JP6051241B2

JP6051241B2 - Ｔｄｐ−４３蛋白質症に関連した配列およびその使用法

Info

Publication number: JP6051241B2
Application number: JP2015019179A
Authority: JP
Inventors: ケアンズ、ナイジェル、ジェイ．; バロー、ロバート、エイチ．; ペストロンク、アラン; ギッチョー、マイケル、エー．; ゴート、アリソン、エム．
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 2008-02-01
Filing date: 2015-02-03
Publication date: 2016-12-27
Anticipated expiration: 2029-01-30
Also published as: US10683544B2; WO2009099941A3; JP2011510661A; US9523128B2; US20110065600A1; JP2015119721A; JP5798322B2; US8889597B2; CA2713871A1; WO2009099941A2; US20170067112A1; CA2713871C; US20150065384A1

Description

政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所の財政的援助Ｐ５０−ＡＧ０５６８１のもとに行われた。本発明について、合衆国政府が一定の権利を有する。

本発明は、ＴＤＰ−４３蛋白質症のリスクのある対象の同定に用い得る核酸およびアミノ酸配列を提供する。

ＴＡＲＤＮＡ結合蛋白質４３（ＴＤＰ−４３）は、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）を併発したまたは併発していない、ユビキチン陽性タウ陰性封入体を伴う孤発性および家族性前頭側頭葉変性症：ＦＴＬＤ（ＦＴＬＤ−Ｕ）の病的蛋白質である。ＭＮＤは上位および／または下位運動ニューロンの損失を伴う神経変性障害であり、発症後数年以内の進行性衰弱および死亡を臨床的特徴とする。ＭＮＤの最も一般的な臨床表現型は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。最近、孤発性ＭＮＤには見られるがＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）突然変異を伴う家族性ＭＮＤには見られない運動ニューロン封入体の病的蛋白質としてＴＡＲＤＮＡ結合蛋白質４３（ＴＤＰ−４３）が同定された^１〜４。したがってＴＤＰ−４３はＴＤＰ−４３蛋白質症と称される神経変性疾患の分類を定義する。診断的および治療的処置が発展し得るように、当技術分野においてＴＤＰ−４３とこれらの疾患との間の関連性が理解される必要がある。

本発明のある態様には、配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む、少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを含む単離核酸が含まれる。

本発明の別の態様には、配列番号：２の３１５位のアミノ酸を含む、少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む単離ペプチドが含まれる。

本発明のさらに別の態様には、ＴＤＰ−４３蛋白質症のリスクを有する対象の同定法が包まれる。当該方法には、対象からのサンプルにおいて、配列番号：１の核酸配列を含むヌクレオチド配列の１０７７位のヌクレオチドが何であるかを決定することが含まれる。１０７７位のヌクレオチドにＡの代わりにＧが存在することは、ＴＤＰ−４３蛋白質症のリスクを示す。

本発明の別の態様には、ＴＤＰ−４３蛋白質症のリスクを有する対象の同定法が含まれる。当該方法には、対象からのサンプルにおける配列番号：２のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列３１５位のアミノ酸が何であるかを決定することが含まれる。３１５位のアミノ酸にアラニンの代わりにトレオニンが存在することは、ＴＤＰ−４３蛋白質症のリスクを示す。

本発明のさらなる態様には、エピトープ結合剤を含むアドレスを含むアレイが含まれる。ある変形形態では、エピトープ結合剤は、配列番号：１または１０７７位のヌクレオチドを含むその一部と特異的に結合し得る。あるいは、エピトープ結合剤は、配列番号：２または３１５位のアミノ酸を含むその一部と特異的に結合し得る。

本発明の他の態様および変形形態を以下に詳述する。

ＴＤＰ−４３のエクソン６の高度保存領域内のミスセンス突然変異Ａ３１５Ｔが常染色体優性ＭＮＤ家系の全罹患者で分離することを示す図である。（ａ）ＴＤＰ−４３ゲノム構造、ミスセンス突然変異の位置、およびグリシンリッチドメインに隣接したアミノ酸変化の位置。ＴＤＰ−４３のエクソン６の高度保存領域内のミスセンス突然変異Ａ３１５Ｔが常染色体優性ＭＮＤ家系の全罹患者で分離することを示す図である。（ｂ）エクソン６のクロマトグラムは、対照家系と比較した塩基対の変化（ｃ．１０７７Ｇ＞Ａ）を示す。ＴＤＰ−４３のエクソン６の高度保存領域内のミスセンス突然変異Ａ３１５Ｔが常染色体優性ＭＮＤ家系の全罹患者で分離することを示す図である。（ｃ）家系図は疾患とともに突然変異が分離することを示す（◇＝非罹患者、◆＝突然変異を有する罹患者、斜線＝故人）。Ｒｓａ１制限酵素による消化を用いて家族構成員および１，５０５例の対照をスクリーニングした。突然変異について検証するため、この研究の全家族構成員に対して直接配列決定も実施した。

本発明は、ＴＤＰ−４３蛋白質症に関連したＴＤＰ−４３の核酸配列変異体（表１の配列番号：１）を提供する。具体的には、配列番号：１の１０７７位の核酸はＧではなくＡである。また、本発明は、ＴＤＰ−４３蛋白質症に関連したＴＤＰ−４３のアミノ酸配列変異体（表１の配列番号：２）を提供する。具体的には、配列番号：２の３１５位のアミノ酸は、アラニンではなくトレオニンである。本発明には、対象およびアレイにおけるＴＤＰ−４３蛋白質症の診断法または検出法も含まれる。配列番号１、２、３、および４の配列を以下の表１に示す。

Ｉ．核酸
本発明のある態様には、単離核酸が含まれる。一般的には、当該核酸配列は配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む。具体的には、当該核酸配列は、１０７７位にＧを有する野生型配列（表１の配列番号：３）とは対照的に、配列番号：１の１０７７位にＡを含む。ある実施形態では、核酸は、配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む少なくとも５個の連続するヌクレオチドを含む。別の実施形態では、核酸は、配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、または少なくとも１００個の連続するヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、核酸は配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、または少なくとも１０００個の連続するヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、核酸は配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも３０００個、少なくとも４０００個、または４０００個を超える連続するヌクレオチドを含む。

別の実施形態では、核酸はＴＤＰ−４３のエクソン６を含み、１０７７位の核酸はＧではなくＡである。さらに別の実施形態では、核酸はＴＤＰ−４３のｃＤＮＡを含み、１０７７位の核酸はＧではなくＡである。ある実施形態では、核酸は配列番号：１の核酸配列からなる。

本発明には、上記の単離核酸配列に相補的な核酸も含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の核酸は配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む核酸とハイブリダイズする。他の実施形態では、核酸は配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む核酸とハイブリダイズするが配列番号：３の１０７７位のヌクレオチドを含む核酸とはハイブリダイズしない。ある実施形態では、核酸はＴＤＰ−４３のエクソン６を含む核酸とハイブリダイズし、１０７７位の核酸はＧではなくＡである。

核酸のハイブリダイゼーションは、通常は、ストリンジェントな条件下で実施される。核酸二本鎖またはハイブリッドの安定性は、プローブが標的ＤＮＡから解離する温度である融解温度すなわちＴｍとして表現される。この融解温度を使用して、必要なストリンジェントな条件を定義する。プローブとその標的のアニーリング率を最大化するため、ハイブリッド形成は通常、Ｔｍより約２０〜２５℃低い温度で行われる。例えば、ストリンジェントな条件は、通常は、約６８℃の５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／１．０％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、および約６８℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄を含んでいてもよい。中程度のストリンジェントな条件には、４２℃での３×ＳＳＣ中での洗浄が含まれる。塩分濃度および温度のパラメータを変化させ、核酸と標的配列、例えば、配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む配列、を最適な同一性レベルに到達させることができる。当業者であれば、どのパラメータを操作してハイブリダイゼーションを最適化するかを理解するであろう。そのような条件に関する追加指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ他（編）、１９９５、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．）ａｔＵｎｉｔ２．１０などにより、当技術分野において容易に入手可能である。

本発明の単離核酸は標識されていてもよい。好適な標識例には、これらに限定されないが、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、色素標識、および共鳴標識が含まれる。核酸の標識法は、当技術分野において周知である。

上述した様々な核酸は、当技術分野において既知である様々な異なる技術を用いて入手してもよい。当該核酸は標準技術を用いて単離してもよく、標準技術を用いて合成してもよく、または寄託機関から購入もしくは入手してもよい。一旦入手した核酸は、様々な応用、例えば、下記方法における使用のために増幅および／または配列決定することができる。

本発明には、配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む複数の核酸、またはそれらの誘導体もしくは断片の生成も含まれ、この生成は合成化学を含む当技術分野において既知の任意の方法によって行ってもよい。生成後、該合成配列は、当技術分野において周知である試薬を用いて任意の多くの利用可能な発現ベクターおよび細胞系に挿入してもよい。

ＩＩ．ペプチド
本発明の別の態様には、単離ペプチドが含まれる。一般的には、当該ペプチドのアミノ酸配列は配列番号：２の３１５位のアミノ酸を含む。特に当該ペプチドの配列は、３１５位にアラニンを有する野生型配列（表１の配列番号：４）とは対照的に、配列番号：２の３１５位にトレオニンを含む。ある実施形態では、当該ペプチドは配列番号：２の３１５位のアミノ酸を含む少なくとも５個の連続するアミノ酸を含む。別の実施形態では、当該ペプチドは配列番号：２の３１５位のアミノ酸を含む、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも９０個または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、当該ペプチドは配列番号：２の３１５位のアミノ酸を含む、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個または少なくとも５００個の連続するアミノ酸を含む。

別の実施形態では、当該ペプチドはＴＤＰ−４３のエクソン６の翻訳されたアミノ酸配列を含み、３１５位のアミノ酸はトレオニンである。さらに別の実施形態では、当該ペプチドはＴＤＰ−４３のアミノ酸配列からなり、３１５位のアミノ酸はトレオニンである。

本発明の単離ペプチドは標識されていてもよい。好適な標識例には、これらに限定されないが、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、色素標識、および共鳴標識が含まれる。ペプチドの標識法は当技術分野において周知である。

上述した様々なペプチドは、当技術分野において既知である様々な異なる技術を用いて入手してもよい。当該ペプチドは、標準技術を用いて単離してもよく、標準技術を用いて合成してもよく、または寄託機関から購入もしくは入手してもよい。

本発明には、配列番号：２の３１５位のアミノ酸を含むペプチド、またはそれらの誘導体もしくは断片の生成も含まれ、この生成は合成化学を含む当技術分野において既知の任意の方法によって行ってもよい。

ＩＩＩ．方法
本発明のさらに別の態様には、ＴＤＰ−４３蛋白質症のリスクの決定法および診断法が含まれる。本明細書で使用されるＴＤＰ−４３蛋白質症とは、ＴＤＰ−４３蛋白質の突然変異または機能不全を特徴の一部とする障害または疾患である。例示的な実施形態では、ＴＤＰ−４３蛋白質症は、配列番号：３の１０７７位のヌクレオチドのグアニンからアデニンへの置換により配列番号：１の核酸配列種となること、または配列番号：４の３１５位のアミノ酸のアラニンからトレオニンへの置換により配列番号：２のアミノ酸配列種となること、を特徴の一部とする疾患または障害である。ＴＤＰ−４３蛋白質症の例には、これらに限定されないが、前頭側頭型認知症とも称される孤発性前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、家族性ＦＴＬＤ、孤発性ＭＮＤ、家族性ＭＮＤ、孤発性ＡＬＳ、および家族性ＡＬＳ、ならびにＦＴＬＤ−ＭＮＤなど、これらのうち２つの運動性および認知表現型の組み合わせが含まれる。

ある実施形態では、本発明は対象がＴＤＰ−４３蛋白質症のリスクを有するかどうかを決定する方法が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は対象がＡＬＳリスクを有するかどうかの決定法を提供する。一般的には、当該方法は、対象がＴＤＰ−４３の１０７７位のヌクレオチドにグアニンではなくアデニンを有しているかどうかを決定することを含む。アデニンが存在する場合、当該対象はＴＤＰ−４３蛋白質症を発症するリスクを有することがある。あるいは、当該方法は、対象がＴＤＰ−４３の３１５位のアミノ酸にアラニンではなくトレオニンを有するかどうかを決定することを含んでいてもよい。トレオニンが存在する場合、当該対象はＴＤＰ−４３蛋白質症を発症するリスクを有することがある。

別の実施形態では、本発明はＴＤＰ−４３蛋白質症に罹患した対象の診断法が提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本発明はＡＬＳに罹患した対象の診断法を提供する。通常、当該方法は、対象がＴＤＰ−４３の１０７７位のヌクレオチドにグアニンではなくアデニンを有しているかどうかを決定することを含む。アデニンが存在する場合、当該対象はＴＤＰ−４３蛋白質症と診断されることがある。あるいは、当該方法は対象がＴＤＰ−４３の３１５位のアミノ酸にアラニンではなくトレオニンを有するかどうかを決定することを含んでいてもよい。トレオニンが存在する場合、当該対象はＴＤＰ−４３蛋白質症と診断されることがある。

対象がＴＤＰ−４３の１０７７位のヌクレオチドにグアニンの代わりにアデニンを有しているかどうかを決定する方法は、当技術分野において既知である。例えば実施例に詳述するように、１０７７位のヌクレオチドを含むＴＤＰ−４３の一部の配列決定を実施してもよい。あるいは、以下に詳述したとおり、アレイを使用してもよい。

ある実施形態では、ＴＤＰ−４３の１０７７位のヌクレオチドにグアニンの代わりにアデニンを有する対象において独特な断片を生成する制限酵素で、対象の核酸を消化してもよい。例えば、制限酵素Ｒｓａ１を使用してもよい。Ｒｓａ１は、１０７７位のヌクレオチドがアデニンである場合にＴＤＰ−４３のエクソン６を含む核酸とインキュベートすると独特な断片を生成する。該断片はポリメラーゼ連鎖反応法を使用してゲノムＤＮＡから増幅してもよい。例えば、図１Ｃを参照のこと。

同様に、対象がＴＤＰ−４３の３１５位のアミノ酸にアラニンの代わりにトレオニンを有するかどうかを決定する方法は当技術分野において既知である。例えば、以下に詳述したとおり、アレイを使用してもよい。あるいは、３１５位のトレオニンを認識するが、３１５位のアラニンを認識しない抗体を使用してもよい。

本発明の核酸および／またはペプチドを対象から入手する方法は、当技術分野において既知である。例えば、本発明の核酸および／またはペプチドを含む生体サンプルを対象から採取してもよい。好適な生体サンプルの例には、これらに限定されないが、血液サンプル、組織サンプル、または体液サンプルが含まれる。血液サンプルとしては、全血、血清、または血漿を挙げることができる。体液サンプルとしては、尿、リンパ液、または唾液サンプルを挙げることができる。

好適な対象はＴＤＰ−４３を発現する。例えば、これら限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類、家畜動物、およびペット動物が好適な対象の例である。齧歯類としてはマウス、ラット、およびモルモットを挙げることができる。家畜動物としてはウシ、ブタ、およびニワトリを挙げることができる。ペット動物としてはネコおよびイヌを挙げることができる。いくつかの実施形態では、当該対象はカエルである。上記実施形態の各々において、当該対象が、ＴＤＰ−４３蛋白質症、ＭＮＤ、またはＦＴＬＤの家族歴を有している場合がある。あるいは、当該対象が、ＴＤＰ−４３蛋白質症、ＭＮＤ、またはＦＴＬＤ症状を呈している場合がある。いくつかの実施形態では、当該対象が、ＴＤＰ−４３蛋白質症、ＭＮＤ、またはＦＴＬＤの臨床症状を呈していない場合がある。

ＩＶ．アレイ
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つのアドレスを含むアレイである。いくつかの実施形態では、該アレイの少なくとも１つのアドレス上には、配列番号：１または１０７７位のヌクレオチドを含むその一部に特異的に結合し得るエピトープ結合剤が配置されている。他の実施形態では、該アレイの少なくとも１つのアドレス上には、配列番号：２または３１５位のアミノ酸を含むその一部に特異的に結合し得るエピトープ結合剤が配置されている。

アレイの構築に適したいくつもの基板が当技術分野において既知であり、当業者であれば当技術分野が発展するにつれて他の基板も利用可能となり得ることを理解するであろう。該基板は、エピトープ結合剤の付着または結合に適した別個の部位を含むように修飾されてもよく、かつ少なくとも１つの検出法を受け入れ可能な材料であってもよい。基板材料の例には、これらに限定されないが、ガラス、修飾ガラスまたは官能化ガラス、プラスチック（アクリル類、ポリスチレンならびにスチレンおよび他の材料のコポリマー類、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン類、テフロン（登録商標)Ｊ
など）、ナイロンまたはニトロセルロース、多糖類、ナイロン、樹脂類、シリカまたはシリコンおよび改質シリコンを含むシリカ系材料、炭素、金属類、無機ガラス類およびプラスチック類が含まれる。例示的な実施形態では、該基板は、感知できるほどの蛍光を伴わずに光学的な検出が可能である。

基板は平面状であってもよく、基板はウェル、すなわち３６４ウェルプレートであってもよく、あるいは基板はビーズであってもよい。また、基板はサンプルの体積を最小化するフロースルー式サンプル分析のチューブ内面であってもよい。同様に、当該基板は、特定のプラスチック製の独立気泡発砲体を含む軟質発泡体などのように弾力性があってもよい。

当業者には理解されるように、エピトープ結合剤は多種多様な方法で当該基板に結合させることができる。核酸またはエピトープ結合剤をまず合成して、次いで基板に結合してもよいし、基板上で直接合成してもよい。基板およびエピトープ結合剤は、これら２つを後で結合させるために化学官能基で誘導体化してもよい。例えば、当該基板を、これらに限定されないが、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基またはチオール基などの化学官能基で誘導体化してもよい。これらの官能基を使用し、リンカーを直接または間接的に使用して、核酸またはエピトープ結合剤上の官能基を用いてエピトープ結合剤を結合することができる。

当該エピトープ結合剤は当該基板に非共有結合的に結合してもよい。例えば、ストレプトアビジンにて共有結合的にコーティングされた表面に結合して結合される、ビオチン化エピトープ結合剤を調製してもよい。あるいは、光重合およびフォトリソグラフィなどの技術を用いて表面上でエピトープ結合剤を合成してもよい。アレイへエピトープ結合剤を結合させる他の方法、および基板上で生体分子を合成する方法、すなわちＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社のＶＬＳＩＰＳ技術は、当技術分野において周知である（例えば、その全体が参照するにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５６６，４９５号、およびＲｏｃｋｅｔｔａｎｄＤｉｘ，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ３０（２）：１５５−１７７を参照）。

ある実施形態では、基板に結合したエピトープ結合剤は、空間的に定義されたアレイのアドレスに位置する。アレイは約１〜約数十万個のアドレスを含んでいてもよい。ある実施形態では、該アレイは１０，０００個未満のアドレスで構成されていてもよい。別の実施形態では、該アレイは少なくとも１０，０００個のアドレスで構成されていてもよい。さらに別の実施形態では、該アレイは５，０００個未満のアドレスで構成されていてもよい。さらに別の実施形態では、該アレイは少なくとも５，０００個のアドレスで構成されていてもよい。別の実施形態では、該アレイは５００個未満のアドレスで構成されていてもよい。別の実施形態では、該アレイは少なくも５００個のアドレスで構成されていてもよい。

エピトープ結合剤は、所与のアレイ上に２回以上提示されていてもよい。すなわち、アレイの２つ以上のアドレスが同一のエピトープ結合剤で構成されていてもよい。いくつかの実施形態では、アレイの２、３、または４つ以上のアドレスが同一のエピトープ結合剤で構成されていてもよい。ある実施形態では、アレイは対照エピトープ結合剤および／または対照アドレスを含んでいてもよい。該対照は内部対照、陽性対照、陰性対照、または背景対照であってもよい。

本明細書における「エピトープ結合剤」とは、配列番号：２もしくは３１５位のアミノ酸を含むその一部、または配列番号：１もしくは１０７７位の核酸を含むその一部を認識して結合することができる核酸、オリゴ核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質、脂質、代謝物、これらの小分子または断片を指すことがある。核酸としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、および天然の誘導体または合成的に作成された誘導体を挙げることができる。

さらなる実施形態では、アレイのエピトープ結合剤は、ＭＮＤに関連する、小胞関連膜蛋白質関連蛋白質Ｂ（ＶＡＰＢ）、ダイナクチン（ＤＣＴＮ１）、アルシン（ＡＬＳ２）、免疫グロブリンμ結合蛋白質２（ＩＧＨＭＢＰ２）、またはグリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）の遺伝子を含む配列からなる群から選択される１もしくは複数の配列における突然変異を認識し得る。

アレイは様々な適切な応用に利用してもよい。例えば、これらのアレイはエピトープ結合剤と標的との結合を検出する方法に使用してもよい。本明細書における「標的」とは、配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む核酸、または配列番号：２の３１５位のアミノ酸を含むペプチドを指す。本方法は、通常、標的がアレイに結合したエピトープ結合剤と結合し得るような条件下にて、該アレイと該標的を含むサンプルとをインキュベートすることを含む。次いで、この結合を、蛍光などの一般的に当技術分野において既知である手段を使用して検出してもよい。この文脈における「結合」とは、ハイブリッド形成、共有結合、またはイオン結合を指すことがある。結合が生じ得る条件は、利用したエピトープ結合剤、基板、サンプル、および検出法によって異なり得ることを当業者であれば理解するであろう。そのようなものとして、作製した個々のアレイに適した条件を最適化しなければならない場合がある。

さらに別の実施形態では、対象がＴＤＰ−４３蛋白質症を発症するリスクを有するかどうか決定する方法の一手段として当該アレイを使用してもよい。同様に、対象がＭＮＤリスクを有するかどうか決定する方法の一手段として当該アレイを使用してもよい。あるいは、対象がＡＬＳリスクを有するかどうか決定する方法の一手段として当該アレイを使用してもよい。別の実施形態では、対象がＦＴＬＤリスクを有するかどうか決定する方法の一手段として当該アレイを使用してもよい。通常は、そのような方法には、当該アレイを該対象の生体サンプルとインキュベートすることが含まれる。生体サンプルが配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む核酸、または配列番号：２の３１５位のアミノ酸を含むペプチドを含む場合、アレイとサンプルとの結合が検出される場合があり、該対象はＴＤＰ−４３蛋白質症を発症するリスクを有することがある。

ある実施形態では、ＴＤＰ−４３蛋白質症に罹患した対象を診断する方法の一手段として当該アレイを使用してもよい。同様に、ＭＮＤに罹患した対象を診断する方法の一手段として当該アレイを使用してもよい。あるいは、ＡＬＳに罹患した対象を診断する方法の一手段として当該アレイを使用してもよい。別の実施形態では、ＦＴＬＤに罹患した対象を診断する方法の一手段として当該アレイを使用してもよい。通常、そのような方法には、当該アレイを対象由来生体サンプルとインキュベートすることが含まれる。生体サンプルが配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む核酸を含む場合、または配列番号：２の３１５位のアミノ酸を含むペプチドを含む場合、アレイとサンプルとの結合が検出される場合があり、該対象はＴＤＰ−４３蛋白質症と診断されることがある。

上記実施形態の各々において、当該対象はＭＮＤ、ＡＬＳ、またはＦＴＬＤの臨床症状を呈さない場合がある。いくつかの実施形態では、当該対象はＭＮＤ、ＡＬＳまたはＦＴＬＤの臨床症状をわずかにのみ呈する場合がある。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するためのものである。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施において十分に機能するように本発明者らによって見出された技術であることを当業者であれば理解するはずである。しかしながら、本開示を踏まえて、開示された特定の実施形態において多くの変更を行い、かつ本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似した結果を得ることができることを当業者であれば理解するはずである。したがって、添付図面に記載または示したものはすべて、例示的なものであり、制限的なものではないと解釈されるべきである。

下記の実施例は、本発明の様々な変形形態を例証するものである。

方法
遺伝子解析
標準手順によって全血、血清または脳組織から高分子量ＤＮＡを抽出した。遺伝子解析に先だって、ＲＥＰＬＩ−ｇ（登録商標）ＭｉｄｉＫｉｔ（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して血清ＤＮＡの全ゲノム増幅を行った。各家系における罹患者１例のＤＮＡをＴＤＰ−４３の配列決定に使用した。遺伝子特異的イントロンプライマーを用いてＴＤＰ−４３遺伝子の全エクソンおよびイントロン−エクソン境界を増幅した。ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）および標準プロトコルを用いて増幅断片の直接配列決定を実施した。ほとんどの断片において、配列決定に用いたプライマーは、ＰＣＲ増幅に用いたものと同一であった。反応はＡＢＩ３１３０で実行し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒソフトウェアｖ４．６（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，Ｍｌ，ＵＳＡ）を用いて突然変異解析を実施した。順方向および逆方向の両方向からの配列読み込み時において変異体が観察された場合のみ、配列変異体の陽性シグナルが発せられた。可能な場合、疾患と配列変異体の分離について試験を行い、血縁でない民族的に適合した対照１，５０５例の組をスクリーニングした。

実施例１
スクリーニング
常染色体優性の遺伝パターンを有し、ＳＯＤ１遺伝子内に突然変異を有さないＭＮＤ／ＡＬＳに罹患した８家系、家族性ＦＴＬＤ−ＭＮＤに罹患した５家系、およびＦＴＬＤ−Ｕに罹患した２５家系に対してＴＤＰ−４３遺伝子の突然変異解析を実施した^１４。全家系が欧州系であった。孤発性ＭＮＤ症例は得られなかったが、孤発性ＦＴＬＤ−ＭＮＤ症例（ｎ＝６）および孤発性ＦＴＬＤ−Ｕ症例（ｎ＝２８）をさらに調査した。

本解析により、エクソン６中にＡｌａ−３１５−Ｔｈｒ（ｃ．１０７７Ｇ＞Ａ）のミスセンス突然変異を同定した。ＴＤＰ−４３において、このアラニン残基は、ヒト（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）からゼノパス・トロピカリス（Ｘｅｎｏｐｕｓｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）までの進化的範囲を通して高度に保存されており、機能的に重要である可能性を支持している（表２）。Ａ３１５Ｔ突然変異は、常染色体優性ＭＮＤ家系の罹患者全員で分離していた（さらなる非コード配列変異体はＦＴＬＤ−Ｕ、ＦＴＬＤ−ＭＮＤ、およびＭＮＤ症例においても同定された、図１Ｂ、図Ｃおよび表３を参照のこと）。この突然変異は民族的に適合した高齢対照者の症例集積（ｎ＝１，５０５）には認められなかった。

ＴＤＰ−４３のＡ３１５Ｔ突然変異を有する家系の罹患者４例の表現型は、呼吸器合併症を有するが、上位運動すなわち延髄ニューロン障害は最小限のみであり、認知症は伴わない、緩徐進行性下位運動ニューロン変性症症候群を併発していた（表３）。この家系の脳剖検は依然として着手されていない。類似した臨床的表現型が孤発性ＭＮＤおよびＳＯＤ１突然変異を有する家系において報告されている５，６。本明細書に報告した家族性ＭＮＤにおけるＴＤＰ−４３突然変異は、小胞関連膜蛋白質関連蛋白質Ｂ（ＶＡＰＢ）、ダイナクチン（ＤＣＴＮ１）、アルシン（ＡＬＳ２）、免疫グロブリンμ結合蛋白質２（ＩＧＨＭＢＰ２）、およびグリシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＧＡＲＳ）の遺伝子における突然変異、ならびに若年性ＭＮＤにおける他の突然変異などの、主に下位運動ニューロンに影響を及ぼす他の家族性神経変性病態を補完するが、これら突然変異の一部は様々な臨床的表現型を有する運動ニューロン病および遺伝性運動神経障害において同定されている^１５。

これらのデータは、一般的な分子病理学であるＴＤＰ−４３蛋白質症に関連した、孤発型および家族型の両方のＭＮＤおよびＦＴＬＤ−Ｕにとって重要な意味を有する。優性遺伝性ＭＮＤ家系におけるＴＤＰ−４３のミスセンス突然変異の発見は、ＴＤＰ−４３の機能と神経変性症との間に直接的な関連性があるという証拠を提示する。

実施例２
臨床的家系解析
発端者（図１Ｄの対象ＩＩＩ−１）は、４８歳時に右手の脱力および萎縮症を発症した。初回検査時では、脚力、精神状態、脳神経、感覚検査、反射運動、運動協調性および歩行は正常であり、上位運動ニューロン所見は認められなかった。運動および感覚神経伝導は正常であったが、筋電図（ＥＭＧ）では、両腕遠近位での除神経が示され、両脚の線維束収縮電位および間欠的な高閾値運動単位電位も示された。脳および脊髄の核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、および抗ＧＭ１抗体が陰性であるなどの血液検査も正常であり、ＳＯＤ１遺伝子検査は正常であった。３年後、発端者の上肢脱力は進行したが精神状態、脳神経機能、脚力、および感覚は正常なままであった。

発端者の父親（対象ＩＩ−２）は７２歳時に左足の下垂を発症した。検査では左足の萎縮症および遠位脱力、線維束収縮、および深部腱反射増大が示されたが、他の異常は認められなかった。ＥＭＧでは両脚および傍脊柱筋群での除神経変化を伴う広範囲の線維束収縮が認められた。脱力は全四肢にまで確実に進行して呼吸困難および嚥下困難を伴い、診断後７年目に呼吸器不全により死亡した。

対象ＩＩ−３は６４歳時に左足の下垂を発症し、２年以内に両脚両腕まで進行した。６９歳時の検査では、両脚における非対称性（左＞右）遠位部優位の脱力を伴う上肢の対称性遠近位脱力が示された。反射運動は一貫して活発であった。電気生理学的検査では、両上下肢の除神経変化を伴う正常感覚神経伝導および正常運動神経伝導を示した。７２歳時に呼吸機能の低下が生じ、７３歳時に呼吸器合併症により死亡した。

対象ＩＩ−４は８３歳時に右足脱力を発症し、２年以内に両足に併発し、車椅子を必要とするまで進行した。８５歳時に腕の非対称性脱力および呼吸機能の低下が生じ、８６歳時に広汎性の線維束収縮を伴う上下肢の重度の萎縮および脱力を呈した。

詳細については、表４を参照のこと。

参考文献
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Claims

配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを含む２０個〜１００個の連続するヌクレオチドからなる、配列番号：１の１０７７位に相当するヌクレオチドがＡであるかを調べ、ＴＤＰ−４３蛋白質症を発症するリスクを評価するためのプローブ。
少なくとも１つのアドレスを有する基板を含む、配列番号：１の１０７７位のヌクレオチドを検出してＴＤＰ−４３蛋白質症を発症するリスクを決定するためのアレイであって、
ここで、前記アドレスは、配列番号：１、または１０７７位のヌクレオチドを含むその一部、に特異的に結合し得るエピトープ結合剤を含み、
前記エピトープ結合剤は、２０個〜１００個のヌクレオチドからなる核酸であり、且つ、少なくとも、配列番号：１の１０７７位のヌクレオチド、または１０７７位のヌクレオチドを含むその一部、に結合する、
前記アレイ。
前記基板が５００個以下のアドレスを有する、請求項２に記載のアレイ。
前記基板が５００個を超えるアドレスを有する、請求項２に記載のアレイ。
配列番号：３、または１０７７位のヌクレオチドを含むその一部、に特異的に結合する第二のエピトープ結合剤を含むアドレスをさらに含み、
ここで、第二のエピトープ結合剤は、２０個〜１００個のヌクレオチドからなる核酸であり、且つ、少なくとも、配列番号：３の１０７７位のヌクレオチド、または１０７７位のヌクレオチドを含むその一部、に結合する、
請求項２〜４のいずれか１項に記載のアレイ。