CN116919932A - 成骨剂及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于在有需要的受试者中减少或抑制骨丢失的组合物和方法，具体提供了包含一种或多种以有效减少或抑制骨丢失或者促进骨形成(优选经由刺激成骨细胞分化)的量的成骨化合物或其功能性衍生物的药物组合物，所述组合物特别适用于治疗与骨质疏松症有关的骨丢失。本发明还描述了治疗或预防骨丢失的方法，其使用所述组合物并任选地与一种或多种治疗剂、预防剂或诊断剂或程序进行组合。

Description

成骨剂及其用途

技术领域

本发明总体上涉及用于治疗、减轻或预防诸如在骨质疏松症中的骨丢失(亦称骨质流失，英文原文：bone loss)的组合物和方法。

背景技术

骨质疏松症是普遍的骨病。该病特征在于骨丢失加速，从而导致脆且弱的骨头，因此容易骨折。骨是不断再生，以新骨替代旧骨，然而在老年个体中这个过程的不太有效，并且，老年个体丢失的骨的程度会比被新骨替代的程度更严重，这些都导致更薄且更弱的骨头。患有骨质疏松症的患者具有增加的骨折风险，特别是髋部、脊柱和腕部。

骨质疏松症通常是由于骨重塑期间在骨形成(成骨细胞的作用)和骨吸收(破骨细胞的作用)之间的不平衡而发生的。骨质疏松症的治疗主要旨在预防脆性骨折，其通过减少骨丢失(抗吸收剂)或者备选地通过提高骨密度和强度(合成代谢剂)进行(Khan,SN等人，Clin Obstet Gynecol 56,694-702(2013))。许多目前使用的抗骨质疏松剂通过抑制破骨细胞活性以减少骨吸收而起作用。然而，骨质疏松症是一种慢性疾病，并且通过抗吸收剂以抑制骨重塑的长期治疗可能导致修复失败、微裂纹和骨坏死(Miller,PD等人，OsteoporosInt.21,1793-802(2010))。诱导成骨在治疗和/或预防骨质疏松症方面是更可行的方法。因此，迫切需要通过增加成骨细胞活性来逐渐促使骨形成的有效疗法。

尽管最近在理解与骨质疏松症相关的骨丢失的机理方面取得了许多进展，但是仍然缺乏针对这些病症的有效治疗。

一类来源于来自天然植物来源的雌激素样化合物的成骨剂值得注意，例如“植物雌激素”(Poluzzi E等人，Curr Med Chem.21,417-36(2014))。植物雌激素作为成骨剂的应用与内源性雌激素通过维持成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的平衡来调控绝经后妇女的骨量的事实有关。绝经后阶段中的雌激素缺乏可以导致骨吸收增强，从而导致骨质疏松症。虽然雌激素可以用于治疗绝经后妇女的骨质疏松症，但它也可能增加患乳腺癌和子宫癌的风险，但植物雌激素具有明显不同于雌激素的活性分布曲线，并且因此可为骨质疏松症提供新的治疗机会。

因此，本发明的一个目的是提供新的和有效的用于治疗与骨丢失相关的疾病和病症的治疗剂和方法。

本发明的另一个目的是提供新的方法和治疗以通过刺激成骨细胞分化、活性和存活来促进骨修复、形成。

发明内容

本发明公开了包含有效量的一种或多种成骨化合物的药物组合物，及其在制备治疗、抑制或预防骨丢失的制剂中用途，以及用于治疗、抑制或预防骨丢失的方法。作为本发明的特征，组合物的施用在有需要的受试者中有效地减少或抑制骨丢失。

本发明所公开的组合物和方法对于治疗骨丢失病症如骨质减少(osteopenia)和骨质疏松症(osteoporosis)特别有效。组合物包含一种或多种以在治疗部位处/附近有效刺激成骨细胞分化、成骨细胞活性和/或减少成骨细胞凋亡的量的成骨分子。在一些实施方案中，一种或多种成骨分子是菲或其衍生物。在一个实施方案中，组合物基本上由厄弗酚(effusol)或其衍生物组成。

本发明描述了用于增强通过成骨细胞的钙沉积到骨基质中的速率的组合物及其使用方法。优选地，所公开的组合物和方法还在治疗部位处/附近有效地减少或抑制通过破骨细胞的骨吸收。

本发明描述了用于增强成骨蛋白表达的组合物及其使用方法。示例性的成骨蛋白包括碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、骨唾液酸蛋白及其组合。描述了用于增加成骨细胞特异性转录因子的水平的组合物及其使用方法。示例性成骨细胞特异性转录因子包括RUNX2、DLX5、SP7及其组合。

本发明还描述了用于增加一种或多种参与成骨细胞分化的促分裂原活化激酶(MAPK)的磷酸化水平的组合物及其使用方法。示例性MAPK包括p38。还描述了用于增加Wnt/β-连环蛋白信号传导通路的一个或多个成员的蛋白质表达、转录本水平和/或活性的组合物及其使用方法。

本发明还提供了使用这些组合物治疗有需要的受试者的方法。典型地，将所公开的组合物全身性地施用于受试者，优选人受试者。在一些实施方案中，组合物在另外的治疗/程序(例如利用一种或多种治疗剂、预防剂或诊断剂治疗)之前、结合、之后或交替施用。

本发明所公开的方法和组合物的额外优点将部分地在下面的描述中阐述，并且部分地将从描述中理解，或者可以通过所公开的方法和组合物的实践来了解。所公开的方法和组合物的优点将借助于在所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都只是示例性和解释性的，而不是对所要求保护的发明的限制。

附图说明

附图构成此说明书一部分，其含义并入本说明书中，附图举例说明了所公开的方法和组合物的若干实施方案，并且与描述一起用于解释所公开的方法和组合物的原理。

图1A-1B是直方图，其示出了(图1A)使用DMSO、0.5μM、1.5μM和5μM的F1、0.5μM、1.5μM和5μM的F4以及抗坏血酸盐和β-甘油磷酸盐(ASC+β-GP)在4天时间内F1和F4对MC3T3-E1成骨细胞中的ALP活性的作用；(图1B)F1和F4对MC3T3-E1成骨细胞中的细胞活力的作用。

图2A-2F是条形图，其示出了通过qPCR在用5μM F1、5μM F4、30ng/ml BMP2、抗坏血酸盐加β-甘油磷酸盐或0.05％DMSO媒介物处理4天时间的MC3T3-E1细胞中测定的与成骨细胞分化相关的成骨基因的mRNA水平，其包括ALP(图2A)、OCN(图2B)、OPN(图2C)、Wnt3A(图2D)、Frizzled 1(图2E)、Runx2(图2F)。

图3是条形图，其示出了在存在或不存在p38抑制剂SB203580(SB)的情况下在用DMSO媒介物或5μM F4处理2天时间的MC3T3-E1成骨细胞中的ALP活性。

图4A-4E是条形图，其示出了(图4A)在MC3T3-E1成骨细胞中通过0.5μM、1.5μM、5μM、10μM的F4或10nM雌二醇(E2)对ERE-介导的启动子活性的刺激；(图4B)通过在10nM和1μM浓度下的ICI182780对5μM F4-刺激的ERE启动子活性的抑制；(图4C)通过在10nM和1μM浓度下的ICI182780对雌二醇刺激的ERE启动子活性的抑制；在第4天(图4D)和第7天(图4E)在1nM、10nM、100nM、1μM的ICI182780对通过5μM F4刺激的MC3T3-E1成骨细胞的ALP活性的作用。

图5A-5B是条形图，其示出了在与0.1％DMSO、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL灯芯草(Medulla Junci)(MJ)、40μM抗坏血酸盐(Asc)加5mMβ-甘油磷酸盐(β-GP)、5μM F1或5μM F4温育四天(图5A)和七天(图5B)时对MC3T3-E1成骨细胞的ALP酶活性的作用。

图6示出了通过量子力学/分子力学计算确定的与雌激素受体结合的厄弗酚模型。

图7是示出了在指定浓度的F4存在下与雌激素受体α和β结合的放射性标记的17β-雌二醇的抑制的曲线。

图8A-8E是示出了通过溴脱氧尿苷(BrdU)掺入测定确定的F4对雌激素处理的乳腺癌细胞的抗增殖性能的曲线。图8A示出了用17β-雌二醇处理的MCF7细胞的增殖的倍数增加。图8B和8C示出了用指定浓度的F4和F5处理的MCF7细胞的增殖的倍数变化。图8D示出了F4(5μM)和F5(脱氢厄弗酚，5μM)在MCF7细胞(ER阳性)中抑制通过17β-雌二醇诱导的细胞增殖，但是对MDA-MB-231细胞(ER阴性)没有作用(图8E)。

图9A-9B是条形图，其示出了雌激素受体响应性元件报告基因处理对F4的荧光素酶活性。F4处理下调了MCF7细胞的雌激素受体荧光素酶报告基因活性(图9A)，但是在MDA-MB-231细胞中没有下调(图9B)。

具体实施方式

通过参考以下特定实施方案的详细描述和其中所包括的实施例以及通过参考附图及其先前和随后的描述，可以更容易地理解所公开的方法和组合物。

本发明公开了用于在有需要的受试者中治疗或预防骨丢失或促进骨形成的化合物、组合物及其用途和方法。在一些表达方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的一种或多种菲化合物或其衍生物，以在该受试者中减少骨丢失的一种或多种症状、预防骨丢失的一种或多种症状、促进骨形成或其组合。在一些表达方式中，骨丢失的一种或多种症状的减少、骨丢失的一种或多种症状的预防、骨形成的促进或其组合是相对于未处理的对照(未治疗的对照，untreated control)而言的。

在一些表达方式中，所述用途包括以包含一种或多种菲化合物或其衍生物的活性剂的药物组合物用于制备治疗或预防骨丢失或促进骨形成的制剂。

在一些表达方式中，组合物是药物组合物。在一些表达方式中，药物组合物包括包含一种或多种菲化合物或其衍生物的活性剂，该一种或多种菲化合物或其衍生物量为有效减少骨丢失的一种或多种症状、预防骨丢失的一种或多种症状、促进骨形成或其组合。在一些表达方式中，骨丢失的一种或多种症状的减少、骨丢失的一种或多种症状的预防、骨形成的促进或其组合是相对于未处理的对照而言的。

在一些表达方式中，一种或多种菲化合物包括厄弗酚。在一些表达方式中，受试者是人。在一些表达方式中，受试者具有骨质减少或骨质疏松症。

在一些表达方式中，一种或多种菲化合物以在受试者中有效刺激成骨细胞分化、活性、存活或其组合的量施用或存在于组合物中。在一些表达方式中，成骨细胞分化、活性、存活或其组合的刺激是相对于未处理的对照而言的。

在一些表达方式中，一种或多种菲化合物以相对于未处理的对照有效增强一种或多种成骨蛋白的表达的量施用或存在于组合物中。在一些表达方式中，一种或多种成骨蛋白选自由碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、骨唾液酸蛋白及其组合组成的组。

在一些表达方式中，一种或多种菲化合物以在受试者中有效增加一种或多种成骨细胞特异性转录因子的水平的量施用或存在于组合物中。在一些表达方式中，一种或多种成骨细胞特异性转录因子的水平的增加是相对于未处理的对照而言的。在一些表达方式中，一种或多种成骨细胞特异性转录因子选自由RUNX2、DLX5、SP7及其组合组成的组。

在一些表达方式中，一种或多种菲化合物以在受试者中有效增加参与成骨细胞分化的一种或多种促分裂原活化激酶(MAPK)的磷酸化的量施用或存在于组合物中。在一些表达方式中，参与成骨细胞分化的一种或多种MAPK的磷酸化的增加是相对于未处理的对照而言的。在某些形式中，一种或多种MAPK是p38。

在一些表达方式中，一种或多种菲化合物以在受试者中有效增加Wnt/β-连环蛋白信号传导通路的一个或多个成员的蛋白质表达、转录本水平、活性或其组合的量施用。在一些表达方式中，Wnt/β-连环蛋白信号传导通路的一个或多个成员的蛋白质表达、转录本水平、活性或其组合的增加是相对于未处理的对照而言的。

在一些表达方式中，一种或多种菲化合物包括厄弗酚。在一些表达方式中，一种或多种菲化合物基本上由厄弗酚组成。在一些表达方式中，一种或多种菲化合物由厄弗酚组成。

在一些表达方式中，厄弗酚是从灯芯草属(Juncus)富集的、纯化的或其组合。在一些表达方式中，厄弗酚是从灯芯草(Juncus effuses)富集的、纯化的或其组合。在一些表达方式中，厄弗酚比其在来自灯芯草属的粗提取物中的浓度更浓10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或超过100倍。在一些表达方式中，厄弗酚比其在来自灯芯草(Juncus effuses)的粗提取物中的浓度更浓10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或超过100倍。

本领域技术人员能够理解，除非另有说明，否则所公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或特别的试剂，并且因此可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特别实施方案的目的，并不意图进行限制。

A.定义

除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则在描述当前所要求保护的发明的上下文中(尤其是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”、“一种”、“该”及类似指代应被解释为涵盖单数和复数二者。

除非在本文中另有说明，否则本文中数值范围的列举仅意图用作个别地提及落入该范围内的各个单独值的简写方法，并且各个单独的值如同其在本文中个别地被列举一样结合到说明书中。

使用的术语“约”意图描述在大约+/-10％的范围内高于或低于规定值的值；在其他实施方案中，这些值可以在大约+/-5％的范围内高于或低于规定值的值的范围内；在其他实施方案中，这些值在大约+/-2％的范围内高于或低于规定值的值的范围内；在其他实施方案中，这些值在大约+/-1％的范围内高于或低于规定值的值的范围内。前述范围意图通过上下文变得清楚，并且不暗示进一步的限制。除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文所描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行。除非另有声明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅意图更好地举例说明本发明并且不对本发明的范围施加限制。说明书中的语言都不应解释为表明任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必要的。

术语“受试者”或“个体”是指动物，尤其是哺乳动物。例如，受试者可以是脊椎动物，更具体地是哺乳动物(例如，人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类动物、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或者爬行动物或两栖动物。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，意图涵盖成年和新生儿受试者以及胎儿，无论是雄性还是雌性。患者是指患有疾病或病症的受试者。术语“患者”包括人类和兽医受试者。优选的受试者是需要用所公开的化合物、组合物或方法治疗的那些。

与化合物相关的术语“衍生物”是指具有化学改变的化合物(如所公开的化合物)的修饰形式。可以被称为修饰的这样的改变可以包括例如化合物的水解、还原或氧化产物。水解、还原和氧化反应在本领域是已知的。

与化合物相关的术语“功能性衍生物”是指(至少部分地)保留化合物的功能的该化合物的衍生物。例如，在厄弗酚的情况下，在本公开内容的上下文中，厄弗酚的功能性衍生物可以包括在具有低骨量(如骨质减少或骨质疏松症)的受试者中保留例如刺激成骨细胞分化和活性的作用的厄弗酚的衍生物。

术语“载体”或“赋形剂”是指制剂中的有机或无机、天然或合成的非活性成分(一种或多种活性成分与其组合)。在一些表达方式中，载体或赋形剂可以是添加到药物组合物中以进一步有利于化合物的施用的惰性物质，和/或不会对生物体引起显著刺激并且不会废除所施用化合物的生物活性和特性。载体可以由例如被认为是安全和有效的并且可以施用于个体而不会引起不期望的生物学副作用或不希望的相互作用的材料组成。载体可以是例如存在于药物制剂中的除所述活性成分或多种活性成分外的任何组分。术语“载体”包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填料和涂层组合物。

载体也可以是涂层组合物的组分，其可以包括增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂和助流剂。可以如参考文献，诸如“Pharmaceutical dosage form tablets(药物剂型片剂)”,eds.Liberman等人(New York,Marcel Dekker,Inc.,1989),“Remington–The science andpractice of pharmacy(雷明顿—药学科学与实践)”，第20版，Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2000以及“Pharmaceutical dosage forms and drug deliverysystems(药物剂型及药物递送系统)”，第6版，Ansel等人(Media,PA:Williams andWilkins,1995)中所述来制备延迟释放剂型，这些参考文献提供了关于用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊和颗粒剂的延迟释放剂型的载体、材料、设备和工艺的信息。

与化合物或组合物有关的术语“有效量”是指化合物的无毒但足以提供所期望或参考结果的量。化合物的术语“治疗有效量”是指化合物的无毒但足以提供所期望或参考治疗结果的量。例如，有效量可以是指足以减少或抑制所治疗的病症、疾病或病况，或以其他方式提供所期望药理学和/或生理学作用的剂量。精确剂量将根据各种各样的因素如受试者相关变量(例如年龄、免疫系统健康等)、所治疗疾病或病症的严重性以及施用途径和所施用药剂的药代动力学而有所不同。如本文其他地方所讨论的，并且已知的，所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、正在治疗的疾病的严重性、所使用的特定化合物，其施用模式等。因此，不可能规定确切的“有效量”。然而，恰当的有效量可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。

可以通过评价已知在评价需要所公开组合物来治疗涉及骨丢失或其他疾病和/或病症的疾病和病症的受试者的状态方面有用的病史、体征、症状和客观实验室测试的特定方面，来确定根据本文所述的方法施用特定剂量的化合物或组合物的功效。这些体征、症状和客观实验室测试将根据所治疗或预防的特定疾病或病症而有所不同，正如任何治疗这样的患者的临床医生或在此领域进行实验的研究人员所知道的那样。例如，如果基于与恰当对照组的比较和/或对一般人群或特定个体中疾病的正常进展的了解：(1)受试者的身体状况显示得到改善(例如，肿瘤已部分或完全消退)，(2)疾病或病症的进展显示得到稳定或减慢或逆转，或(3)对治疗疾病或病症的其他药物的需求得到减少或消除，那么特定的治疗方案将被认为是有效的。

术语“药用”是指根据诸如美国食品和药物管理局等机构的指导方针，在合理的医学判断范围内，适用于与人和动物的组织接触而没有过度毒性、刺激性、变态反应或者与合理的收益/风险比相称的其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型。术语“药用载体”是指药物制剂中有利于组合物在体内递送的所有组分。药用载体包括但不限于稀释剂、防腐剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、溶胀剂、填料、稳定剂及其组合。

术语“预防(英文原文包括prevent、prevention和preventing”是指将组合物施用于处于由疾病或病症引起的一种或多种症状(例如，骨丢失)的风险或易感性的受试者或系统，以引起疾病或病症的特定症状的停止、疾病或病症的一种或多种症状的减少或预防、疾病或病症的严重性的减轻、疾病或病症的完全消融、疾病或病症的发展或进展的稳定或延迟。优选地，用于预防的治疗将在疾病或病症的临床症状发作之前进行，以防止与疾病或病症相关的异常的物理表现。

术语“抑制”、“压制”、“降低”、“干扰”和/或“减少”(和类似术语)通常是指相对于自然的、预期的或平均的或者相对于当前状况直接或间接减少功能、活动、水平、浓度、行为等的动作。应理解，这典型地与一些标准或预期值有关，换句话说，它是相对的，但它并不总是需要参考标准或相对值。例如，抑制、压制、降低或减少或干扰骨丢失的某种物质可能会停止或减慢成骨细胞凋亡或破骨细胞活性。这可以是功能、活性、水平、浓度、行为等的完全抑制、压制、降低、干扰和/或减少。抑制、压制、降低、干扰和/或减少可以与对照或标准水平进行比较。抑制、压制、降低、干扰和/或减少可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

术语“增加”、“增强”、“刺激”、“促进”和/或“诱导”(和类似术语)通常指相对于自然的、预期的或平均的或者相对于当前状况直接或间接地改善或增加功能、活动、水平、浓度、行为等的动作。应理解，这典型地与某一标准或预期值有关，换句话说，它是相对的，但它并不总是需要参考标准或相对值。例如，在成骨细胞分化的上下文中，增加、刺激、促进、诱导或增强骨形成的某种物质可能会诱导成骨分子如碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、骨唾液酸蛋白和胶原蛋白1A1的产生和/或分泌。增加、增强、刺激、促进和/或诱导可以与对照或标准水平进行比较。增加、增强、刺激、促进和/或诱导可以为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64,65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、320％、325％、340％、350％、360％、375％、380％、400％、425％、450％、475％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、10³％、10⁴％、10⁵％、10⁶或10⁷％。

术语“治疗”和“处理”是指意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症而对受试者进行的医学管理。该术语包括积极治疗，即专门针对改善疾病、病理状况或病症的治疗，并且还包括病因治疗，即针对消除相关疾病、病理状况或病症的病因的治疗。此外，该术语还包括姑息治疗，即设计用于缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即针对最小化或者部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症的发展的治疗；以及支持治疗，即用于补充另一种针对改善相关疾病、病理状况或病症的特定治疗的治疗。应理解，治疗虽然意图治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症，但实际上不需要导致治愈、改善、稳定或预防。治疗的作用可以如本文所述和本领域已知的适用于所涉及的疾病、病理状况或病症的方式进行测量或评估。这样的测量和评估可以以定性和/或定量的方式进行。因此，例如，可以将疾病、病理状况或病症的特性或特征和/或疾病、病理状况或病症的症状减少至任何作用或至任何量。

如本文所使用的，术语“需要治疗”是指由护理人员(例如，在人的情况下为医生、护士、执业护士或个人；在动物(包括非人类哺乳动物)的情况下为兽医)做出的判断：受试者需要治疗或将从治疗中受益。这种判断是基于护理人员专业知识范围内的各种各样的因素做出的，但包括作为通过北风那么的化合物可治疗的病症的结果，受试者生病或将会生病的知识。对于所公开的治疗，表现出骨丢失或处于骨丢失风险中的受试者是需要治疗的优选受试者。

术语“施用”、“施予”和“给药”是指将物质、材料或产品与受试者的身体接触。例如，施用物质、材料或产品包括接触受试者的皮肤并将物质、材料或产品注射或植入到受试者中。

术语“肠胃外施用”是指通过不同于经由消化道或者非侵入性局部或区域途径的任何方法进行施用。例如，肠胃外施用可以包括静脉内、皮内、腹膜内、胸膜内、气管内、肌肉内、皮下、结膜下、通过注射和通过输注向患者施用。

术语“局部施用”是指对皮肤、孔口或粘膜的非侵入性施用。局部施用可以局部地施用，即它们能够在施加的区域中提供局部作用而不会全身暴露。局部制剂可以经由吸收到个体的血流中来提供全身作用。局部施用可以包括但不限于皮肤和透皮施用、面颊施用、鼻内施用、阴道内施用、膀胱内施用、眼部施用和直肠施用。

可互换使用的术语“生物活性剂”和“活性剂”包括但不限于在体内局部或全身起作用的生理学或药理学活性物质。生物活性剂是用于治疗(例如，治疗剂)、预防(例如，预防剂)、诊断(例如，诊断剂)、治愈或缓解疾病或病症的物质、影响身体的结构或功能的物质或者在被放置在预定的生理环境中后变为具有生物活性或更大活性的前药。

可互换使用的术语“足够”和“有效”是指实现一个或多个所期望结果所需的量(例如质量、体积、剂量、浓度和/或时间段)。

术语“生物相容性”是指与任何代谢物或其降解产物一起通常对接受者无毒且不会对接受者引起任何显著不利作用的材料。一般而言，生物相容性材料是在施用于患者时不会引发显著炎症或免疫反应的材料。

术语“可生物降解的”通常是指在生理条件下将降解或侵蚀成能够被受试者代谢、消除或排泄的更小单位或化学物质的材料。降解时间是组成和形态的函数。降解时间可以为数小时到数周。

术语“分子量”通常是指材料的质量或平均质量。如果是聚合物或低聚物，则分子量可以指本体聚合物的相对平均链长或相对链质量。在实践中，聚合物和低聚物的分子量可以以多种方式(包括凝胶渗透色谱法(GPC)或毛细管粘度测定法)进行估算或表征。GPC分子量报告为重均分子量(Mw)，而不是数均分子量(Mn)。毛细管粘度法提供了作为使用一组特定的浓度、温度和溶剂条件从稀释的聚合物溶液中确定的特性粘度的分子量的估算值。

术语“基本上由……组成”将提及的材料或主题限制为规定的材料或步骤，“以及不会实质性地影响所提及的材料或主题的基本和新颖特性的那些材料或步骤”。在reHerz,537F.2d 549,551-52(CCPA 1976)中。

术语“骨丢失”是指骨密度、骨量或其他骨含量测量值的降低。术语“骨丢失的症状”是指由骨丢失产生的作用。骨丢失症状的实例包括骨折、牙龈萎缩、握力降低、软脆的指甲、抽筋、肌肉酸痛、骨痛、身高下降和整体健康状况不佳。骨丢失的症状还可以包括与骨形成和骨丢失相关的生理和代谢测量值，如低骨密度的测量值。

术语“骨形成”是指在生长期间骨的形成以及在骨重塑期间骨密度的增加或提高。骨重塑是骨在吸收过程中的持续更新，随后是在形状上几乎没有变化的情况下的骨更换。这是通过成骨细胞和破骨细胞完成的。所公开的化合物、组合物和方法优选地用于在骨重塑的上下文中增加或刺激骨形成。

术语“相对”和“相对于”是指根据参考、对照或比较条件、测量、水平等来描述的条件、测量、水平等。

在生物学过程的上下文中，术语“涉及”和“参与”是指由参考产品、条件或过程引起的生物过程或影响参考产品、条件或过程的的生物过程。例如，成骨细胞和破骨细胞参与骨重塑。

术语“未处理的对照”是指与用对照化合物、组合物或方法处理的总体类似于经治疗的受试者(例如，患有相同的疾病或病症)的受试者。对照化合物、组合物或方法是与处理化合物、组合物或方法相同的化合物、组合物或方法，除了不存在或替代规定组分(例如，活性成分)。

在基因和基因产物的上下文中，术语“表达”是指来自基因的信息通过其用于合成功能基因产物的过程。表达可以以各种各样的方式测量，这包括例如通过测量基因表达的一种或多种产物的水平。

术语“骨质减少”是指其中骨矿物质密度低于正常值(通常骨矿物质密度T-评分在-1.0和-2.5之间)的病症。骨质减少可以是骨质疏松症的前兆。术语“骨质疏松症”是指其中降低的骨强度增加断骨风险的疾病。所有骨质疏松症的病例中的潜在机制是骨吸收和骨形成之间的不平衡。骨质疏松症发展的三种主要机制是峰值骨量不足(骨骼在生长期间发育的量和强度不足)、过度骨吸收和重塑期间新骨的形成不足。这三种机制的相互作用是脆性骨组织发育的基础。

术语“破骨细胞”是指一种类型的分解骨组织的骨细胞。这种功能对于椎骨骨骼的维护、修复和重塑至关重要。破骨细胞通过分泌酸和胶原酶在分子水平上分解和消化水合蛋白质和矿物质的复合物，这一过程称为骨吸收。这个过程还有助于调节血钙水平。术语“破骨细胞分化”是指破骨细胞从前体细胞的发育。通常理解的是，破骨细胞通过巨噬细胞在活化剂的影响下自融合而形成。术语“破骨细胞活性”是指骨组织被破骨细胞破坏。如上下文所指出的，该术语可以指骨分解的整个过程或作为此过程的一部分的破骨细胞的任何一种或多种组分活性。术语“破骨细胞存活”是指破骨细胞的持续活力。通常，破骨细胞功能可以部分通过促进或抑制破骨细胞存活来调节或调控。例如，糖皮质激素可以增加破骨细胞存活。

术语“成骨细胞”是指合成骨的具有单个核的细胞。成骨细胞是间充质干细胞的特化、终末分化产物。成骨细胞合成致密、交联的胶原蛋白和数量少得多的特化蛋白质(包括构成骨骼的有机基质的骨钙素和骨桥蛋白)。术语“成骨细胞特异性转录因子”是指在成骨细胞中被特异性抑制的转录因子。优选的成骨细胞特异性转录因子是参与成骨细胞的骨形成活性的那些。成骨细胞特异性转录因子的实例包括RUNX2、DLX5和SP7。

术语“成骨蛋白质”是指促进骨形成和/或指导骨组织结构的蛋白质。

术语“蛋白质水平”是指一种或多种参考蛋白质的水平(例如，量、浓度)。术语“转录本水平”是指一种或多种参考转录物的水平(例如，量、浓度)。

术语“通路”和“信号传导通路”是指细胞中的一组分子，它们共同起作用以控制一种或多种细胞功能，如细胞分裂或细胞死亡。在通路中的第一个分子接收到信号之后，它会激活另一个分子。重复此过程，直到最后一个分子被激活并执行细胞功能。信号传导通路的异常激活可以导致癌症，并且正在开发药物来阻断这些通路。这些药物可能有助于阻止癌细胞生长并杀死癌细胞。在信号传导通路的上下文中，术语“蛋白质水平”是指作为信号传导通路的一部分的一种或多种蛋白质的水平。在信号传导通路的上下文中，术语“转录本水平”是指一个或多个基因的转录本水平，这些基因编码作为信号传导通路的一部分的蛋白质或调节元件。在信号传导通路的上下文中，术语“活性”是指信号传导通路的激活水平。

如本文所使用的，术语“菲”、“菲化合物”是指一组由三个稠合六元环(其中这些环中的两个或三个是芳族的)组成的多环芳烃中的一种。

术语“粗提取物”是指从复杂来源(如细胞、组织或生物体)中部分纯化或分离的材料集合。粗提取物通常是指在从复杂来源的第一步或第一程序分解或分离组分之后的产物。通常，粗提取物将包括大量的至少25、50、75、100或200种组分。

在化合物或产物的上下文中，术语“富集的”是指参考化合物或产物的样品或制剂或者含有参考化合物或产物的样品或制剂，其中相对于先前的、起始的或参考的样品或制剂，化合物或产物的浓度、相对丰度或两者被增加。粗提取物是先前的、起始的或参考的样品的一个实例。可以将化合物或产物富集至任何合适的水平。例如，相对于先前的、起始的或参考的样品或制剂，化合物或产物的浓度、相对丰度或两者可以增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64,65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、320％、325％、340％、350％、360％、375％、380％、400％、425％、450％、475％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、10³％、10⁴％、10⁵％、10⁶或10⁷％。

在化合物或产物的上下文中，术语“纯化的”是指参考化合物或产物的样品或制剂或者含有参考化合物或产物的样品或制剂，其中相对于先前的、起始的或参考的样品或制剂，化合物或产物的浓度、相对丰度或两者被增加。可以将化合物或产物纯化至任何合适的水平。例如，相对于先前的、起始的或参考的样品或制剂，化合物或产物的浓度、相对丰度或两者可以增加至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64,65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、320％、325％、340％、350％、360％、375％、380％、400％、425％、450％、475％、500％、550％、600％、650％、700％、750％、800％、850％、900％、10³％、10⁴％、10⁵％、10⁶或10⁷％。

术语“命中(hit)”是指在测定中显示出所期望特性的测试化合物。术语“测试化合物”是指通过一种或多种筛选方法被测试作为推定调节剂的化学物质。测试化合物可以是任何化学物质，如无机化学物质、有机化学物质、蛋白质、肽、碳水化合物、脂质或其组合。通常，使用各种预定浓度的测试化合物进行筛选，如0.01微摩尔、1微摩尔和10微摩尔。测试化合物对照可以包括在不存在测试化合物的情况下信号的测量值或与已知调节靶标的化合物进行比较。

如本文所使用的，术语“调节”是指与恰当对照相比，化合物以某种可测量的方式改变活性的能力。作为测定中化合物存在的结果，与不存在这些化合物的对照相比，活性可以增加或降低。优选地，与不存在化合物的活性水平相比，活性增加为至少25％，更优选至少50％，最优选至少100％。类似地，与不存在化合物的活性水平相比，活性降低优选为至少25％，更优选至少50％，最优选至少100％。增加已知活性的化合物是“激动剂”。降低或阻止已知活性的化合物是“拮抗剂”。

如本文所使用的，术语“监测”是指本领域中可以测量活性的任何方法。

如本文所使用的，术语“提供”是指将化合物或分子添加到本领域已知的某物中的任何手段。提供的实例可以包括使用移液管、移液器、注射器、针头、管道、枪等。这可以是手动的或自动的。它可以包括通过任何手段的转染或者任何向培养皿、细胞、组织、无细胞系统提供核酸的其他方式，并且可以在体外或体内进行。

说明书和结论性权利要求中对组合物或制品中的特定元素或组分的重量份数的提及表示该元素或组分与组合物或制品中的任何其他元素或组分之间的以重量份数表示的重量关系。因此，在含有2重量份的组分X和5重量份的组分Y的化合物中，X和Y以2:5的重量比存在，并且无论该化合物是否含有额外的组分，都以这样的比率存在。

除非有相反的特别说明，否则组分的重量百分比基于包含该组分的制剂或组合物的总重量。

如说明书和结论性技术方案(claims)中所使用的化学物质的残基是指作为特定反应方案或者后续制剂或化学产物中的化学物种的所得产物的部分，其与该部分是否是实际获自化学物种无关。因此，聚酯中的乙二醇残基是指聚酯中的一个或多个-OCH₂CH₂O-单元，这与是否使用乙二醇来制备该聚酯无关。类似地，聚酯中的癸二酸残基是指聚酯中的一个或多个-CO(CH₂)₈CO-部分，这与该残基是否是通过使癸二酸或其酯反应以获得该聚酯无关。

材料

本说明书中公开了材料、组合物和组分，其可以用于、可以结合使用、可以用于制备所公开的方法和组合物或者是所公开的方法和组合物的产物。这些和其他材料在本文中公开，并且应当理解，当公开这些材料的组合、子集、相互作用、基团等时，虽然可能没有明确公开这些化合物的每一各种单独和总体组合和排列的具体提及，但是每一个都在本文中被具体考虑和描述。例如，如果公开和讨论了一种化合物，并且讨论了可以对包括该化合物在内的多种分子进行的多种修饰，则除非有相反的特别支持，否则具体考虑了每种组合和排列以及可能的修饰。因此，如果公开了一类分子A、B和C以及一类分子D、E和F及组合分子A-D的一个实例，那么即使没有单独列举每一个，每一个是单独和总体考虑的。因此，在该实例中，组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一个都被具体考虑并且应该认为从A、B和C、D、E和F以及示例性组合A-D的公开内容中被公开。同样，这些的任何子集或组合也被具体考虑和公开。因此，例如，A-E、B-F和C-E的子组被具体考虑并且应认为从A、B和C、D、E和F以及示例性组合A-D的公开内容中被公开。此外，如上所考虑和公开的材料、组合物、组分等中的每一个也可以具体且独立地包括在这样的材料的任何组、子组、列表、集合等中或从其中排除。这些概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制造和使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的各种各样的附加步骤，则应理解，这些附加步骤中的每一个都可以利用所公开方法的任何特定实施方案或实施方案的组合来执行，并且每个这样的组合都被具体考虑并且应视为已被公开。

A.化合物

组合物包括一种或多种成骨化合物或其功能性衍生物。通常，一种或多种成骨化合物包括一种或多种菲化合物或其衍生物。通常这些菲化合物的化学结构在式I和II中示出。

式I菲的一般化学结构

式II菲的一般化学结构

在式I和II中，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、卤代、OH、O-酰基、O-烷基、O-烯基、O-单糖、O-二糖、O-寡糖、COR、COOR、CRR'OR”、OSO₃H、OSO₃Na、N₃、NRR'、NHSO₂R、SR、SOR、SO₂R、OPO₃H₂、OPO₃HNa或OPO₃Na₂，并且其中R、R'和R”各自独立地是H、烷基、烯基、炔基。在一些实施方案中，R₂是OH，R1是甲基，R₅是-CH＝CH₂，R₃、R₄、R₉和R₁₀是H，并且R₆、R₇、R₈各自独立地是H、OH或CH₃。

在一些实施方案中，包括菲化合物如F1、F4(厄弗酚)及其衍生物。F1和F4的化学结构在式III和IV示出。

式III F1的化学结构。

式IV F4(厄弗酚)的化学结构。

在一些实施方案中，一种或多种成骨化合物包括一种或多种菲化合物，其实现与植物雌激素相似的功能。例如，一种或多种菲化合物是成骨的，至少部分地是由于它们与雌激素受体的结合。

在一些实施方案中，组合物来源于中药的天然产物。一个实施方案提供了从普通且廉价的中药材灯芯草中纯化的菲化合物。

在进一步的实施方案中，组合物包括从灯芯草纯化和富集的厄弗酚。因此，与其在来自任何天然产物如灯芯草的粗提取物中的浓度相比，厄弗酚被富集为更浓2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或超过100倍。在一些实施方案中，包括厄弗酚的组合物不是任何天然植物如灯芯草的粗提取物。在更进一步的实施方案中，包括厄弗酚的组合物是化学合成的，因此不是来源于任何天然产物。

在一些实施方案中，组合物表现出有效的成骨活性。在优选的实施方案中，组合物至少部分地通过其植物雌激素特性而表现出有效的成骨活性。

在本文中描述的一个方面是具有式I、II、III或IV的结构的化合物或者其药用盐或酯。式I、II、III和IV还涵盖药用盐。通过用适量的药用碱处理游离酸来制备药用盐。代表性的药用碱是氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化亚铁、氢氧化锌、氢氧化铜、氢氧化铝、氢氧化铁、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。在一个方面，反应在水(单独或与惰性、水混溶性有机溶剂组合地)中在约0℃至约100℃的温度下如在室温下进行。选择化合物与所用碱的摩尔比以提供对于任何特定盐所需的比率。例如，为了制备游离酸起始材料的铵盐，可以用大约一当量的药用碱处理起始材料以产生中性盐。

酯衍生物典型地制备为化合物酸形式的前体，并且因此可以用作前药。通常，这些衍生物将是诸如甲基、乙基等的低级烷基酯。酰胺衍生物-(CO)NH₂、-(CO)NHR和-(CO)NR₂(其中R是以上所定义的烷基)可以通过含羧酸的化合物与氨或取代胺的反应来制备。

上述定义内的每种化合物都意图并且应该被认为是在本文中具体公开的。此外，可以在上述定义内鉴别的每个子组意图并且应该被视为在本文中具体公开。因此，特别考虑到任何化合物或化合物的子组可以被具体包括用于使用或从使用中排除，或者包括在化合物列表中或从化合物列表中排除。例如，作为一种选择，考虑了一组化合物，其中每种化合物如上文所定义但不是从植物如灯芯草属植物获得、富集或纯化的。作为另一个实例，作为一种选择，考虑了一组化合物，其中每种化合物如上所定义，但不是从药用提取物(如灯芯草)中获得、富集或纯化的。作为另一个实例，考虑了一组化合物，其中每种化合物如上所定义并且能够预防或减少骨丢失。F1和F4可以独立且具体地包括在本文公开的化合物和方法中或从其中排除。

B.组合物

本发明公开了用于治疗或预防骨丢失的包含有效量的一种或多种天然菲化合物的组合物。典型地，组合物的施用在有需要的受试者中有效地减少或抑制骨吸收和/或增加骨形成。

本发明的一个实施方案提供了在治疗部位处/附近有效刺激成骨细胞分化、成骨细胞活性和/或减少成骨细胞凋亡的组合物。在一些实施方案中，组合物增强通过成骨细胞的钙沉积到骨基质中的速率。

另一个实施方案提供了在治疗部位处/附近有效地减少或抑制通过破骨细胞的骨吸收的组合物。

在一些实施方案中，所公开的组合物引起成骨细胞特异性分泌蛋白的蛋白质、转录物和/或活性的直接或间接诱导。示例性的成骨细胞特异性分泌蛋白包括碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、骨唾液酸蛋白和胶原蛋白1A1。

又一个实施方案提供了引起成骨细胞特异性基因的直接或间接诱导的组合物，所述成骨细胞特异性基因包括转录因子如RUNX2、DLX5和SP7(Osterix)。在一些实施方案中，组合物增加一种或多种成骨细胞特异性基因的磷酸化水平，所述成骨细胞特异性基因包括转录因子如RUNX2、DLX5和SP7(Osterix)。

又一个实施方案提供了经由Wnt/β-连环蛋白信号传导通路中的激活引起直接或间接成骨细胞生成的组合物。Wnt/β-连环蛋白信号传导的激活发生在Wnt与跨越7个跨膜结构域的frizzled受体以及低密度脂蛋白受体-相关蛋白5和6(LRP5/6)共受体结合后(Krishnan V等人，J Clin Invest.116(5):1202–1209(2006))。信号通过蛋白质Disheveled、Axin和Frat-1产生，它们破坏蛋白质复合物并抑制GSK3的活性，由此引起其底物β-连环蛋白的低磷酸化。然后稳定化的β-连环蛋白在细胞溶质中积累并转移至细胞核，在那里这种转录共激活剂与T细胞因子/淋巴增强剂结合因子(TCF/LEF)转录因子相互作用，以介导Wnt对基因转录的许多作用。

因此，在一些实施方案中，所公开的组合物引起β-连环蛋白的直接或间接活化和/或蛋白质水平，以及由β-连环蛋白调节的任何下游基因转录。在其他实施方案中，所公开的组合物引起Wnt/β-连环蛋白信号传导通路的一个或多个成员的蛋白质表达、转录本水平和/或活性的直接或间接增加。例如，Wnt3A、Wnt受体Frizzled1、β-连环蛋白及其组合的转录本水平增加。

研究表明，BMP2诱导的成骨细胞分化介导轻度ER应激激活的ATF6并直接调节骨钙素表达(Jang WG等人，J Biol Chem.287,905-15(2012))。因此，另一个实施方案提供了引起内质网(ER)应激的直接或间接增加的组合物。在一些实施方案中，所公开的组合物引起ATF6的表达、转录和/或活性的直接或间接增加。

另一个实施方案提供了引起一种或多种参与成骨细胞分化的促分裂原活化激酶(MAPK)的活性的直接或间接增加的组合物。示例性的MAP激酶包括细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、ERK5、c-Jun氨基(N)-末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)和p38同种型(p38α、p38β、p38γ和p38δ)。在一些实施方案中，所公开的组合物引起参与成骨细胞分化的一种或多种促分裂原活化激酶(MAPK)的磷酸化水平的增加。一个具体实施方案提供了引起总磷酸化p38的直接或间接增加的组合物。

在一些实施方案中，组合物引起包括p38在内的促分裂原活化激酶(MAPK)的一种或多种下游分子的磷酸化的直接或间接增加。示例性分子包括Runx2、Dlx5、Osx和ATF4。

在一些实施方案中，组合物至少部分地通过雌激素受体来增加成骨细胞分化和/或活性。在一些实施方案中，组合物发挥类似于植物雌激素如雌二醇的作用。在一些实施方案中，组合物具有植物雌激素样特性。因此，在一些实施方案中，组合物适用于治疗更年期症状以及其中需要植物雌激素活性的其他疾病。

C.另外的治疗剂、预防剂或诊断剂

本发明所公开的组合物可以与一种或多种另外的治疗剂、诊断剂和/或预防剂组合或交替施用。例如，一种或多种另外的治疗剂、诊断剂和/或预防剂可以减少或抑制骨丢失。

第二治疗剂的量通常取决于待治疗病症的严重性。本领域技术人员可以容易地确定具体剂量。参见Ansel、Howard C.等人，Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(药物剂型和药物输送系统)(第6版)Williams和Wilkins,Malvern,PA(1995)。

在一些情况下，一种或多种另外的活性剂可以分散在制剂中或以其他方式与制剂中的颗粒缔合。在某些实施方案中，一种或多种另外的活性剂也可以溶解或悬浮在药用载体中。

在一些情况下，活性剂是成像或以其他方式评估炎性病症的诊断剂。示例性的诊断剂包括顺磁性分子、荧光化合物、磁性分子和放射性核素、X射线成像剂和造影剂。

存在可以减缓或阻止骨丢失的若干药物，这有助于降低骨折的风险。此外，这些药物中的一些可以用于被诊断患有骨质减少的患者以预防骨质疏松症。用于预防和治疗骨质疏松症的常用药物是二膦酸盐、选择性雌激素受体调节剂(SERMS)、降钙素和甲状旁腺激素。

在一些实施方案中，所公开的组合物与一种或多种二膦酸盐组合使用。二膦酸盐抑制通过破骨细胞的骨吸收，这有助于维持骨密度。用于治疗骨质疏松症的二膦酸盐有不同的多种，例如是阿仑膦酸盐(alendronate)利塞膦酸盐(risedronate)伊班膦酸盐(ibandronate)/>和唑来膦酸(zoledronicacid)/>

在一些实施方案中，所公开的组合物与一种或多种选择性雌激素受体调节剂(SERMS)组合使用。取决于组织类型，SERMS作为雌激素拮抗剂或激动剂起作用。对于骨组织，SERM充当雌激素激动剂并增加骨密度。用于治疗骨质疏松症的示例性SERM包括雷洛昔芬(raloxifene)

在一些实施方案中，所公开的组合物与一种或多种激素或激素样药物组合使用。降钙素是一种通常存在于体内并由甲状腺释放的激素。它参与钙调节和骨代谢。降钙素通过让骨骼保留钙来降低血液中的钙水平。用于治疗骨质疏松症的不同降钙素是和/>

在一些实施方案中，所公开的组合物与一种或多种甲状旁腺激素组合使用。甲状旁腺激素通常存在于人体内并且有助于调节钙和磷酸盐水平。它们通过刺激骨生长和减少骨丢失来发挥作用。唯一经FDA批准的甲状旁腺激素是特立帕肽(teriparatide)

在一些实施方案中，所公开的组合物与一种或多种靶向破骨细胞的抗体组合使用。例如，抗-RANKL(核因子-κB配体的受体激活剂)抗体地诺单抗(denosumab)减少破骨细胞的分化和活性。

在一些实施方案中，所公开的组合物与一种或多种膳食补充剂组合使用。示例性的补充剂包括钙、镁、维生素D、K、C、硼、铜、脱氢表雄酮(DHEA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)、叶酸、维生素B6和维生素B12、锰、硅、锶和锌。

在一些实施方案中，一种或多种治疗剂、预防剂或诊断剂在使用所公开的组合物的治疗之前、结合、之后或交替施用。

D.制剂

本发明提供了在药物载体中含有有效量的组合物的制剂和药物组合物，该药物载体适合施用于有需要的受试者以减少或抑制骨丢失和/或促进成骨细胞分化和骨形成。组合物可设计成局部或全身施用。

本发明中，使用药用载体来制备制剂。载体可以由这样的材料组成，所述材料被认为是安全且有效的，并且可以施用于个体而不会引起不期望的生物学副作用或不希望的相互作用。术语“载体”可以例如是指存在于药物制剂中的不同于一种或多种活性成分的所有成分。术语“载体”包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、填料和涂层组合物。

本发明中，载体也可以是涂层组合物的组分，其可以包括增塑剂、颜料、着色剂、稳定剂和助流剂。可以如参考文献，诸如“Pharmaceutical dosage form tablets(药物剂型片剂)”，Liberman等人编辑(New York,Marcel Dekker,Inc.,1989)，“Remington–Thescience and practice of pharmacy(雷明顿—药学科学与实践)”，第20版，LippincottWilliams&Wilkins,Baltimore,MD,2000以及“Pharmaceutical dosage forms and drugdelivery systems(药物剂型及药物递送系统)”，第6版，Ansel等人(Media,PA:Williamsand Wilkins,1995)中所述来制备延迟释放剂型，这些参考文献提供了关于用于制备片剂和胶囊以及片剂、胶囊和颗粒剂的延迟释放剂型的载体、材料、设备和工艺的信息。

合适的涂层材料的实例包括但不限于纤维素聚合物，如乙酸邻苯二甲酸纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素；聚乙酸邻苯二甲酸乙烯酯、丙烯酸聚合物和共聚物，以及以商品名(Roth Pharma,Westerstadt，Germany)商购可得的甲基丙烯酸树脂、玉米蛋白、虫胶和多糖。

此外，涂层材料可以含有常规载体，如增塑剂、颜料、着色剂、助流剂、稳定剂、成孔剂和表面活性剂。

存在于含药片剂、珠粒、颗粒或粒子中的任选的药用赋形剂包括但不限于稀释剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、稳定剂和表面活性剂。

稀释剂，也称为“填料”，典型地是增加固体剂型的体积所必需的，使得为片剂的压缩或珠粒和颗粒的形成提供实用的尺寸。合适的稀释剂包括但不限于二水合磷酸二钙、硫酸钙、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、纤维素、微晶纤维素、高岭土、氯化钠、干淀粉、水解淀粉、预胶化淀粉、二氧化硅、氧化钛、硅酸铝镁和粉糖。

粘合剂用于对固体剂型赋予内聚品质，并且由此确保片剂或珠粒或颗粒在剂型形成后保持完整。合适的粘合剂材料包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、糖(包括蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖和山梨糖醇)、聚乙二醇、蜡、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶、海藻酸钠、纤维素(包括羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、乙基纤维素和veegum)，以及合成的聚合物如丙烯酸和甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸共聚物、甲基丙烯酸甲酯共聚物、甲基丙烯酸氨基烷基酯共聚物、聚丙烯酸/聚甲基丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。

润滑剂用于促进片剂的制造。合适的润滑剂的实例包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、山嵛酸甘油酯、聚乙二醇、滑石和矿物油。

崩解剂用于促进剂型在施用后崩解或“瓦解”，并且通常包括但不限于淀粉、羟基乙酸淀粉钠、羧甲基淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、预胶化淀粉、粘土、纤维素、藻蛋白碱、树胶或交联聚合物如交联PVP(来自GAF Chemical Corp的Polyplasdone XL)。

稳定剂用于抑制或延缓药物分解反应，其包括例如氧化反应。

表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子型表面活性剂。合适的阴离子型表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子型表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸钠、钾、铵盐和烷基芳基磺酸钠、钾、铵盐如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠；和烷基硫酸盐如月桂基硫酸钠。阳离子型表面活性剂包括但不限于季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰子胺。非离子型表面活性剂的实例包括单硬脂酸乙二醇酯、肉豆蔻酸丙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚4-油酸甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛油酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻两性乙酸盐、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。

如果需要，片剂、珠粒或粒子还可以含有少量的无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、染料、pH缓冲剂和防腐剂。

如本领域技术人员将理解的并且如相关文本和文献中所描述的，许多方法可用于制备提供各种各样药物释放曲线的含药物片剂、珠粒、颗粒或粒子。这样的方法包括但不限于以下：用适当的涂层材料对药物或含药物的组合物进行包衣，典型地但不必需地掺入聚合物材料，增加药物粒度，将药物置于基质内，并形成药物与合适络合剂的复合物。

可以使用常规技术，例如使用常规包衣锅、无气喷涂技术、流化床包衣设备(带有或不带有Wurster插入物)等，用延迟释放聚合物涂层对延迟释放剂量单位进行包衣。对于涉及用于制备片剂和延迟释放剂型的材料、设备和工艺的详细信息，参见PharmaceuticalDosage Forms:Tablets(药物剂型：片剂)，Lieberman等人编辑(New York:Marcel Dekker,Inc.,1989)和Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(药物剂型和药物输送系统)，6.sup.th Ed.(Media,PA:Williams&Wilkins,1995)。

一种用于制备缓释片剂的优选方法是压制使用直接共混、湿法制粒或干法制粒工艺制备的含药物共混物，例如颗粒的共混物。缓释片剂也可以模制而不是压制，其从含有合适水溶性润滑剂的潮湿材料开始。然而，片剂优选使用压制而不是模制来制造。一种用于形成缓释含药共混物的优选方法是将药物粒子直接与一种或多种赋形剂如稀释剂(或填料)、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂和着色剂混合。作为直接共混的替代方法，可以通过使用湿法制粒或干法制粒工艺来制备含药物共混物。含有活性剂的珠粒也可以通过许多常规技术中的任何一种来制备，典型地从流体分散体开始。例如，一种制备含药物珠粒的典型方法包括将活性剂分散或溶解在涂层悬浮液或溶液中，所述涂层悬浮液或溶液含有药物赋形剂如聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、滑石、金属硬脂酸盐、二氧化硅、增塑剂等。使用掺混物来包衣珠芯如具有大约60至20目大小的糖球(或所谓的“沾糖扁圆巧克力(non-pareil)”)。

一种用于制备药物珠粒的替代方法是通过将药物与一种或多种药用赋形剂混合如微晶纤维素、乳糖、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、滑石、硬脂酸镁、崩解剂等共混，将共混物挤出，将挤出物滚圆，干燥和任选地包衣以形成即释珠粒。

i.赋形剂

除了治疗剂或预防剂(或可能用于递送的其他所需分子)之外，粒子可以包括赋形剂诸如糖如乳糖、蛋白质如白蛋白和/或表面活性剂。

代表性赋形剂包括溶剂、稀释剂、pH调节剂、防腐剂、抗氧化剂、悬浮剂、润湿剂、粘度调节剂、张度剂、稳定剂及其组合。合适的药用赋形剂优选地选自通常被认为是安全的(GRAS)的材料，并且可以施用于个体而不会引起不期望的生物学副作用或不希望的相互作用。

2.肠内施用

组合物通常被配制用于经口递送。

i.用于经口施用的添加剂

经口固体剂型总体描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)，第18版，1990(Mack Publishing Co.Easton Pa.18042)第89章。固体剂型包括片剂、胶囊、丸剂、糖锭或锭剂、扁囊剂、糖丸、粉剂或颗粒剂，或者将材料掺入聚合化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等的粒状制剂中或掺入脂质体中。这样的组合物可影响本活性化合物和衍生物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。参见，例如，(雷明顿制药科学)，第18版，1990(Mack Publishing Co.Easton Pa.18042)第1435-1712页。组合物可以以液体形式制备，或可以以干燥粉末(例如，冻干)形式制备。脂质体或类蛋白包封可用于配制组合物(如例如，美国专利号4,925,673中报道的类蛋白微球)。可以使用脂质体包封，并且脂质体可以用各种聚合物衍生化(例如，美国专利号5,013,556)。还参见Marshall,K.In:ModernPharmaceutics，由G.S.Banker和C.T.Rhodes编辑，第10章，1979年。

另一个实施方案提供了用于经口施用的液体剂型，其包括药用乳液、溶液、混悬剂和糖浆，它们可以含有其他组分，这包括惰性稀释剂；助剂如润湿剂、乳化剂和悬浮剂；以及甜味剂、调味剂和芳香剂。

ii.用于口服剂量的化学修饰形式

可以对所公开的组合物进行化学修饰，以使得衍生物的经口递送有效。通常，所考虑的化学修饰是将至少一个部分连接至组分分子本身，其中所述部分允许(a)抑制降解；和(b)从胃或肠摄入到血流中。还希望的是一种或多种组分的总体稳定性增加和体内循环时间增加。聚乙二醇化是一种用于药物用途的优选化学修饰。可以使用的其他部分包括：丙二醇，乙二醇和丙二醇的共聚物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，聚脯氨酸，聚-1,3-二氧戊环和聚-1,3,6-三氧辛环(参见，例如，Abuchowski和Davis(1981)“Soluble Polymer-Enzyme Adducts,”in Enzymes as Drugs(作为药物的酶中的可溶性聚合物-酶加合物)，Hocenberg和Roberts,eds.(Wiley-Interscience:New York,N.Y.)pp.367-383；和Newmark等人(1982)J.Appl.Biochem.4:185-189)。

3.肠胃外和局部施用

在一些实施方案中，组合物通常被配制用于肠胃外或局部施用。

i.溶液、凝胶、软膏和混悬剂

许多肠胃外或局部制剂是已知的并且是可用的。溶液可以是无菌过滤的、浓缩的或者用水、缓冲盐水或等效物稀释的，与多糖如藻酸盐或透明质酸、聚乙烯吡咯形成凝胶，或软膏如凡士林或矿物油，或用脂质或油乳化的。

乳液通常是油滴在水相中的分散体。不应有破裂或聚结的迹象。

悬浮液含有分散在液体媒介物中的固体粒子；它们在轻轻摇动时必须是均匀的，并保持充分分散，以使得能够从容器中取出正确的剂量。可能会出现沉积物，但这在摇动容器时应很容易分散，并且应控制分散粒子的大小。对于眼科应用，活性成分和任何其他悬浮材料必须减小到足够小以防止刺激和损伤角膜的粒度。

软膏是无菌的、均质的、半固体的制剂，其意图施加至诸如皮肤、结膜或眼睑的表面。它们通常由非水基例如软石蜡(凡士林)、液体石蜡和羊毛脂制备。它们可以含有合适的添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂和稳定剂。

可以将组合物配制用于肠胃外递送，如注射或输注，为溶液或混悬液或粉末的形式。制剂可以经由任何途径施用，如血流或直接施用于待治疗的器官或组织。

组合物还可以配制用于局部递送(例如，至粘膜表面，如口腔、结膜、鼻内、阴道内等)。粒子可以以单位剂型的冻干或干燥形式提供，用于在注射时混悬。这些可以在带有恰当量的稀释剂(如无菌水或缓冲溶液)的试剂盒中提供。

可以使用本领域已知的技术将制剂制备为水性组合物。组合物可以制备成可注射的制剂，例如溶液或混悬剂；适用于在注射前通过加入重构介质后制备溶液或混悬剂的固体形式；乳液，如油包水型(w/o)乳液、水包油型(o/w)乳液及其微乳液、脂质体或乳脂体。

载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、一种或多种多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)、油如植物油(例如花生油、玉米油、芝麻油等)及其组合。适当的流动性可以例如通过使用涂层如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持所需的粒度和/或通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。

化合物或纳米粒子的溶液和分散体可以在与一种或多种药用赋形剂适当混合的水或另一种溶剂或分散介质中制备，所述药用赋形剂包括但不限于表面活性剂、分散剂、乳化剂、pH调节剂及其组合。

合适的表面活性剂可以是阴离子、阳离子、两性或非离子型表面活性剂。合适的阴离子型表面活性剂包括但不限于含有羧酸根、磺酸根和硫酸根离子的那些。阴离子型表面活性剂的实例包括长链烷基磺酸钠、钾、铵盐和烷基芳基磺酸钠、钾、铵盐如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如十二烷基苯磺酸钠；二烷基磺基琥珀酸钠，如双-(2-乙基硫氧基)-磺基琥珀酸钠；和烷基硫酸盐如月桂基硫酸钠。阳离子型表面活性剂包括但不限于季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯铵、西曲溴铵、硬脂基二甲基苄基氯化铵、聚氧乙烯和椰子胺。非离子型表面活性剂的实例包括单硬脂酸乙二醇酯、肉豆蔻酸丙二醇酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、聚4-油酸甘油酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酰化物、PEG-150月桂酸酯、PEG-400单月桂酸酯、聚氧乙烯单月桂酸酯、聚山梨醇酯、聚氧乙烯辛基苯基醚、PEG-1000十六烷基醚、聚氧乙烯十三烷基醚、聚丙二醇丁基醚、401、硬脂酰单异丙醇酰胺和聚氧乙烯氢化牛油酰胺。两性表面活性剂的实例包括N-十二烷基-β-丙氨酸钠、N-月桂基-β-亚氨基二丙酸钠、肉豆蔻两性乙酸盐、月桂基甜菜碱和月桂基磺基甜菜碱。/>

制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。合适的防腐剂包括但不限于对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸和硫柳汞。制剂还可以含有抗氧化剂以防止一种或多种活性剂或纳米粒子的降解。

制剂典型地缓冲至3至8的pH，以在重构后用于肠胃外或局部使用。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液和柠檬酸盐缓冲液。理想地，滴眼液的pH应等于泪液的pH(其为7.4)。然而，添加缓冲剂的决定应基于稳定性考虑。选择的pH应是对于活性药物成分的稳定性和生理耐受性二者的最佳值。如果使用缓冲体系，则其必须不会引起活性成分的沉淀或劣化。还应考虑到对泪液流动的影响。

水溶性聚合物经常用于肠胃外或局部使用的制剂中。合适的水溶性聚合物包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、羧甲基纤维素和聚乙二醇。

可以通过将化合物或纳米颗粒以所需量与根据需要的一种或多种以上列出的赋形剂掺入适当的溶剂或分散介质中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，分散体是通过将各种已灭菌的组合物掺入到无菌媒介物中来制备的，该媒介物含有基础分散介质和来自以上列出的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，它们由其先前无菌过滤的溶液产生化合物或纳米粒子加任何另外所需成分的粉末。粉末可以以这样的方式制备，即粒子本质上是多孔的，这可以增加粒子的溶解。用于制备多孔粒子的方法在本领域中是众所周知的。

用于肠胃外或局部施用的药物制剂优选为由一种或多种聚合物-药物缀合物形成的粒子的无菌水溶液或混悬剂的形式。可接受的溶剂包括例如水、林格溶液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和等渗氯化钠溶液。制剂还可以是在无毒、可接受的稀释剂或溶剂如1,3-丁二醇中的无菌溶液、混悬剂或乳液。

在一些情况下，制剂以液体形式分配或包装。备选地，用于肠胃外或局部施用的制剂可以包装为固体，例如通过合适的液体制剂的冻干获得。固体可以在施用前用适当的载体或稀释剂重构。

用于肠胃外或局部施用的溶液、混悬剂或乳液可以用维持适合眼部施用的pH所需的有效量的缓冲液进行缓冲。合适的缓冲液是本领域技术人员熟知的，并且有用的缓冲液的一些实例是乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液。

用于肠胃外或局部施用的溶液、混悬剂或乳液也可以含有一种或多种张度剂以调节制剂的等渗范围。合适的张度剂是本领域众所周知的。实例包括甘油、甘露醇、山梨糖醇、氯化钠和其他电解质。

用于肠胃外或局部施用的溶液、混悬剂或乳液也可以含有一种或多种防腐剂以防止局部制剂的细菌污染。合适的防腐剂是本领域已知的，并且包括聚六亚甲基双胍(PHMB)、苯扎氯铵(BAK)、稳定化的氧氯复合物(也称为)、乙酸苯汞、氯丁醇、山梨酸、洗必泰、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯、硫柳汞及其混合物。

用于肠胃外施用的溶液、混悬剂或乳液还可以含有一种或多种本领域已知的赋形剂，如分散剂、润湿剂和悬浮剂。

在一些表达方式中，载体可以包括霜剂、糊剂、流体、涂层、涂料、喷雾剂、清洁剂或其组合。在一些实施方案中，所公开的组合物可以以与皮肤直接和/或间接接触的任何形式使用。例如，在身体霜剂/糊剂/洗剂/凝胶、沐浴皂、皮肤外洗液(skin wash)、洗衣液、皮肤喷雾剂、伤口清洁剂、伤口覆盖物、洗发水、沐浴露、洗面奶、面霜或面皂中。

在一些实施方案中，组合物可以进一步包含增强组合物至感兴趣细胞(例如与银屑病的发病机制相关的角质形成细胞和巨噬细胞)的递送的载体。载体可以是屏障破坏剂或渗透增强媒介物。示例性的渗透增强媒介物包括保湿剂(例如，乙二醇、甘油)、粉末(例如，粘土、摇荡剂)、油/水(O/W)型乳液(例如，水性乳膏)、水/油型乳液(例如，油性乳膏)、乳化基质(例如，无水脂质和O/W乳化剂)、吸收基质(例如，无水脂质和W/O乳化剂)、亲脂性的(例如，脂肪、蜡、油、有机硅)、水杨酸、尿素磷脂酶A2、磷脂酰胆碱依赖性磷脂酶C、乙醇、丙酮、去污剂、碱、丙二醇、吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、烷基亚砜、氧化膦、表面活性剂和己内酰胺如氮酮、胺和酰胺、N,N-分布的-氨基乙酸烷基酯、癸基甲基亚砜、吡咯烷酮、Pirotiodecane(亦称HPE-101)、苄烷铵(benzlyalkonium)、氯化苄烷铵聚合物、有机硅类聚合物、脂肪酸、环脲、萜烯、脂质体、环糊精及其组合。

E.试剂盒

本发明还公开了医疗试剂盒。典型地，所描述的组合物使用药用载体制备，所述载体由被认为是安全和有效的并且可以施用于个体而不引起不期望的生物学副作用或不希望的相互作用的材料组成。试剂盒可以包括所描述的化合物或组合物中的一种或多种。例如，试剂盒可以是包含厄弗酚化合物的容器。试剂盒还可以包括一种或多种药物(例如，二膦酸盐)。试剂盒可以准备好进行施用。试剂盒可以另外包括试剂盒的使用说明(例如，用于治疗受试者的说明)。

F.混合物

本发明公开了通过执行或准备执行所公开的方法而形成的混合物。例如，公开了包含一种或多种所公开的化合物和载体的混合物。

每当所述方法涉及混合或使组合物或组分或试剂接触时，执行该方法就产生许多不同的混合物。例如，如果所述方法包括3个混合步骤，则在这些步骤中的每一个之后，如果这些步骤是单独进行的则形成独特的混合物。此外，在所有步骤完成时都形成混合物，与这些步骤是如何进行的无关。本公开内容考虑了通过执行所公开的方法获得的这些混合物，以及含有任何公开的试剂、组合物或组分(例如本文公开的)的混合物。

方法

公开了用于在有需要的受试者中治疗或预防骨丢失或促进骨形成的方法。在一些表达方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的一种或多种菲化合物或其衍生物，以在该受试者中减少骨丢失的一种或多种症状、预防骨丢失的一种或多种症状、促进骨形成或其组合。在一些表达方式中，骨丢失的一种或多种症状的减少、骨丢失的一种或多种症状的预防、骨形成的促进或其组合是相对于未处理的对照而言的。

A.减少骨丢失的方法

本发明提供了使用组合物来在受试者中减少或预防骨丢失的方法。还提供了使用组合物来在受试者中促进成骨细胞分化和/或骨形成的方法。

本发明的方法特征在于包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包括一种或多种菲化合物如厄弗酚或其功能性衍生物。在优选的实施方案中，组合物包括一种或多种具有植物雌激素样功能的菲化合物。在一些实施方案中，受试者需要用于骨质减少或骨质疏松症的治疗。

本发明描述了使用组合物来治疗或预防骨质减少的方法。本发明还描述了使用组合物来治疗或预防骨质疏松症的方法。本发明还提供了使用组合物来增加骨量/密度的方法，优选地通过成骨细胞分化。

在一些实施方案中，所公开的组合物以在有需要的受试者中有效减少或抑制骨吸收和/或增加骨形成的量施用于受试者。在一些实施方案中，所公开的组合物有效地将骨吸收率减少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或超过200％。在一些实施方案中，所公开的组合物使通过成骨细胞的钙沉积到骨基质中的速率增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或超过200％。

本发明还提供了使用组合物通过mRNA和/或蛋白质表达来增加一种或多种成骨分子的方法。示例性的成骨分子包括成骨细胞特异性分泌蛋白，其包括碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、骨唾液酸蛋白和胶原蛋白1A1。示例性的成骨转录因子包括RUNX2、DLX5和SP7(Osterix)。在一些实施方案中，所公开的组合物直接和/或间接将一种或多种成骨分子增加5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或超过200％。

本发明描述了使用组合物来增加Wnt/β-连环蛋白信号传导通路的一个或多个成员的方法。典型地，所公开的组合物有效地增加与Wnt/β-连环蛋白信号传导通路相关的一个或多个成员的活性和/或数量，所述成员包括Wnt3A、Wnt受体Frizzled1、Disheveled、Axin、Frat-1和/或β-连环蛋白。在一些实施方案中，所公开的组合物导致Wnt/β-连环蛋白信号传导通路的一个或多个成员的转录本水平直接和/或间接增加了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或超过200％。

本发明提供了使用组合物来增加内质网(ER)应激和/或ATF6的表达、转录和/或活性的方法。还提供了使用组合物来增加一种或多种参与成骨细胞分化的促分裂原活化激酶(MAPK)的活性的方法。在一些实施方案中，所公开的组合物导致总磷酸化p38直接和/或间接增加了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或超过200％。

本发明还描述了使用组合物来增加通过雌激素受体的信号传导的方法。在一些实施方案中，所公开的组合物导致通过雌激素受体的信号传导直接和/或间接增加了5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或超过200％(通过其下游效应分子中的任一个测量的)。

A.施用

用于减少骨量损失的药物组合物可以以多种方式施用，这取决于待治疗病症的严重性。无论是用于预防还是治疗，用于施用所公开的组合物的方法基本上相同。

在一些实施方案中，所公开的组合物包含在食品或营养产品如膳食补充剂中。在一些实施方案中，所公开的组合物包含在诸如茶、咖啡、苏打饮料、能量饮料、早餐谷物和点心棒之类的产品中。

组合物可以在疾病症状发作之前、之中或之后的时期期间施用，或在一种或多种疾病症状发作之前、之中或之后的时期的任何组合期间施用。例如，可以在疾病症状发作前每1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48天向受试者施用一个或多个剂量的组合物。可以在疾病症状发作后每1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48天向受试者施用一个或多个剂量的组合物。在一些实施方案中，在疾病状况有明显改善之前施用多个剂量的组合物。例如，在一些实施方案中，受试者在疾病状况明显改善之前的1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48天或几周的时期内接受1、2、3、4、5、6、7、14、21、28、35或48个剂量。

组合物可以单独施用，或与作为疾病治疗方案的一部分的第二活性剂组合施用。例如，组合物可以在第一天、第二天、第三天或第四天或其组合施用。组合物可以在与第二活性剂相同天数或不同天数施用。

任何化合物都可以在治疗上与药用载体组合使用。本文所描述的化合物可以方便地配制成由一种或多种化合物联合药用载体组成的药物组合物。参见，例如，Remington'sPharmaceutical Sciences(雷明顿制药科学)，最新版，E.W.Martin Mack Pub.Co.,Easton,PA，其公开了可以与本文所描述的化合物的制剂的制备结合使用的制备药物组合物的典型载体和常规方法，并将其通过引用并入本文。这些最典型地是用于将组合物施用于人的标准载体。在一个方面，人类和非人类，包括溶液如无菌水、盐水和处于生理pH的缓冲溶液。其他化合物将根据本领域技术人员使用的标准程序施用。

除了所选分子之外，本文所描述的药物组合物可以包括但不限于载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。药物组合物还可以包括一种或多种活性成分，如抗微生物剂、抗炎剂、麻醉剂等。

本文所描述的化合物和药物组合物可以以多种方式施用于受试者，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。因此，例如，本文所描述的化合物或药物组合物可以作为眼用溶液和/或软膏施用于眼表面。此外，化合物或药物组合物可以通过阴道、直肠、鼻内、经口、吸入或肠胃外(例如通过皮内、皮下、肌肉内、腹膜内、直肠内、动脉内、淋巴管内、静脉内、鞘内和气管内途径)施用至受试者。肠胃外施用(如果使用的话)通常以注射为特征。可以将注射剂制备成常规形式，作为液体溶液或混悬剂、适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或者作为乳液。最近修订的用于肠胃外施用的方法涉及使用缓释或持续释放系统，使得维持恒定剂量。参见例如美国专利号3,610,795，将其通过引用并入本文。

用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、混悬剂和乳液，它们也可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液，其包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格溶液或非挥发油。静脉内媒介物包括流体和营养补充物、电解质补充物(如基于林格葡萄糖的那些)等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

用于局部施用的制剂可以包括软膏、洗剂、霜剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂。常规药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或期望的。

用于经口施用的组合物可以包括粉末或颗粒、在水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、囊剂或片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是期望的。

B.要治疗的病症

本发明所公开的组合物特别适用于在受试者中治疗涉及低骨量的病症。例如，所公开的方法可以用于预防性或治疗性地抑制、减少、减轻或永久逆转骨丢失。

在一些实施方案中，受试者患有骨质减少。在其他实施方案中，受试者患有骨质疏松症。在进一步的实施方案中，受试者处于发展骨质疏松症的高风险群体中。高风险群体包括绝经后的女性、有低骨量家族史的那些、50岁以上的男性和女性、患有促进骨丢失的其他医学病症(如甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进和/或库欣综合征(Cushing'ssyndrome))的那些以及患有饮食不良(缺乏钙和维生素D)、吸烟、过度使用酒精或咖啡因和缺乏运动的那些。

骨矿物质密度(BMD)是骨骼中钙水平的量度，其可以估算骨折的风险。它还用于确定患者是否患有骨质减少或骨质疏松症。骨矿物质密度测试是非侵入性且无痛的程序，通常在臀部、脊柱、手腕、手指、胫骨或脚跟上进行。

虽然可以使用平片X光照片来诊断骨质减少，但是用于测量BMD的最常用方法(以及明确诊断骨质疏松症的方式)是通过双能X射线吸收测定法或DEXA进行的。这种扫描使用低能量X射线，其与标准X射线相比将患者暴露于显著更少的辐射，并且可以评估骨骼中的钙水平。结果作为“评分”测量，并与健康个体的那些评分进行比较。

患者的BMD给出T评分，这是通过将其与对于30岁的同性别和种族的健康人员的平均评分进行比较得出的。“正常年轻”评分与患者评分之间的差异称为标准偏差(SD)。在2.5至-1SD范围内的T评分被认为是正常的骨密度。T评分在-1SD至-2.5SD之间的患者被诊断患有骨质减少，并被认为处于骨质疏松症的高风险。T评分低于-2.5SD的患者被诊断患有骨质疏松症。

可以将制剂施用于动物以及人以预防或治疗与低骨量相关的任何疾病。优选的动物包括狗、猫、马以及可以被治疗的其他动物，这包括家畜(牛、绵羊、猪、山羊)。组合物和方法可用于管理或治疗马的关节病症。制剂可以预防性或治疗性施用。在许多情况下，使用定期施用来防止进一步的损害。需要预防性治疗的马的实例包括赛马、绕桶马(barrelhorse)、驯马和截牛用马、跳马和盛装舞步马。

在一些体内方法中，将组合物以治疗有效量施用于受试者。如本文所使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以治疗、抑制或减轻所治疗病症的一种或多种症状或者足以以其他方式提供所期望的药理和/或生理作用的剂量。精确剂量将根据各种各样的因素如受试者相关变量(例如年龄、免疫系统健康等)、疾病或病症、及正实施的治疗、每天的次数和治疗的天数或周数，以及益生菌是否与抗生素同时施用而有所不同。

选择的剂量取决于所期望的治疗效果、施用途径和所期望的治疗持续时间。优选地，与未处理的对照相比，施用的组合物的量在受试者中有效地预防或减少骨丢失。

在一些实施方案中，剂量对于每千克接受治疗的受试者体重为约0.1-100mg。优选地，为约1-20mg/kg。

C.对照

本发明所描述的组合物的效果可以与对照进行比较。合适的对照是本领域已知的，并且包括例如未处理的受试者或安慰剂处理的受试者。在一些实施方案中，未处理的对照受试者患有与所治疗受试者相同的疾病或病症，例如骨质疏松症，优选具有相似程度的严重性。在一些实施方案中，合适的对照是具有与在同一受试者上被治疗的区域相同的骨密度的区域。例如，在两个手腕上患有骨质疏松症的患者可以用组合物局部地治疗一个手腕，而使用另一个手腕作为对照。

通过参考以下实施例将进一步理解本发明，这些实施例为非限制性的。

实施例

实施例1：F化合物诱导MC3T3-E1成骨细胞的细胞分化和矿化

1.方法与材料

细胞培养

将MC3T3-E1(第4-10代)维持在补充有10％FBS、1mM丙酮酸钠和1％100ug/ml青霉素-链霉素(100U/ml)的最小基本培养基(MEM)中。所有试剂均来自GIBCO LifeTechnologies。

细胞活力测定

将MC3T3-E1细胞以7x10³个细胞/孔在96孔板中接种2天。用F4的一系列稀释液(最高浓度在10μM)处理细胞。在处理后，将细胞用3％福尔马林固定，并在室温下用NBB溶液(0.05％NBB与0.1M乙酸钠和9％乙酸)染色。二十四小时后，移除染色液并加入蒸馏水以除去游离染料。然后，加入100ul的50mM NaCl以溶解结合的染料并记录在590nm处的吸光度。

碱性磷酸酶(ALP)测定

将C3T3-E1细胞以1x10⁵个细胞/孔接种在24孔板中。二十四小时后，用0.5μM F4、1.5μM F4、5μM F4以及0.1％DMSO(媒介物对照)和作为阳性对照的抗坏血酸(ASC，400μM)/β-甘油磷酸盐(β-GP，5mM)处理细胞。在处理后，将细胞用PBS洗涤两次并用含有50mM TrispH7.4和0.1％Triton X-100的缓冲液裂解。在3个冷冻-解冻循环后，将40ul的细胞裂解物与50ul的2x测定缓冲液(2-氨基-2甲基-1-丙醇，pH 10.4，具有4mM MgCl₂)和10ul的0.1M磷酸4-硝基苯酯混合。在37℃温育并在OD410记录。

成骨细胞矿化测定

将MC3T3-E1细胞以1x10⁵个细胞/孔接种在24孔板中。将细胞在补充有DMSO、F4(1.5μM)或F4(5μM)的含有ASC(50ug/ml)/β-GP(10mM)的MEM中培养16天。培养基每3-4天补充一次，直到第16天，通过茜素红(Alizarin Red)染色来测定矿化。将细胞用PBS洗涤两次并用10％福尔马林固定1小时。将固定的细胞用蒸馏水洗涤两次，并在黑暗中用2％茜素红S溶液(pH 4.1)染色1小时。移除染色溶液并用蒸馏水洗涤4次。

2.结果

为了确定从灯芯草(Medulla Junci)中分离的菲是否具有成骨活性，首先考察了它们对成骨细胞MC3T3-E1细胞的细胞分化和矿化的作用。如图1A中所显示的，两种化合物F1和F4以浓度依赖性方式增加细胞的碱性磷酸酶(ALP)酶活性。对于这两种化合物，ALP活性的增加在处理后的24和48小时在0.5μM的浓度下已经很明显并且在5μM的浓度下为最大。与未处理的细胞相比，用5μM F1或F4处理的细胞显示出ALP活性增加了2-3倍。作为阳性对照，用抗坏血酸盐和β-甘油磷酸盐对细胞的处理也将ALP活性增加了2-3倍。此外，F1和F4对细胞数的作用通过NBB测定进行评估(图1B)。结果表明，在刺激ALP活性的浓度(0.625至10μM)下，F1和F4略微增加了细胞增殖的细胞数量。在较高浓度(25-100μM)下，观察到细胞活力的显著丧失。

为了考察F1和F4是否诱导功能性成骨细胞分化，通过茜素红染色考察了钙化骨基质的沉积。将MC3T3-E1成骨细胞在成骨细胞矿化培养基中用F1或F4(处于1.5μM或5μM)处理14天，并通过茜素红染色测量细胞层中的钙沉积。与第14天观察到的对照相比，F1和F4二者均显著增强了MC3T3-E1细胞层中的茜素红染色。在F1或F5的较高浓度(即5μM)下观察到更多的钙沉积(相比于在其较低浓度(即1.5μM)下)。

实施例2：成骨细胞分化相关的标记基因的诱导

1.方法与材料

RNA提取和定量实时聚合酶链反应(实时PCR)

将MC3T3-E1细胞以1x105个细胞/孔在6孔板中接种2天。将细胞在MEM中用0.05％DMSO、30ng/ml BMP2、400μM ASC/5mMβ-GP处理。在第2天和第4天用试剂分离总RNA，使用Superscript III第一链合成系统(Life Technologies)，使1ug的总RNA经过逆转录/cDNA合成。

利用Green PCR Master Mix和用于成骨细胞分化标志物的引物，使从逆转录反应产生的等量的cDNA经过实时PCR。使用的引物包括：

碱性磷酸酶(ALP)：

5’-TCAGGGCAATGAGGTCACATC-3’(正向)(SEQ ID NO:1)

5’-CACAATGCCCACGGACTTC-3’(反向)(SEQ ID NO:2)；

骨钙素(OCN)：

5’-GCAATAAGGTAGTGAACAGACTCC-3’(正向)(SEQ ID NO:3)

5’-GTTTGTAGGCGGTCTTCAAGC-3’(反向)(SEQ ID NO:4)；

骨桥蛋白(OPN)：

5’-GATGCCACAGATGAGGACCTC-3’(正向)(SEQ ID NO:5)

5’-CTGGGCAACAGGGATGACAT-3’(反向)(SEQ ID NO:6)；

GAPDH：

5’-TGGTGCTGCCAAGGCTGTGG-3’(正向)(SEQ ID NO:7)

5’-TCTCCAGGCGGCACGTCAGA-3’(反向)(SEQ ID NO:8)。

成骨细胞分化标志物基因表达通过ABI prism 7900HT序列检测系统进行分析，并且转录物表达的相对水平通过ΔΔCt法进行定量。

2.结果

对F1和F4对终末分化标志物和信号分子的mRNA表达的作用进行了研究(表1)。终末分化标志物包括ALP和若干细胞外基质或分泌蛋白(骨钙素、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、骨唾液酸蛋白和胶原蛋白1A1)。在这些蛋白质之中，在用F1或F4处理细胞后，骨钙素(OCN)和骨桥蛋白(OPN)的水平显著增加(图2B-2C)。

表1.MC3T3-E1成骨细胞中与骨生成相关的分子的mRNA表达水平(相对于DMSO对照的倍数变化，归一化为GAPDH)。

ALP–碱性磷酸酶；OCN–骨钙素；ATF3–激活转录因子3；ATF6–激活转录因子6；OSN–骨粘连蛋白；Axin2–Axin相关蛋白2；OSX–Osterix蛋白；BSP–骨唾液酸蛋白；Runx2–Runt-相关转录因子；BMP2–骨形态发生蛋白2；Wnt3A–Wnt配体3A；BMP7–骨形态发生蛋白7；Wnt5A–Wnt配体5A；COL1A1–胶原蛋白1A1(胶原蛋白，I型，α1)；Wnt7B–Wnt配体7B；Fzd1–Frizzled1；Wnt11–Wnt配体11；Fzd2–Frizzled2；VDR–维生素D受体；Fzd5–Frizzled5。

与成骨细胞分化相关的信号传导分子包括Wnt配体、Wnt受体复合物(frizzled，LRP5)、β-连环蛋白调节剂(Axin2)、骨形态发生蛋白(BMP)和转录调节剂(runx2和osterix)(Canalis E,Nat Rev Endocrinol.9,575-83(2013)；Lin GL等人,J Cell Biochem.112,3491-501(2011)；Komori T,J Cell Biochem.112,750-5(2011))。通过F4处理介导的明显变化是Wnt通路的两个成员Wnt3A和Frizzled1增加(图2D-2E)。与F1和F4化合物相比，原型成骨细胞分化剂抗坏血酸盐/β-甘油磷酸盐和BMP-2显示出不同的基因调控。

实施例3：MAP激酶在F4诱导的ALP活性中的作用

1.方法与材料

蛋白质印迹

将MC3T3-E1用20mM Tris pH8.0、137mM NaCl、2mM EDTA、1％Triton X-100和10％甘油与蛋白酶抑制剂混合物(Roche，完全)裂解。蛋白质浓度通过Bradford蛋白测定(Bio-Rad)测定，并将等量的蛋白质(30μg)通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上。将该膜用在含有0.1％Tween 20的Tris缓冲盐水中的3％BSA封闭，并与一抗(1:1000)在4℃下温育过夜，然后与HRP连接的二抗温育1小时。使用增强型化学发光试剂(GE Healthcare)在X射线胶片(Fujifilm)上检测化学发光信号。

2.结果

已证实MAP激酶(ERK、p38、JNK)参与成骨细胞分化(Greenblatt MB等人，Annu RevCell Dev Biol.29,63-79(2013))。为了考察MAP激酶在F4诱导的成骨细胞分化中的作用，在MC3T3-E1成骨细胞中测定了单个MAP激酶抑制剂对ALP活性的作用。在存在或不存在p38抑制剂SB203580的情况下，将细胞用DMSO媒介物、5μM F4处理15-30min。通过免疫印迹实验来测定磷酸化p38和总p38的水平。将MC3T3-E1成骨细胞与5μM F4一起温育15min和30min显示出磷酸化p38水平升高。然而，添加p38抑制剂SB203580在任一时间点均降低了磷酸化p38的水平。

在存在或不存在p38抑制剂SB203580的情况下，将细胞用DMSO媒介物或5μM F4处理2天，并测定ALP活性(图3)。p38抑制剂SB203580显著抑制F4诱导的ALP活性的增加，而ERK和JNK抑制剂没有明显的效果。如免疫印迹所表明的，F还证实4刺激p38的磷酸化。

实施例4：F4作为成骨植物雌激素

1.方法与材料

瞬时转染和报告基因测定

将MC3T3-E1以9.0x10⁴个细胞/孔接种在24孔板中。在细胞接种后二十四小时，根据制造商的说明(lipofectamine:DNA＝3:1)，通过lipofectamine 2000(LifeTechnologies)用500ng pERE-Luc(含有三个重复的雌激素反应元件)瞬时转染细胞。在6小时温育后，将细胞在MEM中用DMSO(0.05％)、F4(5μM)或17β-雌二醇(10nM)处理24小时。

2.结果

为了进一步了解F化合物的机械作用，基于相似性集合方法对F化合物进行了化学相似性搜索(Keiser MJ等人，Nat Biotechnol.25,197-206(2007))。结果示于表2。分析表明，F4与雌激素受体激动剂如雌二醇有关。这导致了针对F化合物对成骨细胞分化的雌激素样活性的研究。使用报告基因测定，证实F4以剂量依赖性方式刺激由雌激素反应性基因元件(ERE)驱动的转录活性(图4A-4E)。重要地，该刺激性作用可能被特定的雌激素受体拮抗剂(ICI182780)抑制，其也抑制雌二醇刺激的ERE驱动的启动子活性。为了确定F4的雌激素样活性对成骨细胞分化的作用，研究了ICI对F4诱导的ALP活性的作用。结果表明，ICI在第7天抑制了F4诱导的活性，而在第4天更早时候没有观察到任何效果。

结果表明，F4刺激雌激素受体介导的转录活性，并且这种活性可能至少部分地参与成骨细胞分化相关的ALP活性，如通过特定雌激素受体拮抗剂ICI 182780所评估的。

首次证实，从灯心草中分离的菲化合物表现出成骨作用。证实两种菲化合物(F化合物，F1和F4)在低微摩尔浓度下刺激MC3T3-E1成骨细胞的分化。它们显著增加了分化相关的ALP酶活性和mRNA表达。此外，它们增强了编码与骨形成相关的分泌蛋白(包括OCN、OPN和OSN)的mRNA子组的表达。在分化性成骨细胞与F化合物的长时间温育后，存在钙矿化的显著刺激。这些数据表明F化合物促进骨形成中的功能性过程。

表2.基于相似性集合方法的F化合物的化学相似性搜索。

等级	大小	活性类别	E-值	Max Tc
					1	1102	雌激素受体β[100nM]	5.68e-5	1.00
2	1552	雌激素受体β[1000nM]	2.17e-3	1.00
					3	1755	雌激素受体β[10000nM]	5.77e-3	1.00
4	1723	雌激素受体α[10000nM]	4.01e-1	1.00
					5	1389	雌激素受体α[1000nM]	4.78e+1	1.00
6	6	雌激素受体α[1000nM]	1.75e-5	0.32
					7	10	雌激素受体α[10000nM]	7.11e-3	0.32
8	509	雌激素受体β[10nM]	2.73e-1	0.40
					9	20	雌激素受体β[10nM]	1.73e+0	0.32
10	23	多巴胺D1受体[10nM]	4.61e+0	0.31
					11	24	雌激素受体β[100nM]	5.10e+0	0.32

通过考察参与成骨细胞分化信号传导的基因调控来研究F化合物的作用机制，所述基因调控包括Wnt(Wnt配体、Frizzled 1、Axin2和Lrp5)、骨形态发生蛋白(BMP2、BMP7、Runx2、Osterix)和内质网应激(ATF3和ATF6)的通路(Jang WG等人，J Biol Chem.287,905-15(2012))。从筛选这些化合物中确定了，F化合物显著上调了两个Wnt通路成员(即Wnt配体Wnt3A和Wnt受体frizzled 1)的mRNA表达。规范的Wnt信号传导通过Wnt配体与共受体的frizzled家族的结合介导，最终导致核β-连环蛋白水平和成骨细胞基因的转录调节增加。最近已经证明了frizzled 1的上调在成骨细胞分化中的特定作用(Yu S等人，Bone.56,234-41(2013))。还观察到F化合物处理增加了ER应激相关的ATF6 mRNA表达。ATF6是在ER应激后转录因子介导的内质网应激未折叠蛋白反应。最近，证实了由BMP2诱导的轻度ER应激经由激活包括ATF6在内的UPR传导器正面地调节成骨细胞分化(Jang WG等人，J BiolChem.287,905-15(2012))。

总之，已经确定了从灯心草中分离出的菲化合物是通过多种成骨信号传导成分(包括Wnt通路、ER应激和雌激素受体)刺激成骨细胞分化的新型化合物。

实施例5：含有F化合物(包括F1和F4)的灯心草提取物诱导MC3T3-E1成骨细胞的分化。

1.材料与方法

将灯心草的茎髓(0.5kg)粉碎并在室温下在甲醇(3L)中浸渍三天。将草药混合物过滤并将滤液通过旋转蒸发器干燥。将提取程序重复两次。然后将甲醇提取物合并并再次通过真空进一步干燥，以得到粉末形式的甲醇提取物(5g)。在应用于细胞培养之前，将粉末状提取物溶解在DMSO中，作为10mg/mL储备溶液。

2.结果

使用实施例1中描述的程序来考察灯心草提取物对MC3T3-E1成骨细胞分化在ALP酶活性方面的作用。如图5所示，用灯心草提取物(MJ)处理MC3T3-E1细胞以浓度和时间依赖性方式增加细胞的ALP酶活性。

实施例6：雌激素受体结合。

F4与雌激素受体(ERα和ERβ)结合的量子力学/分子力学建模如图6所示。F4与雌激素受体的结合活性通过竞争性放射性配体雌激素受体结合测定来测定。F4对雌二醇与雌激素受体α结合的IC₅₀为130nM，并且F4对雌二醇与对雌激素受体β结合的IC₅₀为5.6nM(图7)。

实施例7：对雌激素依赖性癌细胞增殖的作用。

研究了F化合物对雌激素依赖性癌细胞的作用(图8)。F4(厄弗酚)或F5(脱氢厄弗酚)以0.3μM的低剂量的处理诱导MCF7细胞增殖。MCF7增殖的倍数增加与通过雌二醇处理诱导的相似。然而，在5μM或更高的剂量下，F4和F5二者均抑制MCF7的增殖。为了进一步确认F4对MCF7增殖的抑制作用，采用了荧光素酶报告基因测定(图9)。发现了在携带雌激素受体的MCF7细胞中，F4处理以剂量依赖性方式降低雌激素受体荧光素酶的活性，但对MDA-MB-231(一种不携带雌激素受体的乳腺癌细胞系)不是这样。此外，F4和F5二者的处理都可以显著抑制由雌二醇诱导的MCF7细胞增殖，但在MDA-MB-231中不是这样(图8)。总的来说，所有这些数据表明，在具有成骨作用的剂量下，F4可以抑制MCF7细胞增殖。

对本说明书中已包括的文献、动作、材料、装置、制品等的任何讨论不应被视为承认任何或所有这些事项形成现有技术基础的一部分或者是本公开内容相关领域中的公知常识(如同其在与本申请的每个权利要求的优先权日之前存在那样)。

在整个本说明书中，用语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变体将被理解为暗示包含所述及的要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或者要素、整数或步骤的组。

应理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。

必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种化合物”包括多种这样的化合物，提及“该化合物”是对一种或多种化合物及其本领域技术人员已知的等效物的提及等等。

在本说明书的整个描述和权利要求书中，用语“包括”和该用语的变体如“包含”和“含有”意指“包括但不限于”，并且不意图排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。

“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件、情形或材料可发生或可以不会发生或存在，并且该描述包括其中该事件、情形或材料发生或存在的情况以及其中它不发生或不存在的情况。

范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表达这样的范围时，除非上下文另有明确说明，否则还特别考虑和认为公开了从一个特定值和/或至另一特定值的范围。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解的是，除非上下文另有明确说明，否则该特定值形成应被视为公开的另一个具体考虑的实施方案。将进一步理解的是，除非上下文另有明确说明，否则每个范围的端点相对于另一个端点并且独立于另一个端点都是重要的。应当理解，除非上下文另有明确说明，包含在明确公开的范围内的所有单个值和值的子范围也被具体考虑并且应该被认为是公开的。最后，应该理解的是，所有范围都将所述及的范围称为范围和从第一端点并且包括第一端点到第二端点并包括第二端点的各个数字的集合。在后一种情况下，应该理解，可以选择任何单个数字作为该范围所提及的数量、值或特征的一种形式。以这种方式，一个范围描述了从第一端点并且包括第一端点到第二端点并包括第二端点的一组数字或值，从其中可以选择该集合的单个成员(即单个数字)作为该范围所提及的数量、值或特征。无论在特定情况下是否明确公开了这些实施方案中的一些或全部，前述内容都适用。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与所公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文所描述的那些相似或等效的任何方法和材料可以用于本方法和组合物的实践或测试，但是特别有用的方法、装置和材料是如所描述的。本文引用的出版物和引用它们的材料在此通过引用具体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而早于这样的公开内容。不承认任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论说明了作者的主张，并且申请人保留质疑所引用文件的准确性和相关性的权利。将清楚地理解的是，尽管本文提及了许多出版物，但是这样的提及并不构成承认任何这些文件构成本领域公知常识的一部分。

尽管对材料、组合物、组分、步骤、技术等的描述可以包括许多选项和替代方案，但是这不应被解释为并且也不是承认这样的选项和替代方案是彼此等价的，或者特别地是显而易见的替代方案。因此，例如，不同组件或材料的列表并不表明所列出的组分或材料彼此之间是显而易见的，也不是对等价或显而易见性的承认。

本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验能够确定本文描述的方法和组合物的具体实施方案的许多等同替换。这样的等同替换意图被所附权利要求涵盖。

Claims (28)

1.一种用于在有需要的受试者中治疗或预防骨丢失或者促进骨形成的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用有效量的一种或多种菲化合物或其衍生物，以相对于未处理的对照在所述受试者中减少骨丢失的一种或多种症状、预防骨丢失的一种或多种症状、促进骨形成或其组合。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种菲化合物具有化学式I或式II：

其中R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀各自独立地是H、烷基、烯基、炔基、卤代、OH、O-酰基、O-烷基、O-烯基、O-单糖、O-二糖、O-寡糖、COR、COOR、CRR'OR”、OSO₃H、OSO₃Na、N₃、NRR'、NHSO₂R、SR、SOR、SO₂R、OPO₃H₂、OPO₃HNa或OPO₃Na₂，并且其中R、R'和R”各自独立地是H、烷基、烯基、炔基。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种菲化合物包括厄弗酚。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者是人。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述受试者患有骨质减少或骨质疏松症。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种菲化合物以相对于未处理的对照在所述受试者中有效刺激成骨细胞分化、活性、存活或其组合的量施用。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种菲化合物以相对于未处理的对照有效增强一种或多种成骨蛋白的表达的量施用。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种成骨蛋白选自由碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、骨唾液酸蛋白及其组合组成的组。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种菲化合物以相对于未处理的对照在所述受试者中有效增加一种或多种成骨细胞特异性转录因子的水平的量施用。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述一种或多种成骨细胞特异性转录因子选自由RUNX2、DLX5、SP7及其组合组成的组。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种菲化合物以相对于未处理的对照在所述受试者中有效增加参与细胞分化的一种或多种促分裂原活化激酶(MAPK)的磷酸化的量施用。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种MAPK是p38。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种菲化合物以相对于未处理的对照在所述受试者中有效增加Wnt/β-连环蛋白信号传导通路中的一个或多个成员的蛋白质表达、转录本水平、活性或其组合的量施用。

14.一种用于在有需要的受试者中治疗或预防骨丢失或促进骨形成的药物组合物，所述药物组合物包含：

包含一种或多种菲化合物或其衍生物的活性剂，所述一种或多种菲化合物或其衍生物的量为相对于未处理的对照在所述受试者中有效减少骨丢失的一种或多种症状、预防骨丢失的一种或多种症状、促进骨形成或其组合。

15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述一种或多种菲化合物是从灯芯草属(Juncus)中富集的、纯化的或其组合。

16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述一种或多种菲化合物比其在来自灯芯草属的粗提取物中的浓度更浓10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或超过100倍。

17.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述一种或多种菲化合物基本上由厄弗酚组成。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中厄弗酚是从灯芯草属中富集的、纯化的或其组合。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中厄弗酚比其在来自灯芯草属的粗提取物中的浓度更浓10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或超过100倍。

20.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述一种或多种菲化合物的量为相对于未处理的对照在所述受试者中有效增加一种或多种成骨蛋白的表达。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述一种或多种成骨蛋白选自由碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、骨粘连蛋白、骨唾液酸蛋白及其组合组成的组。

22.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述一种或多种菲化合物的量为相对于未处理的对照在所述受试者中有效增加一种或多种成骨细胞特异性转录因子的水平。

23.根据权利要求22所述的药物组合物，其中所述一种或多种成骨细胞特异性转录因子选自由RUNX2、DLX5、SP7及其组合组成的组。

24.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述一种或多种菲化合物的量为相对于未处理的对照在所述受试者中有效增加参与成骨细胞分化的一种或多种促分裂原活化激酶(MAPK)的磷酸化。

25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述一种或多种MAPK是p38。

26.一种根据权利要求14-24中任意一项所述的药物组合物在制备治疗或预防骨丢失或促进骨形成的制剂中的用途。

27.根据权利要求26所述的用途，其特征在于，所述制剂还包含药物载体和/或一种或多种另外的活性剂。

28.一种根据权利要求14-24中任意一项所述的药物组合物在制备治疗雌激素依赖性癌症的制剂中的用途。