CN102256996A - 早期骨关节炎的治疗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种治疗动物中早期骨关节炎的方法。所述方法包括将治疗有效量的甲状旁腺素或甲状旁腺素衍生的物质递送至患者的受影响的关节腔。本发明还提供一种抑制关节软骨细胞凋亡的方法和一种抑制患病的动物中的关节软骨细胞的退化进程的方法。
Description
序列表
本发明含有已通过EFS-Web提交的序列表，据此通过引用全部并入本文中。所述ASCII拷贝创建于2009年12月15日，名称为383295WO.txt，大小为4219比特。
领域
本发明涉及骨关节炎的治疗，特别涉及通过施用甲状旁腺素或由甲状旁腺素衍生的物质来治疗早期骨关节炎的方法。
背景
关节炎包括涉及身体关节损伤的一类疾病。关节炎是五十五岁以上人群残疾的最主要原因。关节炎的最常见的形式——骨关节炎(OA)是由关节创伤、关节感染或年长引起的。骨关节炎是一种临床综合症，轻微的炎症会导致关节疼痛，它是由覆盖关节并在关节内起衬垫作用的软骨的非正常磨损以及润滑关节的滑液的性质的破坏或改变而引起的。当骨表面变得被软骨保护得不太好时，负重 (包括走路或站立)时患者会感到疼痛。由于疼痛使得移动增加，则局部肌肉可能萎缩，韧带会变得更加松弛。
骨关节炎在美国影响近两千一百万人群，占初级护理医生出诊人数的25%以及非类固醇抗炎药(NSAID)处方的一半。据估计，这些人的80%到65岁时X光照相会显示有患骨关节炎，即使只有60%会表现出症状。
随着许多国家年长者数量的增加，骨关节炎成为了一种日益普遍的关节疾病。例如，在美国，60岁以上人群的10%都患有OA。OA的当前治疗主要包括使用抗炎药、止痛剂和润滑补充剂。因此，开发能够在早期抑制OA进展的药剂是优先考虑的事项。
在患OA的患者中，软骨细胞，例如在骨骺生长板中的软骨细胞，已知能够恢复表型改变，其中软骨细胞经历从肥大到矿物质沉积到最终凋亡的终末分化过程(Blanco FJ et al., Arthritis Rheum 1998; 41: 284-9; Kirsch T et al., Osteoarthritis Cartilage 2000; 8: 294-302)。OA中的软骨细胞表达肥大软骨细胞的标记蛋白，包括膜联蛋白(annexin)、碱性磷酸酶和X型胶原(Col X)(非II型胶原(Col II))。
在生长板中调节软骨内骨化的反馈回路包括甲状旁腺素相关肽(PTHrP)、IHH蛋白(Indian hedgehog)和Bcl-2。PTHrP维持增殖性软骨细胞的功能并抑制软骨细胞朝肥大分化(Horton WE Jr et al., Matrix Biol 1998; 17: 107-15; Weisser J et al., Exp Cell Res, 2002; 279: 1-13)。先前的报道已表明，OA进展期间的关节软骨细胞的生物学变化与软骨内骨化类似(Blanco FJ, et al., Arthritis Rheum 1998; 41 : 284-9; Kirsch T et al., Osteoarthritis Cartilage 2000; 8: 294-302)。
生长板中的软骨细胞分化的生物学变化与在骨关节炎的进展中观察到的类似。已报道称，在骨关节炎中，软骨细胞的表型变化类似于在骨骺生长板中的变化，在骨骺生长板中，软骨细胞经历终末分化、肥大、矿物质沉积和最终的凋亡(Arthritis. Rheum. (1998) 41(2): 284-9; Ann. Rheum. Dis. (2000) 59(12): 959-65; Osteoarthritis Cartilage (2000) 8(4): 294-302)。骨关节炎的软骨细胞表达肥大软骨细胞的标记蛋白，包括钙依赖性磷脂结合蛋白、碱性磷酸酶和X型胶原(Col X)，但不表达II型胶原(Col II)。
之前已表明，甲状旁腺素相关蛋白(PTHrP)可能可以用于治疗骨关节炎。例如PCT专利申请，WO2008/156725，描述了通过将PTHrP注射到关节软骨的深层区域来抑制关节软骨矿化。如上所述，软骨细胞分化涉及复杂的过程，包括细胞分化、肥大、终末分化、矿化和细胞死亡(凋亡)。但是，现有技术并未显得提供任何会逆转软骨细胞退化进程的方法，所述退化进程包括在患者骨关节炎的发展期间出现的关节软骨矿化。
因此，需要一种可抑制或预防软骨矿化和软骨细胞凋亡的方法，所述方法将抑制或逆转早期骨关节炎的软骨细胞的退化进程并且可被用来治疗骨关节炎，特别是早期骨关节炎。
概述
一方面，本发明提供一种用于治疗动物的早期骨关节炎的方法，所述方法包括将治疗有效量的选自甲状腺旁素(PTH)和PTH衍生物质的试剂，例如PTH (1-34)，递送至需要这种治疗的动物的受侵害的关节的关节腔中。
另一方面，本发明提供一种用于抑制动物的关节软骨细胞凋亡的方法，所述方法包括将治疗有效量的选自甲状腺旁素(PTH)和PTH衍生物质的试剂，例如PTH (1-34)，递送至需要这种治疗的动物的受侵害的关节的关节腔中。
另一方面，本发明提供一种用于抑制动物的受侵害的关节的关节软骨细胞的退化进程的方法，所述方法包括将治疗有效量的选自甲状腺旁素和甲状腺旁素衍生物质的试剂递送至需要这种治疗的动物的受侵害的关节的关节腔中，从而关节软骨细胞接触所述试剂。
在本文公开的方法的某些实施方式中，所述试剂包括PTH的氨基酸1-34，在这种实施方式的一个具体方面，所述试剂包括人甲状旁腺素的氨基酸1-34。
在本文公开的方法的其他实施方式中，所述试剂本质上由PTH的氨基酸1-34构成，在这种实施方式的具体方面，所述试剂本质上由人甲状旁腺素的氨基酸1-34构成。
在一个实施方式中，所述试剂的递送是通过关节内注射实现的。
在本文公开的方法的某些实施方式中，所治疗的动物是人，并且受侵害的关节是选自指关节、腕关节、肘关节、肩关节、颈关节、臀关节、膝关节、踝关节和趾关节的滑液关节。在这些实施方式的某些方面，试剂的治疗有效量是指在滑液关节的滑液中提供约0.1 nM至约200 nM、约0.25 nM至约100 nM、约0.5 nM至约75 nM、约0.75 nM至约50 nM或约1 nM至约25 nM的初始浓度的试剂。
在本文公开的方法的某些实施方式中，试剂的治疗有效量为约0.1皮摩尔至约5000皮摩尔、约0.5皮摩尔至约1500皮摩尔、约1皮摩尔至约1000皮摩尔、约2.5皮摩尔至约500皮摩尔或约5皮摩尔至约300皮摩尔。在某些实施方式中，递送的溶液体积可为约0.1 ml至约10 ml，试剂在溶液中的浓度为约1 nM至约500 nM、约2.5 nM至约250 nM或约5 nM至约100 nM。在另一个实施方式中，递送的溶液体积为约1 ml至约3 ml，所含试剂的浓度为约5 nM至约100 nM。
本发明的其他目的和特征将从以下结合附图考虑的详细说明中变得明显。
附图说明
本发明将根据以下结合附图的详细描述而进一步被理解。
图1A-1F显示各物质在对照或azaC处理的人关节软骨细胞(使用或未用PTH(1-34)处理)中的水平的变化：(A)聚集蛋白聚糖mRNA，(B)糖胺聚糖(GAG)，(C)IIa1型胶原(Col2a1)，(D)Xa1型胶原(Col10a1)，(E)碱性磷酸酶(ALP)和(F)IHH，其中PTH(1-34)是由人甲状腺旁素的氨基末端氨基酸1-34 组成的34个氨基酸长的肽。
图2A-2C显示各物质在对照或azaC处理的人关节软骨细胞(使用或未用PTH(1-34)处理)中的变化：(A)Bcl-2的mRNA表达，(B)Bax的mRNA表达，(C)Bcl-2与Bax的比率。
图3显示在人关节软骨细胞中PTH(1-34)对azaC诱导的凋亡的影响。
图4显示在正常的和骨关节炎(OA)大鼠关节软骨中PTH(1-34)对糖胺聚糖(GAG)水平的影响。
图5显示在正常的和骨关节炎(OA)大鼠关节软骨中PTH(1-34)对免疫定位的II型胶原的影响。
图6显示在正常的和骨关节炎(OA)大鼠关节软骨中PTH(1-34)对软骨细胞凋亡的影响。
图7显示在骨关节炎(OA)大鼠关节软骨中三倍剂量的PTH(1-34)对糖胺聚糖(GAG)水平的影响。
详细描述
以下优选实施方式的描述和附图仅用来说明本发明，而不是对本发明的限制，对于本发明的范围请参考所附权利要求。
本文中使用的术语仅是用来描述本发明的特定实施方式，而并非用来作为限制。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学的术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
而且，本文无论在上文或在下文中所引用的所有公开文献、专利和专利申请，都通过引用将它们全部合并至本文中。
最后，除非另有明确说明，如在说明书和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个”和“所述”包括复数个指代物。
定义
本文的术语“甲状旁腺素(PTH)”和“PTH”是指甲状旁腺素，特别是人甲状旁腺素，以及它的衍生物。在本发明的方法中使用的甲状旁腺素可为各种形式，例如天然型的PTH、通过基因工程技术生产的PTH或化学合成的PTH。PTH衍生物的例子有如上所述的PTH局部肽、PTH的或其局部肽的组成型氨基酸(可被其他氨基酸部分地取代)、PTH的或其局部肽的组成型氨基酸(可被部分缺失)、以及向PTH或其局部肽添加一个或多个氨基酸形成的肽。注意，例如PTH衍生物的肽可具有与PTH本身类似的活性。PTH的局部肽的例子包括人PTH(1-34)、人PTH(1-64)、人PTH(35-84)和牛PTH(1-34)。PTH(1-34)是指从PTH的N末端计数共34个氨基酸组成的PTH的局部肽。在本文公开的方法的某些实施方式中，所施用的试剂是PTH(1-34)(即人PTH(1-34))。因此，本文所用的术语“甲状旁腺素(PTH)”和“PTH衍生物质”包括但不限于人PTH盐、人PTH(1-34)、特立帕肽(teriparatide)人PTH类似物、紧密相关肽和具有与84个氨基酸人甲状旁腺素的34 N-末端氨基酸(生物活性区)序列相同功能的肽序列的试剂。术语“甲状旁腺素(PTH)”、“PTH”和“PTH衍生物质”因此包括但不限于重组人PTH(1-34)、合成人PTH(1-34)、PTH(1-34)、人PTH(1-34)盐、特立帕肽、人PTH(1-34)的简单衍生物，例如人PTH(1-34)酰胺和紧密相关分子，例如人PTH(1-33)或人PTH(1-31)酰胺或紧密相关骨生肽(osteogenic peptide)。合适的人PTH盐的例子包括但不限于醋酸盐、己二酸盐、当归酸盐、溴化物、丁酸盐、氯化物、柠檬酸盐、柠康酸盐、柠苹酸盐、巴豆酸盐、丙酸盐、戊酸盐、己酸盐、庚酸盐、乙酰丙酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、乙醇酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、3-羟基异丁酸盐、丙三酸盐(tricarballylicate)、丙二酸盐、戊二酸盐、衣康酸盐、中康酸盐、二亚甲醇丙酸盐、惕各酸盐(tiglicate)、甘油酸盐、甲基丙烯酸盐、异巴豆酸盐酯、β-羟基丁酸盐、羟基丙烯酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、2-羟基异丁酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、丙酮酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、硝酸盐、磷酸盐、苯、磺酸盐、甲磺酸盐、硫酸盐和磺酸盐。所记载的术语“甲状旁腺素(PTH)”和“PTH衍生物”还可包括各种形式，例如，酸、游离碱、带电荷或不带电荷的分子、分子复合物的组分或无刺激性的药理上可接受的盐。
本文使用的术语“早期骨关节炎”包括但不限于如下医疗症状，在所述症状中，即使软骨细胞有一些明显的集簇，但患病的动物(例如，患病的人)的关节软骨表现出非常少至没有纤维性颤动的征兆并且明显地保持了软骨的整体厚度。术语“早期骨关节炎”通过观察到患病的动物的软骨样本的不超过70%的软骨细胞表现出对碱性磷酸酶、膜联蛋白和X型胶原的免疫染色来表征。(T. Kirsch et al., Osteoarthritis and Cartilage (2000) 8: 294-302)。患有早期骨关节炎的动物(例如，人类)可感觉到轻微的僵硬和偶然的关节痛，并且他们中的一些可感觉到局部关节痛。
本文使用的术语“关节腔”是指滑液关节的骨头之间充满液体的空间。
术语“关节内注射”是指将药物施加于患者的关节腔内的方法，所述方法包括使用注射器和其他注射设备。
根据公开的方法治疗的患病的“受治者”、“患者”或“动物”可以是人类或非人类哺乳动物，因此，所述患病的“受治者”、“患者”或“动物”可以是人类和狗、猫、小鼠、大鼠、牛、绵羊、猪、山羊或灵长类动物，并且可包括实验室动物、牧畜和家畜。在一些实施方式中，所述患病的受治者、患者或动物是患有骨关节炎的人类，更加具体而言，是患有早期骨关节炎的人类。
关于软骨细胞退化的术语“退化进程”的特征是例如软骨细胞的基质组分的合成的变化，所述变化例如是II型胶原减少和X型胶原增加，并且术语“退化进程”包括但不限于软骨细胞的终末分化。
早期骨关节炎及其治疗
早期骨关节炎的症状可包括疼痛、僵硬、关节活动受限制、肿胀和骨扩大。这些症状可在患病动物的各个部分表现出来，例如在臀部、膝盖、手部或体内的任何其他关节中表现出来。而且，在诸如弯曲、跪下、爬楼梯、跑步、划船之类的一些活动过程中以及其他激烈的或长期的体力活动中这些症状可变得明显，关节中的疼痛和僵硬，在使用期间或之后或静止一段时间之后或其任何组合，会变得明显。此外，所述症状可与天气有关或随天气变化而加重，例如在天气变化之前或过程中关节不适，例如，与大气压的变化有关。
根据本发明公开的方法用PTH或PTH衍生物质治疗患有早期骨关节炎的动物(例如人类)可维持软骨形成和关节软骨细胞的继续存活，从而抑制骨关节炎的发展。
在骨关节炎中发生的软骨细胞的变化通过已建立的细胞培养模型来模拟，所述已建立的细胞培养模型涉及azaC-诱导的人类关节软骨细胞的终末分化，所述已建立的细胞培养模型用于确定将PTH用于治疗早期骨关节炎。使用该人类关节软骨细胞培养模型，发现PTH(1-34)治疗不仅缓解了azaC-诱导的II型胶原抑制而且增加了II型胶原的表达。还发现了PTH在糖胺聚糖水平的变化方面的类似作用。常见的关节软骨细胞表达关节软骨的正常作用所需的II型胶原和聚集蛋白聚糖。当经过终末分化，产生骨关节炎时，软骨细胞将表达标记物，所述标记物包括碱性磷酸酶和X型胶原，而II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达降低。该退化进程可导致软骨细胞矿化作用并且最终细胞死亡。因此，本发明公开的方法可抑制、终止或逆转早期OA中的软骨细胞的退化进程。
根据本文公开的方法，用PTH或PTH衍生物质(例如，PTH(1-34))治疗早期骨关节炎可抑制或预防软骨细胞的细胞死亡(凋亡)。
骨关节炎的临床特征包括关节疼痛、早晨僵硬持续超过30分钟，关节不稳定性或弯曲以及功能丧失。骨关节炎的征兆包括受影响的关节处骨扩大、活动范围受限制、关节活动之后的咿轧音，活动疼痛、受影响的关节不成直线以及受影响的关节畸形。用于检测早期骨关节炎的示范性的方法包括基于放射性方法的那些方法，所述放射性方法可检测并确定关节软骨中的糖胺聚糖的存在和浓度。这些方法包括称为“软骨的延迟钆增强MRI”(dGEMRIC)和“基于化学交换的饱和传递”(gagCEST)(参见，例如，Ling et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(7): 2266-70)的MRI技术和基于计算机断层摄影的方法(参见例如，Josh et al. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131 (37): 13234-35)。用于诊断骨关节炎的其他方法包括超声波检查法和平片(X-射线)以及包括关节造影术和关节内窥镜检测在内的侵入性方法(参见例如，Tsai et al. (2007) OsteoArthritis and Cartilage 15: 245-50, and Lee et al. (2008) OsteoArthritis and Cartilage 16: 352-58)。
一旦作出诊断，早期骨关节炎可使用本文公开的方法来治疗。在一些实施方式中，早期骨关节炎通过将选自PTH和PTH衍生的物质(例如PTH(1-34)(人类PTH(1-34)))的药剂给药于患者的患病的关节，例如向滑液关节的骨之间的液体填充空间注射来治疗。在这些实施方式的一个方面，使用注射器或其他注射设备将所述药剂注射进入患病的关节的滑液中。药剂的量和剂型以及药剂的给药频率的确定在本发明公开的内容所提供的合适的医生的专业范围内。所述药剂的给药量为约0.1 皮摩尔至约5000 皮摩尔，约0.5皮摩尔至约1500 皮摩尔，约1 皮摩尔至约1000 皮摩尔，约2.5 皮摩尔至约500 皮摩尔或约5 皮摩尔 至约300 皮摩尔。在一些实施方式中，治疗有效剂量为提供了滑液关节的滑液中的所述药剂的初始浓度为约0.1 nM至约200 nM，约0.25 nM至约100 nM，约0.5 nM至约75 nM，约0.75 nM至约50 nM或约1 nM至约25 nM的量。在另一方面，通过递送约0.1 ml至约10 mL溶液提供所述药剂的治疗剂量，所述溶液中所述药剂的浓度为约1 nM至约500 nM。在另一方面，以约1 mL至约3 ml的体积来递送所述药剂，并且在溶液中所述药剂的浓度为约5 nM至约100 nM。
本发明公开的内容提供大鼠中骨关节炎的木瓜蛋白酶诱导模型，所述模型用于测试PTH(1-34)在体内骨关节炎发展过程中对关节软骨的作用。在该骨关节炎的木瓜蛋白酶诱导的大鼠模型中，PTH(1-34)的关节内给药使GAG的降低减弱并且恢复了II型胶原。而且，在骨关节炎诱导的软骨中治疗5周使GAG恢复至正常水平并且使II型胶原提高至高于正常水平。此外，用PTH(1-34)治疗3至5周表现出抑制由骨关节炎诱导而产生的X型胶原的表达。此外，由OA诱导而产生的软骨细胞的凋亡通过PTH(1-34)的1至5周的治疗显著抑制。
根据本文公开的方法，PTH(1-34)治疗不表现出改变正常人类关节软骨细胞和对照大鼠膝关节(即非骨关节炎大鼠膝关节)中II型胶原、X型胶原、ALP、聚集蛋白聚糖和GAG的表达。申请人认为而不希望坚持该观点，PTH和PTH衍生物的物质(例如PTH(1-34))的给药可仅仅影响骨关节炎影响的关节。根据本发明公开的方法，PTH或PTH衍生物的物质(例如，PTH(1-34))可抑制、终止或逆转人类关节软骨细胞的终末分化的过程，所述人类关节软骨细胞的终末分化的过程类似于骨关节炎中看到的过程。因此，PTH或PTH衍生的物质(例如，PTH(1-34))可用于治疗早期骨关节炎而不影响正常软骨。
根据本发明公开的方法，PTH或PTH衍生的物质(例如，PTH(1-34))可连续给药或周期性给药于患病的动物(例如患有早期骨关节炎的人类)，从而抑制或预防关节软骨细胞凋亡，并且抑制、终止或逆转关节软骨细胞的退化进程。
剂型和剂量
注射用剂型可包括载体，其是溶剂或分散介质。合适的载体包括水、生理盐水、抑菌水、Cremophor EL?(BASF, Parsippany NJ)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、乙二醇、丙二醇等等)及其混合物。这些组合物必须是无菌的并且是可注射的液体。流动性可用诸如卵磷脂或表面活性剂之类的包衣来维持。微生物污染可通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞之类的抗菌剂和抗真菌剂来预防。诸如甘露醇、山梨糖、氯化钠之类的糖类和多元醇可用于维持组合物中的等渗性。
如本文所公开的，用于治疗早期骨关节炎的选自PTH和PTH衍生的物质(例如，PTH(1-34)(人类PTH(1-34)))的药剂的治疗有效剂量为约0.1 皮摩尔 至约5000 皮摩尔, 约 0.5 皮摩尔至约1500 皮摩尔, 约1 皮摩尔至约1000 皮摩尔, 约2.5 皮摩尔至约500 皮摩尔，或约5 皮摩尔至约300 皮摩尔。在一些实施方式中，所述治疗有效剂量为提供滑液关节的滑液中所述药剂的起始浓度为约0.1 nM至约200 nM，约0.25 nM至约100 nM，约0.5 nM至约75 nM，约0.75 nM至约50 nM，或约1 nM至约25 nM的量。在另一方面，所述药剂的治疗剂量通过递送约0.1 ml至约10 ml的溶液来提供，所述溶液中所述药剂的浓度为约1 nM至约500 nM。在另一方面，所述药剂以约1 ml至约3 ml的体积来递送，并且溶液中所述药剂的浓度为约5 nM至约100 nM。
根据本发明的方法递送的组合物可包括额外的或第二药剂，例如有机二膦酸盐、化疗药剂、放射性药剂、TNF-α拮抗剂、非类固醇抗炎药剂、类固醇、抗氧化剂、血管生成抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、维生素、选择性雌激素受体调节剂(SERM)、雌激素-孕酮、雄激素、降血钙素、抗生素、组织蛋白酶K抑制剂、抑制素、整合素受体拮抗剂、造骨细胞合成代谢剂或选择性血清素再吸收抑制剂、葡糖胺、透明质酸或其混合物。在一些实施方式中，所述第二药剂是葡糖胺、透明质酸或其混合物。
实施例
材料和方法
人类关节软骨细胞培养
从死于车祸的23周岁亚种男性的膝关节中获得正常人类关节软骨样品。从患有OA的64周岁女性捐献者获得的膝关节正常区域中获得另一关节软骨样品，该捐献者已经历关节造型术。将软骨样品切碎并依次在透明质酸酶(0.5 mg/ml)、链霉蛋白酶(1 mg/ml)和胶原酶(1 mg/ml)中消化。然后将分离的软骨细胞包在海藻酸盐小球中。在6孔平板的每个孔中的5 ml培养基中培养15个小球。培养基由含有100 mg/ml 抗坏血酸、非基本氨基酸、青霉素/链霉素、1%胰岛素-转铁蛋白-硒和10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改性的Eagle培养基组成。在每次试验之前，将小球在37℃条件下、在潮湿的5%CO2孵育器中培养7天，并且每三天更换一次培养基。
AzaC诱导和PTH治疗软骨细胞培养物
将软骨细胞培养物分为四组。azaC加PTH组首先经过azaC诱导，然后用PTH治疗。azaC组经过azaC诱导，但没有随后用PTH治疗。PTH组接受PTH，但没有经过azaC诱导。对照组没有经过azaC诱导且没有用PTH治疗。AzaC诱导用于诱导软骨细胞的终末分化(参见，例如，Cell Biol lnt (2006) 30(3): 288-94)。简单来说，用15μg/ml的5-氮杂胞苷(Sigma, St. Louis, MO)处理培养物48小时。azaC诱导之后PTH治疗包括在含有10 nM的PTH(1-34)的培养基中培养软骨细胞。在PTH治疗的第3天、第7天和第10天收集所有组中的细胞。当将小球在pH为7.4条件下溶解于含有0.05 M柠檬酸二钠和0.03 M的EDTA二钠的0.9% NaCl溶液中时，从海藻酸盐小球中释放出软骨细胞。通过以1,500 rpm的低速离心处理5分钟来收集细胞。
定量实时聚合酶链反应(PCR)
使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen, Valencia, CA)分离软骨细胞中的总RNA。使用Advantage RT-for-PCR试剂盒(Clontech, Palo Alto, CA)通过1μg RNA来转换第一互补链DNA。SOX9、聚集蛋白聚糖、IIα1型胶原(Col2al)、Xα1型胶原(Col10a1)、ALP、IHH、Bcl-2和Bax的信使RNA(mRNA)的水平使用具有Bio-Rad iQ5实时PCR检测体系(Bio-Rad, Hercules, CA)的定量实时PCR，使用iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad, Hercules, CA)来测量。在含有cDNA、每个基因的特异性引物和iQ SYBR Green Supermix的25μl混合物中发生反应。
特异性PCR产物通过双链DNA结合荧光染料SYBR Green来检测。相对mRNA水平通过每个PCR产物的阈值循环(Ct)值来计算并且使用比较Ct方法归一化至GAPDH的水平。将对照细胞中的每个基因表达的相对值设置为1，并且所有其他量转化为比值。解离(熔融)曲线在每次PCR之后产生以检查其特异性。
以一式三份来进行所有PCR扩增并且试验重复至少三次。
二甲基亚甲基蓝(DMMB)分析
如上所述，溶解海藻酸盐小球并且进一步由木瓜酶蛋白(300μg/ml)在60℃消化18小时。样品中DNA水平和硫酸化的糖胺聚糖水平使用Hoechst 33258 染料和1,9-二甲基亚甲基蓝染料来分别定量。DMMB分析的标准曲线使用浓度为0至25μg/μl的硫酸软骨素C水溶液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)来产生。
TUNEL染色
我们使用TUNEL(末端去氧-核苷酸转移酶介导的dUTP末端标记)染色法，使用原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红色(Roche, Mannheim, Germany)测量了凋亡的细胞。根据生产厂家的指南，将细胞用4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)来固定，细胞密度为1 * 106/ml并在室温下孵育10分钟，然后通过以2,000 rpm的速度离心5分钟使用细胞离心涂片器(Cytospin 3; Shandon, Cheshire, UK)固定在载玻片上。用PBS冲洗载玻片两次，通过在冰上在透化作用溶液(0.1 % Triton X-100的0.1 % 柠檬酸钠)中孵育2分钟使细胞被渗透。含有末端去氧核苷酸转移酶和若丹明(标记染料)的TUNEL反应混合物加至载玻片上并在潮湿的腔室中、黑暗中、37℃条件下孵育60分钟。通过阻断缓冲液(溶于PBS的0.1 % Triton X-100/0.5% 牛血清白蛋白)来停止反应。通过4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞进行复染色。在荧光显微镜下，使用用于若丹明的580 nm的激发波长和用于DAPI的365 nm的激发波长来观察载玻片。细胞核被DAPI染色为蓝色，仅仅凋亡的细胞被若丹明染色为红色。在每个载玻片上在5个显微视野(1.566 mm2/视野)中对染色的细胞进行计数。使用Image-Pro Plus分析软件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)来分析数据。软骨细胞中的凋亡速度界定为染色为红色的细胞(凋亡细胞)与染色为蓝色的细胞(总细胞)的比例。
动物实验
从BioLASCO 台湾购买54只12周大的雄性Sprague-Dawley大鼠(250-300gm)并且将这些大鼠关在标准实验室环境下(温度24℃，12小时明暗循环)，随意地喂食和喂水。实验之前这些动物适应实验室环境1周。
骨关节炎诱导和PTH治疗
将大鼠分为3组：OA(OA诱导而没有PTHP[1-34]治疗)(n=18)，OA加PTH(OA诱导之后PTH[1-34]治疗)(n=18)和PTH(PTH[1-34]治疗而没有OA诱导)(n=18)。用作对侧对照关节的每个左侧膝盖被注射没有PTH治疗或OA诱导的介质。右侧膝盖是研究关节。在OA组和OA加PTH组中采用关节内注射20μl 4%木瓜蛋白酶溶液和20μl 0.03 M的半胱氨酸在大鼠的右侧膝盖中诱导OA。所述注射采用26-g针通过髌韧带在实验的第1天、第4天和第7天给予(参见，例如，Nucl Med Commun (1996) 17(6): 529-35)。在OA加PTH组中，在OA诱导之后，每三天在右侧膝盖关节内注射40μl 10 nM的PTH直至大鼠死亡。在PTH组中，进行相同的PTH(1-34)治疗但是不诱导OA。当OA加PTH组中向大鼠给予PTH(1-34)治疗持续1周、3周和5周时，每个组中的六只大鼠在相同的时间点通过吸入CO2来杀死。
组织学分析
杀死大鼠之后，收集膝盖，并且收集具有关节软骨的胫骨平台，在组织学制备之前用10%中性缓冲福尔马林固定。然后，在10% 甲酸/PBS中对样品进行除去石灰质处理。将除去石灰质的胫骨关节样品嵌入石蜡中，并制备在冠状平面中的5-μm 磨片。用番红精O-固绿(fast green)对GAG进行染色(1% 番红精O与0.75%苏木精和1%固绿一同复染色)(Sigma, St. Louis MO)。对局部化的II型胶原和X型胶原进行免疫染色。对软骨中的凋亡细胞进行TUNEL染色。
组织形态分析
用番红精O对GAG进行染色为红色，在每个胫骨近端的关节软骨中总区域和红色染色的区域使用Imane-Pro Plus软件，5.0版本进行测量。计算每组中红色染色的区域和总区域的比例(红色:总区域)。
免疫组化
将胫骨关节部分再水合，并且用3% 过氧化氢阻断组织中的内源性过氧化物酶。在用一抗孵育之前，由酶消化样品用于抗原修复(参见例如，J Histochem Cytochem (2002) 50(8): 1049-58)。用于II型胶原免疫染色的酶消化最佳条件是PBS(pH 7.4，Sigma)中2.5% 透明质酸酶和1 mg/ml 链霉蛋白酶的混合物，在37℃条件下持续1小时。用于X型胶原免疫染色的最佳条件是0.1 单位/ml 软骨素酶 ABC(Sigma)持续1小时以及Tris HCl(pH 3.0)中的1 mg/ml胃蛋白酶，在37℃下持续15分钟。然后用胎牛血清(FBS)阻断胫骨关节部分持续1小时，用II型胶原的一抗(小鼠单克隆抗体，Chemicon, Temecula, CA)和X型胶原的一抗(大鼠多克隆抗体)(1:200；Cosmo Bio, Tokyo, Japan)或(小鼠单克隆抗体)(1:100)(Sigma)在37℃孵育4小时或在室温下孵育1小时。使用II型胶原的生物素标记的山羊抗-小鼠免疫球蛋白(Dako, Carpinteha, CA)和X型胶原的生物素标记的山羊抗-兔免疫球蛋白(Biocare Medical, Walnut Creek, CA)以及辣根过氧化物酶共轭的抗生蛋白链菌素(Dako, Carpenteria CA or Biocare Medical)孵育二抗30分钟。用含有0.01%过氧化氢的3,3’-二氨基联苯胺染色产生棕色。最后，用苏木精对胫骨关节部分复染色并在显微镜下观察。使用Image-Pro Plus软件，5.0版本(Media Cybernetics)测量免疫染色的相对密度(密度/区域；平均值± SEM区域 25.44 ± 2.77 mm2)。
用于胫骨关节部分的TUNEL染色
每个胫骨关节部分中的凋亡细胞通过TUNEL染色，使用原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红色来测量。再水合胫骨关节部分并且用蛋白酶K(Tris HCl[pH 7.4]中10μg/ml)孵育20分钟。透化作用之后，将胫骨关节部分用胃蛋白酶(在HCl[pH 2.0]中0.25%)在37℃条件下孵育30分钟。之后的过程与上述软骨细胞培养物的过程相同。还用DAPI和苏木精以及曙红对胫骨关节部分进行染色以检查细胞的局部化作用。对胫骨平台中的软骨的中心区域的DAPI染色的细胞(平均值± SEM 150 ± 40)进行计数。凋亡比例使用软骨细胞培养物中所使用的相同方法来界定。
统计学分析
数据表示为体内研究中的6个样品和体外研究中的4个样品的结果的平均值和SEM。所有试验重复至少3次。统计学显著性通过方差单向分析来评估，并且使用Scheffe测试进行多重比较。P值小于0.05认为是显著的。
实施例1：人关节软骨细胞的退化进程的抑制(体外)
正常的关节软骨细胞表达关节软骨正常起效所需的II型胶原、GAG和聚集蛋白聚糖。当经过终末分化，导致OA时，软骨细胞将表达包括碱性磷酸酶(ALP)、印度刺猬(IHH)和X型胶原在内的标记物，同时，II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达将降低。这种退化进程可导致软骨细胞矿化作用，并且最终细胞死亡。
图1A至图1F表示了用甲状旁腺素相关物质PTH(1-34)治疗之后，人关节软骨细胞中下列成分的水平的变化：(A)聚集蛋白聚糖的mRNA、(B)糖胺聚糖(GAG)、(C)IIα1型胶原(Col2a1)、(D)Xα1型胶原(CoMOaI)、(E)进行磷酸酶(ALP)和(F)印度刺猬(IHH)。左边起依次为：未处理(对照)的细胞、仅仅用PTH处理的细胞、仅仅用azaC处理的细胞或用azaC和PTH这两者处理的细胞。当azaC加PTH组达到PTH治疗3天、7天和10天时，收集所有组中的细胞。通过实时聚合酶链反应定量mRNA表达。棒状物表示4次复制的培养物的平均值和SEM。所有实验重复至少3次。数据通过方差的单向分析来评估，使用Scheffe方法进行多重比较。* =P<0.05; * * =P < 0.01相对于对照；#=P < 0.05; ##=P < 0.01。
分离软骨细胞中总RNA，如上面材料与方法中所述，制备第一互补链DNA(cDNA)。SOX9、聚集蛋白聚糖、IIα1型胶原(Col2a1)、Xα1型胶原(CoMOaI)、ALP、IHH、Bc1-2和Bax的信使RNA(mRNA)的水平使用具有Bio-Rad iQ5实时PCR检测体系(Bio-Rad, Hercules, CA)的定量实时PCR，使用iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad, Hercules, CA)来测量。反应在含有cDNA、每个基因的特异性引物以及iQ SYBR Green Supermix的25μl混合物中发生。
循环条件如下：对于IIα1型胶原(col2a1)、Xα1型胶原(col10a1)和甘油醛-3-膦酸盐脱氢酶(DAPDH)而言，循环条件为在95℃下1个循环持续3分钟、接着在95℃下40个循环持续10秒，61℃持续30秒以及55℃持续1分钟或对于ALP而言，循环条件为95℃下1个循环持续3分钟，接着在95℃下40个循环持续10秒，65℃下持续30秒以及55℃下持续1分钟。引物序列如下所示：(i)IIα1型胶原(81 bp产物)：正向引物：5'-CAA CAC TGC CAA CGT CCA GAT-3'，指定为SEQ ID NO:1，逆向引物：5'-TCT TGC AGT GGT AGG TGA TGT TCT-3'，指定为SEQ ID NO:2。(ii)Xα1型胶原(85 bp产物)：正向引物：5'-CAG ATT TGA GCT ATC AGA CCA ACA A-3'，指定为SEQ ID NO:3；逆向引物：5'-AAA TTC AAG AGA GGC TTC ACA TAC G-3'，指定为SEQ ID NO:4。(iii)GAPDH(126 bp产物)：正向引物：5'-TCT CCT CTG ACT TCA ACA GCG AC-3'，指定为SEQ ID NO:5，逆向引物：5'-CCC TGT TGC TGT AGC CAA ATT C-3'，指定为SEQ ID NO:6。(iv)碱性磷酸酶(64 bp产物)：正向引物：5'-AAC TTC CAG ACC ATT GGC TTG A-3'，指定为SEQ ID NO:7；逆向引物：5'-TTG CCG CGT GTC GTG TT-3'，指定为SEQ ID NO:8。(v)聚集蛋白聚糖(189 bp产物)：正向引物：5'- ACA GCT GGG GAC ATT AGT GG -3'，指定为SEQ ID NO:9，逆向引物：5'- GTG GAA TGC AGA GGT GGT TT -3'，指定为SEQ ID NO:10。(vi)印度刺猬(82 bp产物)：正向引物：5'- TCA TCT TCA AGG ACG AGG AG-3'，指定为SEQ ID NO:11，逆向引物：5'- ATA GCC AGC GAG TTC AGG -3'，指定为SEQ ID NO:12。(vii)Bcl-2(254 bp产物)：正向引物：5'- TCA TCT TCA AGG ACG AGG AG-3'，指定为SEQ ID NO:13，逆向引物：5'- ATA GCC AGC GAG TTC AGG-3'，指定为SEQ ID NO:14。(viii)Bax(161 bp产物)：正向引物：5'- TTT GCT TCA GGG TTT CAT CC，指定为SEQ ID NO:15，逆向引物：5'- TCC TCT GCA GCT CCA TGT TA，指定为SEQ ID NO:16。
通过SYBR绿色、双链DNA结合染料的荧光检测特异性PCR产物(Biotechniques (1998) 24(6): 954-8, 960, 962)。相对mRNA表达水平通过每个PCR产物的阈值循环(Ct)值来计算并且通过使用对比Ct方法(Methods (2001 ) 25(4): 402-8)使用GAPDH的水平归一化。在AzaC-诱导后第3天，对照细胞中的每个基因的表达相对量设置为100%，所有其他转化为相对于该基础的百分比变化。PCR反应之后，产生解离(熔融)曲线以检查PCR反应的特异性。所有PCR扩增以一式三份来进行，并且试验重复至少三次。
在PTH组中聚集蛋白聚糖、Col2al(II型胶原)、Col10a1(X型胶原)、ALP以及IHH基因的表达与在PTH治疗3至10天后对照组中那些基因的表达没有显著差异(图1A和图1C至图1F)。在azaC组中，聚集蛋白聚糖和Col2al的mRNA水平低于azaC诱导3天和7天之后对照组中聚集蛋白聚糖和Col2al的mRNA的水平(图1A和1C)。azaC诱导3天后，聚集蛋白聚糖水平是对照的56%(P<0.05)并且Col2al水平是对照的46.3%(P<0.01)。azaC诱导7天后，聚集蛋白聚糖水平是对照的31%(P<0.01)并且Col2al水平是对照的64.8%(P<0.05)。而且，azaC组中Col10al水平(对照的2.3至2.4倍)和ALP水平(对照的5.3至10.9倍)显著高于azaC诱导后7天和10天对照组中的水平(P<0.01)(图1D和1E)。azaC诱导后3天、7天和10天，IHH表达也显著提高(azaC诱导后3天，IHH表达水平为对照的6.5倍[P<0.01]，azaC诱导后7天，IHH表达水平是对照的2.6倍[P<0.05]，以及azaC诱导后10天，IHH表达水平是对照的2.7倍[P<0.05])。(图1F)。在azaC加PTH组中，azaC诱导后PTH治疗3天、7天和10天逆转了azaC诱导的、Col2a1 , Col10a1, ALP, IHH和聚集蛋白聚糖的mRNA水平的变化(除了Col2al和聚集蛋白聚糖的10天培养物)(图1)。治疗3天、7天之后，在azaC加PTH组中，聚集蛋白聚糖的mRNA水平显著高于azaC组中聚集蛋白聚糖的mRNA水平(治疗3天，P<0.05，治疗7天P<0.01)并且与对照组无显著差异。然而，PTH治疗10天后，聚集蛋白聚糖水平与azaC组中聚集蛋白聚糖的水平没有差异，聚集蛋白聚糖水平低于对照组中的水平(P<0.05)(图1)。PTH(1-34)治疗3天后，在azaC加PTH组中Col2al表达水平显著高于azaC组中Col2al表达水平(P<0.05)并且与对照组无显著差异。PTH(1-34)治疗7天后，azaC加PTH组中Col2al表达水平高于azaC组中Col2al表达水平(P<0.01)或对照组中Col2al表达水平(P<0.05)(图1C)。然而，PTH(1-34)治疗10天后，在所有3组中没有发现显著差异。在PTH(1-34)治疗后，由azaC诱导的Col10a1、ALP和IHH的mRNA水平的变化在azaC加PTH培养物中显著消除(治疗3天、7天和10天后CoMOal和ALP的P<0.01，治疗3天后IHH的P<0.01，治疗7天和10天后IHH的P<0.05)(图1D至图1F)。特别注意的是，在PTH(1-34)治疗的第3天，在azaC加PTH培养物中的Col10a1和ALP的表达低于对照培养物中Col10a1和ALP的表达(P<0.01)(图1D至图1E)。然而，在治疗的第7天，在任一种基因的表达方面，对照组和azaC加PTH组之间没有显著差异。在治疗的第10天，azaC加PTH培养物中ALP的表达高于对照培养物中ALP的表达(P<0.05)(图1E)。PTH(1-34)治疗3至10天之后，azaC加PTH组中的IHH的mRNA水平比对照培养物中IHH的mRNA水平低47%至71%，但是仅仅10天后的差异是接近统计学显著的(图1F)。
PTH组和对照组中软骨细胞培养物中GAG水平之间没有显著差异。azaC组中GAG水平显著低于azaC诱导后第3天和第7天对照组中GAG水平(P<0.01)(图1B)。PTH(1-34)治疗后第3天、第7天和第10天，azaC加PTH组中GAG水平显著高于azaC组中GAG水平(P<0.01)。虽然，在azaC加PTH组中治疗10天后，聚集蛋白聚糖的mRNA表达不被PTH(1-34)逆转(图1A)，但是azaC加PTH组中GAG水平仍然高于7天后和10天后对照组中GAG水平(P<0.01)(图1B)。在用PTH治疗患有azaC诱导的OA的人类的关节软骨细胞过程中观察到的Col10a1、ALP、IHH基因、聚集蛋白聚糖、Col2al和GAG的表达降低，这说明PTH治疗可逆转人类关节软骨细胞的退化进程并且抑制软骨细胞的终末分化。此外，正常人类关节软骨细胞的聚集蛋白聚糖、Col2al和GAG的表达显著不受PTH治疗的影响，这说明PTH或PTH衍生的物质可用于治疗早期OA而不影响正常软骨细胞。
实施例2：抑制人类关节软骨细胞凋亡(体外)
Bcl-2和Bax是细胞质蛋白家族的成员，所述细胞质蛋白调节凋亡。这两种蛋白具有非常相似的氨基酸序列但是功能相反：Bcl-2起抑制凋亡的作用，而Bax抵消这种作用(Hunter, J Biol Chem. (1996) 271(15):8521 -4)。
图2A至图2C表示用甲状旁腺素(PTH)治疗之后，人类关节软骨细胞中下列成分的变化：(A)Bcl-2的mRNA表达，(B)Bax的mRNA表达，(c)Bcl-2与Bax的比值。左边起为：未处理的(对照)细胞，仅仅用PTH处理的细胞，仅仅用azaC处理的细胞或用azaC和PTH这两者处理的细胞。当azaC加PTH组达到PTH治疗3天、7天、10天和14天时，收集所有组中的细胞。通过实时聚合酶链反应定量mRNA表达。棒状物表示4次复制的培养物的平均值和SEM。所有实验重复至少3次。数据通过方差的单向分析来评估，并且使用Scheffe方法进行多重比较。* =P<0.05; * * =P<0.01 相对于对照；#=P < 0.05; ##=P< 0.01。
为了研究经过更长的时间段Bcl-2和Bax的表达的变化，加入了14天组。在PTH组中，相对于对照培养物，Bcl-2和Bax的表达显示出无显著变化。虽然，治疗3至10天后，Bcl-2表达是对照中Bcl-2的表达的1.7倍，但是没有发现统计学上的显著差异。在azaC组中，在azaC诱导后3天和10天Bcl-2的mRNA水平显著提高(治疗3天后为对照的3.2倍[P<0.05]；治疗10天后为对照的4.7倍[P<0.01])(图2A)。在azaC加PTH组中，Bcl-2表达也高于对照培养物中Bcl-2表达(治疗3天后为对照的2.1倍[P<0.05]，治疗7天后为对照的2.1倍[P<0.05]，治疗10天后为对照的6.0倍[P<0.01])，这说明PTH治疗不可逆转azaC对Bcl-2的表达的影响。用PTH治疗14天后，各组之间的Bcl-2的表达没有显著差异(图2A)。在用PTH治疗3天至10天后，在azaC和azaC加PTH这两组中，Bax的mRNA表达水平略微降低(对照的61%至88%)，但是，这种差异不是统计学上显著的。然而，在azaC诱导14天后，azaC组中的Bax表达显著提高(对照的2.1倍[P<0.01])并且azaC加PTH组中Bax表达仍为对照培养物的1.6倍，这说明PTH治疗不可完全逆转azaC对Bax表达的影响(图2B)。用PTH治疗3天(P<0.05)后和10天(P<0.01)后，azaC组和azaC加PTH组中Bcl-2和Bax的比值高于对照组中Bcl-2和Bax的比值。PTH治疗7天或14天后，没有发现azaC组和azaC加PTH组的Bcl-2：Bax比值的显著差异(图2C)。当患者(例如患有晚期OA)发生了软骨细胞凋亡时，PTH治疗不可逆转细胞死亡。
通过使用TUNEL染色，比较PTH(1-34)(就azaC加PTH组而言)治疗14天后，对照组、azaC组和azaC加PTH组中人类关节软骨细胞培养物中的凋亡速度。
图3表示人类关节软骨细胞中甲状旁腺素对azaC诱导的凋亡的作用。比较了对照细胞、仅仅用azaC处理的细胞、用azaC加PTH处理的细胞的凋亡速度。棒状物表示4次复制的培养物的平均值和SEM。数据通过方差的单向分析来评估并且使用Scheffe方法进行多重比较。* * =P <0.01 相对于对照；##=P< 0.01。
azaC培养物中的人类关节软骨细胞中的凋亡速度显著高于对照培养物中的凋亡速度(提高了4.8倍，P<0.01)。在azaC加PTH培养物中的凋亡速度显著低于azaC培养物中的凋亡速度(P<0.01)，但是仍然高于对照培养物中的凋亡速度(提高了3.1倍，P<0.01)(图3)。虽然一旦开始凋亡，PTH治疗不可逆转软骨细胞凋亡，但是PTH治疗可预防软骨细胞死亡并且通过逆转早期OA过程中的软骨细胞的退化进程来降低凋亡速度。
实施例3：大鼠动物模型中抑制关节软骨细胞的退化进程
图4表示在正常的和骨关节炎(OA)大鼠关节软骨中甲状旁腺素对糖胺聚糖(GAG)的作用。测量来自OA组中的大鼠的对侧对照关节的胫骨近端中的番红精-O染色的关节软骨和OA组、OA加PTH组和PTH组中大鼠的研究关节的番红精O染色的区域与总区域的比值。比较PTH治疗1周、3周和5周之后的所有组中番红精O染色的区域与总区域(红色/总区域)的比值。棒状物代表6个样品的平均值和SEM。数据通过方差的单向分析来评估并且使用Scheffe方法进行多重比较。* * =P <0.01 相对于在每个时间点的OA组中的研究关节，##=P < 0.01。
根据上述方法，产生了来自OA组中的大鼠的对侧对照关节的番红精O染色(GAG阳性)的关节软骨的显微照片和来自OA组、OA加PTH组和PTH组中的大鼠的研究关节的番红精O染色(GAG阳性)的关节软骨的显微照片。测量番红精O染色的区域和总区域的比值(红色：总区域)并且比较各组之间的比值(图4)。在任何时间点，所有3组中的OA组、OA加PTH组和PTH组中的对侧对照关节的红色：总区域比值没有显著差异。在OA诱导后1周、3周和5周，OA组中研究关节中的软骨中红色：总区域的比值显著低于对侧对照关节的红色：总区域的比值(P<0.01)(图4)。OA诱导后PTH治疗1周和3周后，OA加PTH组中研究软骨中红色：总区域的比值还显著低于对侧对照组的红色：总区域的比值。然而，所述比值随时间增加。PTH(1-34)治疗5周后，OA加PTH组中软骨与对侧对照软骨没有显著差异(图4)。PTH(1-34)治疗1周、3周和5周后，OA加PTH组中的红色：总区域的比值显著高于OA组中红色：总区域的比值(P<0.01)(图4)。在PTH组中，在任何时间点，研究软骨和对侧对照软骨之间没有显著差异(图4)。
根据上述方法，产生了来自OA组中的大鼠对侧对照关节的免疫组化染色的关节软骨的显微照片和来自OA组和OA加PTH组中的大鼠的研究关节的免疫组化染色的关节软骨的显微照片。通过定量相对密度的免疫组化分析说明3组之间对侧对照关节的免疫局部化的II型胶原的密度没有显著差异。
图5表示在正常的和骨关节炎(OA)大鼠关节软骨中甲状旁腺素对免疫局部化的II型胶原的作用。测量了来自OA组中的大鼠的对侧对照关节和来自OA组和OA加PTH组中的大鼠的研究关节的胫骨近端中用关节软骨的II型胶原免疫染色的关节软骨。生长板软骨染色为阳性对照。未用一抗染色的生长板和关节软骨样品用作阴性对照。治疗3周和5周后，比较了对侧对照软骨、OA软骨和用PTH治疗的OA软骨。棒状物表示6个样品的平均值和SEM。数据通过方差的单向分析来评估并且使用Scheffe方法进行多重比较。* =P<0.05; * * =P<0.01，相对于每个时间点OA组中的研究关节，#=P<0.05。
相对于对侧对照关节，OA诱导之后3周和5周，来自OA组中的大鼠的研究关节中免疫局部化的II型胶原明显消失(P < 0.05)。在来自OA加PTH组的研究关节中，免疫局部化的II型胶原的密度显著高于OA组中免疫局部化的II型胶原的密度(P<0.05)，但是与OA诱导后PTH(1-34)治疗3周后对侧对照关节中的免疫局部化的II型胶原的密度没有差异(图5)。用PTH(1-34)治疗5周后，来自OA加PTH组的研究关节中的免疫局部化的II型胶原的密度不仅仅显著高于OA组中免疫局部化的II型胶原的密度(P<0.01)还显著高于OA加PTH组的对侧对照中的免疫局部化的II型胶原的密度(P<0.05)。免疫局部化的X型胶原主要在来自OA组的关节软骨细胞中发现，但是在PTH(1-34)治疗3周和5周之后，在OA加PTH组中的关节中不太明显。在对侧对照关节中没有发现明显的X型胶原染色的软骨细胞。当PTH治疗患有木瓜蛋白酶诱导的OA的大鼠时，GAG、II型胶原和X型胶原的表达还说明了逆转关节软骨细胞的退化进程的作用。
实施例4：大鼠动物模型中抑制关节软骨细胞凋亡
根据上述方法，产生了来自OA组中大鼠的对侧对照关节的TUNEL染色的关节软骨的代表性的显微照片和来自OA组和OA加PTH组中大鼠的研究关节的TUNEL染色的关节软骨的代表性的显微照片。
图6表示在正常的和骨关节炎(OA)大鼠关节软骨中甲状旁腺素对软骨细胞凋亡的作用。在PTH治疗1周、3周和5周之后，测量了来自OA组中大鼠对侧对照关节和OA组以及OA加PTH组中大鼠研究关节的胫骨近端中的TUNEL染色的关节软骨和4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的关节软骨。比较了对侧对照关节、OA关节和用PTH治疗的OA关节中的凋亡速度。棒状物表示6个样品的平均值和SEM。数据通过方差的单向分析来评估并且使用Scheffe方法进行多重比较。* =P<0.05; * * =P<0.01，相对于在每个时间点OA组中研究关节，#=P<0.05; ##=P<0.01。
OA诱导后3周(P<0.05)和5周(P<0.01)的结果说明来自OA组的研究关节中细胞凋亡速度显著高于对侧对照关节中的细胞凋亡速度(图6)。在OA加PTH组中，研究关节中的软骨细胞凋亡速度显著低于OA组中软骨细胞的凋亡速度(P<0.01)，并且与对侧对照关节没有表现出显著差异(图6)。因此，当用PTH治疗患有木瓜蛋白酶诱导的OA的大鼠时，软骨细胞的死亡得以预防并且凋亡速度降低。
如本文所描述的，azaC诱导的软骨细胞终末分化(模仿OA变化)培养模型和木瓜蛋白酶诱导的OA大鼠模型用于说明甲状旁腺素(PTH)可用于治疗早期骨关节炎、预防关节软骨细胞凋亡和逆转关节软骨细胞的退化进程。此外，根据本发明公开的方法，木瓜蛋白酶诱导的OA大鼠模型可用于说明通过关节内注射用PTH治疗早期OA。
实施例5：大鼠动物模型中抑制关节软骨细胞的退化进程的剂量范围
图7表示治疗5周之后，在正常和骨关节炎(OA)大鼠关节软骨中甲状旁腺素对糖胺聚糖(GAG)水平的影响。方法为上面标题为“动物实验”和“骨关节炎诱导和PTH治疗”的部分所述的，除了PTH(1-34)的给药剂量浓度为5 nM、10 nM或100 nM。测量了来自OA组中大鼠的对侧对照关节和OA组以及OA加PHT组中大鼠的研究关节的胫骨近端中番红精O染色的关节软骨的番红精O染色区域与总区域的比值。比较了PTH治疗5周后所有组中番红精O染色的区域与总区域(红色/总区域)的比值。棒状物表示6个样品的平均值和SEM。数据通过方差的单向分析来评估并且使用Scheffe方法进行多重分析。* * =P <0.01：在指明的时间点OA组中对照关节相对于研究关节；##=P <0.01：在OA加5 nM PTH、OA加10 nM PTH和OA加100 nM PTH组中OA关节相对于研究关节。
根据上述方法，产生了来自OA组中大鼠的对侧对照关节的番红精O染色(GAG阳性)的关节软骨的显微照片以及来自OA组和OA加PTH组中大鼠的研究关节的番红精O染色(GAG阳性)的关节软骨的显微照片。测量并比较了各组之间番红精O染色区域与总区域(红色：总区域)的比值。在所有三组之间，OA组和OA加PTH组中对侧对照关节的红色：总区域比值没有显著差异。OA诱导后5周，来自OA组中研究关节的软骨中的红色：总区域比值显著低于对侧对照关节的软骨中的红色：总区域比值(P<0.01)(图7)。PTH(1-34)治疗5周后，来自OA加PTH组的关节与对侧对照关节没有显著差异(图7)，即，PTH(1-34)治疗5周后，OA加PTH组中红色：总区域比值显著大于OA组中红色：总区域比值(P<0.01)(图7)。这些结果说明用5 nM、10 nM和100 nM PTH(1-34)治疗5周(每三天注射)可对GAG损失产生显著抑制。OA组的GAG水平显著低于对照组的GAG水平(p<0.01)。用5 nM、10 nM和100 nM PTH(1-34)治疗之后观察到的GAG水平显著高于OA组中GAG水平(p<0.01)。此外，对照组和PTH治疗组之间没有显著差异。
虽然本发明已通过实施例的方式并根据优选实施方式描述，应理解的是本发明不限于所公开的实施方式。相反，本发明意在覆盖各种改变和类似的排列(对于本领域技术人员而言是显而易见的)。因此，所附的权利要求书的范围应当被给予最广泛的解释以包含所有这些改变和类似的排列。
序列表
<110> 高雄医学大学
<120> 早期骨关节炎的治疗
<130> 383295-001WO
<140>
<141>
<150> 12/336,209
<151> 2008-12-16
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 1
caacactgcc aacgtccaga t 21
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 2
tcttgcagtg gtaggtgatg ttct 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 3
cagatttgag ctatcagacc aacaa 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 4
aaattcaaga gaggcttcac atacg 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 5
tctcctctga cttcaacagc gac 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 6
ccctgttgct gtagccaaat tc 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 7
aacttccaga ccattggctt ga 22
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 8
ttgccgcgtg tcgtgtt 17
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
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<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 9
acagctgggg acattagtgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
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gtggaatgca gaggtggttt 20
<210> 11
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<212> DNA
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<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 11
tcatcttcaa ggacgaggag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 12
atagccagcg agttcagg 18
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 13
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<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 14
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<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<400> 15
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<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 合成引物
<400> 16
tcctctgcag ctccatgtta 20
<210> 17
<211> 34
<212> PRT
<213> 人
<400> 17
Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn
1 5 10 15
Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His
20 25 30
Asn Phe
Claims (21)
1. 一种治疗动物中早期骨关节炎的方法，所述方法包括将治疗有效量的药剂递送进入需要这种治疗的动物的受侵害的关节的关节腔内，所述药剂选自甲状旁腺素和甲状旁腺素衍生物质。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述递送通过关节内注射来实现。
3. 如权利要求1所述的方法，其中，所述治疗有效量的药剂为约0.1皮摩尔至约5000皮摩尔范围内。
4. 如权利要求1所述的方法，其中，所述治疗有效量的药剂通过递送约0.1 ml至约10 ml的溶液来提供，在所述溶液中所述药剂的浓度为约1 nM至约500 nM。
5. 如权利要求1所述的方法，其中，所述治疗有效量的药剂通过递送约1 ml至约3 ml的溶液来提供，在所述溶液中所述药剂的浓度为约5 nM至约100 nM。
6. 如权利要求1所述的方法，其中，所述药剂包含甲状旁腺素的氨基酸1-34。
7. 如权利要求1所述的方法，其中，所述药剂基本上由甲状旁腺素的氨基酸1-34构成。
8. 一种抑制动物中关节软骨细胞凋亡的方法，所述方法包括将治疗有效量的药剂递送至需要这种治疗的动物的受侵害的关节的关节腔内，所述药剂选自甲状旁腺素和甲状旁腺素衍生物质。
9. 如权利要求8所述的方法，其中，所述递送通过关节内注射来实现。
10. 如权利要求8所述的方法，其中，所述有效量的药剂为约0.1皮摩尔至约5000皮摩尔范围内。
11. 如权利要求8所述的方法，其中，所述有效量的药剂通过递送约0.1ml至约10 ml溶液来提供，所述溶液中所述药剂的浓度为约1 nM 至约500 nM。
12. 如权利要求8所述的方法，其中，所述有效量的药剂通过递送约1 ml至约3 ml溶液来提供，所述溶液中所述药剂的浓度为约5 nM至约100 nM。
13. 如权利要求8所述的方法，其中，所述药剂包含甲状旁腺素的氨基酸1-34。
14. 如权利要求8所述的方法，其中，所述药剂基本上由甲状旁腺素的氨基酸1-34构成。
15. 如权利要求8所述的方法，其中，所述动物患有早期骨关节炎。
16. 一种抑制动物中受侵害的关节的关节软骨细胞的退化进程的方法，所述方法包括将治疗有效量的药剂递送进入需要这种治疗的动物的受侵害的关节的关节腔内，从而使所述关节软骨细胞与所述药剂接触，所述药剂选自甲状旁腺素和甲状旁腺素衍生物质。
17. 如权利要求16所述的方法，其中，所述递送通过关节内注射来实现。
18. 如权利要求16所述的方法，其中，所述有效量的药剂为约0.1皮摩尔至约5000皮摩尔的范围内。
19. 如权利要求16所述的方法，其中，所述治疗有效量的药剂通过递送约0.1 ml至约10 ml的溶液来提供，所述溶液中所述药剂的浓度为约1 nM至约500 nM。
20. 如权利要求16所述的方法，其中，所述治疗有效量的药剂通过递送约1 ml至约3ml的溶液来提供，所述溶液中所述药剂的浓度为约5 nM至约100 nM。
21. 如权利要求1、8或16所述的方法，其中所述动物是人类。
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