JP6052532B2 - 早期変形性関節症の治療 - Google Patents
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Description
本出願はEFS−Webを経由して提出された配列表を含み、その配列表は参照によりその全体が本明細書に援用される。2009年12月15日に作成された前記ASCIIコピーは383295WO.txtと名付けられ、大きさは4,219バイトである。
本開示における用語「副甲状腺ホルモン(PTH)」および「PTH」は、副甲状腺ホルモン、特にヒト副甲状腺ホルモン、およびその誘導体を指す。本開示の方法において使用される副甲状腺ホルモンは、天然型のPTH、遺伝子工学技術によって製造されたPTH、または化学的に合成されたPTHなど様々な形態で生じ得る。PTH誘導体の例としては、上に定義したようにPTHの部分ペプチド、その他のアミノ酸によって部分的に置き換え可能なPTHまたはその部分ペプチドの構成アミノ酸、部分的に欠損し得るPTHまたはその部分ペプチドの構成アミノ酸、およびPTHまたはその部分ペプチドに加えられる1以上のアミノ酸を有するペプチドが挙げられる。ここで留意すべきは、PTH誘導体としてのペプチドはPTHそれ自体と同様の活性を有し得ることである。PTHの部分ペプチドの例としては、ヒトPTH(1−34)、ヒトPTH(1−64)、ヒトPTH(35−84)およびウシPTH(1−34)が挙げられる。PTH(1−34)は、PTHのN末端から数えて34個のアミノ酸で構成されるPTHの部分ペプチドを指す。本明細書に開示された方法におけるある実施形態では、投与される薬剤はPTH(1−34)(すなわちヒトPTH(1−34))である。したがって、本明細書において使用される用語「副甲状腺ホルモン(PTH)」および「PTH由来の物質」は、限定されるものではないが、ヒトPTH塩、ヒトPTH(1−34)、テリパラチドヒトPTH類似体、84−アミノ酸ヒト副甲状腺ホルモンの34N末端アミノ酸(生物学的活性領域)配列と同様にペプチド配列機能を有する近縁のペプチドおよび薬剤を含む。したがって、用語「副甲状腺ホルモン(PTH)」、「PTH」および「PTH由来の物質」は、限定されるものではないが、組み換えヒトPTH(1−34)、合成ヒトPTH(1−34)、PTH(1−34)、ヒトPTH(1−34)塩、テリパラチド、ヒトPTH(1−34)アミドなどのヒトPTH(1−34)の単純誘導体、ヒトPTH(1−33)またはヒトPTH(1−31)アミドなどの近縁分子、および近縁骨形成ペプチドを含む。適切なヒトPTH塩の例としては、限定されるものではないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アンゲリカ酸塩、臭化物、酪酸塩、塩化物、クエン酸塩、シトラコン酸塩、シトラマル酸(citramalate)、クロトン酸塩、プロピオン酸塩、吉草酸塩、ヘキサン酸塩、ヘプタン酸塩、レブリン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、3−ヒドロキシイソ酪酸塩、トリカルバリル酸塩(tricarballylicate)、マロン酸塩、グルタル酸塩、イタコン酸塩、メサコン酸塩、ジメチロールプロピオン酸塩、チグリン酸塩(tiglicate)、グリセリン酸塩、メタクリル酸塩、イソクロトン酸塩、β−ヒドロキシ酪酸塩、ヒドロアクリル酸塩(hydracrylate)、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、2−ヒドロキシイソ酪酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、ピルビン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、硝酸塩、リン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、硫酸塩およびスルホン酸塩が挙げられる。また、記載された用語「副甲状腺ホルモン(PTH)」および「PTH由来の物質」は、酸、遊離塩基、荷電もしくは非荷電分子、分子錯体の成分、または非刺激性の薬理学的に受容可能な塩など様々な形態を包含し得る。
早期変形性関節症の症状は、痛み、こわばり、制限された関節運動、腫れ、および骨の肥大を含み得る。これらの症状は、身体における腰、膝、手、またはその他の関節など、苦しんでいる動物の様々な部分においてそれらが現れる。さらに、これらの症状は、曲げ、膝立ち、階段を上ること、走ること、漕ぐこと、およびその他の激しいまたは拡張した身体運動などのある活動の最中に現れ、関節の痛みおよびこわばりは、関節を使用している間もしくはその後、非活動期間の後、またはそれらの組み合わせにおいて現れ得る。さらに、例えば気圧の変化に関連した、天気が変化する前または最中の関節の不快症状などのように、症状は天気に関連しているかまたは天気によって悪化し得る。
注射のための処方設計には、溶剤または分散媒であるキャリアが含まれていてもよい。適切なキャリアは、水、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(登録商標)(BASF社、ニュージャージー州パーシッパニー所在)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、グリコール、プロピレングリコール等)、およびそれらの混合物を含む。これらの組成物は注射可能であるように無菌かつ液体でなければならない。流動性はレシチンまたは界面活性剤などのコーティング剤で維持可能である。微生物汚染は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどの抗菌剤および抗真菌薬を包含することによって阻止可能である。マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの糖類および多価アルコールは、組成物中で等張性を維持するために使用可能である。
ヒト関節軟骨細胞培養
正常ヒト関節軟骨の試料は、交通事故によって亡くなった23歳のアジア人男性の膝関節から採取した。他の関節軟骨の試料は、関節形成術を受けた変形性関節症の64歳の女性のドナーから採取した膝関節の正常な部分から採取した。軟骨の試料は細かく刻み、続いてヒアルロニダーゼ(0.5mg/ml)、プロナーゼ(1mg/ml)、およびコラゲナーゼ(1mg/ml)中で消化した。その後、単離された軟骨細胞を、アルギン酸ビーズ内に封入した。15個のビーズを6ウェルプレートのそれぞれのウェル内で、5mlの培養培地で培養した。培養培地は、100mg/mlのアスコルビン酸、非必須アミノ酸、ペニシリン/ストレプトマイシン、1%インスリン−トランスフェリン−セレン、および10%ウシ胎仔血清(FBS)を含むダルベッコ変法イーグル培地から構成されていた。ビーズをそれぞれの実験の前に、7日間5%CO2加湿インキュベータ内で37℃で培養し、培養培地を3日ごとに交換した。
軟骨細胞培養を4つのグループに分割した。azaCプラスPTH群には最初にazaC誘導を行い、その後PTHで処理した。azaC群にはazaC誘導を行ったが、続けてPTHでは処理しなかった。PTH群ではPTHを受理するが、azaC誘導は行わなかった。コントロール群にはazaC誘導を行わず、かつPTH処理でも処理しなかった。azaC誘導を軟骨細胞における最終分化を誘導するために使用した(例えば、Cell Biol Int(2006) 30(3):288−94を参照のこと)。つまり、培養は48時間15μg/mlの5−アザシチジン(Sigma社、ミズーリ州セントルイス所在)で処理した。azaC誘導後のPTH処理は、10nMのPTH(1−34)を含む培地における軟骨細胞の培養を含むものであった。全ての群の細胞を、PTH(1−34)処理から3、7および10日目で採取した。ビーズをpH7.4の0.05Mのクエン酸二ナトリウムおよび0.03MのEDTAを含む0.9%のNaCl溶液中で溶解したときに、軟骨細胞がアルギン酸ビーズから放出された。細胞を1,500rpmで5分間低速遠心分離して収集した。
軟骨細胞からの全RNAをRNeasy Mini Kit(Qiagen社、カリフォルニア州バレンシア所在)を使用して単離した。ファースト−ストランド相補的DNA(cDNA)を、Advantage RT−for−PCR Kit(Clontech社、カリフォルニア州パロアルト所在)を使用して1μgのRNAから変換した。SOX9、アグリカン、II型α1コラーゲン(Col2a1)、X型α1コラーゲン(Col10a1)、ALP、IHH、Bcl−2、およびBaxのメッセンジャーRNA(mRNA)のレベルを、iQ SYBR Green Supermix(Bio−Rad社、カリフォルニア州ハーキュリーズ所在)を用いて、Bio−Rad iQ5リアルタイムPCR解析システム(Bio−Rad社、カリフォルニア州ハーキュリーズ所在)により、定量リアルタイムPCRを使用して測定した。反応は、cDNA、それぞれの遺伝子に対する特定のプライマー、およびiQ SYBR Green Supermixを含む25μlの混合物中で行った。
アルギン酸ビーズを上述したように溶解し、さらに60℃で18時間パパイン(300μg/ml)で消化した。試料中のDNAおよび硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)のレベルを、hoechst 33258染料および1,9−ジメチルメチレンブルー染料をそれぞれ用いて定量した。DMMB試験のための検量線を、0から25μg/μlの範囲の濃度の水性コンドロイチン硫酸C溶液(Sigma−Aldrich社、ミズーリ州セントルイス所在)を用いて作成した。
私達は、In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red(Roche社、独国マンハイム所在)を使用して、TUNEL(terminal deoxy−nucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling)染色法を用いてアポトーシス細胞を測定した。製造ガイドラインに従って、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で4%のパラホルムアルデヒドを用いて1×106/mlの細胞密度にて固定し、室温で10分間インキュベートした。その後、サイトスピン(Cytospin 3;Shandon社、英国チェシャー州所在)を使用して、5分間2,000rpmの速度の遠心分離によって細胞をスライド上に定着させた。スライドをPBSで二回洗浄し、細胞を氷上で2分間、透過溶液(permeabilizationt solution)(0.1%クエン酸ナトリウム中で0.1%トリトンX−100)中でインキュベートすることによって透過化した。末端デオキシヌクレオチド転移酵素およびローダミン(標識染料)を含むTUNEL反応混合物をスライドに添加し、暗所加湿室内にて60分間37℃でインキュベートした。反応はブロッキング緩衝液(PBS中で0.1%トリトンX−100/0.5%ウシ血清アルブミン)で停止した。細胞を4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)で対比染色した。スライドをローダミンの580nmおよびDAPIの365nmの励起波長を用いて蛍光顕微鏡下で観察した。細胞核はDAPIで青色に染色され、アポトーシス細胞のみがローダミンによって赤色に染色された。染色された細胞をそれぞれのスライド上の5顕微鏡視野(1.566mm2/フィールド)において数えた。データをイメージ−プロプラス(Image−Pro Plus)解析ソフトウェア(Media Cybernetics社、メリーランド州シルバースプリング所在)を使用して解析した。軟骨細胞におけるアポトーシスの割合を、赤色染色細胞(アポトーシス細胞)の青色染色細胞(全細胞)に対する比率として定義した。
54匹の12週の雄Sprague−Dawleyラット(250−300gm)をBioLASCO Taiwan社から購入し、餌および水を絶えず与えて(ad libitum)標準の実験室条件(温度24℃、12時間の明暗サイクル)下で飼育した。動物は実験前に1週間実験室環境に慣れさせた。
ラットを以下の3つの群に分割した:OA(PTH[1−34]処理無しのOA誘導)(n=18)、OAプラスPTH(OA誘導に続いてPTH[1−34]処理)(n=18)、およびPTH(OA誘導無しのPTH[1−34]処理)(n=18)。対側コントロール膝としての役割を果たすそれぞれの左膝にPTH処理もOA誘導も行わずに賦形剤を注射した。右膝は調査用関節である。20μlの4%パパイン溶液および20μlの0.03Mシステインを関節内に注射して、OAおよびOAプラスPTH群のラットの右膝にOAを誘導した。注射は実験の1、4および7日目に、膝蓋腱を介して26ゲージ針を用いて行った(Nucl Med Commun(1996)17(6):529−35を参照のこと)。OAプラスPTH群では、OA誘導の後、ラットは殺されるまで3日ごとに40μlの10nMPTH(1−34)を右膝の関節内に注射された。PTH群では、同じPTH(1−34)処理を行ったが、OA誘導は行わなかった。それぞれの群の6匹のラットはOAプラスPTH群のラットと同時期にCO2吸入によって殺され、PTH(1−34)処理は1、3および5週間行われた。
ラットを殺した後に、膝を採取し、関節軟骨と共に脛骨プラトーを集めて、組織学的準備の前に10%の中性緩衝ホルマリンで固定した。その後、試料を10%のギ酸/PBS中で脱灰した。脱灰した脛骨関節(tibia articular)試料をパラフィンで包埋し、冠状面(coronary plane)における5−μmの検鏡試片を作成した。GAGをサフラニンO−ファストグリーン(1%のサフラニンO、対比染色は0.75%のヘマトキシリン、その後1%のファストグリーン)(Sigma社、ミズーリ州セントルイス所在)で染色した。局所II型コラーゲンおよびX型コラーゲンを免疫染色した。軟骨内のアポトーシス細胞はTUNEL染色した。
GAGはサフラニンOで赤色に染色され、それぞれの脛骨近位端における関節軟骨の全体および赤色染色領域を、イメージ−プロプラスソフトウェア、バージョン5.0を用いて測定した。それぞれの群における赤色染色領域の全体領域に対する比率(赤色:全体)を算出した。
脛骨関節の切片を水で戻し、組織内の内因性ペルオキシダーゼを3%の過酸化水素でブロックした。一次抗体と共にインキュベートする前に、エピトープを回復させるために酵素によって試料を消化した(例えば、J Histochem Cytochem(2002)50(8):1049−58を参照のこと)。II型コラーゲンの免疫染色のための酵素消化に対する最適な条件は、PBS(pH7.4;Sigma社)中で2.5%のヒアルロニダーゼおよび1mg/mlのプロナーゼの混合物を37℃で1時間であった。X型コラーゲンの免疫染色のための最適な条件は、0.1units/mlのコンドロイチナーゼABC(シグマ社)を1時間、およびトリス塩酸(pH3.0)中で1mg/mlのペプシンを37℃で15分であった。その後、切片は1時間ウシ胎仔血清(FBS)でブロックし、II型コラーゲンに対する一次抗体(マウスモノクローナル抗体;Chemicon社、カリフォルニア州テメキュラ所在)およびX型コラーゲンに対する一次抗体(ラットポリクローナル抗体)(1:200;Cosmo Bio社、日本、東京)または(マウスモノクローナル抗体)(1:100)(Sigma社)を37℃で4時間または室温で1時間インキュベートした。二次抗体を、II型コラーゲンに対するビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリン(Dako社、カリフォルニア州カーピンテリア所在)、およびX型コラーゲンに対するビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン(Biocare Medical社、カリフォルニア州ウォールナットクリーク所在)、および西洋ワサビペルオキシダーゼ−複合化ストレプトアビジン(horseradish peroxidase−conjugated streptavidin)(Dako社、カリフォルニア州カーピンテリア所在またはBiocare Medical社)を用いて、30分間インキュベートした。0.01%の過酸化水素を含む3,3’−ジアミノベンジジン溶液を用いた染色により褐色となった。最後に、切片をヘマトキシリンで対比染色し、顕微鏡で観察した。免疫染色の相対密度(密度/領域;mean±SEM領域25.44±2.77mm2)を、イメージ−プロプラスソフトウェア、バージョン5.0(Media Cybernetics社)を使用して測定した。
それぞれの切片におけるアポトーシス細胞を、In Situ Cell Death Detection Kit, TMR redを使用したTUNEL染色によって測定した。切片を水で戻し、プロテイナーゼK(トリス塩酸[pH7.4]中で10μg/ml)と共に20分間インキュベートした。透過化の後、切片をペプシン(HCl[pH2.0]中で0.25%)と共に37℃で30分間インキュベートした。以下の方法は上述した軟骨細胞培養に対するものと同様である。また、切片はDAPIおよびヘマトキシリンおよびエオシンで染色して細胞の局在化を確認した。DAPI−染色細胞(mean±SEM 150±40)を脛骨プラトーにおける軟骨の中心領域で数えた。アポトーシスの割合は軟骨細胞培養において使用したものと同様の方法を用いて定義した。
データはインビトロ研究の4試料およびインビボ研究の6試料からのmean and SEMとして示す。全ての実験を少なくとも3回繰り返した。統計的有意性を一元配置分散分析により評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施した。0.05未満のP値が有意であると判断した。
正常な関節軟骨細胞は、関節軟骨の適切な機能のために必要とされる、II型コラーゲン、GAGおよびアグリカンを発現する。OAをもたらす最終分化を経るとき、軟骨細胞はアルカリホスファターゼ(ALP)、インディアンヘッジホッグ(IHH)、およびX型コラーゲンを含むマーカーを発現し、それと同時に、II型コラーゲンおよびアグリカンの発現は減少し得る。この変性過程は軟骨細胞の石灰化そして最終的には細胞死をもたらし得る。
Bcl−2およびBaxは、アポトーシスを制御する細胞質タンパク質のファミリーメンバーである。2つのタンパク質は非常によく似たアミノ酸配列を有するが、機能的には正反対である:Bcl−2はアポトーシスを抑制する一方、Baxはこの効果に対抗する(Hunter、J Biol Chem.(1996)271(15):8521−4)。
図4は、正常および変形性関節症(OA)のラットの関節軟骨における、副甲状腺ホルモンのグリコサミノグリカン(GAG)レベルに対する効果を示す。OA群におけるラットの対側コントロール関節、並びにOA、OAプラスPTH、およびPTH群のラットの調査用関節からの脛骨近位端におけるサフラニンOで染色された関節軟骨を、サフラニンO染色領域の全体領域に対する比率のため測定した。サフラニンO染色領域の全体領域に対する比率(赤色/全体)を、PTH処理後1、3および5週間の全群間で比較した。バーは6試料のmean and SEMを示す。データを一元配置分散分析によって評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施した。それぞれの時点でのOA群における調査用関節と比べて**=P<0.01;##=P<0.01。
OA群におけるラットの対側コントロール関節と同様に、OAおよびOAプラスPTH群におけるラットの調査用関節からのTUNEL染色された関節軟骨の代表的な顕微鏡写真を前述した方法に従って作成した。
図7は、処理後5週間の正常および変形性関節症(OA)のラットの関節軟骨における、副甲状腺ホルモンのグリコサミノグリカン(GAG)レベルに対する効果を示す。方法は、PTH(1−34)の投与量の濃度が5nM、10nM、または100nMであることを除いて、「動物実験」および「変形性関節症誘導およびPTH処理」と題する節において上述した通りである。OA群におけるラットの対側コントロール関節、ならびにOAおよびOAプラスPTH群におけるラットの調査用関節からの脛骨近位端におけるサフラニンOで染色された関節軟骨を、サフラニンO染色領域の全体領域に対する比率のため測定する。サフラニンO染色領域の全体領域に対する比率(赤色/全体)を、PTH処理後5週間の全群間で比較する。バーは6試料のmean and SEMを示す。データを一元配置分散分析によって評価し、多重比較をシェフェの方法を用いて実施する。**=P<0.01:それぞれの時点でのOA群におけるコントロール関節対調査用関節;##=P<0.01:OA関節対OAプラスPTH5nM、OAプラスPTH10nM、およびOAプラスPTH100nM群における調査用関節。
Claims (9)
- PTH(1−34)を有効成分として含み、前記PTH(1−34)の投与量が0.1pmoleから5000pmoleの範囲内である、ヒトの早期変形性関節症の治療を目的とした関節腔に投与するための医薬組成物。
- 前記医薬組成物において、前記PTH(1−34)が1nMから500nMの濃度で存在し、0.1mLから10mLの溶液を送達することにより提供される請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物において、前記PTH(1−34)が5nMから100nMの濃度で存在し、1mLから3mLの溶液を送達することにより提供される請求項1に記載の医薬組成物。
- PTH(1−34)を有効成分として含み、前記PTH(1−34)の投与量が0.1pmoleから5000pmoleの範囲内である、早期OAを患うヒトの罹患関節の関節軟骨細胞のアポトーシスの抑制を目的とした関節腔に投与するための医薬組成物。
- 前記医薬組成物において、前記PTH(1−34)が1nMから500nMの濃度で存在し、0.1mLから10mLの溶液を送達することにより提供される請求項4に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物において、前記PTH(1−34)が5nMから100nMの濃度で存在し、1mLから3mLの溶液を送達することにより提供される請求項4に記載の医薬組成物。
- PTH(1−34)を有効成分として含み、前記PTH(1−34)の投与量が0.1pmoleから5000pmoleの範囲内である、早期OAを患うヒトの罹患関節の関節軟骨細胞の変性過程を抑制することを目的とした関節腔に投与するための医薬組成物。
- 前記医薬組成物において、前記PTH(1−34)が1nMから500nMの濃度で存在し、0.1mLから10mLの溶液を送達することにより提供される請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記医薬組成物において、前記PTH(1−34)が5nMから100nMの濃度で存在し、1mLから3mLの溶液を送達することにより提供される請求項7に記載の医薬組成物。
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