KR20100129288A

KR20100129288A - 골 전이 또는 기타 골 질환의 예방 및 치료를 위한 제제 및 방법

Info

Publication number: KR20100129288A
Application number: KR1020107019901A
Authority: KR
Inventors: 바네사 부르조; 얀 고드프랭
Original assignee: 에리테끄 파르마
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2010-12-08
Also published as: CN101965182B; ES2544967T3; JP6034001B2; FR2928270B1; IL207713A0; US20140010795A1; WO2009112493A1; EP2249816A1; US20110014171A1; AU2009224681A1; US20140363413A1; JP2011513464A; IL207713A; HK1152883A1; FR2928270A1; KR101604451B1; AU2009224681B2; CA2718028A1; EP2249816B1; CA2718028C

Abstract

본 발명은 골 전이(bone metastases) 및 기타 골수 질환의 예방 및 치료를 위한 의약으로서의 사용을 위한, 비스포스포네이트를 캡슐화하는(encapsulate) 적혈구의 현탁액에 관한 것이다. 또한 본 발명은 적혈구가 골수의 표적화를 촉진하기 위해 BS3와 같은 작용제로 화학적 처리된 것인, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액에 관한 것이다.

Description

골 전이 또는 기타 골 질환의 예방 및 치료를 위한 제제 및 방법{Formulation and method for the prevention and treatment of bone metastases or other bone diseases}

본 발명은 골 전이(bone metastases) 및 기타 골 질환의 치료를 위한 제제 및 의약에 관한 것이다. 본 발명은 또한 예방 및 치료 방법에 관한 것이다.

비스포스포네이트는 피로포스페이트(pyrophosphate) (P-O-P 구조)의 합성 유사체(analogue)로서, 피로포스페이트에서 중앙의 산소 원자가 탄소 원자로 대체된 것이다. 그의 화학 구조는 하기 식으로 표시될 수 있다:

비스포스포네이트는 두 카테고리로 나뉠 수 있다.

첫번째 카테고리는 그의 측쇄(side chain) R¹ 및 R²에 질소 원자를 포함하지 않는, "제1-세대" 화합물을 포함한다. 이 카테고리는 특히, 에티드로네이트, 클로드로네이트 및 틸루드로네이트(tiludronate)를 포함한다.

두번째 카테고리는 그의 측쇄 R¹ 또는 R² 중 하나에 하나 이상의 질소 원자를 포함하는, "제2-세대" 및 "제3-세대" 화합물을 포함한다. 제2 세대의 화합물들은 질소 원자 또는 말단 NH₂ 기를 갖는 지방족 측쇄를 포함한다. 파미드로네이트, 알렌드로네이트, 이반드로네이트 및 네리드로네이트가 언급될 수 있을 것이다. 제3 세대의 화합물은 질소 원자를 포함하는 헤테로고리 모핵을 갖는다. 리제드로네이트(risedronate) 및 졸레드로네이트(zoledronate) (이미다졸 모핵)가 언급될 수 있을 것이다.

제1 세대, 제2 세대 및 제3 세대로의 분류는 당업자에게 전부 공지되어 있다. 예시적으로, T. Yuasa 등에 의한, Current Medical Chemistry 2007, 14: 2126-2135 및 Selvaggi 등에 의한, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2005, 56(3): 365-378; V. Stresing 등에 의한, Cancer Letters 2007, 257: 16-35; R. Graham G. Russell 등에 의한, Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007, 1117: 209-257가 언급될 수 있다.

골 전이는 진행된(advanced) 암의 사례에서 흔하다. 이는 다발성 골수종, 유방암 및 전립선암에서 가장 흔하나, 흑색종의 사례 및 방광암, 폐암 및 신장암의 사례에서도 존재한다.

비스포스포네이트는 골암을 앓고 있는 환자의 치료적 처치에서(therapeutic treatment) 필수적인 것이 되었다. 그에 따라 클로드로네이트, 파미드로네이트, 졸레드로네이트 및 이반드로네이트가 사용된다.

그러나 비스포스포네이트는 고용량에서 독성을 나타낼 수 있다. 이들은 또한 상당한 신장 제거(renal elimination)을 겪을 수 있다. 예를 들면, 졸레드로네이트에 있어서, 이러한 신장에 의한 제거는 신장 독성을 발생시켜, 사람에서 임상적으로 사용되는 투여량은 신중하게 관리되어야 하며, 그 투여량은 골 전이의 치료를 위한 유효 투여량보다 낮을 수도 있다. 따라서, 졸레드로네이트의 임상적 투여량은 동물에서 결정된 유효 투여량보다 10 내지 40 배 낮다 (J. Green, Oncologist 2004, 9: 3-13).

L. Rossi 등은 (Journal of Drug Targeting, February 2005, 13(2): 99-11 1) 클로드로네이트의 적혈구 내로의 캡슐화(encapsulation) 및 대식세포의 제거 (depletion)를 위한 그의 용도를 개시한다. 또한 이들은 에탄올아민 및 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)의 존재하에서, ZnCl₂ 및 BS³을 사용한 적혈구의 처리를 개시한다. 저자들은 마우스에서 비장 대식세포의 제거를 입증한다. 상기 연구는 골 적용(bone applications)에서, 비스포스포네이트 벡터로서의 적혈구의 용도에 관하여 기재하거나 예측하고 있지 않다.

따라서 본 발명의 목적은 비스포스포네이트를 골수의 수준에서 전달하기 위한 용액을 제시하여, 그에 의해 신장 제거를 제한하고 현재 이 활성 성분들의 효능을 제한하는 독성 문제를 회피하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 골수의 수준에서 비스포스포네이트의 생체이용률을 증가시킬 수 있게 하는 그러한 용액을 제시하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한 유리 형태(free form)에 비해, 주어진 치료를 위해 투여되는 비스포스포네이트의 양을 감소시킬 수 있게 하는 그러한 용액을 제시하는 것이다.

본 발명의 목적은 또한, 유리 형태의 독성에 따른 제한 문제를 겪지 않고 투여 용량을 증가시킬 수 있게 하는 그러한 용액을 제시하는 것이다.

따라서 본 발명의 주제(subject)는 골수를 표적화하고, 비스포스포네이트를 골수로 운반하여 독성, 특히 신장 독성의 위험을 제한하거나 또는 심지어 제거한 의약으로서의 용도를 목적으로 하는, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액이다.

또한 본 발명의 주제는 특히 골 전이와 같은 골 질환의 치료 또는 예방을 위해, 비스포스포네이트를 골수로 운반하기 위한 담체로서의 용도를 목적으로 하는, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액이다.

정의에 의해, 용어 "비스포스포네이트(bisphosphonate)"는 모든 비스포스포네이트 및 그의 염과 유도체, 및 특히 제1-, 제2- 및 제3-세대 비스포스포네이트 및 그의 염과 유도체를 포함한다. 따라서 이 용어는 디포스포네이트, 비포스폰산(biphosphonic acid) 및 디포스폰산(diphosphonic acid)을 포함한다.

비스포스포네이트의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 에티드로네이트, 클로드로네이트, 틸루드로네이트, 파미드로네이트, 특히 디소듐 형태, 알렌드로네이트, 인카드로네이트, 이반드로네이트, 네리드로네이트, 리제드로네이트(risedronate) 및 졸레드로네이트(zoledronate).

바람직하게, 본 발명은 하나 이상의 질소 원자를 포함하는 비스포스포네이트, 예를 들면 제2-세대 및 제3-세대 비스포스포네이트를 사용한다. 특히 하기의 것들이 선택된다: 제2 세대로서 파미드로네이트, 알렌드로네이트, 이반드로네이트 및 네리드로네이트. 제3 세대의 비스포스포네이트는 질소 원자를 포함하는 헤테로고리 모핵(heterocyclic nucleus)을 갖는다. 리제드로네이트 및 졸레드로네이트(이미다졸 모핵)가 언급될 수 있다.

본 발명은 특히, 비스포스포네이트가 권고될(indicated) 수 있는 골 및 골수 질환(pathologies)의 예방 및 치료용 의약으로서의 용도를 위한, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액에 관한 것이다. 본 발명은 치료 프로토콜이 비스포스포네이트의 유리 형태와 관련된 독성에 의해 더이상 제한되지 않는 한에 있어서는, 표적으로 하는 질환의 치료를 위한 최적화된 투여량을 제공할 수 있게 한다.

따라서, 상기 용도는 골 전이, 악성 과칼슘혈증, 파제트씨 병(Paget's disease) 및 골다공증의 예방 또는 치료에 관한 것일 수 있다.

본 발명은 보다 특별하게는 골 전이의 예방 및 치료용 의약으로서의 용도를 위한, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액이다.

또한 본 발명은 골 또는 골수 질환 및 특히 골 전이의 예방 및 치료를 위한 용도를 목적으로 하는, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액을 포함하는 의약에 관한 것이다.

본 발명은 또한 골 또는 골수 질환 및 특히 골 전이의 예방 및 치료에서의 사용을 위한 의약의 제조를 목적으로 하는, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구 현탁액의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 골 전이의 치료 또는 예방 목적으로, 비스포스포네이트를 골수 내로 운반하기 위한 담체로서의 용도를 위한, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액에 관한 것이다.

바람직하게, 비스포스포네이트의 캡슐화는 용해-재봉합(lysis-resealing)으로 지칭되는 과정에 의해 수행된다.

비스포스포네이트는 일반적으로 완충 용액, 예를 들면 PBS 중에서, pH 7.2 내지 7.6, 바람직하게는 7.4에서 제조된다.

이 과정의 한 특성에 따르면, 적혈구의 용해는 우선 후자(the latter)를 저장성 조건에 두는 것에 의해 수행된다. 적혈구는 팽윤되어(swell), 소공(pore)을 열게 된다. 그 다음 비스포스포네이트가 첨가되고, 적혈구 내부로 침투한다. 바람직하게, 비스포스포네이트 용액은 서서히 첨가되고, 그 다음 혼합물은 예를 들어, 10분 내지 60분, 통상적으로 약 30분 동안 인큐베이션된다. 뒤이어 등장 조건이 다시 조성되고(re-established) 이에 따라 소공들이 재봉합 또는 재-폐쇄(re-closed)되어, 적혈구들은 안정적으로 비스포스포네이트를 캡슐화하게 된다.

본 발명의 한 가지 유익한 특성에 따르면, 적혈구들은 골수의 표적화를 촉진하는 조건 하에서 화학적 작용제(chemical agent)로 처리된다. 이 화학적 작용제는 골수의 식세포(phagocytic cell) (대식세포 및 수지상 세포)에 의한 인식(recognition)을 촉진시킨다.

화학적 처리는 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구를 대상으로 수행된다. 인체에서의 임상적 사용에 적합한 바람직한 화학적 작용제는 비스(술포숙시니미딜) 수버레이트(bis(sulphosuccinimidyl) suberate) (BS3 또는 BS³로 약칭됨; CAS 82436-77-9)이다. 유용하게는 이 작용제의 용액이 사용된다.

또한 본 발명의 주제는 비스포스포네이트를 캡슐화하며, 골수의 식세포에 의한 인식을 촉진하기 위해 막이 화학적 작용제, 바람직하게 BS3를 사용하여 처리된 적혈구를 포함하는, 적혈구의 현탁액 또는 그러한 현탁액을 포함하는 의약이다. BS3는 ZnCl₂와 같은 다른 화학적 또는 생물학적 작용제를 제외하고, 바람직하게는 단독으로 사용된다. 제1 구체예에 따르면, 비스포스포네이트는 제1-세대 비스포스포네이트이다. 제2 구체예에 따르면, 비스포스포네이트는 제2-세대 비스포스포네이트이다. 제3 구체예에 따르면, 비스포스포네이트는 제3-세대 비스포스포네이트이다. 비스포스포네이트의 비제한적인 예는 하기를 포함한다: 에티드로네이트, 클로드로네이트, 틸루드로네이트, 파미드로네이트, 특히 디소듐 형태, 알렌드로네이트, 인카드로네이트, 이반드로네이트, 네리드로네이트, 리제드로네이트 및 졸레드로네이트. 일 구체예에 따르면, 비스포스포네이트는 하기로부터 선택된다: 에티드로네이트, 틸루드로네이트, 파미드로네이트, 특히 디소듐 형태, 알렌드로네이트, 인카드로네이트, 이반드로네이트, 네리드로네이트, 리제드로네이트 및 졸레드로네이트.

BS3로 처리하는 방법의 한 특성에 따르면, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액은 적절한 시간 동안 BS3와 접촉되며, 상기 시간은 특히 약 10분 내지 약 1시간일 수 있다. 이 시간은 유용하게는 약 15분 내지 약 45분, 바람직하게 약 20분 내지 약 40분, 통상적으로 30분 정도이다.

BS3로 처리하는 방법의 또다른 특성에 따르면, 이 인큐베이션은 바람직하게는 주변 온도(ambient temperature), 특히 18 내지 25 ℃에서 수행된다.

BS3로 처리하는 방법의 또다른 특성에 따르면, 비스포스포네이트를 포함하는 적혈구의 현탁액은 적당한 완충액, 예를 들면 PBS로 미리-세척된다.

또다른 특성에 따르면, BS3로 처리된 적혈구의 현탁액은 BS3 용액과 접촉되기 전에, 약 0.5 x 10⁶ 내지 약 5 x 10⁶ 세포/㎕, 통상적으로 약 1 x 10⁶내지 약 3 x 10⁶ 세포/㎕의 농도가 된다.

또다른 특성에 따르면, BS3 용액은 현탁액 중 약 0.1 내지 약 6 mM, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 3 mM, 통상적으로 약 1 mM의 BS3 최종 농도를 얻도록 사용된다. 특히 약 2 mM의 BS3 용액이 사용될 수 있다. 바람직하게 글루코오스 및 인산염 완충액을 포함하는, BS3의 완충 용액이 바람직하게 원하는 BS3 최종 농도, 특히 약 1 mM의 원하는 최종 농도를 얻기 위해 사용된다. 한 특성에 따르면, BS3의 완충 용액은 유용하게는 약 7.2 내지 약 7.6의 pH, 바람직하게 약 7.4의 pH이다. 또다른 특성에 따르면, 상기 BS3의 완충 용액은 약 280 내지 약 320 mOsm의 오스몰 농도(osmolarity)를 갖는다.

인큐베이션은 Tris-HCl과 같은 작용제를 사용하여 중단될 수 있으며, 그 다음 혼합물은 원심분리되고, 세포들은 세척되어 SAG-BSA와 같은 적당한 완충액 중에 재현탁화(resuspend) 된다. 혼합물은 원심분리 전에 주변 온도에서 수 분, 특히 1 내지 10분 동안 인큐베이션된다.

현탁액은 즉시 사용가능한(ready for use) 것일 수 있고, 희석 없이 투여되기에 적합한 헤마토크리트(haematocrit)를 가질 수 있다.

현탁액은 또한 투여 전에 희석되어야 하는 방법으로 포장될 수 있다.

본 발명에 따르면, 즉시 사용가능한 현탁액의 헤마토크리트는 유용하게는 약 40 % 내지 약 70%이고, 바람직하게는 약 45 % 내지 약 55 %, 그보다 바람직하게는 약 50 %이다.

희석용 형태에서는 헤마토크리트가 높을 수 있으며, 특히 약 60 % 내지 약 90 %이다.

현탁액은 바람직하게 약 10 내지 약 250 mL의 부피로 포장된다. 포장은 바람직하게는 혈액 수혈에 적합한 종류의 혈액 백(blood bag)이다. 바람직하게는, 의료 처방(medical prescription)에 상응하는 비스포스포네이트의 캡슐화된 양이 혈액 백에 전부 포함된다.

예를 들어, 1회 투여량에 상당하는 현탁액, 예를 들면 한 개의 혈액 백은 1 내지 40 mg의 비스포스포네이트, 특별하게는 2 내지 10 mg의 비스포스포네이트를 포함한다.

본 발명의 한 특성에 따르면, 투여되는 적혈구는 약학적으로 허용가능한 염수 용액(saline solution)(예를 들면, 적혈구용 표준 매질, 특히 NaCl 및 글루코오스, 덱스트로오스, 아데닌 및 만니톨로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 함유하는 용액; 예를 들면 SAG-만니톨 또는 ADsol) 중의 현탁액 상태이다. 이 용액은 적혈구를 보존할 수 있고, 또한 L-카르니틴과 같은 보존 첨가제(preservation additive)를 포함할 수 있다.

따라서 본 발명의 주제는 골 전이 또는 기타 골 질환을 예방하거나 또는 치료하는 방법이다. 상기 방법은 환자에 대한, 본 발명에 따른 제제 또는 의약의 투여를 포함한다.

본 발명에 따라, 제제 또는 의약의 투여는 정맥내 또는 동맥-내 주사에 의해 수행되며, 바람직하게 혈액 백 등으로부터의 점적(drip)에 의해 수행된다. 상기 투여는 통상적으로 팔 또는 중심 카테터(central catheter)를 통해 정맥내로 수행된다.

특히 본 발명에 따른 제제의 약 10 내지 약 250 mL (1회 투여량)가 투여된다. 50 mL 이상부터는, 점적의 사용이 바람직하다.

치료는 결정된 프로토콜에 따라 1회 투여량 또는 수회 투여량의 투여를 포함한다. 상기 프로토콜은 권장되는 치료 기간에 걸쳐, 매월, 매 2개월, 매 3개월, 매 6개월 또는 매년의 빈도수로 수회 투여를 제공할 수 있다.

활성 성분을 적혈구 내에 캡슐화하는 기술은 공지되어 있고, 본 명세서에서 선호되는 용해-재봉합에 의한 기초 기술은 특허 EP-A-101 341 및 EP-A-679 101에서 개시되며, 당업자는 이를 참조할 수 있다. 본 기술에 따르면, 투석 요소(dialysis element)(예를 들면, 투석 백 또는 투석 카트리지)의 제1 구획(primary compartment)은 지속적으로 적혈구의 현탁액을 공급받으며, 제2 구획은 후자를 용해시키기 위해 상기 적혈구 현탁액에 대해 저장성인 수용액을 포함한다: 다음으로, 재봉합 유닛(unit)에서, 삼투압(osmotic and/or oncotic pressure)을 증가시킴으로써 비스포스포네이트의 존재 하에서 적혈구의 재봉합이 유도되고, 그 다음 비스포스포네이트를 포함하는 적혈구의 현탁액이 회수된다. 본 발명의 한 특성에 따르면, 캡슐화될 비스포스포네이트를 이미 함유하고 있는 적혈구 현탁액의 용해를 수행하는 것이 바람직하다.

비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액은 특히 다음의 방법에 의해 수득될 수 있으며, 이는 역시 본 발명의 한 주제이다:

1 - 65 % 이상의 헤마토크리트 수준까지 등장 용액 중에 적혈구 펠렛(pellet)을 현탁시키고, +1 내지 +8 ℃에서 냉각시키는 단계,

2 - 상기 65 % 이상의 헤마토크리트 수준의 적혈구 현탁액 및 +1 내지 +8 ℃로 냉각된 저장성 용해 용액(lysis solution)을 투석 백 또는 투석 카트리지(카트리지가 바람직하다) 내로 통과시키는 단계를 포함하는, +1 내지 +8 ℃로 지속적으로 유지되는 온도에서 용해시키는 단계,

3 - +1 내지 +8 ℃로 유지되는 온도에서, 바람직하게 특히 10 내지 60분, 통상적으로 약 30분의 인큐베이션 기간 동안, 상기 용해된 현탁액에 비스포스포네이트 용액을, 바람직하게는 서서히(gradual) 첨가시키는 것에 의한 캡슐화 단계, 및

4 - 더 높은 온도, 특히 +30 내지 +42 ℃에서 저장성 용액의 존재 하에서 수행되는 재봉합 단계.

바람직한 변형(variant)으로, 비스포스포네이트를 효과적으로, 재현가능하게, 안전하고 안정적으로 캡슐화할 수 있게 하는, WO-A-2006/016247에 개시된 방법으로부터 교시를 얻을 수 있다. 그 다음, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액은 다음의 방법에 의해 수득될 수 있으며, 이는 또한 본 발명의 주제이다:

1 - 65 % 이상의 헤마토크리트 수준까지 등장 용액 중에 적혈구 펠렛을 현탁시키고, +1 내지 +8 ℃에서 냉각시키는 단계,

2 - 상기와 동일한 적혈구 펠렛으로부터의 적혈구 샘플을 사용하여 삼투압 취약성(osmotic fragility)를 측정하는 단계, 단계 1 및 2는 어떤 순서로든지 수행 가능하다 (동시에 수행하는 것을 포함함),

3 - 상기 65 % 이상의 헤마토크리트 수준의 적혈구 현탁액 및 +1 내지 +8 ℃로 냉각된 저장성 용해 용액을 투석 백 또는 투석 카트리지(카트리지가 바람직하다) 내로 통과시키는 단계를 포함하는, 특히 동일한 챔버(chamber) 내에서, +1 내지 +8 ℃로 지속적으로 유지되는 온도에서 용해시키는 단계로서 용해 파라미터(lysis parameter)는 앞에서 측정된 삼투압 취약성에 대한 함수로서 조정되는 것인 단계, 및

4 - +1 내지 +8 ℃로 유지되는 온도에서, 바람직하게 특히 10 내지 60분, 통상적으로 약 30분의 인큐베이션 기간 동안, 상기 용해된 현탁액에 비스포스포네이트 용액을, 바람직하게는 서서히 첨가시키는 것에 의한 캡슐화 단계, 및

5 - 고장성 용액의 존재 하에, 보다 높은 온도에서, 특히 +30 내지 +42 ℃ 에서 제2 챔버 내에서 수행되는 재봉합 단계.

용어 "내부화(internalization)"는 비스포스포네이트의 적혈구 내부로의 침투(penetration)를 의미하는 것으로 의도된다.

특히, 투석을 위해, 적혈구 펠렛은 등장 용액 중에서 65% 이상, 바람직하게는 70% 이상의, 높은 헤마토크리트 수준으로 현탁화되고, 이 현탁액은 +1 내지 +8 ℃, 바람직하게 +2 내지 +6 ℃, 통상적으로 약 +4 ℃에서 냉각된다. 특별한 일 구체예에 따르면, 헤마토크리트는 65% 내지 80%, 바람직하게는 70% 내지 80%이다.

삼투압 취약성은 측정될 때, 유용하게는 용해 단계 직전에, 현탁액 중에 비스포스포네이트의 존재 또는 부재 하에서 적혈구에 대해 측정된다. 적혈구 또는 이들을 포함하는 현탁액은 유용하게는 용해를 위해 선택된 온도와 근접하거나 동일한 온도에 있다. 본 발명의 유용한 한가지 특성에 따르면, 수행된 삼투압 취약성 측정은 신속하게 활용되며, 즉 용해 단계가 샘플을 취한 직후에 수행된다. 바람직하게, 샘플의 채취 및 용해의 개시 사이의 시간은 30분 이하, 보다 낫게는 25분 이하 및 심지어 20분 이하이다.

삼투압 취약성을 측정하고 참작하는 단계를 포함한, 용해-재봉합 단계가 수행되는 방법에 대하여, 당업자는 보다 상세한 사항을 위해 WO-A-2006/016247을 참고할 수 있다. 상기 문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.

본 발명은 이제 비제한적인 실시예로서 주어지는 구체예에 의해 더욱 상세하게 설명될 것이다.

I - 실시예 1 : 마우스(murine) 및 사람 적혈구 중에 졸레드로네이트를 캡슐화하는 방법

Ia - 재료:

투석용: 투석 카트리지 (Gambro 280 fibres)

분석: 적혈구 중의 졸레드로네이트의 분석은 다음의 방법에 따른 샘플의 제조 후, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography), HPLC에 의해 수행된다. 졸레드로네이트를 캡슐화하는 RBC를 물 2.5 부피로 용해시키고, 다음 12% 트리클로로아세트산을 사용한 단백질 및 막의 침전에 의해 졸레드로네이트를 추출한다.

캡슐화된 졸레드로네이트의 양을 평가하기 위해, (캡슐화 전의) RBC, BS3로 처리 또는 미처리된, 최종 생성물 RBC-Zol 및 RBC-LR, 및 D0 및 D1에서의 이들의 상등액(supernatant)을 분석한다.

C18 지지체(support) 상에서의 졸레드로네이트의 체류(retention) 시간을 개선하기 위해, 화합물 테트라부틸암모늄 히드로게노 술페이트(etrabutylammonium hydrogeno sulphate)를 이온쌍 작용제(ion-pairing agent)로서 사용한다.

기기: Shimadzu UFLC

컬럼: Gemini C18 5μ 110A 250 x 4.6 mm ID

온도: 4O ℃

투여 부피: 40 ㎕

UV 검출: 220 nm

유량(flow rate): 0.7 ml/분

이동상 A: 8 mM K₂HPO₄ - (1.39 g/l), 2 mM Na₂HPO₄ - (0.1 g/l), 7 mM 테트 라부틸암모늄 히드로겐 술페이트 - (2.7 g/l)

이동상 B: 메탄올

Ib - 방법:

적혈구를 원심분리시킨 후, PBS 중에서 3회 세척한다. PBS를 사용하여 현탁액의 헤마토크리트를 70%로 만들고, 그 다음 투석을 시작한다. RBC를 저-삼투성 용해 완충액에 대해 (15 ml/분의 역방향 흐름) 2 ml/분의 유량으로 투석시킨다. 컬럼을 빠져나간 용해된 RBC를 동일한 2개의 부피로 나눈다. 투석된 적혈구 부피 중 1 부피에 Zometa^® (졸레드론 산(zoledronic acid) 0.8 mg/ml) 용액을 서서히 첨가하여 (10 배), 최종농도 0.4 mg/ml에 도달하게 한다.

대조군으로, 투석된 적혈구의 나머지 1 부피를 PBS 1 부피를 서서히 첨가하여, 희석시킨다. 상기 두 현탁액을 4 내지 8 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시킨다.

고-삼투성 용액 (0.1 부피)을 첨가하고, 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 적혈구를 재봉합한다. 재봉합된 세포를 글루코오스를 함유하는 PBS 중에서 3회 세척한다. 현탁액을 BSA (6 %)가 보충되거나(supplemented), 보충되지 않은 SAG 만니톨 또는 글루코오스를 함유하는 PBS를 사용하여 헤마토크리트 50 %로 하거나, 또는 높은 헤마토크리트 (80 %) 상태로 곧바로 저장하여, 최종 생성물 RBC-Zol (졸레드로네이트) 및 RBC-LR (졸레드로네이트를 포함하지 않는 용해-재봉합 대조군)이 되도록 한다.

Ⅱ - 실시예 2: 졸레드로네이트를 포함하는 적혈구에 대한, 비스( 술포숙시니미딜 ) 수버레이트 ( BS3 )를 사용한 화학 처리

졸레드로네이트를 포함하는 적혈구의 현탁액을 실시예 1에서 기술된 바와 같이 수득한다. 이 현탁액을 수회 세척한 후 1.7 x 10⁶ 세포/㎕까지 희석시키고, 그 다음 pH 7.4의 50 mM 인산염 완충액 및 0.09% 글루코오스를 포함하는 BS³ 2mM 용액과 접촉시켜, 1 mM의 BS³ 최종 농도를 얻는다. 적헐구를 30분 동안 주변 온도(ambient temperature)에서 인큐베이션시키고, 그 후 1 부피의 20 mM Tris, 140 mM NaCl을 첨가하여 반응을 중단시킨다. 5분간의 원심분리 후, 상기 적혈구를 글루코오스를 함유하는 PBS로 1회 세척하고, 그 다음 BSA (6 %)가 보충되거나 보충되지 않은 SAG-만니톨로 1회 세척한다. 적혈구를 BSA (6 %)가 보충되거나 보충되지 않은 SAG-만니톨, 또는 글루코오스를 함유하는 PBS 등 중에서 헤마토크리트 50%가 되도록 하거나, 또는 즉시 높은 헤마토크리트 (80 %) 상태로 저장한다.

Ⅲ - 실시예 1 및 2의 결과:

a) 사람 RBC 내의 캡슐화

다음 표는 사람 적혈구 (RBC 농축 백)을 이용하여 수행된 4회의 Zometa^® 캡슐화 실험에 대한 검토를 제공한다.

D1에 최종 생성물 RBC-Zol을 분석하여 수득된 세포 데이터 (표 1)는 적재된(loaded) RBC가 백(bag) RBC에 근접한 세포 특성을 유지하며 특별한 손상을 겪지 않는다는 것을 입증한다.

(D 1)사람 적혈구에 대한 세포 데이터
실험	처리	저장 매질	MCV (㎛³)	세포외 헤모글로빈 (g/dl)	MCHC (g/dl)	세포 수율
1	-	글루코오스함유 PBS	87	0.81	25.5	-
2	-	SAG-만니톨	83	1.49	26.9	76.50%
3	-	글루코오스 함유 PBS	80	0.69	28.8	78.00%
4	1 mM BS3	SAG-만니톨	84	1.17	28.1	58.00%

적혈구 헤모글로빈 농도(corpuscular haemoglobin concentration, MCHC)는 25 g/dl 보다 높은 수치로 만족스러운 수준을 유지했다. 이는 상기 방법 중 적혈구-내부 함량의 작은 소실(loss)을 입증한다. 세포외 헤모글로빈은 2 g/dl 미만이고, 따라서 수득된 최종 생성물은 주사가능한 품질을 나타낸다. 1 mM BS3 군에 대한 수율은 17%의 세포 소실을 유발했다. 그러나, 최종 생성물의 전체 세포 수율은 모두 산업적 생산에 적합하다(> 55%).

투석 과정은 백 중의 적혈구(97 ㎛³)에 비해 RBC-Zol 적혈구 (80-88 ㎛³)의 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV)의 감소를 야기한다..

졸레드로네이트의 캡슐화와 관련된 데이터가 표 2에 주어진다.

(D 1)졸레드로네이트의 캡슐화에 대한 세포 데이터
실험	저장 헤마토크리트 4 ℃	저장 매질	졸레드로네이트 투여량 (㎍/ml)	세포내 졸레드로네이트 (%)	세포외 졸레드로네이트 (%)	포함 수율 (%)
1	50%	글루코오스함유 PBS	54.3	68	32	23
2	50%	SAG-만니톨	66.2	83	17	33.6
3	80%	글루코오스 함유 PBS	69.5	83	17	35.5
4	50%	SAG-만니톨	56.1	71	29	24.5

졸레드로네이트는 RBC 내 캡슐화를 위한 임계적(critical) 크기를 가지며 관찰되어야 할 가장 중요한 기준은 D1에, 세포외 비율에 비해 RBC 내에 캡슐화된 화합물의 양이다. 적혈구 막에 대한 특별한 처리 없이 3회의 실험을 수행했으며, 그 결과는, D1에 만족스러운 졸레드로네이트의 캡슐화를 보여준다(최종 생성물에서 68% 내지 83%의 졸레드로네이트가 RBC 중에 캡슐화됨). BS3 처리시, 캡슐화는 71%이다.

표 3은 졸레드로네이트를 포함하는 사람 적혈구의 안정성에 대한 데이터를 보여준다. 생성일(D0) 및 그 다음 날(D1)에, 세포외 헤모글로빈, 현탁액의 헤마토크리트 및 세포내 및 세포외 졸레드로네이트의 양을 측정했다.

실험	매질	세포외 zol D0 (%)	세포외 zol D1 (%)	세포외 Hb D0 (g/dl)	세포외 Hb D1 (g/dl)	헤마토크리트 D0(%) D1(%)		헤마토크리트 수율 (%)
1	글루코오스함유 PBS	13	32	0.30	0.81	49.4	47.8	96.76%
2	SAG-만니톨	13	17	0.45	1.49	50.0	48.4	96.80%
3	SAG-만니톨	16	29	0.26	1.17	51.1	49.5	96.87%

D0과 D1 사이에 세포외 졸레드로네이트의 증가가 관찰된다. 이는 D0과 D1 사이에 증가하는 세포외 헤모글로빈, 및 세포 소실 (헤마토크리트 수율)과도 상관될 수 있다. 따라서 졸레드로네이트의 세포외 기질로의 방출은 근본적으로 투석 후 적절하게 재봉합되지 않은 적혈구의 파열(rupturing)에 기인한 것이며, 적혈구 막을 통한 수동적 또는 능동적 유출(leaking)로 인한 것이 아니다. 결과는 다양한 조건하에서의 우수한 저장을 보여준다.

b) 마우스 RBC 내의 캡슐화

다음 표는 마우스 적혈구 (전혈 (whole blood))를 이용하여 수행된 3회의 Zometa® 캡슐화 실험에 대한 검토를 제공한다. 사람 RBC에 대해서와 마찬가지로, RBC-Zol은 전혈에 가까운 세포 특성을 유지한다.

(D 1)사람 적혈구에 대한 세포 데이터
실험	처리	MCV (㎛³)	세포외 헤모글로빈 (g/dl)	삼투압 취약성 (g/l)	MCHC (g/dl)
5	1mM BS3	43	1.99	1.67	32.2
6	-	46	3.88	1.47	26.7
7	1mM BS3	43	2	-	31.5

적혈구 헤모글로빈 농도 (MCHC)는 매우 만족스럽다. 마우스 적혈구가 더 깨지기 쉬우므로(fragile), 세포외 헤모글로빈은 사람 RBC의 경우에서보다 높다. 투석 단계는 실험 상호 간에 균일한 RBC-Zol 적혈구의 평균 적혈구 용적(43-46 ㎛³)을 초래한다.

표 5는 마우스 RBC 중 졸레드로네이트의 캡슐화(D1에 측정)에 대한 데이터를 보여준다. 최종 현탁액은 80%의 헤마토크리트를 갖는 농축된 현탁액이다.

졸레드로네이트의 캡슐화에 대한 세포 데이터 (마우스 RBC)(D1)
실험	처리	졸레드로네이트 투여량 (㎍/ml)	세포내 졸레드로네이트 (%)	세포외 졸레드로네이트 (%)	포함 수율 (%)
11	1mM BS3	55.7	92	8	28
12	-	79.8	70	30	30
13	1mM BS3	55.1	78	22	24

결과는 D1에 만족스러운 캡슐화를 보여준다.

V - 실시예 3: BS ³ 처리에 의한 골수 표적화의 유효성 검증( validation )

플루오로크롬 FITC-덱스트란 (70 kDa)을 컬럼에서의 저장 투석(hypotonic dialysis) 방법에 의해 마우스 적혈구 (OF1 마우스) 중에 캡슐화시켰다. 혈액을 미리 원심분리하고, 다음 PBS 중에서 3회 세척한다. 투석을 시작하기 전에, 최종 농도 8 mg/ml로 첨가된 FITC-덱스트란의 존재 하에서 헤마토크리트 70 %가 되도록 하였다. RBC를 저-삼투성 용해 완충액 (15 ml/분으로 역방향 흐름)에 대해 2 ml/분의 유량으로 투석시킨다. 컬럼을 빠져나간 용해된 RBC를, 고-삼투성 용액을 첨가하고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 재봉합한다. 글루코오스를 함유하는 PBS 중에서 2회 세척 후, RBC를 1.7 x 10⁶ 세포/㎕까지 희석시키고, 그 다음 pH 7.4의 5 mM 인산 완충액 및 0.09% 글루코오스를 포함하는 BS³ 10 mM 용액과 접촉시킨다. RBC를 30분 동안 주변 온도에서 인큐베이션시킨 후, 20 mM Tris, 140 mM NaCl 1 부피를 첨가하여 반응을 중단시킨다. 5분간의 원심분리 후, RBC를 글루코오스를 함유하는 PBS로 1회 세척하고, 다음 BSA (6 %)가 보충된 SAG-만니톨로 1회 세척한다. 적혈구를 헤마토크리트 50 %가 되게 하여 최종 생성물로 하고, 이것을 D1에 마우스에 주사한다. 주사 1시간 30분 후에 마우스를 희생시키고, 골수를 대퇴골로부터 분리하여, 질소 중에서 동결시키기 위해 Tissue-Tek 내에 둔다. 면역조직화학적(immunohistochemical) 분석을 위해 10 ㎛ 크리오스탯(cryostat) 절편을 절단한다. 아세톤 중에 고정시킨(fixing) 후, 이중 표지화(double labelling)를 수행하여, FITC (DAB, 갈색) 및 F4/80 대식세포 (신규 fuschin, 적색)를 입증하였다.

현미경 하에서의 상기 절편의 관찰은 대식세포 및 덱스트란의 공동 국재(colocalization)를 보여준다. 이 관찰은 적혈구의 식세포작용(phagocytosis)을 통한, 대식세포에 의한 덱스트란의 포함(incorporation)을 확인한다.

유세포 분석 시험(flow cytometry analysis) (FC500 Beckman Coulter)은 하기의 정보를 제공한다.

마우스내 RBC의 정맥내 주사 1시간 30분 후 골수 중 형광(flurescent) 세포의 백분율

처리	총 형광 세포의 수
RBC-덱스트란	5.3 %
RBC-덱스트란-BS3	7.4 %

유세포 분석 시험은 BS3가 처리 또는 미처리된 경우, 주사 1시간 30분 후에 골수 중 세포의 약 7 % 및 5 %가 형광을 나타낸다는 것을 보여준다.

표 7은 처리 또는 미처리된 적혈구를 포식한(phagocytize) 식세포의 백분율을 보여준다.

처리	F4/80 대식세포	수지상 세포
RBC-덱스트란	5.2 %	7.9 %
RBC-덱스트란-BS3	9.5 %	16.3 %

BS3 처리는, 처리가 없는 경우에 비해 골수 내 RBC의 식세포작용에 의한, 더욱 신속하고 우수한 흡수를 유도한다.

결론

■ 졸레드로네이트는 RBC 중에 안정적으로 캡슐화될 수 있고, 이는 BS3로 막이 처리되거나(membrane-treated) 그렇지 않을 수 있다.

■ 캡슐화된 양은 임상적으로 사용되는 양과 대체로 양립가능(compatible)하다. 캡슐화 실험 (1 mM BS3 처리를 포함함)은 56.1 ㎍/ml의 졸레드로네이트를 포함하는 최종 생성물이 수득된다는 것을 보여주었다. 따라서 4 mg의 당량을 취하도록 하기 위해서는, 개체에게 약 71 ml의 RBC-Zol을 주입(infusion)할 필요가 있다.

■ 1 mM BS3의 처리는 골수의 세포를 표적화할 수 있게 한다.

이 모든 결론은, 골 전이 또는 기타 골 질환과 관련하여 골수를 표적화하기 위한 졸레드로네이트의 담체로서의 RBC의 용도를 검증한다.

Claims

골 전이(bone metastases)의 예방 및 치료용 의약으로서의 용도를 위한, 비스포스포네이트를 캡슐화(encapsulate)하는 적혈구의 현탁액.
제1항에 있어서, 상기 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구는 골수의 표적화(targeting)를 촉진하기 위해 작용제(agent)로 화학 처리된 것인 적혈구 현탁액.
제2항에 있어서, 상기 화학 처리는 비스(술포숙시니미딜)수베레이트(bis(sulphosuccinimidyl)suberate, BS3) 용액으로 수행되는 것인 적혈구 현탁액.
제3항에 있어서, 상기 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액은 10분 내지 1시간, 특히 15분 내지 45분, 바람직하게 20분 내지 40분, 통상적으로는 30분 정도의 시간 동안 BS3와 접촉되는 것인 적혈구 현탁액.
제3항 또는 제4항에 있어서, BS3와의 인큐베이션(incubation)은 주변 온도(ambient temperature)에서 이루어지는 것인 적혈구 현탁액.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, BS3와의 인큐베이션 전에, 상기 비스포스포네이트를 포함하는 적혈구의 현탁액은 적당한 완충액, 바람직하게는 PBS로 세척되는 것인 적혈구 현탁액.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액은 BS3 용액과 접촉되기 전에, 0.5 x 10⁶ 내지 5 x 10⁶세포/㎕의 농도, 바람직하게는 1 x 10⁶ 내지 3 x 10⁶ 세포/㎕의 농도인 것인 적혈구 현탁액.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BS3 용액은, 상기 현탁액 중 0.1 내지 6 mM, 바람직하게는 0.5 내지 3 mM, 보다 바람직하게는 약 1 mM의 BS3 최종 농도를 얻기 위해 사용되는 것인 적혈구 현탁액.
제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 280 내지 320 mOsm의 오스몰농도(osmolarity) 및 7.2 내지 7.6, 바람직하게는 7.4의 pH를 갖는 BS3의 완충 용액이 사용되는 것인 적혈구 현탁액.
제9항에 있어서, 상기 BS3 용액은 글루코오스 및 인산염 완충액(buffer)을 포함하는 것인 적혈구 현탁액.
비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액으로써, 상기 적혈구는 골수의 표적화를 촉진하기 위해 작용제로 화학 처리된 것인 적혈구 현탁액.
특히 골 전이의 치료 또는 예방을 위해, 비스포스포네이트를 골수 내로 운반하기 위한 담체로서의 용도를 위한, 비스포스포네이트를 캡슐화하는 적혈구의 현탁액.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비스포스포네이트는 제2-세대 또는 제3-세대 비스포스포네이트인 것인 적혈구 현탁액.
제13항에 있어서, 상기 비스포스포네이트는 하기로부터 선택되는 것인 적혈구 현탁액: 파미드로네이트, 특히 디소듐 형태의 파미드로네이트, 알렌드로네이트, 인카드로네이트, 이반드로네이트, 네리드로네이트, 리제드로네이트(risedronate) 및 졸레드로네이트(zoledronate).
제13항에 있어서, 상기 비스포스포네이트는 졸레드로네이트인 것인 적혈구 현탁액.