KR20240011826A - 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

[과제] 인체 친화적이며, 기질(基質)에 부착된 세균 등이 산출하는 바이오 필름을 효과적으로 파괴하는 용액과 그 제조 방법을 제공한다.
[해결 수단] 물(H2O)과 중수소황산(D2SO4)으로 이루어지며, pH가 0.5 이상 4.0 이하인, 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액이다. 이 바이오 필름을 파괴하는 용액은, 침투성이 좋으므로, 바이오 필름을 효율적으로 파괴할 수 있다. 또, 그 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액은, 물(H2O)을 이용하여 중수소황산(D2SO4)의 pH가 0.5 이상 4.0 이하가 되도록 희석 조제함으로써 얻어진다.

Description

바이오 필름을 파괴하기 위한 용액 및 그 제조 방법
이 발명은, 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
바이오 필름은, 기질(基質)에 부착된 세균 등이 세포외 다당류(EPS, extracellar polysaccharide)를 분비하여 생기는 세균을 둘러싸는 막이다. EPS는, 세균을 지키는 배리어의 역할, 세균이 영양분 등을 도입하는 운반 경로의 역할을 하여, 환경 변화나 화학 물질로부터 바이오 필름 내부의 세균 등을 지키는 역할을 하고 있다.
그 고차 구조체의 매트릭스인 바이오 필름 내에는, 갇힌 세균 등의 마이크로 콜로니가 점재하고 있다. 그 콜로니에는, 세균을 비롯하여, 진균, 조류(藻類), 원생동물 등 다종 다양한 미생물이 존재할 수 있다. 바이오 필름 내의 균 등의 수가 일정 이상이 되면, 바이오 필름 내의 세균 등은, 바이오 필름으로부터 방출되고, 또한 별도의 부위에서 바이오 필름은 퍼져 나가, 오염, 감염은 퍼져 나간다.
바이오 필름은 연못이나 강과 같은 자연계 중이나, 건조물의 배관 중과 같은 환경 중에서도 확인된다. 그리고 병원 환경도 예외는 아니다. 바이오 필름은 환경 이외의, 인체 중에서도 형성되며, 특히 의료의 분야에서는 만성의 난치성 감염증으로서 관여하여, 의료상 큰 문제가 되고 있다.
세균 등에 의한 바이오 필름의 형성에 의해, 약제의 효과의 대폭적인 저하뿐만 아니라, 세균 등 자체가 약제에 견디는 힘을 획득하는 경우도 있다. 이 내(耐)약제성을 획득하는 메커니즘은, 바이오 필름이 형성됨으로써, 물리적으로 항균약이 바이오 필름 내에 침투하기 어려워지는 것, 매트릭스와 항균약이 결합하여, 약제의 효력이 저하되는 것이 생각되고 있다. 또, 바이오 필름 내의 심층부가 저영양, 저산소 상태가 됨으로써 세균 등 자체가 휴면 상태가 되어 버리는 것 등을 들 수 있다.
예를 들면, 바이오 필름을 형성한 녹농균에서는, 항생 물질에 대한 내성이 부유 세포에 비해 수백배나 상승하여, 약제 치료를 곤란하게 하고 있다. 또, 치과 분야에서는, 치주포켓에 세균이 바이오 필름을 산출하여, 치료 곤란한 치주병의 원인도 되고 있다.
바이오 필름의 형성을 저해하는 약제의 개발은 진행되어 왔다. 바이오 필름이 한번 형성되면, 감염증 등의 치료가 곤란해지는 점에서, 형성된 바이오 필름을 파괴하는 약제도 개발되고 있다. 특허문헌 1에 기재된 발명은, 아크네균이 산출하는 바이오 필름을 파괴하는 것을 목적으로 하며, 이소프로필메틸페놀, 살리신산, 글리시리진산, 이부프로펜피코놀, 설파다이아진 및 그들의 염, 에탄올, 레조르신, 황, 및 과산화벤조일로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 1종의 아크네균 바이오 필름 파괴 성분으로 하는 것이다.
특허문헌 2에 기재된 발명은, 낭포성 섬유증 환자에 있어서의 바이오 필름의 파괴 방법에 관한 것으로, 단리되었거나 또는 재조합형 통합 숙주 인자(IHF) 폴리펩타이드, 또는 그 각각의 단편 혹은 등가물을 이용하고 있다.
이들 바이오 필름 파괴를 위한 약제는, 특정 세균 등에 의해 산출되는 바이오 필름의 특성을 고려하여 발명된 것이다. 특허문헌 3에 기재된 바이오 필름을 파괴하기 위한 약제는, 구취 억제를 위한 것으로, 탄산수소나트륨과 차아염소산을 필수 성분으로 하는 것이다. 이 약제는, 바이오 필름의 표층에 존재하는 워터 채널이라고 하는 세균 등의 영양원인 혈액 성분이 통과할 수 있는 분자량이 비교적 작은 무기 재료(분자량 200 이내)의 약제를 이용하는 것에 특징을 갖고 있다. 또, 세균 등이 다량으로 존재하는 바이오 필름의 중심부에는 더 작은 나노 채널이라고 하는 구멍이 있어, 분자량 100 이하의 초저분자량의 소독제 등 밖에 통과할 수 없다고 여겨지고 있다.
일본국 특허공개 2021-165284호 공보 일본국 특허공개 2020-037595호 공보 국제공개 WO2010/004699호 공보
바이오 필름은, 다당, 단백질, 핵산, 지질 등 다종 다양한 성분으로 구성되어 있으며, 바이오 필름이 산출되는 각 성분의 양이나 생화학적 성질은, 균종이나 균주에 따라 상이해진다. 상기 특허문헌 1 및 2는, 각 세균 등의 특성이나 바이오 필름의 특성에 따라 바이오 필름을 파괴하는 것을 특징으로 하고 있으므로, 바이오 필름 전반에 적용할 수 없다고 하는 문제가 있다. 상기 특허문헌 3은, 바이오 필름이 일반적으로 갖는 워터 채널이나 나노 채널을 통과하여 약제를 보낸다고 하는 기술 사상이긴 하지만, 특허문헌 3의 기재에 의하면, 차아염소산을 주성분으로 하는 액은, 염소 농도를 수백ppm 정도로까지 농축한 것이 필요하기 때문에, 사용 후에는 즉시 씻어내지 않으면 안 된다.
이 발명의 목적은, 인체 친화적이며, 바이오 필름을 효과적으로 파괴하는 용액과 그 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명 (1)은, 물(H2O)과 중수소황산(D2SO4)으로 이루어지며, pH가 0.5 이상 4.0 이하인, 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액이다.
발명자들은, 바이오 필름의 구조적 특징을 연구하여, 바이오 필름 자체를 효율적으로 파괴하고, 게다가 인체 친화적인 본 발명의 용액을 취득하는 것에 성공했다. 바이오 필름인 세포외 고분자 물질(세포외 다당류(EPS))은, 다당류와 단백질로 이루어지며, 그 외, DNA나 지질이나 부식 물질과 같은 거대 분자도 포함하고 있다. 균체외 다당은 일반적으로, 단당류와 비탄수화물의 치환기로 구성되어 있다.
중수소황산(D2SO4)을 물(H2O)로 희석하여, pH 0.5 이상 4.0 이하로 조제된 용액은 높은 산성의 용액이며, 세포외 다당류(EPS)를 산화하고, 바이오 필름의 워터 채널이나 나노 채널을 용이하게 통과하여 내부의 세포외 다당류를 분해하는 기능을 갖는다. 또, 수소 이온 농도를 높이고 저pH로 하는 성분을 중수소황산(D2SO4)으로 함으로써, 인체 친화적이며, 바이오 필름을 효과적으로 파괴하는 용액으로 할 수 있다.
희석된 pH의 상한은, 4.0 이하가 바람직하고, 3.0 이하, 2.0 이하, 1.9 이하, 1.8 이하, 1.7 이하, 1.6 이하, 1.5 이하, 1.4 이하, 1.3 이하, 1.2 이하, 1.1 이하가 순서대로 보다 바람직하다. 본원의 바이오 필름을 파괴하는 용액은, pH가 작으면 작을수록 세포외 다당류(EPS)를 분해하는 효능을 보다 높게 갖기 때문이다. pH의 하한은, 0.5 이상이면 유효하게 바이오 필름을 분해할 수 있으므로 바람직하다. pH의 하한은, 세포에 대한 영향을 고려하여, 0.6 이상, 0.7 이상, 0.8 이상, 0.9 이상, 1.0 이상이 순서대로 보다 바람직하다.
바이오 필름의 성분인 다당류는, 글루코오스 등의 단당이 여럿 연속된 물질이며, 이 다당류는, 저pH의 용액에 의해 산화 수분해라는 메커니즘으로 분해될 수 있다. 특히, pH가 2.0 이하이면 다당류는, 그 분해가 효율적으로 행해진다. 또, 중수소황산(D2SO4)으로 함으로써, 세포 조직에 대한 부작용(대미지)이 저감된다.
본 발명 (2)는, 물(H2O)을 이용하여 중수소황산(D2SO4)을 희석하여, 물(H2O)과 중수소황산(D2SO4)으로 이루어지며, pH가 0.5 이상 4.0 이하인, 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액의 제조 방법이다.
본 발명 (2)의 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액의 제조 방법은, 물(H2O)을 이용하여 중수소황산(D2SO4)의 pH가 0.5 이상 4.0 이하가 되도록 희석 조제할 뿐이므로, 제조 방법이 간편하다.
본 발명에 의하면, 인체 친화적이며, 바이오 필름을 효과적으로 파괴하는 용액과 그 제조 방법을 제공할 수 있다.
도 1은, 바이오 필름 파괴액의 pH를 변화시켜 다당류를 분해하는 경향을 나타낸다.
도 2는, 히비스커스의 잎을 이용한 부작용의 시험 결과를 나타낸다.
도 3은, 뮤탄스균을 이용한 실험 1~3의 사진을 나타낸다.
도 4는, 뮤탄스균을 이용한 실험 1의 결과를 나타낸다.
도 5는, 뮤탄스균을 이용한 실험 2의 결과를 나타낸다.
도 6은, 뮤탄스균을 이용한 실험 3의 결과를 나타낸다.
도 7은, Fn균을 이용한 실험 4의 결과를 나타낸다.
이하, 도면 및 표를 참조하여, 본 발명의 최상의 실시 형태를 설명한다.
본 발명의 살균용 용액은, 물(H2O)을 이용해서 중수소황산(D2SO4)의 pH를 조제하여 만들어진 것이다. 중수소황산(D2SO4)은, Cambridge Isotope Laboratories, Inc. 제조의 것을 이용했다. 물(H2O)은, 수돗물을 이용했다. 본 발명의 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액은, 이들 2개의 물질로 구성되는 것이지만, pH값에 영향을 미치지 않는, 혹은 영향이 적은 미량 성분을 첨가해도 된다. pH의 측정은, HORIBA, Ltd. 제조의 모델 METRO-51을 이용했다.
(pH를 변화시켜 다당류를 분해하는 실험)
실제의 세포외 다당류(EPS)를 대신하는 다당류로서, 물엿과 식물성 젤리를 이용하여, 다당류가 본 발명에 의해 어떻게 분해되는지를 조사하기 위한 예비 시험을 행했다. 물엿은, KATO SANGYO CO., LTD. 제조의 것(상품명 「Kanpy 물엿」)을 이용하고, 식물성 젤리는, COOP 제조(제조자: Ina Food Industry Co., Ltd.)의 것(상품명 「코프 아가」)을 이용했다.
물엿은, 전분을 산이나 당화 효소로 당화하여 만들어진 점액상의 감미료이며, 포도당, 맥아당, 덱스트린 등의 혼합물로, 주성분은 맥아당이다. 코프 아가는, 한천을 주원료로 하는 식물성 젤리의 원료이다. 코프 아가의 원재료는, 포도당, 한천, 곤약 가루, 증점제(로커스트빈검, 크산탄검), 젖산칼슘이다. 양 원료 모두 기본 원료는, 다당류이다.
물엿과 코프 아가를 혼합한 시험품에, 각종 pH값으로 조제된 바이오 필름 파괴액 등을 첨가하고, 그 혼합액의 점도를 측정했다. 점도의 측정은, RION Co., Ltd. 제조의 「비스코테스터(고점도 타입) VT-06」을 이용했다.
우선, 물엿과 코프 아가를 34:5의 비율로, 비커 내에서 혼합하고, 그 점도를, 비스코테스터(고점도 타입) VT-06으로 측정한 바, 점도는 460dPa·S였다. 시험에 제공하는 물엿과 코프 아가의 혼합물(피시험체) 중량을 150g으로 하여 칭량해서 준비했다. 물(H2O)을 이용해서 중수소황산(D2SO4)의 pH를 조제하여 준비한 시험액의 pH는, pH=0.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0이었다. 그에 더하여, 중수소황산(D2SO4)을 첨가하지 않은 수돗물인 채인 pH=7.0의 시험액도 준비했다. 피시험체 150g에 시험액 4cc를 첨가하여, 비스코테스터(고점도 타입) VT-06으로 측정한 바, 하기 표 1의 결과가 되었다. 시험을 행했을 때의 실온은 25℃, 습도는 63%였다.
도 1은, 표 1의 측정 결과를 꺾은선 그래프로 만든 것이다. 이 그래프를 보면, pH 6.0에서 pH가 내려감에 따라 점도도 내려가고 있는 것을 알 수 있다. 이 시험 결과에 의해, 저pH의 용액에 의해 다당류가 산화 수분해되고 있는 것을 명확하게 나타내고 있다. pH=0.5의 경우는, pH=7.0의 경우에 비해, 다당류가 분해되고, 점도가 1/3 가까이까지 감소하고 있다.
도 2는, 본 바이오 필름 파괴액의 안전성을 조사한 실험 결과를 나타낸다. 1장의 히비스커스의 잎을 중앙의 엽맥을 경계로 하여 좌우로 분할하고, 한쪽의 잎 표면에 pH=0.5로 조정한 황산(H2SO4)을 이용하여 적시고, 다른 쪽에 pH=0.5로 조제한 중수소황산(D2SO4)을 이용하여 적셔, 20시간 경과 후를 관찰했다. 도 2의 (A)는, 황산(H2SO4)을 이용하여 적시고 20시간 경과 후의 잎 표면의 상태를 나타내고 있다. 점선으로 둘러싼 희고 반점 형상으로 되어 있는 부분은 잎의 세포가 죽어 있는 부분이다. 도 2의 (B)는, 중수소황산(D2SO4)을 이용하여 적시고 20시간 경과 후의 잎 표면의 상태를 나타내고 있다. 도 2의 (A)와 비교하여, 점선으로 둘러싼 희고 반점 형상으로 되어 있는 부분이 큰 폭으로 적어, 본 바이오 필름 파괴액의 안전성이 높은 것을 나타내고 있다.
도 3~도 6은, 실제로 스트렙토코커스·뮤탄스(Streptococcus mutans) 균주를 이용한 실험 결과를 나타내고 있다. 스트렙토코커스·뮤탄스균은, 통성혐기성균이며, 그램 양성의 연쇄구균이다. 불용성, 점착성이 있는 글루칸을 산출하여 치아의 표면에 점착된다. 주로 치아의 충치의 원인이 되는 균의 하나이다. 배지는, THB(TODD-HEWITT BROTH)에 2%(w/v) 수크로오스를 첨가한 것을 이용했다. 수크로오스는, 단당인 글루코오스(포도당)와 프룩토오스(과당)가 α-1,2-글리코시드 결합한 당이며, 이당류의 1종이다. THB는 Becton, Dickinson and Company 제조의 것을 이용했다. 수크로오스는 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 제조 「CASRN」을 이용했다. 배양에 이용한 플레이트는, Thermo scientific사의 Nunclon Delta Surface 96well이다. 배양기는, Panasonic 멀티 가스 인큐베이터 MCO-5MUV-PJ를 이용했다. 배양은, 37℃, CO2 가스 5%, O2 가스 5%, N2 가스 90%의 분위기 하에서 행했다.
바이오 필름의 잔존을 측정하는 기기 등에 대하여 이하에 설명한다. 염색은, 0.1%의 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 제조의 크리스탈 바이올렛을 0.1%(w/v)가 되도록 증류수에 용해한 것을 이용했다.
촬영에 이용한 현미경은, Life technologies사 제조의 EVOS XL core를 이용했다. 흡광도 측정기는, CORONA ELECTRIC사 SH-1000 Lab을 이용했다. 데이터 처리 소프트웨어는 「SF6」으로 하고, 흡광도 파장은, 590nm로 했다.
(「실험 1: 균 파종과 동시에 첨가」의 수순)
스트렙토코커스·뮤탄스균을 2% 수크로오스 함유 THB로 희석하고, 세포 배양용 플레이트(Thermo scientific사의 Nunclon Delta Surface 96well)에 100μl 파종한 것을 10개 준비했다. 파종과 동시에, 중수소황산(D2SO4)을 물(H2O)로 희석하여, pH=0.8, 1.2, 1.5, 2.3, 2.7, 3.0, 3.3, 3.7, 4.0으로 조제한 시험액 100ml를 첨가했다. 또한, 파종한 10개 중 1개에 대해서는, 시험액은 첨가하지 않았다.
그 후, 멀티 가스 인큐베이터에서 24시간 배양하여 플레이트 저면에 바이오 필름을 형성시켰다. 배양 후, 플레이트를 증류수로 세정하고, 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 10분간 염색했다. 염색 후에는 다시 증류수로 세정하고, 건조시킨 후에 명시야 도립현미경으로 관찰하고 사진을 촬영했다.
그 후, 99.5% 에탄올 100μl(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 제조)로 크리스탈 바이올렛을 추출하고, 흡광도계 그레이팅 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 590nm의 파장에서 흡광도를 측정했다.
(「실험 2: 균 파종 24시간 후(바이오 필름 형성 후)의 배지에 첨가」의 수순)
스트렙토코커스·뮤탄스균을 2% 수크로오스 함유 THB로 희석하고, 세포 배양용 플레이트(Thermo scientific사의 Nunclon Delta Surface 96well)에 100μl 파종한 것을 10개 준비했다. 그 후, 멀티 가스 인큐베이터에서 24시간 배양하여 플레이트 저면에 바이오 필름을 형성시켰다.
중수소황산(D2SO4)을 물(H2O)로 희석하여, pH=0.8, 1.2, 1.5, 2.3, 2.7, 3.0, 3.3, 3.7, 4.0으로 조제한 시험액을, 배양 개시로부터 24시간 후(바이오 필름 형성 후)에, 배지를 제거하지 않고, 배양계에 첨가했다. 추가로 24시간, 멀티 가스 인큐베이터에서 배양했다. 배양 후, 플레이트를 증류수로 세정하고, 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 10분간 염색했다. 염색 후에는 다시 증류수로 세정하고 건조시킨 후에 명시야 도립현미경을 이용하여 관찰하고, 사진을 촬영했다.
그 후, 99.5% 에탄올 100μl(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 제조)로 크리스탈 바이올렛을 추출하고, 흡광도계 그레이팅 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 590nm의 파장에서 흡광도를 측정했다.
(「실험 3: 균 파종 24시간 후(바이오 필름 형성 후)의 배지를 치환」의 수순)
스트렙토코커스·뮤탄스균을 2% 수크로오스 함유 THB로 희석하고, 세포 배양용 플레이트(Thermo scientific사의 Nunclon Delta Surface 96well)에 100μl 파종한 것을 10개 준비했다. 그 후, 멀티 가스 인큐베이터에서 24시간 배양하여 플레이트 저면에 바이오 필름을 형성시켰다.
배양 개시로부터 24시간 후에, 배지를 제거하고, 플레이트를 증류수로 세정했다. 중수소황산(D2SO4)을 물(H2O)로 희석하여, pH=0.5, 0.8, 1.2, 2.0, 2.3, 2.7, 3.0, 3.3, 3.7로 조제한 시험액을, 100ml씩 주입하고, 제거한 배지를 되돌렸다. 추가로 24시간, 멀티 가스 인큐베이터에서 배양했다. 배양 후, 플레이트를 증류수로 세정하고, 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 10분간 염색했다. 염색 후에는 다시 증류수로 세정하고 건조시킨 후에 명시야 도립현미경을 이용하여 관찰하고, 사진을 촬영했다.
도 3의 상단은, 실험 1의 뮤탄스균 파종과 동시에 시험액을 첨가하고, 배양한 것을 염색·세정한 사진이다. 색이 진할수록 보다 많은 바이오 필름이 잔존하고 있는 것을 나타내고 있다. pH=0.8, 1.2, 1.5의 경우에 하얗게 되어 있으며, 바이오 필름 형성이 크게 저해·파괴되어 있는 것을 알 수 있다.
도 3의 중단은, 실험 2의 뮤탄스균 파종 24시간 후(바이오 필름 형성 후)의 배지에 시험액을 첨가하고, 추가로 24시간 배양한 것을 염색·세정한 사진이다. 도 3의 하단은, 실험 3의 뮤탄스균 파종 24시간 후(바이오 필름 형성 후)의 배지를 시험액으로 치환하고, 추가로 24시간 배양한 것을 염색·세정한 사진이다. 이들 사진을 보면, pH값이 작을수록 색이 연해져 있으며, 보다 많은 바이오 필름이 파괴되어 있는 것을 알 수 있다.
도 4는, 상기 실험 1에서 시험한 샘플의 흡광도를 측정한 결과를 나타내고 있다. 횡축이 pH값이고, 종축이 흡광도이며, pH값이 2.3보다 작아지면 급격하게 흡광도가 작아지고, 바이오 필름이 거의 형성되어 있지 않다고 하는 결과였다. 하기 표 2는, 실험 1의 pH와 흡광도의 데이터이다.
Figure pct00002
도 5는, 상기 실험 2에서 시험한 샘플의 흡광도를 측정한 결과를 나타내고 있다. 횡축이 pH값이고, 종축이 흡광도이며, pH값이 3.0보다 작아지면 서서히 흡광도가 작아지고, pH 1.5에서 작아지면 급격하게 작아지고 있다. pH가 작아지면, 바이오 필름이 파괴되고 있는 것을 나타내고 있다. 하기 표 3은, 실험 2의 pH와 흡광도의 데이터이다.
Figure pct00003
도 6은, 상기 실험 3에서 시험한 샘플의 흡광도를 측정한 결과를 나타내고 있다. 횡축이 pH값이고, 종축이 흡광도이며, pH값이 2.3보다 작아지면 서서히 흡광도가 작아지고, pH가 0.5까지 현저한 감소 경향이 계속되고 있다. pH가 2.0보다 작아지면, 바이오 필름이 파괴되고 있는 것을 명확하게 나타내고 있다. 하기 표 4는, 실험 3의 pH와 흡광도의 데이터이다.
Figure pct00004
뮤탄스균은, 당을 영양원으로 하여 산을 산생하는 점에서, 균이 밀집된 국소에서 pH 저하에 견딜 수 있도록 내산성의 성질이 이 시스템에 의해 활성화된다. 실험 1~3에 제공한 뮤탄스균은, 산성에 대해 저항력을 갖고 있다. 이와 같은 시스템을 갖고 있지 않은 바이오 필름을 산출하는 균이 산출하는 바이오 필름에 대해서는, 당연히 효과를 갖는다.
뮤탄스균은, 쿼럼 센싱 시스템을 갖고 있으며, 특히 가혹한 환경에서도 견딜 수 있는 내성을 갖고 있다. 쿼럼 센싱 시스템이란, 균의 수가 일정 수를 초과했을 때에, 그 밀도를 감지하여, 시그널 전달이 일어나고, 균의 서식에 유리한 활성이 일어나는 시스템이다.
뮤탄스균은, 당을 영양원으로 하여 산을 산생하는 점에서, 균이 밀집된 국소에서 pH 저하에 견딜 수 있도록 내산성의 성질이 이 시스템으로 활성화된다. 또, 균의 증식에 제동이 걸리도록 살균 물질인 박테리오신을 산생하여, 균량의 조절을 행한다.
뮤탄스균은, 환경에 적응하기 위하여 유전자의 도입이 활성화되어, 가혹한 환경에서도 서식할 수 있는 성질을 가지도록 변이하기 쉽게 한다.
이와 같이, 뮤탄스균에서는, 저pH 환경에 있어도, 이와 같은 시스템을 갖고 있기 때문에 사멸시키는 것이 곤란해져, pH가 0.5 이상 2.0 이하라고 하는 낮은 pH가 필요하다.
한편, 뮤탄스균의 이와 같은 내산성을 갖지 않는 균이며, 바이오 필름을 형성하는 균도 존재한다. 예를 들면, 구강 내에 상존(常存)하는 Fn균(Fusobacterium nucleatum(푸소박테리움·뉴클레아툼))이다. 이 균은, 악취(구취)의 원인이 되는 부티르산을 만들어 내는 균으로, 치주병의 원인균으로 여겨지며, 또한 최근, 대장에 있어서도 발견되어, 대장암의 원인균으로 여겨지고 있는 균이다.
이 균은, 뮤탄스균과 같은 쿼럼 센싱 시스템을 갖지 않기 때문에, 항산성은 뮤탄스균보다 낮아, pH가 뮤탄스균과 비교하여 높은 pH를 갖는 바이오 필름 파괴액으로도 바이오 필름을 파괴할 수 있다.
도 7은, 실제로 Fn 균주를 이용한 실험 결과를 나타내고 있다. 배지는, THB(TODD-HEWITT BROTH)에 2%(w/v) 수크로오스를 첨가한 것을 이용했다. 수크로오스는, 단당인 글루코오스(포도당)와 프룩토오스(과당)가 α-1,2-글리코시드 결합한 당이며, 이당류의 1종이다. THB는 Becton, Dickinson and Company 제조의 것을 이용했다. 수크로오스는 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 제조 「CASRN」을 이용했다. 배양에 이용한 플레이트는, Thermo scientific사의 Nunclon Delta Surface 96well이다. 배양기는, Panasonic 멀티 가스 인큐베이터 MCO-5MUV-PJ를 이용했다. 배양은, 37℃, CO2 가스 5%, O2 가스 5%, N2 가스 90%의 분위기 하에서 행했다.
(「실험 4: 균 파종과 동시에 첨가」의 수순)
Fn균을 2% 수크로오스 함유 THB로 희석하고, 세포 배양용 플레이트(Thermo scientific사의 Nunclon Delta Surface 96well)에 100μl 파종한 것을 10개 준비했다. 파종과 동시에, 중수소황산(D2SO4)을 물(H2O)로 희석하여, pH=0.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0으로 조제한 시험액 100ml를 첨가했다. 또한, 파종한 7개 중 1개에 대해서는, 시험액은 첨가하지 않았다.
그 후, 멀티 가스 인큐베이터에서 24시간 배양하여 플레이트 저면에 바이오 필름을 형성시켰다. 배양 후, 플레이트를 증류수로 세정하고, 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액으로 10분간 염색했다. 염색 후에는 다시 증류수로 세정하고, 건조시켰다.
그 후, 99.5% 에탄올 100μl(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 제조)로 크리스탈 바이올렛을 추출하고, 흡광도계 그레이팅 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 590nm의 파장에서 흡광도를 측정했다.
도 7은, 상기 실험 4에서 시험한 샘플의 흡광도를 측정한 결과를 나타내고 있다. 횡축이 pH값이고, 종축이 흡광도이며, pH값이 4.5보다 작아지면, pH가 6.0인 것과 비교하여 흡광도가 작아지고, 바이오 필름이 형성되기 어려워진다고 하는 결과였다. 하기 표 5는, 실험 4의 pH와 흡광도의 데이터이다.
Figure pct00005
실험 1~실험 4의 결과로부터 알 수 있듯이, 뮤탄스균과 같은 항산성이 강한 균에 대해서는, pH를 0.5~2.0으로 조정한 바이오 필름 파괴액이 바람직하고, Fn균과 같은 항산성이 높지 않은 균에 대해서는, pH를 4.0 이하로 조제한 것이어도 효과가 있으므로, 대상이 되는 균의 종류에 따라 pH를 조정하면 된다.
실험 1~실험 4에서는, 물과 중수소황산의 2성분에 의해 구성된 바이오 필름을 파괴하는 용액이 이용되고 있으나, 다른 성분, 예를 들면 계면 활성제, 증점제, 색소제 등의 부성분을 첨가한 것에 있어서도, 주성분이 물과 중수소황산이며, pH가 0.5~4.0인 한 바이오 필름을 파괴할 수 있다.
본 발명의 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액은, 바이오 필름을 강력하게 파괴하는 기능을 갖는 점에서, 환경에 발생하는 바이오 필름뿐만 아니라, 치과 분야나 의과 분야의 치료에 제공할 수 있다. 또, 의료 분야에 사용하는 의료 기기에 형성된 바이오 필름을 파괴하여, 보다 정밀한 세정에 제공할 수 있다.

Claims (3)

  1. 물(H2O)과 중수소황산(D2SO4)으로 이루어지며, pH가 0.5 이상 4.0 이하인, 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액.
  2. 물(H2O)을 이용하여 중수소황산(D2SO4)을 희석하여, 물(H2O)과 중수소황산(D2SO4)으로 이루어지며, pH가 0.5 이상 4.0 이하인, 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액을 제조하는 방법.
  3. 청구항 1에 기재된 바이오 필름을 파괴하기 위한 용액을 이용하여, 바이오 필름을 산생하는 균의 종류에 따라, pH를 조정하여 바이오 필름을 파괴하는 방법.
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