JP6034001B2

JP6034001B2 - 骨転移または他の骨疾患の予防および治療のための配合物および方法

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Publication number: JP6034001B2
Application number: JP2010550176A
Authority: JP
Inventors: ブルジョー，ヴァネッサ; ゴッドフリン，ヤン
Original assignee: エリテック・ファーマ
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2016-11-30
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Description

本発明は、骨転移および他の骨疾患の処置のための配合物および医薬に関する。本発明はまた、予防方法および治療方法に関する。

ビスホスホネート類はピロホスフェート（構造Ｐ−Ｏ−Ｐ）の合成類似体であって、中心の酸素原子が炭素原子で交換されたものである。それらの化学構造は次式により表わすことができる。

ビスホスホネートは２つのカテゴリーに配属することができる。
第１カテゴリーには、それらの側鎖Ｒ^１およびＲ^２に窒素原子を含まない”第一世代”の化合物が含まれる。このカテゴリーには、特にエチドロネート（ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ）、クロドロネート（ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ）およびチルドロネート（ｔｉｌｕｄｒｏｎａｔｅ）が含まれる。

第２カテゴリーには、それらの側鎖Ｒ^１またはＲ^２の１つに１個以上の窒素原子を含む”第二世代”および”第三世代”の化合物が含まれる。第二世代のものは、窒素原子または末端ＮＨ_２基を保有する脂肪族側鎖を含む。パミドロネート（ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ）、アレンドロネート（ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ）、イバンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）およびネリドロネート（ｎｅｒｉｄｒｏｎａｔｅ）を挙げるべきである。第三世代のものは、窒素原子を含む複素環核を保有する。リセドロネート（ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ）およびゾレドロネート（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）（イミダゾール核）を挙げるべきである。

第一、第二および第三世代としてのこの分類はすべて当業者に既知である。例示として、T. Yuasa et al., Current Medical Chemistry 2007, 14: 2126-2135およびSelvaggi et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2005, 56(3): 365-378；V. Stresing et al., Cancer Letters 2007, 257: 16-35；R. Graham G. Russel et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007, 1117: 209-257が挙げられる。

骨転移は進行癌の症例に一般的である。それらは多発性骨髄腫、乳癌および前立腺癌に最も一般的であるが、黒色腫の症例ならびに膀胱癌、肺癌および腎癌の症例にも存在する。

ビスホスホネート類は、骨癌に罹患している患者の治療処置に必須となっている。たとえば、クロドロネート、パミドロネート、ゾレドロネートおよびイバンドロネートが用いられる。

しかし、ビスホスホネート類は高用量では有毒な可能性がある。それらはかなりの腎排出を受ける可能性もある。たとえばゾレドロネートについて、腎臓によるこの排出は腎毒性を発生するのでヒトに臨床使用する量は慎重に監視されなければならず、骨転移の治療に有効な用量を下回る場合がある。したがって、ゾレドロネートの臨床用量は動物において判定された有効量より１０〜４０倍低い（J. Green, Oncologist 2004, 9: 3-13）。

L. Rossi et al.（Journal of Drug Targeting, February 2005, 13(2): 99-111）には、クロドロネートを赤血球に封入し、マクロファージの枯渇のためにそれを使用することが記載されている。彼らは、エタノールアミンおよびウシ血清アルブミンの存在下において赤血球をＺｎＣｌ_２およびＢＳ３で処理することも記載している。その著者らは、マウスにおいて脾臓マクロファージの枯渇を証明している。その研究は、赤血球をビスホスホネートベクターとして骨適用に際して使用することに関するものではなく、それを想像してもいない。

T. Yuasa et al., Current Medical Chemistry 2007, 14: 2126-2135 Selvaggi et al., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2005, 56(3): 365-378 V. Stresing et al., Cancer Letters 2007, 257: 16-35 R. Graham G. Russel et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007, 1117: 209-257 J. Green, Oncologist 2004, 9: 3-13 L. Rossi et al., Journal of Drug Targeting, February 2005, 13(2): 99-111

したがって本発明の目的は、ビスホスホネート類を骨髄のレベルに送達するための溶液を提供し、これにより腎排出を制限し、現在これらの有効成分の有効性を制限している毒性の問題を避けることである。

本発明の目的は、骨髄のレベルにおけるビスホスホネート類の生物学的利用能を高めるのを可能にする溶液を提供することでもある。
本発明の目的は、特定の処置について遊離形と比較してビスホスホネートの投与量を減らすのを可能にする溶液を提供することでもある。

本発明の目的は、制限となる遊離形の毒性の問題を生じることなく投与可能な量を高めるのを可能にする溶液を提供することでもある。

したがって本発明の対象は、骨髄をターゲティングしてビスホスホネートをこの骨髄へ運ぶ医薬として使用するための、ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤（suspention、懸濁液）であって、これにより毒性、特に腎毒性のいかなるリスクも制限され、または排除すらされる。

本発明の対象は、特に骨転移などの骨疾患を治療または予防するためにビスホスホネートを骨髄内へ運ぶキャリヤーとして使用するための、ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤でもある。

定義によれば、用語”ビスホスホネート”はすべてのビスホスホネート類ならびにその塩類および誘導体、特に第一、第二および第三世代のビスホスホネート類ならびにその塩類および誘導体を包含する。したがって、この用語はジホスホネート、ビホスホン酸およびジホスホン酸を包含する。

限定ではないビスホスホネートの例には、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、特に二ナトリウム形のもの、アレンドロネート、インカドロネート（ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ）、イバンドロネート、ネリドロネート、リセドロネートおよびゾレドロネートが含まれる。

好ましくは、本発明には少なくとも１個の窒素原子を含むビスホスホネート類、たとえば第二世代および第三世代のビスホスホネート類を用いる。特に、第二世代についてはパミドロネート、アレンドロネート、イバンドロネートおよびネリドロネートが選択される。第三世代のものは、窒素原子を含む複素環核を保有する。リセドロネートおよびゾレドロネート（イミダゾール核）を挙げるべきである。

本発明は特に、ビスホスホネート類を適用できる骨および骨髄の病的状態の予防および治療のための医薬として使用するための、ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤に関する。処置プロトコルがもはや遊離形のビスホスホネートに関連する毒性により制限されることはないという限りにおいて、本発明は目標とする病的状態の処置に最適な用量を供給するのを可能にする。

したがってこの使用は、骨転移、悪性高カルシウム血症、ページェット病および骨粗鬆症の予防または治療に関連づけることができる。
本発明は、より具体的には骨転移の予防および治療のための医薬として使用するための、ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤である。

本発明はまた、これらの骨または骨髄の疾患、特に骨転移の予防および治療のために使用するための、ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤を含有する医薬に関する。
本発明はまた、これらの骨または骨髄の疾患、特に骨転移の予防および治療に際して使用する医薬の製造のための、ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤の使用に関する。

本発明はまた、骨転移の治療または予防のためにビスホスホネートを骨髄内へ運ぶキャリヤーとして使用するための、ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤に関する。
好ましくは、ビスホスホネートの封入は細胞溶解−再シール（ｌｙｓｉｓ−ｒｅｓｅａｌｉｎｇ）と呼ばれる方法により行なわれる。

ビスホスホネートは一般に、ｐＨ７．２〜７．６、好ましくは７．４の緩衝液、たとえばＰＢＳ中に調製される。
この方法の１特徴によれば、赤血球を低張状態に置くことにより、赤血球の細胞溶解をまず行なう。赤血球は膨潤して細孔が開く。次いでビスホスホネートを添加すると、赤血球の内側に浸透する。好ましくは、ビスホスホネートの溶液を徐々に添加し、次いで混合物を１０〜６０分間、一般に約３０分間インキュベートしておく。続いて等張状態を再確立し、こうして細孔は再シールまたは再閉鎖され、これにより赤血球はビスホスホネートを安定に封入する。

本発明の有利な１特徴によれば、骨髄のターゲティングを増進する条件下において赤血球を化学物質で処理する。この化学物質は、骨髄の食細胞（マクロファージおよび樹状細胞）による認識を増進する。

この化学処理は、ビスホスホネートを封入した赤血球に対して行なわれる。
ヒトにおける臨床使用と適合する好ましい化学物質は、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３またはＢＳ^３と略称する；ＣＡＳ８２４３６−７７−９）である。この作用物質の溶液を使用するのが有利である。

本発明の対象は、ビスホスホネートを封入した赤血球を含み、その膜が骨髄の食細胞による認識を増進するために化学物質、好ましくはＢＳ３を用いて処理されている、赤血球の懸濁剤またはそのような懸濁剤を含む医薬でもある。ＢＳ３は好ましくは単独で、ＺｎＣｌ_２など他の化学物質または生物学的物質をいずれも含まない状態で用いられる。第１態様によれば、ビスホスホネートは第一世代ビスホスホネートである。第２態様によれば、ビスホスホネートは第二世代ビスホスホネートである。第３態様によれば、ビスホスホネートは第三世代ビスホスホネートである。限定ではないビスホスホネートの例には、エチドロネート、クロドロネート、チルドロネート、パミドロネート、特に二ナトリウム形のもの、アレンドロネート、インカドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、リセドロネートおよびゾレドロネートが含まれる。１態様によれば、ビスホスホネートはエチドロネート、チルドロネート、パミドロネート、特に二ナトリウム形のもの、アレンドロネート、インカドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、リセドロネートおよびゾレドロネートから選択される。

ＢＳ３で処理する方法の１特徴によれば、ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤を適切な期間、ＢＳ３と接触させる；これは特に約１０分〜約１時間であってよい。この期間は、有利には約１５分〜約４５分、好ましくは約２０〜約４０分、一般に３０分程度である。

ＢＳ３で処理する方法の他の特徴によれば、このインキュベーションは好ましくは周囲温度、特に１８〜２５℃で行なわれる。
ＢＳ３で処理する方法の他の特徴によれば、ビスホスホネートを収容した赤血球の懸濁剤を、適切な緩衝液、たとえばＰＢＳで前洗浄する。

他の特徴によれば、ＢＳ３で処理した赤血球の懸濁剤を、ＢＳ３の溶液と接触させる前に、約０．５×１０^６〜約５×１０^６細胞／μｌ、一般に約１×１０^６〜約３×１０^６細胞／μｌの濃度にする。

他の特徴によれば、ＢＳ３の溶液を用いて、懸濁剤中に約０．１〜約６ｍＭ、好ましくは約０．５〜約３ｍＭ、一般に約１ｍＭのＢＳ３最終濃度を得る。約２ｍＭのＢＳ３溶液を特に使用することができる。好ましくはグルコースおよびリン酸緩衝液を含有する緩衝化されたＢＳ３溶液を用いて、希望する最終濃度、特に約１ｍＭのＢＳ３を得ることが好ましい。１特徴によれば、緩衝化されたＢＳ３溶液は有利には約７．２〜約７．６のｐＨ、好ましくは約７．４のｐＨである。他の特徴によれば、緩衝化されたＢＳ３溶液は約２８０〜約３２０ｍＯｓｍのオスモル濃度（ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ）をもつ。

トリス−ＨＣｌなどの作用物質を用いてインキュベーションを停止することができ、次いで混合物を遠心し、細胞を適切な緩衝液、たとえばＳＡＧ−ＢＳＡ中で洗浄および再懸濁する。混合物を遠心前に数分間、特に１分間から１０分間まで、周囲温度でインキュベートしておく。

この懸濁剤は、そのまま使用でき、希釈せずに投与するのに適切なヘマトクリット値をもつことができる。
それは、投与前に希釈すべき状態でパッケージすることもできる。

本発明によれば、そのまま使用できる懸濁剤のヘマトクリット値は、有利には約４０％〜約７０％、好ましくは約４５％〜約５５％、よりさらに良好には約５０％である。
それの希釈用形態においては、マトクリット値は高く、特に約６０％〜約９０％であってよい。

懸濁剤を好ましくは約１０〜約２５０ｍｌの容量でパッケージする。パッケージングは好ましくは輸血に適したタイプの血液バッグ中に行なわれる。医療処方に相当する封入量のビスホスホネート全部を血液バッグに収容することが好ましい。

たとえば１回量に相当する懸濁剤、たとえば１個の血液バッグは、１〜４０ｍｇ、特に２〜１０ｍｇのビスホスホネートを含む。
本発明の１特徴によれば、投与される赤血球は医薬的に許容できる塩類溶液（たとえば、赤血球の標準媒質、特にＮａＣｌとグルコース、デキストロース、アデニンおよびマンニトールから選択される１以上の成分とを含有する溶液；たとえばＳＡＧ−マンニトールまたはＡＤｓｏｌ）中に懸濁している。この溶液は赤血球を保存することができ、かつ保存用添加剤、たとえばＬ−カルニチンを含有することもできる。

したがって本発明の対象は、骨転移または他の骨疾患を予防または治療するための方法である。この方法は、本発明による配合物または医薬を患者に投与することを含む。
本発明によれば、配合物または医薬の投与は静脈内または動脈内への注射により、好ましくは血液バッグまたはこれに類するものからの点滴により行なわれる。投与は一般に腕の静脈内に、または中枢カテーテルを介して行なわれる。

特に、約１０ｍｌから約２５０ｍｌまでの本発明による配合物（１回量）を投与する。５０ｍｌ以上は点滴の採用が好ましい。
処置は、１回量または数回量を、決定したプロトコルに従って投与することを含む。そのプロトコルは、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回、または１年に１回の頻度で、推奨される処置期間にわたる数回の投与を付与することができる。

有効成分を赤血球に封入するための技術は既知であり、本発明において好ましい細胞溶解−再シールによる基礎技術は特許ＥＰ−Ａ−１０１３４１およびＥＰ−Ａ−６７９１０１に記載されており、これらを当業者が参照することができる。この技術によれば、透析エレメント（たとえば透析バッグまたは透析カートリッジ）の第１コンパートメントに赤血球の懸濁剤を連続供給し、一方、第２コンパートメントには赤血球を細胞溶解するために赤血球の懸濁剤に対して低張である水溶液を収容する；次に再シールユニット内において、ビスホスホネートの存在下で、浸透圧および／または膨張圧（ｏｎｃｏｔｉｃｐｒｅｓｓｕｒｅ）を高めることにより赤血球の再シールを誘発し、次いでビスホスホネートを収容した赤血球の懸濁剤を回収する。本発明の１特徴によれば、封入すべきビスホスホネートを既に含有する赤血球懸濁剤の細胞溶解を行なうことが好ましい。

ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤は、特に下記の方法で得ることができ、これも本発明の対象である：
１−赤血球ペレットを６５％以上のヘマトクリットレベルで、＋１〜＋８℃に冷却しながら等張溶液に懸濁、
２−この６５％以上のヘマトクリットレベルの赤血球懸濁剤および＋１〜＋８℃に冷却した低張の細胞溶解溶液を、透析バッグまたは透析カートリッジ（カートリッジが好ましい）に通過させることを含む、＋１〜＋８℃に一定に維持した温度における細胞溶液操作、
３−ビスホスホネートの溶液を、細胞溶解した懸濁剤に、＋１〜＋８℃に維持した温度で、好ましくは特に１０分から６０分まで、一般に約３０分のインキュベーション期間、好ましくは徐々に添加することによる、封入操作、ならびに
４−高張溶液の存在下において、より高い温度、特に＋３０〜＋４２℃で行なう再シール操作。

好ましい変法として、ＷＯ−Ａ−２００６／０１６２４７に記載された方法から着想を引き出すことができ、これによりビスホスホネートを効率的に、再現性をもって、安全かつ安定に封入することが可能になる。その場合、下記の方法によりビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤を得ることができ、これも本発明の対象である：
１−赤血球ペレットを６５％以上のヘマトクリットレベルで、＋１〜＋８℃に冷却しながら等張溶液に懸濁、
２−この同じ赤血球ペレットからの赤血球試料を用いて、浸透圧脆弱性（ｏｓｍｏｔｉｃｆｒａｇｉｌｉｔｙ）を測定、
工程１と２はいかなる順序で行なうこともできる（並行を含む）、
３−この６５％以上のヘマトクリットレベルの赤血球懸濁剤および＋１〜＋８℃に冷却した低張の細胞溶解溶液を、透析バッグまたは透析カートリッジ（カートリッジが好ましい）に通過させることを含む、特に同じチャンバー内での、＋１〜＋８℃に一定に維持した温度における細胞溶液操作；予め測定した浸透圧脆弱性の関数として細胞溶解パラメーターを調整、ならびに
４−ビスホスホネートの溶液を、細胞溶解した懸濁剤に、＋１〜＋８℃に維持した温度で、好ましくは特に１０分から６０分まで、一般に約３０分のインキュベーション期間、好ましくは徐々に添加することによる、封入操作、ならびに
５−第２チャンバー内で、高張溶液の存在下において、より高い温度、特に＋３０〜＋４２℃で行なう再シール操作。

用語”インターナリゼーション”は、ビスホスホネートが赤血球の内側へ透過することを意味するものとする。
特に、透析のために、赤血球ペレットを６５％以上、好ましくは７０％以上の高いヘマトクリットレベルで等張溶液に懸濁させ、この懸濁剤を＋１〜＋８℃、好ましくは＋２〜＋６℃、一般に＋４℃付近に冷却する。特定の１態様によれば、ヘマトクリットレベルは６５％〜８０％、好ましくは７０％〜８０％である。

浸透圧脆弱性を測定する場合、有利には細胞溶解工程の直前の赤血球について、懸濁剤中にビスホスホネートが存在する状態または存在しない状態で測定する。赤血球またはそれらを含有するこの懸濁剤は、有利には細胞溶解のために選択した温度と近接した温度または同一温度である。本発明の有利な１特徴によれば、実施した浸透圧脆弱性の測定を速やかに利用する；すなわち、試料を採取した後、直ちに細胞溶解操作を行なう。好ましくは、試料の採取と細胞溶解の開始との間のこの期間は３０分以下、よりさらに良好には２５分以下、さらには２０分以下である。

浸透圧脆弱性を測定および考慮して細胞溶解−再シール操作を行なう方法に関して、これ以上の詳細について当業者はＷＯ−Ａ−２００６／０１６２４７を参照することができる。この書類を本明細書に援用する。

限定ではない例として考慮される態様によって本発明をより詳細に以下に記載する。
Ｉ−実施例１：ゾレドロネートをネズミおよびヒトの赤血球に封入する方法
Ｉａ−材料：
透析用：透析カートリッジ（Ｇａｍｂｒｏ２８０繊維）
アッセイ：赤血球内のゾレドロネートのアッセイは、後記の方法に従って試料を調製した後、高速液体クロマトグラフィー、ＨＰＬＣにより行なわれる。ゾレドロネートを封入したＲＢＣ（赤血球）を２．５容量の水で細胞溶解し、次いでタンパク質および膜を１２％トリクロロ酢酸で沈殿させることによりゾレドロネートを抽出する。

封入されていたゾレドロネートの量を推定するために、ＲＢＣ（封入前）、最終製品ＲＢＣ−ＺｏｌおよびＲＢＣ−ＬＲ（ＢＳ３で処理したもの、または処理しないもの）、ならびにその上清を、Ｄ０およびＤ１においてアッセイする。

Ｃ１８支持体上でのゾレドロネートの保持時間を改善するために、化合物、硫酸水素テトラブチルアンモニウムをイオン対合剤として用いる。
計測器：島津ＵＦＬＣ
カラム：ＧｅｍｉｎｉＣ１８５μ １１０Ａ２５０×４．６ｍｍ内径
温度：４０℃
注入容量：４０μｌ
ＵＶ検出：２２０ｎｍ
流速：０．７ｍｌ／分
移動相Ａ：８ｍＭＫ_２ＨＰＯ_４−（１．３９ｇ／ｌ）、２ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４−（０．１ｇ／ｌ）、７ｍＭ硫酸水素テトラブチルアンモニウム−（２．７ｇ／ｌ）
移動相Ｂ：メタノール。

Ｉｂ−方法：
赤血球を遠心分離し、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。透析を開始する前に、懸濁剤のヘマトクリット値をＰＢＳで７０％にする。ＲＢＣを２ｍｌ／分の流速で、低オスモル濃度の溶解用緩衝液（１５ｍｌ／分の対向流）に対して透析する。カラムから出る細胞溶解したＲＢＣを等容量に二分する。Ｚｏｍｅｔａ（登録商標）の溶液（０．８ｍｇ／ｍｌのゾレドロン酸（ｚｏｌｅｄｒｏｎｉｃａｃｉｄ））を、透析した赤血球の容量のひとつに徐々に添加して（１０回）、０．４ｍｇ／ｍｌの最終濃度に到達させる。

対照として、透析した赤血球の容量の他方を、徐々に添加した１容量のＰＢＳで希釈する。これら２つの懸濁剤を４〜８℃で３０分間インキュベートする。
高オスモル濃度の溶液（０．１容量）の添加および３７℃で３０分間のインキュベーションにより、赤血球を再シールする。再シールした赤血球を、グルコースを含有するＰＢＳ中で３回洗浄する。ＢＳＡ（６％）を補充したもしくは補充しないＳＡＧ−マンニトールで、またはグルコースを含有するＰＢＳで、この懸濁剤を５０％のヘマトクリット値にし、あるいはそのまま高いヘマトクリット値（８０％）で保存して、これにより最終製品ＲＢＣ−Ｚｏｌ（ゾレドロネート）およびＲＢＣ−ＬＲ（細胞溶解−再シールした（ｌｙｓｅｄ−ｒｅｓｅａｌｅｄ）、ゾレドロネートを含まない対照）を構成する。

ＩＩ−実施例２：ゾレドロネートを収容した赤血球に対するビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ ^３）による化学処理
ゾレドロネートを収容した赤血球の懸濁剤を実施例１の記載に従って得る。この懸濁剤を数回洗浄した後、１．７×１０^６細胞／μｌに希釈し、次いで５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）および０．０９％グルコースを含有する２ｍＭＢＳ^３溶液と、ＢＳ^３の最終濃度１ｍＭが得られるように接触させる。赤血球を周囲温度で３０分間インキュベートし、次いで１容量の２０ｍＭトリス、１４０ｍＭＮａＣｌの添加により反応を停止する。５分間遠心した後、グルコースを含有するＰＢＳで１回、次いでＢＳＡ（６％）を補充したまたは補充しないＳＡＧ−マンニトールで１回、赤血球を洗浄する。ＢＳＡ（６％）を補充したもしくは補充しないＳＡＧ−マンニトール、またはグルコースを含有するＰＢＳ中で、赤血球を５０％のヘマトクリット値にし、あるいはそのまま高いヘマトクリット値（８０％）で保存する。

ＩＩＩ−実施例１および２の結果：
ａ）ヒトＲＢＣ内の封入
下記の表は、ヒト赤血球（ＲＢＣ濃縮液バッグ）を用いて行なった４つのＺｏｍｅｔａ（登録商標）封入実験の概説を示す。

最終製品ＲＢＣ−ＺｏｌをＤ１において分析した際に得た細胞データ（表１）は、装填したＲＢＣがバッグのＲＢＣに近似する細胞特性を維持しており、いかなる特定の損傷も受けていないことを証明する。

表１：

赤血球ヘモグロビン濃度（ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）（ＭＣＨＣ）は、２５ｇ／ｄｌより大きい数値をもち、満足すべき状態を維持している。これは、この方法に際して赤血球内容物の損失が少ないことを証明する。細胞外ヘモグロビンは２ｇ／ｄｌ未満であり、したがって得られた最終製品は注射可能な品質のものである。１ｍＭＢＳ３グループについての収率は１７％の細胞損失を生じる。しかし、最終製品の全細胞収率はすべて工業生産に適合する（＞５５％）。

透析操作により、ＲＢＣ−Ｚｏｌ赤血球の平均赤血球容積（ＭＣＶ）（８０〜８８μｍ^３）はバッグの赤血球（９７μｍ^３）と比較して減少する。
ゾレドロネートの封入に関するデータを表２に示す。

表２

ゾレドロネートはＲＢＣ内への封入について臨界サイズをもち、観察すべき最も重要な基準はＤ１において細胞外割合と比較してＲＢＣに封入されている化合物の量である。赤血球膜の特別な処理なしに３つの実験を行なった；結果はＤ１において満足すべきゾレドロネート封入を示す（最終製品において６８％から８３％までのゾレドロネートがＲＢＣに封入されている）。ＢＳ３処理については、封入は７１％である。

表３は、ゾレドロネートを収容したヒト赤血球の安定性に関するデータを示す。調製した日（Ｄ０）およびその翌日（Ｄ１）に、細胞外ヘモグロビン、懸濁剤のヘマトクリット値、ならびに細胞内および細胞外ゾレドロネートの量を測定する。

Ｄ０とＤ１の間で細胞外ゾレドロネートの増加がみられる。これは、Ｄ０とＤ１の間で増加する細胞外ヘモグロビンと、および細胞損失（ヘマトクリット収率）とも、相関関係を証明できる。したがって、細胞外媒質中へのゾレドロネート放出は本質的に、透析後に適正に再シールされていなかった赤血球の破裂から生じ、赤血球膜を通した受動的または能動的な漏出から生じるのではない。これらの結果は、種々の条件下で良好に貯蔵されることを示す。

ｂ）ネズミＲＢＣ内への封入
次表は、ネズミ赤血球（全血）を用いて行なった３つのＺｏｍｅｔａ（登録商標）封入実験の概説を示す。ヒトＲＢＣの場合と同様に、このＲＢＣ−Ｚｏｌは全血に近い細胞特性を維持する。

表４

赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）はきわめて満足すべきものである。マウス赤血球はより脆いので、細胞外ヘモグロビンはヒトＲＢＣの場合より高い。透析処理により、実験間で均一なＲＢＣ−Ｚｏｌ赤血球の平均赤血球容積（４３〜４６μｍ^３）が得られる。

表５は、ネズミＲＢＣ内へのゾレドロネートの封入に関するデータを示す（Ｄ１における測定）。最終懸濁剤はヘマトクリット値８０％の濃厚懸濁剤である。
表５

これらの結果はＤ１における満足すべき封入を示す。
Ｖ−実施例３：ＢＳ ^３処理による骨髄ターゲティングの確認
蛍光色素ＦＩＴＣ−デキストラン（７０ｋＤａ）を、カラム内での低張透析法によりネズミ赤血球（ＯＦ１マウス）に封入した。血液を予め遠心し、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。透析を開始する前に、最終濃度８ｍｇ／ｍｌで添加したＦＩＴＣ−デキストランの存在下においてヘマトクリット値を７０％にする。このＲＢＣを２ｍｌ／分の流速で、低オスモル濃度の細胞溶解用緩衝液（１５ｍｌ／分の対向流）に対して透析する。カラムから出る細胞溶解したＲＢＣを、高オスモル濃度の溶液の添加および３７℃で３０分間のインキュベーションにより再シールする。グルコースを含有するＰＢＳ中で２回洗浄した後、ＲＢＣを１．７×１０^６細胞／μｌに希釈し、その後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）および０．０９％グルコースを含有する１０ｍＭＢＳ^３溶液と接触させる。ＲＢＣを周囲温度で３０分間インキュベートし、次いで１容量の２０ｍＭトリス、１４０ｍＭＮａＣｌの添加により反応を停止する。５分間遠心した後、グルコースを含有するＰＢＳで１回、次いでＢＳＡ（６％）を補充したＳＡＧ−マンニトールで１回、ＲＢＣを洗浄する。赤血球を５０％のヘマトクリット値にして最終製品を構成し、これをＤ１においてマウスに注射する。注射後１時間３０分目にマウスを屠殺し、次いで大腿骨から摘出した骨髄を窒素中での凍結のためにＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋに入れる。免疫組織学的分析のために１０μｍのクリオスタット切片を切り取る。アセトン中で固定した後、二重標識を行なって、ＦＩＴＣ（ＤＡＢ、褐色）およびＦ４／８０マクロファージ（新規フスシン（ｆｕｓｃｈｉｎ）、赤色）を証明する。

顕微鏡下での切片の所見は、マクロファージとデキストランの同位置局在（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す。この所見は、赤血球が食作用を受けることによりデキストランがマクロファージに取り込まれることを立証する。

フローサイトメトリー分析（ＦＣ５００ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）により下記の情報が得られる。
表６：ＲＢＣをマウスに静脈内注射した後１時間３０分目の骨髄における蛍光性細胞のパーセント

フローサイトメトリー分析は、注射後１時間３０分目に、ＢＳ３処理した場合および処理していない場合、約７％および５％の骨髄細胞が蛍光性であることを示す。
表７は、処理赤血球または非処理赤血球を食作用により取り込んだ食細胞のパーセントを示す。

ＢＳ３処理は、処理しない場合より、食作用による骨髄内への迅速かつ多量のＲＢＣの取込みを誘発する。
結論
・ゾレドロネートを安定にＲＢＣ内に封入することができ、赤血球はＢＳ３で膜処理されてもよく、されなくてもよい；
・封入される量は臨床使用量に大幅に適応する。封入実験（１ｍＭＢＳ３処理を伴う）は、５６．１μｇ／ｍｌのゾレドロネートを収容した最終製品が得られることを示した。したがって、４ｍｇ相当量にするためには、ある者に約７１ｍｌのＲＢＣ−Ｚｏｌを注入する必要がある；
・１ｍＭＢＳ３による処理は、赤血球に骨髄をターゲティングさせるのを可能にする；
これらはすべて、骨転移または他の骨疾患に関連して骨髄をターゲティングするためのゾレドロネートのキャリヤーとしてのＲＢＣの使用を確証する。

Claims

ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤の製造方法であって、該懸濁剤が、ビスホスホネートを骨髄内へ運ぶための医薬品として使用され、かつ骨転移の予防および治療のための医薬として使用されるものであり、該ビスホスホネートが第二世代または第三世代のビスホスホネートであり、該方法が、該ビスホスホネートを赤血球に封入し、次いで、骨髄のターゲティングを増進させるために、該ビスホスホネートを封入した赤血球をビス（ホスホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）の溶液で化学処理することを含む方法。
ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤を、１０分〜１時間、ＢＳ３と接触させる、請求項１に記載の方法。
該ＢＳ３の溶液での化学処理が周囲温度で行なわれる、請求項１または２に記載の方法。
ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤を、該ＢＳ３の溶液での化学処理の前に、適切な緩衝液で洗浄する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
ビスホスホネートを封入した赤血球の懸濁剤を、該ＢＳ３の溶液での化学処理の前に、０．５×１０^６〜５×１０^６細胞／μｌの濃度にする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
懸濁剤の濃度が、１×１０^６〜３×１０^６細胞／μｌである、請求項５に記載の方法。
ＢＳ３の溶液を用いて、懸濁剤中に０．１〜６ｍＭの最終ＢＳ３濃度を得る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
最終ＢＳ３濃度が０．５〜３ｍＭである、請求項７に記載の方法。
最終ＢＳ３濃度が１ｍＭである、請求項８に記載の方法。
２８０〜３２０ｍＯｓｍのオスモル濃度および７．２〜７．６のｐＨを有する緩衝化されたＢＳ３溶液を用いる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
ＢＳ３の溶液がグルコースおよびリン酸緩衝液を含む、請求項１０に記載の方法。
ビスホスホネートが、パミドロネート、アレンドロネート、インカドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、リセドロネートおよびゾレドロネートから選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
ビスホスホネートがゾレドロネートである、請求項１２に記載の方法。