JP3901761B2 - 変形性関節症および炎症性関節疾患治療剤 - Google Patents
変形性関節症および炎症性関節疾患治療剤 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変形性関節症などの関節軟骨組織の破壊および変性を伴った疾患に対して予防、あるいは治療効果を発揮する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
変形性関節症とは関節軟骨表面の崩壊と、これに伴う関節辺縁の新たな軟骨の増殖、関節の変形、適合性の破綻をきたし、さらに関節滑膜の炎症へと波及していくものである。これには外傷や感染などの軟骨変性をきたす原疾患を有する二次性関節症と、原疾患を特定できない一次性関節症がある。変形性関節症は関節軟骨の変性を主病変とし、その主な原因としては、関節軟骨の内因的変性と関節にかかる力学的負荷が考えられるが、その発生機序には不明な点が多い。変形性関節症には主に二つの病態が存在する。一つは軟骨下骨の石灰化亢進による関節裂隙の狭小化および骨組織の破壊をみるもの（Ｂｏｌｌｅｔ Ａ．Ｊ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１２，１５２−１６３，１９６９）、もう一つは滑膜性の炎症により軟骨組織の破壊あるいは変性を引き起こす場合（Ｈｕｓｋｉｓｓｏｎ Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．３８，４２３−４２８，１９７９，Ｃａｍｐｉｏｎ Ｇ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ １７，２３２−２４５，１９８８）である。
【０００３】
炎症性の変形性関節症では、滑膜組織などから産生されたＩＬ−１などの物質による軟骨組織の基質成分（プロテオグリカン）の減少が観察される（Ｔｙｌｅｒ Ｊ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２５，４９３−５０７，１９８５）ばかりではなく、軟骨細胞によるプロテオグリカン産生も抑制される（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３８，５７１−５８０，１９８６）。従って、軟骨基質が減少して（Ｐｅｔｔｉｐｈｅｒ Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８７４９−８７５３，１９８６）、関節軟骨層が次第に遺失するものと考えられる。
【０００４】
関節組織中の軟骨は永久軟骨に分類され、骨格成長に重要な役割を果たす成長軟骨とは厳密に区別される。すなわち、骨端板などに存在する成長軟骨細胞は増殖、分化した後石灰化し骨と置き換わることでその生理的意義が完遂するのに対し、関節軟骨細胞では通常、石灰化は起こらない。これは、関節軟骨細胞では環境的に石灰化は強く抑制されているものと考えられ、関節軟骨は石灰化しないことで弾性を保持し、荷重に対するクッションの役割と関節部での易可動性を保証しているからである。しかし、変形性関節症では、関節軟骨表面の弾性が低下していることが知られている（Ｍｙｅｒｓ Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．ＵＳＡ ２３１，１９８６）。これは軟骨組織におけるコラーゲン繊維の断裂化によるものとされている（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎａｔ．１３６，４２５−４３９，１９８２）。関節軟骨における石灰化抑制の機序は明かではないが、関節軟骨細胞を単離し培養すると石灰化が起こるようになる。おそらく関節軟骨の石灰化を強く抑制しているものは軟骨細胞を取り巻いている基質中にある可能性が高い。（Ｉｗａｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，４６１−４６７，１９９１、Ｐａｃｉｆｉｃｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９２，２６６−２７０，１９９１）。
【０００５】
石灰化する軟骨細胞と関節軟骨細胞の相違点は他にもみられる。石灰化する軟骨は高いアルカリホスファターゼ活性を有する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７，２８６−２９３，１９２３，Ａｌｉ Ｓ．Ｙ．，ｉｎ “Ｃａｒｔｉｌａｇｅ”（Ｂ．Ｋ．Ｈａｌｌ，ｅｄ） Ｖｏｌ．１，ｐｐ．３４３−３７８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のに対し、関節軟骨組織ではその１／１００の活性を示すにすぎない（Ｉｗａｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，４６１−４６７，１９９１）。また、軟骨基質に含まれるＸ型のコラーゲンは石灰化軟骨組織中に存在している（Ｃａｐａｓｓｏ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１４２，１９７−２０６，１９８２）が、関節軟骨にはその発現が少ない。これらのマーカーは軟骨細胞の石灰化と関連していることが示唆されている。（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，９５５２−９５５６，１９８８，Ｋｗａｎ Ａ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９，１８４９−１８５６，１９８９）。一方、変形性関節症において、関節軟骨細胞のアルカリホスファターゼ活性は正常関節軟骨細胞に比較して高く（Ｍｏｋｏｎｄｊｉｍｏｂｅ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，３９，７５９−７６２，１９９１）、ヒトの関節軟骨組織を用いた研究でもその活性は変形性関節症の組織が高い活性を示した（Ｅｉｎｈｏｒｎ Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．３，１６０−１６９，１９８５）。同様に、Ｘ型コラーゲンの発現も変形性関節症の患者から得られた軟骨組織で高いことが示されている（Ｈｏｙｌａｎｄ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．１５，１５１−１６４，１９９１）。以上の知見より、変形性関節症における軟骨組織、あるいは軟骨下骨の石灰化は関節軟骨細胞の形質の変化、すなわちアルカリホスファターゼ産生およびＸ型コラーゲンの発現によるものと推定される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在、変形性関節症の治療では、保存的な療法、抗炎症剤やヒアルロン酸の投与、あるいは外科的な処置など、対症療法的あるいは消極的な治療法のみが行われており、原因療法と言えるような治療法はまだない。
【０００７】
本発明は、変形性関節症など関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患の予防剤および原因療法的かつ積極的な治療剤を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明はＰＴＨ関連ぺプチド（ＰＴＨｒＰ）またはＰＴＨｒＰ由来物質を有効成分として含有する、関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患の予防または治療剤に関するものである。
【０００９】
本発明における副甲状腺ホルモン関連ぺプチド（ＰＴＨｒＰ）とは、天然型のＰＴＨｒＰ、遺伝子工学的手法で作成されたＰＴＨｒＰ、化学的に合成されたＰＴＨｒＰを包含し、たとえば１４１個のアミノ酸より成るヒトＰＴＨｒｐやウシ、ブタなどのＰＴＨｒｐなどがあげられ、好ましくはヒトＰＴＨｒＰを示す。またＰＴＨｒＰ由来物質とは、前記のＰＴＨｒＰの部分ペプチドや、ＰＴＨｒＰそのものあるいはその部分ペプチドの構成アミノ酸の一部を置換、削除、付加したペプチドで同様の活性を有するペプチドを意味する。ＰＴＨｒＰの部分ペプチドとしては、たとえば１−３４ＰＴＨｒＰ、１−８４ＰＴＨｒＰ、３−１４１ＰＴＨｒｐ、７−１４１ＰＴＨｒｐ、３５−１４１ＰＴＨｒｐ、８５−１４１ＰＴＨｒｐ、１０７−１４１ＰＴＨｒｐ、１０７−１４０ＰＴＨｒｐ、１−８７ＰＴＨｒｐ、３−８７ＰＴＨｒｐ、７−８７ＰＴＨｒｐ、１−１１１ＰＴＨｒｐ、３−１１１ＰＴＨｒｐ、７−１１１ＰＴＨｒｐなどがあげられ、好ましくはヒト１−３４ＰＴＨｒＰ、ヒト１−８４ＰＴＨｒＰなどがあげられる。ここで１−３４ＰＴＨｒＰとはＰＴＨｒＰのＮ末端から３４番めのアミノ酸までの３４個のアミノ酸からなるＰＴＨｒＰの部分ペプチドを示す。置換、削除、付加するアミノ酸残基の数は、本発明の活性を保持していれば特に制限はない。関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患とは、例えば変形性関節症や関節リウマチなどがあげられ、好ましくは変形性関節症があげられる。
【００１０】
前述したように、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼは軟骨、あるいは軟骨下骨の石灰化において重要な発現物質であることが知られており、このＸ型コラーゲンの発現やアルカリホスファターゼの産生を抑制することは、変形性関節症の改善に有効である。さらに変形性関節症においては関節軟骨細胞の基質合成機能の低下、基質分解による軟骨組織の変形が認められることから、変形性関節症の治療剤としては軟骨基質であるプロテオグリカンの合成を阻害することなくむしろ合成を促進する薬剤が好ましい。また、軟骨細胞の増殖を阻害するなど、軟骨細胞の増殖・分化に好ましくない作用を有さない薬剤が好ましいのは言うまでもない。
【００１１】
本発明におけるＰＴＨｒＰの関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患に対する有効性は次のようにして確認できる。
【００１２】
すなわち、ＰＴＨｒＰの増殖に対する作用、軟骨組織変性の重要なマーカーであるＸ型コラーゲンの発現、アルカリホスファターゼ産生、それに引き続く石灰化に対する作用、および軟骨基質であるII型コラーゲンの発現に対する作用は、若齢ウサギの増殖軟骨細胞を遠心管内で培養する実験（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，９５５２−９５５６，１９８８，Ｉｗａｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．１３６，５００−５０６，１９８９）、および増殖軟骨細胞の平面培養系（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９，１７９−１８７，１９７５）により確認できる。特に、遠心管内で軟骨細胞を立体的に培養すると、軟骨細胞は増殖・分化し、おおよそ２０日で石灰化する（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ８５，９５５２−９５５６，１９８８）。しかも、同様な培養系で関節軟骨細胞を培養すると、高いアルカリホスファターゼ活性の発現と共に石灰化を行うようになる（Ｐａｃｉｆｉｃｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９２，２６６−２７０，１９９１）。このことは、これらの培養系が変形性関節症における関節軟骨細胞の異常な形質発現に対する薬剤の効果の検討に有用な実験系であることを示している。
【００１３】
またＰＴＨｒＰの軟骨細胞の基質に対する作用は、軟骨基質であるプロテオグリカンの合成を指標にして確認できる。この実験系としては、培養軟骨細胞の基質合成時にＰＴＨｒＰを作用させ、35Ｓ−硫酸の基質への取り込みを指標として確認できる。
【００１４】
以上のＰＴＨｒＰの作用を説明するためには、軟骨細胞中にＰＴＨｒＰの受容体があることが確認される必要がある。実際、ＰＴＨの軟骨細胞に対する作用の発現には、軟骨細胞中にＰＴＨの受容体の存在が重要であることが示されている（Ｌｅｅ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３４，４４１−４５０，１９９４）．
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の薬剤の剤形としてはペプチドの通常の製剤方法により製造される注射剤の他に、例えばマイクロカプセルへの封入あるいはゲル状のシートに含ませるなど局所化および遅効性を期待した剤形も可能である。液剤の場合には、適当な蛋白質を添加したり、あるいは適当な付着防止剤を添加することが好ましい。
【００１６】
本発明の薬剤の投与方法は、たとえば皮下投与、経口投与、経皮投与、直腸内投与、局所投与などがあげられるが、局所投与が好ましい。特に注射による関節腔内あるいは病変部への局所注入が好ましい。
【００１７】
本発明のＰＴＨｒＰの投与量は、適応疾患、症状などにより異なるが、たとえば、組織レベルで１０-20から１０-5Ｍであり、好ましくは１０-15から１０-7Ｍである。
【００１８】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。実施例で用いたＰＴＨｒＰはペプチド研究所より購入したヒト１−３４ＰＴＨｒＰである。
【００１９】
【実施例１】
以下の実施例において増殖軟骨細胞は、生後４週齢のウサギの肋軟骨−骨移行部より下村らの方法（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９，１７９−１８７，１９７５）により分離した。遠心管内での軟骨細胞の培養は岩本らの方法（Ｉｗａｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３６，５００−５０７，１９８９）および加藤らの方法（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７，１１４−１１８，１９９０）により行った。すなわち、分離した軟骨細胞を１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）に８×１０4個／ｍｌとなるよう懸濁し、１ｍｌずつ１５ｍｌのプラスチック製遠心管（コーニング社製）に播種した。５分間遠心（１，５００ｒｐｍ）した後、３７℃に設定した炭酸ガスインキュベータ中で培養した。培地の交換は培養６日め以降、２日毎に行った。軟骨細胞中のＰＴＨｒＰ受容体の確認は、ＳＤＳゲル電気泳動法にて行った。すなわち、培養１４日目の軟骨細胞をホモジナイズした後、125ＩでラベルしたＰＴＨｒＰで５時間インキュベートした。受容体と結合したＰＴＨｒＰはＤＳＳにて架橋した後、ＳＤＳ緩衝液で可溶化してＳＤＳゲル電気泳動法にて泳動した。泳動後、常法によりオートラジオグラフィーを行った。対照として過剰量のＰＴＨｒＰを添加して125Ｉ化ＰＴＨｒＰと受容体との結合を阻害したものを同様の手順でＳＤＳゲル電気泳動法にて泳動し、オートラジオグラフィーを行った。
【００２０】
図１に結果示す。125Ｉ化ＰＴＨｒＰと受容体との結合は、分子量約７６ｋＤａの付近に泳動され（図１・左）、その結合は過剰量のＰＴＨｒＰの添加により完全に阻止された（図１・右）。このことは、軟骨細胞中にＰＴＨｒＰの受容体が存在し、ＰＴＨｒＰはその受容体を介して以下に示す様々な効果を発現できることを示唆している。
【００２１】
【実施例２】
増殖軟骨細胞の分離は実施例１と同様、生後４週齢のウサギの肋軟骨−骨移行部より下村らの方法（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９，１７９−１８７，１９７５）により行った。分離した軟骨細胞は１０％の牛胎児血清および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）に懸濁し、５，０００個づつ９６穴の培養プレートに播種した。細胞がコンフルエントになってからＰＴＨｒＰを添加して１日後に１穴あたり１μＣｉの35Ｓ−硫酸を添加して１７時間培養した。培養液上清中に産生された軟骨基質の量は加藤らの方法（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２２，１９９１−１９９７，１９８８）により行った。すなわち、プロテオグリカン中に取り込まれた35Ｓ−硫酸の量を測定した。
【００２２】
結果を図２に示す。図はＰＴＨｒＰの濃度を１０-10から１０-6Ｍとした濃度反応曲線を示している。ＰＴＨｒＰは用量依存的にプロテオグリカン中への35Ｓ−硫酸の取り込みを促進し、１０-6Ｍでは対照の約３倍の基質合成能を示した。このことは、ＰＴＨｒＰがプロテオグリカンの産生を促進し、軟骨細胞の正常な分化を促進することを示している。
【００２３】
【実施例３】
軟骨細胞の培養は実施例１と同様、遠心管内で行った。培養８日めにＰＴＨｒＰを１０-7添加して２８日間培養した。培養後、適宜細胞を可溶化して経時的なＤＮＡ量を測定した。また、ＰＴＨｒＰを１０-10から１０-7Ｍまで添加して培養２１日目のＤＮＡ量を測定した。
【００２４】
軟骨細胞の経時的なＤＮＡ量の変化を図３に、またＰＴＨｒＰのＤＮＡ量に対する用量反応性を図４に示した。対照群のＤＮＡ量は経時的に増加して軟骨細胞が遠心管内で良好に増殖していたことを表していた。ＰＴＨｒＰを添加しても軟骨細胞のＤＮＡ量には全く影響されなかった。このことは、ＰＴＨｒＰが軟骨細胞の増殖に対してなんら悪影響を与える薬剤ではないことを示している。
【００２５】
【実施例４】
軟骨細胞の培養は実施例１と同様、遠心管内で行った。培養８日めにＰＴＨｒＰを１０-7Ｍになるように添加し、最高２８日めまで培養した。培養２１日目にＰＴＨｒＰを除去した群を設定し、ＰＴＨｒＰ添加群と比較した。また、ＰＴＨｒＰを１０-10から１０-7Ｍまで添加して、アルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ活性）に対する用量反応性を確認した。ＡＬＰ活性の測定は、軟骨塊を０．２％トリトンＸ−１００中にてホモジナイズした後、１２，０００×ｇにて１５分間遠心し、その上清をＢｅｓｓｅｙらの方法（Ｂｅｓｓｅｙ Ｏ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６４，３２１−３２９，１９４６）により測定した。また、石灰化の検討は適当な時期に45Ｃａを０．５μＣｉずつ添加し、軟骨細胞への２４時間後の取り込みを測定すること、および培養２８日目のＣａ量を測定することにより行った。
【００２６】
図５にはＰＴＨｒＰのＡＬＰ活性に対する経時的な作用を、図６にはＰＴＨｒＰを添加して２１日目のＡＬＰ活性に対するＰＴＨｒＰの用量反応性を示している。ＰＴＨｒＰを添加すると、軟骨細胞のＡＬＰ活性が抑制され、その効果はＰＴＨｒＰ作用させている間継続することが明らかとなった（図５・ＰＴＨｒＰ添加群）。また、その効果は可逆的であり、培養２１日目にＰＴＨｒＰを培養液から抜くことでＡＬＰ活性は対照群レベルまで回復した（図５・ＰＴＨｒＰ除去群）。この効果は濃度依存的であり、１０-9Ｍ以上の濃度でＡＬＰ活性を抑制し始め、１０-8Ｍでほぼ完全にＡＬＰ活性を抑制した（図６）。
【００２７】
また、ＰＴＨｒＰはそれに引き続く石灰化も抑制した。すなわち、１０-7ＭのＰＴＨｒＰは軟骨細胞への45Ｃａの取り込みを抑制し（図７・ＰＴＨｒＰ添加群）、その効果はＰＴＨｒＰを除去することで速やかに解除されることが明らかとなった（図７・ＰＴＨｒＰ除去群）。ＰＴＨｒＰの石灰化抑制作用は用量依存的であり、１０-8Ｍ以上の濃度で軟骨細胞の石灰化を完全に抑制した（図８）。これらの結果より、ＰＴＨｒＰが変形性関節症の治療薬として有効であることを示すものである。
【００２８】
【実施例５】
増殖軟骨細胞の分離は実施例１と同様、生後４週齢のウサギの肋軟骨−骨移行部より下村らの方法（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９，１７９−１８７，１９７５）により行った。分離した軟骨細胞は１０％の牛胎児血清および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）に懸濁し、Ｉ型コラーゲンをコートした３．５ｃｍのシャーレに５，０００個づつ播種した。３０日間の培養後、最後の６日間に１０-8および１０-7ＭのＰＴＨｒＰを作用させた。培養細胞よりＣｓＴＦＡ法（Ｓｍａｌｅ ａｎｄ Ｓａｓｓｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０３，３５２−３５６，１９９２）にてＲＮＡを調整し、電気泳動法にて分離、その後メンブレンにトランスファーした。トランスファーしたメンブレンをX型コラーゲンおよびII型コラーゲンの32Ｐレベル化ｃＤＮＡプローブにてハイブリダイズした。
【００２９】
結果を図９に示す。図左はII型コラーゲンｍＲＮＡの発現、図右はＸ型コラーゲンｍＲＮＡ発現を示している。その結果、１０-8および１０-7ＭのＰＴＨｒＰはII型コラーゲンの発現に対し何ら影響を及ぼさなかったのに対し、Ｘ型コラーゲンｍＲＮＡの発現を用量依存的に強く阻害した。このことは、ＰＴＨｒＰが石灰化に強く関与しているＸ型コラーゲンの発現を特異的に抑制する、すなわち軟骨の石灰化を強く抑制するものの、基質成分であるII型コラーゲンの産生に悪影響を与えないことを意味している。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のＰＴＨｒＰを有効成分として含有する薬剤は、変形性関節症など関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患の予防および原因療法的かつ積極的な治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】軟骨細胞中に存在するＰＴＨｒＰの受容体の存在を示す電気泳動写真である。
【図２】ＰＴＨｒＰの軟骨基質の主成分であるプロテオグリカンの合成促進活性を示す図である。
【図３】ＰＴＨｒＰの軟骨細胞の増殖に対する作用を示す図である。
【図４】軟骨細胞の増殖に対するＰＴＨｒＰの用量反応性を示す図である。
【図５】軟骨細胞の経時的なＡＬＰ活性の増加とそれに対するＰＴＨｒＰの抑制効果を示す図である。
【図６】ＰＴＨｒＰの用量依存的なＡＬＰ活性抑制効果を示す図である。
【図７】軟骨細胞の経時的な石灰化能とそれに対するＰＴＨｒＰの抑制効果を示す図である。
【図８】ＰＴＨｒＰの用量依存的な石灰化抑制効果を示す図である。
【図９】ＰＴＨｒＰのII型およびＸ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現に対する効果を示す電気泳動写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、変形性関節症などの関節軟骨組織の破壊および変性を伴った疾患に対して予防、あるいは治療効果を発揮する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
変形性関節症とは関節軟骨表面の崩壊と、これに伴う関節辺縁の新たな軟骨の増殖、関節の変形、適合性の破綻をきたし、さらに関節滑膜の炎症へと波及していくものである。これには外傷や感染などの軟骨変性をきたす原疾患を有する二次性関節症と、原疾患を特定できない一次性関節症がある。変形性関節症は関節軟骨の変性を主病変とし、その主な原因としては、関節軟骨の内因的変性と関節にかかる力学的負荷が考えられるが、その発生機序には不明な点が多い。変形性関節症には主に二つの病態が存在する。一つは軟骨下骨の石灰化亢進による関節裂隙の狭小化および骨組織の破壊をみるもの（Ｂｏｌｌｅｔ Ａ．Ｊ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１２，１５２−１６３，１９６９）、もう一つは滑膜性の炎症により軟骨組織の破壊あるいは変性を引き起こす場合（Ｈｕｓｋｉｓｓｏｎ Ｒ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．３８，４２３−４２８，１９７９，Ｃａｍｐｉｏｎ Ｇ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓｉｎ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ １７，２３２−２４５，１９８８）である。
【０００３】
炎症性の変形性関節症では、滑膜組織などから産生されたＩＬ−１などの物質による軟骨組織の基質成分（プロテオグリカン）の減少が観察される（Ｔｙｌｅｒ Ｊ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２５，４９３−５０７，１９８５）ばかりではなく、軟骨細胞によるプロテオグリカン産生も抑制される（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３８，５７１−５８０，１９８６）。従って、軟骨基質が減少して（Ｐｅｔｔｉｐｈｅｒ Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８７４９−８７５３，１９８６）、関節軟骨層が次第に遺失するものと考えられる。
【０００４】
関節組織中の軟骨は永久軟骨に分類され、骨格成長に重要な役割を果たす成長軟骨とは厳密に区別される。すなわち、骨端板などに存在する成長軟骨細胞は増殖、分化した後石灰化し骨と置き換わることでその生理的意義が完遂するのに対し、関節軟骨細胞では通常、石灰化は起こらない。これは、関節軟骨細胞では環境的に石灰化は強く抑制されているものと考えられ、関節軟骨は石灰化しないことで弾性を保持し、荷重に対するクッションの役割と関節部での易可動性を保証しているからである。しかし、変形性関節症では、関節軟骨表面の弾性が低下していることが知られている（Ｍｙｅｒｓ Ｅ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．ＵＳＡ ２３１，１９８６）。これは軟骨組織におけるコラーゲン繊維の断裂化によるものとされている（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ Ｒ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎａｔ．１３６，４２５−４３９，１９８２）。関節軟骨における石灰化抑制の機序は明かではないが、関節軟骨細胞を単離し培養すると石灰化が起こるようになる。おそらく関節軟骨の石灰化を強く抑制しているものは軟骨細胞を取り巻いている基質中にある可能性が高い。（Ｉｗａｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，４６１−４６７，１９９１、Ｐａｃｉｆｉｃｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９２，２６６−２７０，１９９１）。
【０００５】
石灰化する軟骨細胞と関節軟骨細胞の相違点は他にもみられる。石灰化する軟骨は高いアルカリホスファターゼ活性を有する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７，２８６−２９３，１９２３，Ａｌｉ Ｓ．Ｙ．，ｉｎ “Ｃａｒｔｉｌａｇｅ”（Ｂ．Ｋ．Ｈａｌｌ，ｅｄ） Ｖｏｌ．１，ｐｐ．３４３−３７８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）のに対し、関節軟骨組織ではその１／１００の活性を示すにすぎない（Ｉｗａｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，４６１−４６７，１９９１）。また、軟骨基質に含まれるＸ型のコラーゲンは石灰化軟骨組織中に存在している（Ｃａｐａｓｓｏ Ｏ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１４２，１９７−２０６，１９８２）が、関節軟骨にはその発現が少ない。これらのマーカーは軟骨細胞の石灰化と関連していることが示唆されている。（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，９５５２−９５５６，１９８８，Ｋｗａｎ Ａ．Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０９，１８４９−１８５６，１９８９）。一方、変形性関節症において、関節軟骨細胞のアルカリホスファターゼ活性は正常関節軟骨細胞に比較して高く（Ｍｏｋｏｎｄｊｉｍｏｂｅ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，３９，７５９−７６２，１９９１）、ヒトの関節軟骨組織を用いた研究でもその活性は変形性関節症の組織が高い活性を示した（Ｅｉｎｈｏｒｎ Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｔｈｏｐ．Ｒｅｓ．３，１６０−１６９，１９８５）。同様に、Ｘ型コラーゲンの発現も変形性関節症の患者から得られた軟骨組織で高いことが示されている（Ｈｏｙｌａｎｄ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．１５，１５１−１６４，１９９１）。以上の知見より、変形性関節症における軟骨組織、あるいは軟骨下骨の石灰化は関節軟骨細胞の形質の変化、すなわちアルカリホスファターゼ産生およびＸ型コラーゲンの発現によるものと推定される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
現在、変形性関節症の治療では、保存的な療法、抗炎症剤やヒアルロン酸の投与、あるいは外科的な処置など、対症療法的あるいは消極的な治療法のみが行われており、原因療法と言えるような治療法はまだない。
【０００７】
本発明は、変形性関節症など関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患の予防剤および原因療法的かつ積極的な治療剤を提供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明はＰＴＨ関連ぺプチド（ＰＴＨｒＰ）またはＰＴＨｒＰ由来物質を有効成分として含有する、関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患の予防または治療剤に関するものである。
【０００９】
本発明における副甲状腺ホルモン関連ぺプチド（ＰＴＨｒＰ）とは、天然型のＰＴＨｒＰ、遺伝子工学的手法で作成されたＰＴＨｒＰ、化学的に合成されたＰＴＨｒＰを包含し、たとえば１４１個のアミノ酸より成るヒトＰＴＨｒｐやウシ、ブタなどのＰＴＨｒｐなどがあげられ、好ましくはヒトＰＴＨｒＰを示す。またＰＴＨｒＰ由来物質とは、前記のＰＴＨｒＰの部分ペプチドや、ＰＴＨｒＰそのものあるいはその部分ペプチドの構成アミノ酸の一部を置換、削除、付加したペプチドで同様の活性を有するペプチドを意味する。ＰＴＨｒＰの部分ペプチドとしては、たとえば１−３４ＰＴＨｒＰ、１−８４ＰＴＨｒＰ、３−１４１ＰＴＨｒｐ、７−１４１ＰＴＨｒｐ、３５−１４１ＰＴＨｒｐ、８５−１４１ＰＴＨｒｐ、１０７−１４１ＰＴＨｒｐ、１０７−１４０ＰＴＨｒｐ、１−８７ＰＴＨｒｐ、３−８７ＰＴＨｒｐ、７−８７ＰＴＨｒｐ、１−１１１ＰＴＨｒｐ、３−１１１ＰＴＨｒｐ、７−１１１ＰＴＨｒｐなどがあげられ、好ましくはヒト１−３４ＰＴＨｒＰ、ヒト１−８４ＰＴＨｒＰなどがあげられる。ここで１−３４ＰＴＨｒＰとはＰＴＨｒＰのＮ末端から３４番めのアミノ酸までの３４個のアミノ酸からなるＰＴＨｒＰの部分ペプチドを示す。置換、削除、付加するアミノ酸残基の数は、本発明の活性を保持していれば特に制限はない。関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患とは、例えば変形性関節症や関節リウマチなどがあげられ、好ましくは変形性関節症があげられる。
【００１０】
前述したように、Ｘ型コラーゲン、アルカリホスファターゼは軟骨、あるいは軟骨下骨の石灰化において重要な発現物質であることが知られており、このＸ型コラーゲンの発現やアルカリホスファターゼの産生を抑制することは、変形性関節症の改善に有効である。さらに変形性関節症においては関節軟骨細胞の基質合成機能の低下、基質分解による軟骨組織の変形が認められることから、変形性関節症の治療剤としては軟骨基質であるプロテオグリカンの合成を阻害することなくむしろ合成を促進する薬剤が好ましい。また、軟骨細胞の増殖を阻害するなど、軟骨細胞の増殖・分化に好ましくない作用を有さない薬剤が好ましいのは言うまでもない。
【００１１】
本発明におけるＰＴＨｒＰの関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患に対する有効性は次のようにして確認できる。
【００１２】
すなわち、ＰＴＨｒＰの増殖に対する作用、軟骨組織変性の重要なマーカーであるＸ型コラーゲンの発現、アルカリホスファターゼ産生、それに引き続く石灰化に対する作用、および軟骨基質であるII型コラーゲンの発現に対する作用は、若齢ウサギの増殖軟骨細胞を遠心管内で培養する実験（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，９５５２−９５５６，１９８８，Ｉｗａｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．１３６，５００−５０６，１９８９）、および増殖軟骨細胞の平面培養系（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９，１７９−１８７，１９７５）により確認できる。特に、遠心管内で軟骨細胞を立体的に培養すると、軟骨細胞は増殖・分化し、おおよそ２０日で石灰化する（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ８５，９５５２−９５５６，１９８８）。しかも、同様な培養系で関節軟骨細胞を培養すると、高いアルカリホスファターゼ活性の発現と共に石灰化を行うようになる（Ｐａｃｉｆｉｃｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．１９２，２６６−２７０，１９９１）。このことは、これらの培養系が変形性関節症における関節軟骨細胞の異常な形質発現に対する薬剤の効果の検討に有用な実験系であることを示している。
【００１３】
またＰＴＨｒＰの軟骨細胞の基質に対する作用は、軟骨基質であるプロテオグリカンの合成を指標にして確認できる。この実験系としては、培養軟骨細胞の基質合成時にＰＴＨｒＰを作用させ、35Ｓ−硫酸の基質への取り込みを指標として確認できる。
【００１４】
以上のＰＴＨｒＰの作用を説明するためには、軟骨細胞中にＰＴＨｒＰの受容体があることが確認される必要がある。実際、ＰＴＨの軟骨細胞に対する作用の発現には、軟骨細胞中にＰＴＨの受容体の存在が重要であることが示されている（Ｌｅｅ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３４，４４１−４５０，１９９４）．
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明の薬剤の剤形としてはペプチドの通常の製剤方法により製造される注射剤の他に、例えばマイクロカプセルへの封入あるいはゲル状のシートに含ませるなど局所化および遅効性を期待した剤形も可能である。液剤の場合には、適当な蛋白質を添加したり、あるいは適当な付着防止剤を添加することが好ましい。
【００１６】
本発明の薬剤の投与方法は、たとえば皮下投与、経口投与、経皮投与、直腸内投与、局所投与などがあげられるが、局所投与が好ましい。特に注射による関節腔内あるいは病変部への局所注入が好ましい。
【００１７】
本発明のＰＴＨｒＰの投与量は、適応疾患、症状などにより異なるが、たとえば、組織レベルで１０-20から１０-5Ｍであり、好ましくは１０-15から１０-7Ｍである。
【００１８】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。実施例で用いたＰＴＨｒＰはペプチド研究所より購入したヒト１−３４ＰＴＨｒＰである。
【００１９】
【実施例１】
以下の実施例において増殖軟骨細胞は、生後４週齢のウサギの肋軟骨−骨移行部より下村らの方法（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９，１７９−１８７，１９７５）により分離した。遠心管内での軟骨細胞の培養は岩本らの方法（Ｉｗａｍｏｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３６，５００−５０７，１９８９）および加藤らの方法（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２７，１１４−１１８，１９９０）により行った。すなわち、分離した軟骨細胞を１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）に８×１０4個／ｍｌとなるよう懸濁し、１ｍｌずつ１５ｍｌのプラスチック製遠心管（コーニング社製）に播種した。５分間遠心（１，５００ｒｐｍ）した後、３７℃に設定した炭酸ガスインキュベータ中で培養した。培地の交換は培養６日め以降、２日毎に行った。軟骨細胞中のＰＴＨｒＰ受容体の確認は、ＳＤＳゲル電気泳動法にて行った。すなわち、培養１４日目の軟骨細胞をホモジナイズした後、125ＩでラベルしたＰＴＨｒＰで５時間インキュベートした。受容体と結合したＰＴＨｒＰはＤＳＳにて架橋した後、ＳＤＳ緩衝液で可溶化してＳＤＳゲル電気泳動法にて泳動した。泳動後、常法によりオートラジオグラフィーを行った。対照として過剰量のＰＴＨｒＰを添加して125Ｉ化ＰＴＨｒＰと受容体との結合を阻害したものを同様の手順でＳＤＳゲル電気泳動法にて泳動し、オートラジオグラフィーを行った。
【００２０】
図１に結果示す。125Ｉ化ＰＴＨｒＰと受容体との結合は、分子量約７６ｋＤａの付近に泳動され（図１・左）、その結合は過剰量のＰＴＨｒＰの添加により完全に阻止された（図１・右）。このことは、軟骨細胞中にＰＴＨｒＰの受容体が存在し、ＰＴＨｒＰはその受容体を介して以下に示す様々な効果を発現できることを示唆している。
【００２１】
【実施例２】
増殖軟骨細胞の分離は実施例１と同様、生後４週齢のウサギの肋軟骨−骨移行部より下村らの方法（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９，１７９−１８７，１９７５）により行った。分離した軟骨細胞は１０％の牛胎児血清および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）に懸濁し、５，０００個づつ９６穴の培養プレートに播種した。細胞がコンフルエントになってからＰＴＨｒＰを添加して１日後に１穴あたり１μＣｉの35Ｓ−硫酸を添加して１７時間培養した。培養液上清中に産生された軟骨基質の量は加藤らの方法（Ｋａｔｏ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２２，１９９１−１９９７，１９８８）により行った。すなわち、プロテオグリカン中に取り込まれた35Ｓ−硫酸の量を測定した。
【００２２】
結果を図２に示す。図はＰＴＨｒＰの濃度を１０-10から１０-6Ｍとした濃度反応曲線を示している。ＰＴＨｒＰは用量依存的にプロテオグリカン中への35Ｓ−硫酸の取り込みを促進し、１０-6Ｍでは対照の約３倍の基質合成能を示した。このことは、ＰＴＨｒＰがプロテオグリカンの産生を促進し、軟骨細胞の正常な分化を促進することを示している。
【００２３】
【実施例３】
軟骨細胞の培養は実施例１と同様、遠心管内で行った。培養８日めにＰＴＨｒＰを１０-7添加して２８日間培養した。培養後、適宜細胞を可溶化して経時的なＤＮＡ量を測定した。また、ＰＴＨｒＰを１０-10から１０-7Ｍまで添加して培養２１日目のＤＮＡ量を測定した。
【００２４】
軟骨細胞の経時的なＤＮＡ量の変化を図３に、またＰＴＨｒＰのＤＮＡ量に対する用量反応性を図４に示した。対照群のＤＮＡ量は経時的に増加して軟骨細胞が遠心管内で良好に増殖していたことを表していた。ＰＴＨｒＰを添加しても軟骨細胞のＤＮＡ量には全く影響されなかった。このことは、ＰＴＨｒＰが軟骨細胞の増殖に対してなんら悪影響を与える薬剤ではないことを示している。
【００２５】
【実施例４】
軟骨細胞の培養は実施例１と同様、遠心管内で行った。培養８日めにＰＴＨｒＰを１０-7Ｍになるように添加し、最高２８日めまで培養した。培養２１日目にＰＴＨｒＰを除去した群を設定し、ＰＴＨｒＰ添加群と比較した。また、ＰＴＨｒＰを１０-10から１０-7Ｍまで添加して、アルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ活性）に対する用量反応性を確認した。ＡＬＰ活性の測定は、軟骨塊を０．２％トリトンＸ−１００中にてホモジナイズした後、１２，０００×ｇにて１５分間遠心し、その上清をＢｅｓｓｅｙらの方法（Ｂｅｓｓｅｙ Ｏ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１６４，３２１−３２９，１９４６）により測定した。また、石灰化の検討は適当な時期に45Ｃａを０．５μＣｉずつ添加し、軟骨細胞への２４時間後の取り込みを測定すること、および培養２８日目のＣａ量を測定することにより行った。
【００２６】
図５にはＰＴＨｒＰのＡＬＰ活性に対する経時的な作用を、図６にはＰＴＨｒＰを添加して２１日目のＡＬＰ活性に対するＰＴＨｒＰの用量反応性を示している。ＰＴＨｒＰを添加すると、軟骨細胞のＡＬＰ活性が抑制され、その効果はＰＴＨｒＰ作用させている間継続することが明らかとなった（図５・ＰＴＨｒＰ添加群）。また、その効果は可逆的であり、培養２１日目にＰＴＨｒＰを培養液から抜くことでＡＬＰ活性は対照群レベルまで回復した（図５・ＰＴＨｒＰ除去群）。この効果は濃度依存的であり、１０-9Ｍ以上の濃度でＡＬＰ活性を抑制し始め、１０-8Ｍでほぼ完全にＡＬＰ活性を抑制した（図６）。
【００２７】
また、ＰＴＨｒＰはそれに引き続く石灰化も抑制した。すなわち、１０-7ＭのＰＴＨｒＰは軟骨細胞への45Ｃａの取り込みを抑制し（図７・ＰＴＨｒＰ添加群）、その効果はＰＴＨｒＰを除去することで速やかに解除されることが明らかとなった（図７・ＰＴＨｒＰ除去群）。ＰＴＨｒＰの石灰化抑制作用は用量依存的であり、１０-8Ｍ以上の濃度で軟骨細胞の石灰化を完全に抑制した（図８）。これらの結果より、ＰＴＨｒＰが変形性関節症の治療薬として有効であることを示すものである。
【００２８】
【実施例５】
増殖軟骨細胞の分離は実施例１と同様、生後４週齢のウサギの肋軟骨−骨移行部より下村らの方法（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．１９，１７９−１８７，１９７５）により行った。分離した軟骨細胞は１０％の牛胎児血清および５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を含むイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）に懸濁し、Ｉ型コラーゲンをコートした３．５ｃｍのシャーレに５，０００個づつ播種した。３０日間の培養後、最後の６日間に１０-8および１０-7ＭのＰＴＨｒＰを作用させた。培養細胞よりＣｓＴＦＡ法（Ｓｍａｌｅ ａｎｄ Ｓａｓｓｅ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０３，３５２−３５６，１９９２）にてＲＮＡを調整し、電気泳動法にて分離、その後メンブレンにトランスファーした。トランスファーしたメンブレンをX型コラーゲンおよびII型コラーゲンの32Ｐレベル化ｃＤＮＡプローブにてハイブリダイズした。
【００２９】
結果を図９に示す。図左はII型コラーゲンｍＲＮＡの発現、図右はＸ型コラーゲンｍＲＮＡ発現を示している。その結果、１０-8および１０-7ＭのＰＴＨｒＰはII型コラーゲンの発現に対し何ら影響を及ぼさなかったのに対し、Ｘ型コラーゲンｍＲＮＡの発現を用量依存的に強く阻害した。このことは、ＰＴＨｒＰが石灰化に強く関与しているＸ型コラーゲンの発現を特異的に抑制する、すなわち軟骨の石灰化を強く抑制するものの、基質成分であるII型コラーゲンの産生に悪影響を与えないことを意味している。
【００３０】
【発明の効果】
本発明のＰＴＨｒＰを有効成分として含有する薬剤は、変形性関節症など関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患の予防および原因療法的かつ積極的な治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】軟骨細胞中に存在するＰＴＨｒＰの受容体の存在を示す電気泳動写真である。
【図２】ＰＴＨｒＰの軟骨基質の主成分であるプロテオグリカンの合成促進活性を示す図である。
【図３】ＰＴＨｒＰの軟骨細胞の増殖に対する作用を示す図である。
【図４】軟骨細胞の増殖に対するＰＴＨｒＰの用量反応性を示す図である。
【図５】軟骨細胞の経時的なＡＬＰ活性の増加とそれに対するＰＴＨｒＰの抑制効果を示す図である。
【図６】ＰＴＨｒＰの用量依存的なＡＬＰ活性抑制効果を示す図である。
【図７】軟骨細胞の経時的な石灰化能とそれに対するＰＴＨｒＰの抑制効果を示す図である。
【図８】ＰＴＨｒＰの用量依存的な石灰化抑制効果を示す図である。
【図９】ＰＴＨｒＰのII型およびＸ型コラーゲンのｍＲＮＡ発現に対する効果を示す電気泳動写真である。
Claims (4)
- 遺伝子工学的手法もしくは化学的合成方法で作製された副甲状腺ホルモン関連ぺプチド（ＰＴＨｒＰ）であって、１−３４ＰＴＨｒＰを有効成分として含有することを特徴とする、関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患の予防用または治療用薬剤。
- 副甲状腺ホルモン関連ペプチドがヒト１−３４ＰＴＨｒＰであることを特徴とする請求項１記載の薬剤。
- 関節軟骨組織の破壊および変性を伴う疾患が、変形性関節症であることを特徴とする請求項１または２記載の薬剤。
- 関節軟骨組織の破壊および変性が、軟骨および軟骨下骨の石灰化を伴うものであることを特徴とする請求項１または２記載の薬剤。
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