培地のｐＨを表４に示す各ｐＨに調整した以外は、試験例２の試験方法と同様に行った。
（４）試験結果
結果を表４に示す。

[考察]
実施例に挙げた評価対象物質の濃度はいずれもＭＩＣ未満であり、実質的に評価菌株の増殖抑制作用を有さなかった（試験例１）。従って、実施例に示された評価物質によるバイオフィルムの形成抑制作用、および除去作用は生菌数の違いによるものではなく、菌の存在形態の変化が生じたためと考えられる。
比較例として挙げた有機系殺菌剤の一種であるＤＢＮＰＡ（２，３-ジブロモプロピオンアミド）についてはＭＩＣ未満の濃度においてはバイオフィルムの形成抑制、除去作用を何ら示さなかったことからも、実施例に挙げた物質の作用機序が殺菌作用とは異なるものであることが示された。
実施例に挙げた物質については、分類学上広範囲に渡るバイオフィルム形成菌種、すなわちα-プロテオバクテリア綱、β-プロテオバクテリア綱、γ-プロテオバクテリア綱、アクチノバクテリア門に属する菌種に対していずれもバイオフィルムの形成抑制効果のほかにバイオフィルム除去効果も示した。
試験例２および３より、アントラニル酸および、その一部が置換された誘導体や、これらの塩が有効であった。例えば、ベンゼン環の４位の水素が塩素、フッ素、臭素に置換されたものが有効であり、６位の塩素置換体も効果を示したことから、同様に６位のフッ素、臭素置換体も有効であると考えられる。また、カルボキシル基の置換体であるアントラニルアミドやアントラニル酸メチル、アントラニル酸エチルも有効であったことから、同様に、アントラニル酸プロピルやアントラニル酸ブチル等のアルキルエステルも有効であると考えられる。
また、アミノ基の置換体であるN-アセチルアントラニル酸、N-アセチルアントラニル酸も有効であった。
さらに、試験例４より、本発明のバイオフィルム形成抑制剤および除去剤は、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．０を含む広範囲のｐＨ領域で有効であった。

本発明によれば、アントラニル酸もしくはアントラニル酸誘導体、またはこれらの塩を有効成分とすることにより、分類学上広範囲に渡る細菌に対して有効なバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤を提供することができる。
特に、製紙工場の製紙工程や水分離膜、冷却塔などの水に接する経路で形成されるバイオフィルムに対して有効な薬剤を提供することができる。
また、本発明の薬剤は、対象とするバイオフィルム形成細菌の増殖を抑制しないような低濃度でもバイオフィルム形成抑制効果および／または除去効果を有することから、使用する水環境の菌相への影響を考慮する必要もなく安心である。

Claims

アントラニル酸、アントラニル酸メチル、アントラニル酸エチル、アントラニル酸プロピル、アントラニル酸ブチル、４−クロロアントラニル酸、６−クロロアントラニル酸、４−フルオロアントラニル酸、４−ブロモアントラニル酸、６−ブロモアントラニル酸、Ｎ−アセチルアントラニル酸、Ｎ−アセトアセチルアントラニル酸、アントラニルアミド、４−ニトロアントラニル酸、６−ニトロアントラニル酸、またはこれらの塩より選ばれる１種以上を有効成分として含有するバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤であって、有効成分が、バイオフィルム形成細菌に対して増殖抑制作用を実質的に示さない濃度（最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）未満）で使用され、バイオフィルム形成細菌が、製紙工程、分離膜、または冷却水工程に出現する細菌である、前記バイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤。
バイオフィルム形成細菌が、アクチノバクテリア門に属するミクロバクテリウム属、デイノコッカス門に属するデイノコッカス属、プロテオバクテリア門に属するオクロバクテリウム属、アシドヴォラックス属、エロモナス属、クレブシエラ属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、シトロバクター属、ステノトロフモナス属、シュードモナス属、リゾビウム属、カプリアビダス属、に属する細菌から選ばれる１種以上である請求項１に記載のバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤。
バイオフィルム形成抑制方法および／または除去方法であって、
アントラニル酸、アントラニル酸メチル、アントラニル酸エチル、アントラニル酸プロピル、アントラニル酸ブチル、４−クロロアントラニル酸、６−クロロアントラニル酸、４−フルオロアントラニル酸、４−ブロモアントラニル酸、６−ブロモアントラニル酸、Ｎ−アセチルアントラニル酸、Ｎ−アセトアセチルアントラニル酸、アントラニルアミド、４−ニトロアントラニル酸、６−ニトロアントラニル酸、またはこれらの塩より選ばれる１種以上を有効成分として含有するバイオフィルム形成抑制剤および／または除去剤を、バイオフィルム形成細菌に対して増殖抑制作用を実質的に示さない濃度（最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）未満）でバイオフィルム形成細菌と接触させる工程を含み、バイオフィルム形成細菌が、製紙工程、分離膜、または冷却水工程に出現する細菌である、前記バイオフィルムの形成抑制方法および／または除去方法。
バイオフィルム形成細菌が、アクチノバクテリア門に属するミクロバクテリウム属、デイノコッカス門に属するデイノコッカス属、プロテオバクテリア門に属するオクロバクテリウム属、アシドヴォラックス属、エロモナス属、クレブシエラ属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、シトロバクター属、ステノトロフモナス属、シュードモナス属、リゾビウム属、カプリアビダス属、に属する細菌から選ばれる1種以上である請求項３に記載のバイオフィルム形成抑制方法および／または除去方法。