WO2023228443A1 - バイオフィルムを破壊するための溶液及びその製造方法 - Google Patents

バイオフィルムを破壊するための溶液及びその製造方法 Download PDF

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WO2023228443A1
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solution
biofilms
bacteria
destroying
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Inventor
好郎 田中
頡剛 三浦
Original Assignee
株式会社オクト
株式会社ミセラ
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Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N59/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing elements or inorganic compounds
    • A01N59/02—Sulfur; Selenium; Tellurium; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P1/00—Disinfectants; Antimicrobial compounds or mixtures thereof

Definitions

  • This invention relates to a solution for destroying biofilms and a method for producing the same.
  • a biofilm is a membrane that surrounds bacteria and is formed when bacteria and the like that adhere to a substrate secrete extracellular polysaccharides (EPS).
  • EPS plays the role of a barrier that protects bacteria, a transport route for bacteria to take in nutrients, and a role that protects bacteria inside biofilms from environmental changes and chemical substances.
  • the biofilm which is the matrix of the higher-order structure, is dotted with microcolonies such as trapped bacteria.
  • microcolonies such as trapped bacteria.
  • a wide variety of microorganisms can exist in the colony, including bacteria, fungi, algae, and protozoa.
  • Biofilms are found in the natural world, such as ponds and rivers, and in the environment, such as in the drainage pipes of buildings. And the hospital environment is no exception. Biofilms are formed not only in the environment but also in the human body, and have become a major medical problem, particularly in the medical field, where they are associated with chronic and intractable infections.
  • biofilms by bacteria, etc. not only significantly reduces the effectiveness of drugs, but also allows the bacteria themselves to acquire the ability to withstand drugs.
  • the mechanism by which this drug resistance is acquired is that the formation of a biofilm physically makes it difficult for antibiotics to penetrate into the biofilm, and the matrix and antibiotics bind to each other, reducing the efficacy of the drug. is being considered.
  • Pseudomonas aeruginosa that has formed a biofilm is several hundred times more resistant to antibiotics than floating cells, making drug treatment difficult.
  • bacteria produce biofilms in periodontal pockets, causing periodontal disease that is difficult to treat.
  • the invention described in Patent Document 1 aims to destroy the biofilm produced by P. acnes and contains isopropylmethylphenol, salicylic acid, glycyrrhizic acid, ibuprofenpiconol, sulfadiazine and their salts, ethanol, resorcinol, sulfur, and At least one P. acnes biofilm-destroying component selected from the group consisting of benzoyl peroxide.
  • the invention described in Patent Document 2 relates to a method for disrupting biofilms in cystic fibrosis patients, which comprises isolated or recombinant integrated host factor (IHF) polypeptides, or their respective fragments or equivalents. is used.
  • IHF integrated host factor
  • the drug for destroying biofilm described in Patent Document 3 is for suppressing bad breath, and contains sodium bicarbonate and hypochlorous acid as essential components.
  • This drug is characterized by the use of water channels that exist on the surface of the biofilm, which are inorganic materials with relatively small molecular weights (within a molecular weight of 200) that allow blood components, which are a source of nutrients for bacteria, to pass through. .
  • a nanochannel through which only ultra-low molecular weight disinfectants with a molecular weight of 100 or less can pass through.
  • JP 2021-165284 Publication Japanese Patent Application Publication No. 2020-037595 International Publication WO2010/004699 Publication
  • Biofilms are composed of a wide variety of components, such as polysaccharides, proteins, nucleic acids, and lipids, and the amounts and biochemical properties of each component produced by biofilms vary depending on the bacterial species and strain.
  • Patent Documents 1 and 2 are characterized in that biofilms are destroyed according to the characteristics of each bacteria and the characteristics of biofilms, so there is a problem that they cannot be applied to biofilms in general.
  • the above-mentioned Patent Document 3 has a technical idea of sending a drug through water channels and nanochannels that biofilms generally have, but according to the description in Patent Document 3, a liquid containing hypochlorous acid as a main component is Since the chlorine concentration must be concentrated to several hundred ppm, it must be washed away immediately after use.
  • the purpose of this invention is to provide a solution that is gentle on the human body and effectively destroys biofilms, and a method for producing the same.
  • the present invention (1) is a solution for destroying biofilms, which is composed of water (H 2 O) and deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ) and has a pH of 0.5 or more and 4.0 or less.
  • Extracellular polymeric substances which are biofilms, are composed of polysaccharides and proteins, and also contain macromolecules such as DNA, lipids, and humic substances. Exopolysaccharides are generally composed of monosaccharides and non-carbohydrate substituents.
  • a solution prepared by diluting deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ) with water (H 2 O) and adjusting the pH to 0.5 or more and 2.0 or less is a highly acidic solution and contains extracellular polysaccharides (EPS). It has the ability to easily pass through the water channels and nanochannels of biofilms and decompose internal extracellular polysaccharides. Furthermore, by using deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ) as the component that increases the hydrogen ion concentration and lowers the pH, a solution that is gentle on the human body and that effectively destroys biofilms can be obtained.
  • EPS extracellular polysaccharides
  • the upper limit of the diluted pH is preferably 4.0 or less, 3.0 or less, 2.0 or less, 1.9 or less, 1.8 or less, 1.7 or less, 1.6 or less, 1.5 or less,
  • the preferred values are 1.4 or less, 1.3 or less, 1.2 or less, and 1.1 or less, in order. This is because the lower the pH of the biofilm-destroying solution of the present application, the higher the efficacy of degrading extracellular polysaccharides (EPS).
  • the lower limit of pH is preferably 0.5 or higher, since biofilm can be effectively decomposed.
  • the lower limit of pH is preferably 0.6 or more, 0.7 or more, 0.8 or more, 0.9 or more, and 1.0 or more, in order, considering the influence on cells.
  • Polysaccharides which are components of biofilms, are substances in which many monosaccharides such as glucose are linked together, and these polysaccharides can be decomposed by a mechanism called oxidative water decomposition in a low pH solution. In particular, when the pH is 2 or less, polysaccharides are efficiently decomposed. Further, by using deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ), side effects (damage) to cell tissues are reduced.
  • D 2 SO 4 deuterium sulfuric acid
  • the present invention (2) dilutes deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ) with water (H 2 O) to form a mixture of water (H 2 O) and deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ) with a pH of 0.5 or more. This is a method for producing a solution for destroying biofilms of 4.0 or less.
  • the method for producing a solution for destroying biofilm according to the present invention (2) uses water (H 2 O) to adjust the pH of deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ) to 0.5 or more and 4.0 or less.
  • the manufacturing method is simple as it only needs to be diluted.
  • the disinfecting solution of the present invention is made by adjusting the pH of deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ) using water (H 2 O).
  • Deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ) was purchased from Cambridge Isotope Laboratories, Inc. I used one made by Tap water was used as water (H 2 O).
  • the solution for destroying biofilms of the present invention is composed of these two substances, trace components that do not or have little effect on the pH value may be added.
  • the pH was measured using Horiba Model METRO-51.
  • Starch syrup is a sticky sweetener made by saccharifying starch with acids and saccharifying enzymes, and is a mixture of glucose, maltose, dextrin, etc., with maltose being the main component.
  • Co-op agar is a vegetable jelly base whose main ingredient is agar.
  • the raw materials for Coop Agar are glucose, agar, konjac powder, thickeners (locust bean gum, xanthan gum), and calcium lactate.
  • the basic raw material for both raw materials is polysaccharide.
  • a biofilm-destroying solution adjusted to various pH values was added to a test product made by mixing starch syrup and cope agar, and the viscosity of the mixture was measured.
  • the viscosity was measured using "Visco Tester (high viscosity type) VT-06" manufactured by Rion Co., Ltd.
  • starch syrup and cope agar were mixed in a beaker at a ratio of 34:5, and the viscosity was measured using a Viscotester (high viscosity type) VT-06, and the viscosity was 460 dPa ⁇ S.
  • a mixture of starch syrup and cope agar (test object) to be tested was weighed and prepared to have a weight of 150 g.
  • D 2 SO 4 deuterium sulfuric acid
  • FIG. 2 shows the results of an experiment investigating the safety of this biofilm-disrupting solution.
  • the sample was wetted with deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ) prepared in step 5, and observed after 20 hours.
  • FIG. 2(A) shows the state of the leaf surface 20 hours after wetting with sulfuric acid (H 2 SO 4 ).
  • the white spots surrounded by dotted lines are areas where leaf cells have died.
  • FIG. 2(B) shows the state of the leaf surface 20 hours after wetting with deuterium sulfuric acid (D 2 SO 4 ).
  • D 2 SO 4 deuterium sulfuric acid
  • Streptococcus mutans is a facultative anaerobe and Gram-positive streptococcus. Produces insoluble, sticky glucan that sticks to the tooth surface. It is one of the bacteria that mainly causes dental caries.
  • the medium used was THB (TODD-HEWITT BROTH) supplemented with 2% (w/v) sucrose.
  • Sucrose is a sugar in which the monosaccharides glucose and fructose are bonded to ⁇ -1,2-glycoside, and is a type of disaccharide. THB manufactured by Becton Dickinson was used.
  • sucrose As the sucrose, "CASRN” manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used.
  • the plate used for culturing was Thermo scientifica Nunclon Delta Surface 96well.
  • the incubator used was a Panasonic multi-gas incubator MCO-5MUV-PJ. The culture was performed at 37 degrees Celsius in an atmosphere of 5% CO 2 gas, 5% O 2 gas, and 90% N 2 gas.
  • the equipment for measuring the residual biofilm will be explained below.
  • 0.1% crystal violet manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was dissolved in distilled water to a concentration of 0.1% (w/v).
  • the microscope used for photography was EVOS XL core manufactured by Life technologies.
  • the absorbance measuring device used was CORONA ELECTRIC SH-1000 Lab.
  • the data processing software was "SF6" and the absorbance wavelength was 590 nm.
  • Streptococcus mutans was diluted with THB containing 2% sucrose, and 100 ⁇ l of the diluted solution was inoculated onto a cell culture plate (Thermo scientific Nuclon Delta Surface 96 well) to prepare 10 plates.
  • deuterium sulfuric acid D 2 SO 4
  • water H 2 O
  • pH 0.8, 1.2, 1.5, 2.3, 2.7, 3.0
  • 100 ml of test solutions prepared in 3.3, 3.7, and 4.0 were added. Note that no test solution was added to one of the 10 seeded seeds.
  • the cells were cultured in a multi-gas incubator for 24 hours to form a biofilm on the bottom of the plate. After incubation, the plates were washed with distilled water and stained with 0.1% crystal violet solution for 10 minutes. After staining, the samples were washed again with distilled water, dried, and then observed using a bright field inverted microscope and photographs were taken.
  • crystal violet was extracted with 100 ⁇ l of 99.5% ethanol (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and absorbance was measured at a wavelength of 590 nm using an absorbance grating microplate reader.
  • Streptococcus mutans was diluted with THB containing 2% sucrose, and 100 ⁇ l of the diluted solution was inoculated onto a cell culture plate (Nunclon Delta Surface 96 well, manufactured by Thermo Scientific) to prepare 10 plates. Thereafter, the cells were cultured in a multi-gas incubator for 24 hours to form a biofilm on the bottom of the plate.
  • crystal violet was extracted with 100 ⁇ l of 99.5% ethanol (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and absorbance was measured at a wavelength of 590 nm using an absorbance grating microplate reader.
  • Streptococcus mutans was diluted with THB containing 2% sucrose, and 100 ⁇ l of the diluted solution was inoculated onto a cell culture plate (Nunclon Delta Surface 96 well, manufactured by Thermo Scientific) to prepare 10 plates. Thereafter, the cells were cultured in a multi-gas incubator for 24 hours to form a biofilm on the bottom of the plate.
  • the middle row of Figure 3 is a photograph of the test solution added to the culture medium of Streptococcus mutans in Experiment 2 after 24 hours (after biofilm formation), and the cultured for an additional 24 hours, which was stained and washed.
  • the lower part of FIG. 3 is a photograph of the Streptococcus mutans species in Experiment 3 after 24 hours (after biofilm formation), the medium was replaced with the test solution, and the cultured for an additional 24 hours was stained and washed. Looking at these photos, it can be seen that the lower the pH value, the lighter the color, and the more biofilm is destroyed.
  • FIG. 4 shows the results of measuring the absorbance of the sample tested in Experiment 1 above.
  • the horizontal axis is the pH value
  • the vertical axis is the absorbance.
  • Table 2 shows the pH and absorbance data for Experiment 1.
  • FIG. 5 shows the results of measuring the absorbance of the sample tested in Experiment 2 above.
  • the horizontal axis is the pH value
  • the vertical axis is the absorbance.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the absorbance of the sample tested in Experiment 3 above.
  • the horizontal axis is the pH value
  • the vertical axis is the absorbance.
  • the pH value becomes smaller than 2.3
  • the absorbance gradually decreases, and a remarkable decreasing trend continues until the pH value reaches 0.5.
  • a pH below 2.0 clearly indicates that the biofilm is destroyed.
  • Table 4 below provides pH and absorbance data for Experiment 3. [Table 4]
  • Streptococcus mutans produces acid using sugar as a nutrient source, its acid-resistant properties are activated by this system so that it can withstand a drop in pH in areas where bacteria are densely populated.
  • Streptococcus mutans used in Experiments 1 to 3 has resistance to acidity. It is naturally effective against biofilms produced by biofilm-producing bacteria that do not have such a system.
  • Streptococcus mutans has a quorum sensing system that allows it to withstand particularly harsh environments.
  • a quorum sensing system is a system that senses the density of bacteria when the number of bacteria exceeds a certain number, signal transmission occurs, and an activity that is favorable for the growth of bacteria occurs. Since Streptococcus mutans produces acid using sugar as a nutritional source, its acid-resistant properties are activated in this system so that it can withstand a drop in pH in areas where the bacteria are densely populated. In addition, it produces bacterions, which are bactericidal substances, and regulates the amount of bacteria in order to stop the growth of bacteria.
  • Streptococcus mutans is activated to incorporate genes, making it more likely to mutate so that it can survive in harsh environments. In this way, even if S. mutans is placed in a low pH environment, it is difficult to kill it because it has such a system, and a low pH of 0.5 to 2.0 is required. becomes.
  • Fn bacteria Feusobacterium nucleatum
  • This bacterium produces butyric acid, which causes bad breath (bad breath), and is thought to be the cause of periodontal disease.
  • this bacterium has also been discovered in the large intestine, and is thought to be the cause of colorectal cancer.
  • This bacterium does not have a quorum sensing system like Streptococcus Streptococcus mutans, so its acid-fastness is lower than that of Streptococcus Streptococcus mutans, and even biofilm-disrupting solutions with a pH higher than that of Streptococcus Streptococcus mutans can prevent biofilms. Can be destroyed.
  • FIG. 7 shows the results of an experiment actually using the Fn strain.
  • the medium used was THB (TODD-HEWITT BROTH) supplemented with 2% (w/v) sucrose.
  • Sucrose is a sugar in which the monosaccharides glucose and fructose are bonded to ⁇ -1,2-glycoside, and is a type of disaccharide.
  • THB manufactured by Becton Dickinson was used.
  • As the sucrose "CASRN” manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used.
  • the plate used for culturing was Thermo scientifica Nunclon Delta Surface 96well.
  • the incubator used was a Panasonic multi-gas incubator MCO-5MUV-PJ.
  • the culture was performed at 37 degrees Celsius in an atmosphere of 5% CO 2 gas, 5% O 2 gas, and 90% N 2 gas.
  • Fn bacteria was diluted with THB containing 2% sucrose, and 100 ⁇ l of the diluted solution was inoculated onto a cell culture plate (Thermo scientifica Nunclon Delta Surface 96 well) to prepare 10 pieces.
  • 100 ml of the prepared test solution was added. Note that no test solution was added to one of the seven seeded seeds.
  • the cells were cultured in a multi-gas incubator for 24 hours to form a biofilm on the bottom of the plate. After incubation, the plates were washed with distilled water and stained with 0.1% crystal violet solution for 10 minutes. After dyeing, it was washed again with distilled water and dried.
  • crystal violet was extracted with 100 ⁇ l of 99.5% ethanol (manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and absorbance was measured at a wavelength of 590 nm using an absorbance grating microplate reader.
  • FIG. 7 shows the results of measuring the absorbance of the sample tested in Experiment 4 above.
  • the horizontal axis is the pH value
  • the vertical axis is the absorbance.
  • the pH value is lower than 4.5
  • the absorbance is lower than when the pH is 6.0, making it difficult to form a biofilm.
  • Table 5 below provides pH and absorbance data for Experiment 4. [Table 5]
  • a biofilm-disrupting solution with a pH adjusted to 0.5 to 2.0 is preferable for highly acid-fast bacteria such as S. mutans, and is effective against Fn bacteria.
  • highly acid-fast bacteria such as S. mutans
  • the solution for destroying biofilms of the present invention has the ability to strongly destroy biofilms, it can be used not only for treating biofilms that occur in the environment, but also in the dental and medical fields. Furthermore, biofilms formed on medical devices used in the medical field can be destroyed, allowing for more precise cleaning.

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Abstract

【課題】人体にやさしく、基質に付着した細菌等が産出するバイオフィルムを効果的に破壊する溶液とその製造方法を提供する。 【解決手段】水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下の、バイオフィルムを破壊するための溶液である。このバイオフィルムを破壊する溶液は、浸透性がよいので、バイオフィルムを効率的に破壊することができる。また、そのバイオフィルムを破壊するための溶液は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨが０．５以上４．０以下となるように希釈調製することによって得られる。

Description

バイオフィルムを破壊するための溶液及びその製造方法
　この発明は、バイオフィルムを破壊するための溶液及びその製造方法に関する。
　バイオフィルムは、基質に付着した細菌等が細胞外多糖類（ＥＰＳ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌａｒ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を分泌してできる細菌を取り囲む膜である。ＥＰＳは、細菌を守るバリヤーの役割、細菌が栄養分等を取り込む運搬経路の役割を果たし、環境変化や化学物質からバイオフィルム内部の細菌等を守る役割を果たしている。
　その高次構造体のマトリックスであるバイオフィルム内には、閉じこめられた細菌等のミクロコロニーが点在している。そのコロニーには、細菌をはじめ、真菌、藻類、原生動物など多種多様な微生物が存在しうる。バイオフィルム内の菌等の数が一定以上になると、バイオフィルム内の細菌等は、バイオフィルムから放出されて、さらに別の部位でバイオフィルムは広がっていき、汚染、感染は広がっていく。
　バイオフィルムは池とか川といった自然界の中や，建造物の排管の中といった環境中にも認められる。そして病院環境も例外ではない。バイオフィルムは環境以外の、人体の中でも形成され、特に医療の分野では慢性の難治性の感染症として関与し、医療上大きな問題となってきている
　細菌等によるバイオフィルムの形成によって、薬剤の効果の大幅な低下のみならず、細菌等自体が薬剤に耐える力を獲得することもある。この耐薬剤性を獲得するメカニズムは、バイオフィルムが形成されることによって、物理的に抗菌薬がバイオフィルム内に浸透しにくくなること、マトリックスと抗菌薬が結合し、薬剤の効力が低下することが考えられている。また、バイオフィルム内の深層部が低栄養、低酸素状態になることで細菌等自体が休眠状態になってしまうことなどが挙げられている。
　例えば、バイオフィルムを形成した緑膿菌では、抗生物質に対する耐性が浮遊細胞に比べて数百倍も上昇し、薬剤治療を困難にしている。また、歯科分野では、歯周ポケットに細菌がバイオフィルムを産出して、治療困難な歯周病の原因ともなっている。
　バイオフィルムの形成を阻害する薬剤の開発は進められてきた。バイオフィルムが一度形成されると、感染症等の治療が困難になることから、形成されたバイオフィルムを破壊する薬剤も開発されている。特許文献１に記載の発明は、アクネ菌が産出するバイオフィルムを破壊することを目的とし、イソプロピルメチルフェノール、サリチル酸、グリチルリチン酸、イブプロフェンピコノール、スルファジアジン及びそれらの塩、エタノール、レゾルシン、イオウ、及び過酸化ベンゾイルからなる群から選ばれた少なくとも１種のアクネ菌バイオフィルム破壊成分とするものである。
　特許文献２に記載の発明は、嚢胞性線維症患者におけるバイオフィルムの破壊方法に関するもので、単離されたかまたは組換え型の組込み宿主因子（ＩＨＦ）ポリペプチド、またはそのそれぞれの断片もしくは等価物を用いている。
　これらのバイオフィルム破壊のための薬剤は、特定の細菌等によって産出されるバイオフィルムの特性を考慮して発明されたものである。特許文献３に記載のバイオフィルムを破壊するための薬剤は、口臭抑制のためのもので、炭酸水素ナトリウムと次亜塩素酸を必須成分とするものである。この薬剤は、バイオフィルムの表層に存在するウォーターチャンネルという細菌等の栄養源である血液成分が通過できる分子量の比較的小さな無機材料（分子量２００以内）の薬剤を用いることに特徴を有している。また、細菌等が多量に存在するバイオフィルムの中心部にはさらに小さなナノチャンネルという穴があり、分子量１００以下の超低分子量の消毒剤等しか通過できないとされている。
特開２０２１－１６５２８４号公報 特開２０２０－０３７５９５号公報 国際公開ＷＯ２０１０／００４６９９号公報
　バイオフィルムは、多糖、たんぱく質、核酸、脂質など多種多様な成分から構成されており、バイオフィルムが産出される各成分の量や生化学的性質は、菌種や菌株によって異なってくる。上記特許文献１及び２は、各細菌等の特性やバイオフィルムの特性に応じてバイオフィルムを破壊することを特徴としているので、バイオフィルム全般に適用できないという問題がある。上記特許文献３は、バイオフィルムが一般的に有するウォーターチャンネルやナノチャンネルを通過して薬剤を送り込むという技術思想ではあるが、特許文献３の記載によると、次亜塩素酸を主成分とする液は、塩素濃度を数百ｐｐｍ程度にまで濃縮したものが必要であるため、使用後は直ちに洗い流さなければならない。
　この発明の目的は、人体にやさしく、バイオフィルムを効果的に破壊する溶液とその製造方法を提供することである。
　本発明（１）は、水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下の、バイオフィルムを破壊するための溶液である。
　発明者らは、バイオフィルムの構造的特徴を研究し、バイオフィルム自体を効率的に破壊し、しかも人体にやさしい本発明の溶液を取得することに成功した。バイオフィルムである細胞外高分子物質（細胞外多糖類（ＥＰＳ））は、多糖類とタンパク質から成り、そのほか、ＤＮＡや脂質や腐植物質といった巨大分子も含んでいる。菌体外多糖は一般に、単糖類と非炭水化物の置換基で構成されている。
　重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨを０．５以上２．０以下に調製された溶液は高い酸性の溶液であり、細胞外多糖類（ＥＰＳ）を酸化し、バイオフィルムのウォーターチャンネルやナノチャンネルを容易に通って内部の細胞外多糖類を分解する機能を有する。また、水素イオン濃度を高めて低ｐＨとする成分を重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）とすることによって、人体にやさしく、バイオフィルムを効果的に破壊する溶液とすることができる。
　希釈されたｐＨの上限は、４．０以下が好ましく、３．０以下、２．０以下、１．９以下、１．８以下、１．７以下、１．６以下、１．５以下、１．４以下、１．３以下、１．２以下、１．１以下が順番により好ましい。本願のバイオフィルムを破壊する溶液は、ｐＨが小さければ小さいほど細胞外多糖類（ＥＰＳ）を分解する効能をより高く有するためである。ｐＨの下限は、０．５以上であれば有効にバイオフィルムを分解できるので好ましい。ｐＨの下限は、細胞に対する影響を考慮して、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．９以上、１．０以上が順番により好ましい。
　バイオフィルムの成分である多糖類は、グルコース等の単糖がいくつも連なった物質であり、この多糖類は、低ｐＨの溶液により酸化水分解というメカニズムで分解されうる。特に、ｐＨが２以下であれば多糖類は、その分解が効率的に行われる。また、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）とすることによって、細胞組織への副作用（ダメージ）が低減される。
　本発明（２）は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を希釈して、水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下のバイオフィルムを破壊するための溶液の製造方法である。
　本発明（２）のバイオフィルムを破壊するための溶液の製造方法は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨが０．５以上４．０以下となるように希釈調製するだけなので、製造方法が簡便である。
　本発明によれば、人体にやさしく、バイオフィルムを効果的に破壊する溶液とその製造方法を提供することができる。
バイオフィルム破壊液のｐＨを変化させて多糖類を分解する傾向を示す。 ハイビスカスの葉を用いた副作用の試験結果を示す。 ミュータンス菌を用いた実験１～３の写真を示す。 ミュータンス菌を用いた実験１の結果を示す。 ミュータンス菌を用いた実験２の結果を示す。 ミュータンス菌を用いた実験３の結果を示す。 Ｆｎ菌を用いた実験４の結果を示す。
　以下、図及び表を参照して、本発明の最良の実施形態を説明する。
本発明の殺菌用溶液は、水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨを調製して作られたものである。重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｉｓｏｔｏｐｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．製のものを用いた。水（Ｈ２Ｏ）は、水道水を用いた。本発明のバイオフィルムを破壊するための溶液は、これら２つの物質から構成されるものであるが、ｐＨ値に影響を与えない、若しくは影響が少ない微量成分を添加してもよい。ｐＨの測定は、堀場製作所製のモデルＭＥＴＲＯ－５１を用いた。
（ｐＨを変化させて多糖類を分解する実験）
　実際の細胞外多糖類（ＥＰＳ）の代わりの多糖類として、水あめと植物性ゼリーを用いて、多糖類が本発明によってどのように分解されるのかを調べるための予備試験を行った。水あめは、加藤産業株式会社製のもの（商品名「Ｋａｎｐｙ　水あめ」）を用い、植物性ゼリーは、ＣＯＯＰ製（製造者：伊那食品工業株式会社）のもの（商品名「コープアガー」）を用いた。
　水あめは、デンプンを酸や糖化酵素で糖化して作られた粘液状の甘味料であり、ブドウ糖、麦芽糖、デキストリンなどの混合物で、主成分は麦芽糖である。コープアガーは、寒天を主原料とする植物性ゼリーの素である。コープアガーの原材料は、ブドウ糖、寒天、こんにゃく粉、増粘剤（ローカストビーンガム、キサンタンガム）、乳酸カルシュウムである。両原料共に基本原料は、多糖類である。
　水あめとコープアガーとを混合した試験品に、各種ｐＨ値に調製されたバイオフィルム破壊液等を加え、その混合液の粘度を測定した。粘度の測定は、リオン株式会社製の「ビスコテスタ（高粘度タイプ）ＶＴ－０６」を用いた。
　まず、水あめとコープアガーとを３４：５の比率で、ビーカー内で混合し、その粘度を、ビスコテスタ（高粘度タイプ）ＶＴ－０６で測定したところ、粘度は４６０ｄＰａ・Ｓであった。試験に供する水あめとコープアガーとの混合物（被試験体）重量を１５０ｇとして秤量して準備した。水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）のｐＨを調製して準備した試験液のｐＨは、ｐＨ＝０．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０であった。加えて、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を加えていない水道水のままのｐＨ＝７．０の試験液も準備した。被試験体１５０ｇに試験液４ｃｃを加えて、ビスコテスタ（高粘度タイプ）ＶＴ－０６で測定したところ、下記表１の結果となった。試験を行ったときの室温は２５度Ｃ、湿度は６３％であった。
　［表１］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　図１は、表１の測定結果を折れ線グラフにしたものである。このグラフを見ると、ｐＨ６からｐＨが下がるにつれて粘度も下がっているのがわかる。この試験結果により、低ｐＨの溶液によって多糖類が酸化水分解されていることを明確に示している。ｐＨ＝０．５の場合は、ｐＨ＝７．０の場合に比べて、多糖類が分解されて、粘度が１／３近くにまで減少している。
　図２は、本バイオフィルム破壊液の安全性を調べた実験結果を示す。１枚のハイビスカスの葉を中央の葉脈を境にして左右に分割し、一方の葉表面にｐＨ＝０．５に調製した硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を用いて濡らし、他方にｐＨ＝０．５に調製した重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を用いて濡らし、２０時間経過後を観察した。図２（Ａ）は、硫酸（Ｈ２ＳＯ４）を用いて濡らして２０時間経過後の葉表面の状態を示している。点線で囲んだ白く斑点状になっている部分は葉の細胞が死んでいる部分である。図２（Ｂ）は、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を用いて濡らして２０時間経過後の葉表面の状態を示している。図２（Ａ）と比べて、点線で囲んだ白く斑点状になっている部分が大幅に少なく、本バイオフィルム破壊液の安全性が高いことを示している。
　図３～図６は、実際にストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）菌株を用いた実験結果を示している。ストレプトコッカス・ミュータンス菌は、通性嫌気性菌であり、グラム陽性の連鎖球菌である。不溶性、粘着性のあるグルカンを産出し歯の表面に粘着する。主に歯のう蝕の原因となる菌の一つである。培地は、ＴＨＢ（ＴＯＤＤ－ＨＥＷＩＴＴ　ＢＲＯＴＨ）に２％（ｗ／ｖ）スクロースを添加したものを用いた。スクロースは、単糖であるグルコース（ブドウ糖）とフルクトース（果糖）がα－１，２－グリコシド結合した糖であり、二糖類の１種である。ＴＨＢはベクトン・ディッキンソン社製のものを用いた。スクロースは富士フイルム和光純薬社製「ＣＡＳＲＮ」を用いた。培養に用いたプレートは、Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ　Ｄｅｌｔａ　Ｓｕｒｆａｃｅ　９６ｗｅｌｌである。培養器は、ＰａｎａｓｏｎｉｃマルチガスインキュベーターＭＣＯ－５ＭＵＶ－ＰＪを用いた。培養は、３７度Ｃ，ＣＯ２ガス５％，Ｏ２ガス５％、Ｎ２ガス９０％の雰囲気下で行った。
　バイオフィルムの残存を測定する機器等について以下に説明する。染色は、０．１％の富士フイルム和光純薬株式会社製のクリスタルバイオレットを０．１％（ｗ／ｖ）となるように蒸留水に溶解したものを用いた。
　撮影に用いた顕微鏡は、Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＥＶＯＳ　ＸＬ　ｃｏｒｅを用いた。吸光度測定器は、ＣＯＲＯＮＡ　ＥＬＥＣＴＲＩＣ社ＳＨ－１０００　Ｌａｂを用いた。データ処理ソフトウェアは「ＳＦ６」とし、吸光度波長は、５９０ｎｍとした。
　（「実験１：菌幡種と同時に添加」の手順）
ストレプトコッカス・ミュータンス菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ　Ｄｅｌｔａ　Ｓｕｒｆａｃｅ　９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。播種と同時に、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．８、１．２、１．５、２．３、２．７、３．０、３．３、３．７、４．０に調製した試験液１００ｍｌを添加した。なお、播種した１０個のうち１個については、試験液は添加しなかった。
　その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。培養後、プレートを蒸留水で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。染色後は再び蒸留水で洗浄し、乾燥させた後に明視野倒立顕微鏡で観察し写真を撮影した。
　その後、９９．５％エタノール１００μｌ（富士フイルム和光純薬株式会社製）でクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度計グレーティングマイクロプレートリーダーを用いて５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
　（「実験２：菌幡種２４時間後（バイオフィルム形成後）の培地に添加」の手順）
ストレプトコッカス・ミュータンス菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｎｕｎｃｌｏｎ　Ｄｅｌｔａ　Ｓｕｒｆａｃｅ　９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。
　重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．８、１．２、１．５、２．３、２．７、３．０、３．３、３．７、４．０に調製した試験液を、培養開始から２４時間後（バイオフィルム形成後）に、培地を取り除かず、培養系に添加した。さらに２４時間、マルチガスインキュベーターで培養した。培養後、プレートを蒸留水で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。染色後は再び蒸留水で洗浄し乾燥させた後に明視野倒立顕微鏡を用いて観察し、写真を撮影した。
　その後、９９．５％エタノール１００μｌ（富士フイルム和光純薬株式会社製）でクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度計グレーティングマイクロプレートリーダーを用いて５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
　（「実験３：菌幡種２４時間後（バイオフィルム形成後）の培地を置換」の手順）
ストレプトコッカス・ミュータンス菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社Ｎｕｎｃｌｏｎ　Ｄｅｌｔａ　Ｓｕｒｆａｃｅ　９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。
　培養開始から２４時間後に、培地を除去し、プレートを蒸留水で洗浄した。重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．５、０．８、１．２、２．０、２．３、２．７、３．０、３．３、３．７に調製した試験液を、１００ｍｌずつ注入し、除去した培地を戻した。さらに２４時間、マルチガスインキュベーターで培養した。培養後、プレートを蒸留水で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。染色後は再び蒸留水で洗浄し乾燥させた後に明視野倒立顕微鏡を用いて観察し、写真を撮影した。
　図３の上段は、実験１のミュータンス菌幡種と同時に試験液を添加し、培養したものを染色・洗浄した写真である。色が濃いほどより多くのバイオフィルムが残存していることを示している。ｐＨ＝０．８、１．２、１．５の場合に白くなっており、バイオフィルム形成が大きく阻害・破壊されていることがわかる。
　図３の中段は、実験２のミュータンス菌幡種２４時間後（バイオフィルム形成後）の培地に試験液を添加し、さらに２４時間培養したものを染色・洗浄した写真である。図３の下段は、実験３のミュータンス菌幡種２４時間後（バイオフィルム形成後）の培地を試験液で置換し、さらに２４時間培養したものを染色・洗浄した写真である。これらの写真を見ると、ｐＨ値が小さいものほど色が薄くなっており、より多くのバイオフィルムが破壊されていりことがわかる。
　図４は、上記実験１で試験したサンプルの吸光度を測定した結果を示している。横軸がｐＨ値で、縦軸が吸光度で、ｐＨ値が２．３よりも小さくなると急激に吸光度が小さくなり、バイオフィルムがほとんど形成されていないという結果であった。下記表２は、実験１のｐＨと吸光度のデータである。
［表２］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　図５は、上記実験２で試験したサンプルの吸光度を測定した結果を示している。横軸がｐＨ値で、縦軸が吸光度で、ｐＨ値が３．０よりも小さくなると徐々に吸光度が小さくなり、ｐＨ１．５から小さくなると急激に小さくなっている。ｐＨが小さくなると、バイオフィルム破壊されていることを示している。下記表３は、実験２のｐＨと吸光度のデータである。
［表３］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　図６は、上記実験３で試験したサンプルの吸光度を測定した結果を示している。横軸がｐＨ値で、縦軸が吸光度で、ｐＨ値が２．３よりも小さくなると徐々に吸光度が小さくなり、ｐＨが０．５まで顕著な減少傾向が続いている。ｐＨが２．０よりも小さくなると、バイオフィルムが破壊されていることを明確に示している。下記表４は、実験３のｐＨと吸光度のデータである。
［表４］
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
　ミュータンス菌は、糖を栄養源として酸を産生することから、菌の密集した局所でｐＨ低下に耐えられるように耐酸性の性質がこのシステムにより活性化される。実験１～３に供したミュータンス菌は、酸性に対して抵抗力を有している。このようなシステムを有していないバイオフィルムを産出する菌が産出するバイオフィルムに対しては、当然に効果を有する。
　ミュータンス菌は、クオラムセンシングシステムを有しており、特に厳しい環境でも耐えられる耐性を有している。クオラムセンシングシステムとは、菌の数が一定数を超えたときに、その密度を感知して、シグナル伝達が起こり、菌の生息に都合の良い活性が起こるシステムである。
　ミュータンス菌は、糖を栄養源として酸を産生することから、菌の密集した局所でｐＨ低下に耐えられるように耐酸性の性質がこのシステムで活性化される。また、菌の増殖に歯止めがかけられるように殺菌物質であるバクテリオンを産生し、菌量の調節を行う。
　ミュータンス菌は、環境に適応するために遺伝子の取り込みが活性化され、厳しい環境でも生息できる性質を持つように変異しやすくする。
　このように、ミュータンス菌では、低ｐＨ環境におかれても、このようなシステムを有しているため死滅させることが困難となり、ｐＨが０．５以上２．０以下という低いｐＨが必要となる。
　一方、ミュータンス菌のこのような耐酸性を有しない菌であって、バイオフィルムを形成する菌も存在する。例えば、口腔内に常在するＦｎ菌（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ（フソバクテリウム・ヌクレアタム））である。この菌は、悪臭（口臭）の原因となる酪酸を生み出す菌で、歯周病の原因菌とされ、さらに近年、大腸においても発見され、大腸がんの原因菌とされている菌である。
　この菌は、ミュータンス菌のようなクオラムセンシングシステムを有さないので、抗酸性はミュータンス菌よりも低く、ｐＨがミュータンス菌と比べて高いｐＨを有するバイオフィルム破壊液でもバイオフィルムを破壊することができる。
　図７は、実際にＦｎ菌株を用いた実験結果を示している。培地は、ＴＨＢ（ＴＯＤＤ－ＨＥＷＩＴＴ　ＢＲＯＴＨ）に２％（ｗ／ｖ）スクロースを添加したものを用いた。スクロースは、単糖であるグルコース（ブドウ糖）とフルクトース（果糖）がα－１，２－グリコシド結合した糖であり、二糖類の１種である。ＴＨＢはベクトン・ディッキンソン社製のものを用いた。スクロースは富士フイルム和光純薬社製「ＣＡＳＲＮ」を用いた。培養に用いたプレートは、Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ　Ｄｅｌｔａ　Ｓｕｒｆａｃｅ　９６ｗｅｌｌである。培養器は、ＰａｎａｓｏｎｉｃマルチガスインキュベーターＭＣＯ－５ＭＵＶ－ＰＪを用いた。培養は、３７度Ｃ，ＣＯ２ガス５％，Ｏ２ガス５％、Ｎ２ガス９０％の雰囲気下で行った。
　（「実験４：菌幡種と同時に添加」の手順）
　Ｆｎ菌を２％スクロース含有ＴＨＢで希釈し、細胞培養用プレート（Ｔｈｅｒｍｏ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｓｈａＮｕｎｃｌｏｎ　Ｄｅｌｔａ　Ｓｕｒｆａｃｅ　９６ｗｅｌｌ）に１００μｌ播種したものを１０個用意した。播種と同時に、重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を水（Ｈ２Ｏ）で希釈し、ｐＨ＝０．５、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０に調製した試験液１００ｍｌを添加した。なお、播種した７個のうち１個については、試験液は添加しなかった。
　その後、マルチガスインキュベーターで２４時間培養してプレート底面にバイオフィルムを形成させた。培養後、プレートを蒸留水で洗浄し、０．１％クリスタルバイオレット溶液で１０分間染色した。染色後は再び蒸留水で洗浄し、乾燥させた。
　その後、９９．５％エタノール１００μｌ（富士フイルム和光純薬株式会社製）でクリスタルバイオレットを抽出し、吸光度計グレーティングマイクロプレートリーダーを用いて５９０ｎｍの波長で吸光度を測定した。
　図７は、上記実験４で試験したサンプルの吸光度を測定した結果を示している。横軸がｐＨ値で、縦軸が吸光度で、ｐＨ値が４．５よりも小さくなると、ｐＨが６．０のものと比べて吸光度が小さくなり、バイオフィルムが形成されにくくなるという結果であった。下記表５は、実験４のｐＨと吸光度のデータである。
［表５］
　実験１～実験４の結果からわかるように、ミュータンス菌のような抗酸性の強い菌に対しては、ｐＨが０．５～２，０に調整したバイオフィルム破壊液が好ましく、Ｆｎ菌のような抗酸性が高くない菌に対しては、ｐＨを４．０以下に調製したものでも効果があるので、対象となる菌の種類によってｐＨを調整すれば良い。
　実験１～実験４では、水と重水素硫酸の２成分によって構成されたバイオフィルムを破壊する溶液が用いられているが、他の成分、例えば界面活性剤、増粘剤、色素剤等の副成分を添加したものにおいても、主成分が水と重水素硫酸であり、ｐＨが０．５～４である限りバイオフィルムを破壊することができる。
　本発明のバイオフィルムを破壊するための溶液は、バイオフィルムを強力に破壊する機能を有することから、環境に発生するバイオフィルムのみならず、歯科分野や医科分野の治療に供することが出来る。また、医療分野に使用する医療機器に形成されたバイオフィルムを破壊して、より精密な洗浄に供することができる。

Claims (3)

  1. 　水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下の、バイオフィルムを破壊するための溶液。
  2. 　水（Ｈ２Ｏ）を用いて重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）を希釈して、水（Ｈ２Ｏ）と重水素硫酸（Ｄ２ＳＯ４）からなり、ｐＨが０．５以上４．０以下の、バイオフィルムを破壊するための溶液を製造する方法。
  3. 　請求項１のバイオフィルムを破壊するための溶液を用いて、バイオフィルムを産生する菌の種類によって、ｐＨを調整してバイオフィルムを破壊する方法。

     
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