JP6001650B2

JP6001650B2 - Ｃｄｃ４２抑制剤およびその応用

Info

Publication number: JP6001650B2
Application number: JP2014511708A
Authority: JP
Inventors: 群陸; 虎臣周; 燕華陳
Original assignee: 昂科生物医学技術（蘇州）有限公司
Priority date: 2011-05-23
Filing date: 2012-05-21
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2032-05-21
Also published as: CN102796050A; KR20140028078A; US9725417B2; US20140194451A1; EP2716292A4; JP2014515357A; US20150329496A1; CN102796050B; WO2012159456A1; EP2716292B1; EP2716292A1; US20170334863A1

Description

本発明は、化合物に関し、具体的にはＣｄｃ４２抑制剤及びその応用に関する。

細胞分裂周期タンパクＣｄｃ４２は低分子量ＧタンパクのＲｈｏのＧＴＰ酵素ファミリーの一つのサブクラスであり、多くの細胞の生物学機能の重要な調節タンパクである。初め、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発見され、細胞の極性化に関連していること、その後に細胞骨格再編成、細胞のエンドサイトーシス輸送経路、細胞周期調節および細胞転写で重要な役割を果たしていることが認識された。多数のＧＴＰ酵素と同様に、ＧＤＰをＧＴＰ結合実現シグナル伝達に交換することにより、Ｃｄｃ４２は活性化される。ＲｈｏＧＴＰ酵素ファミリーの活性化、不活性化のサイクルは、三つの重要なタンパク質：ＧＤＰの分離とＧＴＰの結合の触媒である、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）；ＲｈｏＧＴＰ酵素を活性化状態から不活性化状態として、ＲｈｏＧＴＰの加水分解を加速する負の制御因子である、酵素ＧＴＰアクティブタンパク（ＧＡＰ）；ＲｈｏＧＴＰ酵素からのＧＤＰの分離を抑制し、ＲｈｏＧＴＰ酵素の活性を抑制する、ＧＤＰ解離抑制因子（ＧＤＩ）、により調節される。

近年の研究により、Ｃｄｃ４２の異常活性が、腫瘍と神経変性疾患などのヒト疾患病態生理に広く関連することが明らかになった。興味深いことに、ヒト腫瘍の中でＣｄｃ４２突然変異の遺伝子は発見されない。その突然変異は、組織依存の微小環境において、障害または過剰発現として主に発現し、腫瘍細胞の転化及び転移と密接に関連している。重要なニューロン形態の調節器として、Ｃｄｃ４２は正常な脳の発育を制御する。Ｃｄｃ４２を欠損させたマウスは、生まれるまで成長せず、また明らかな脳の奇形を示す。いままでの様々な研究により、Ｃｄｃ４２は上皮間葉転換（ＥＭＴ）を活性化するため、細胞内の物質輸送にとって大変重要であり、このことは腫瘍細胞の浸潤に必要なものであることが明らかになった。

しかし、３つの典型的なＲｈｏのスーパーファミリーサブクラスにおいて、Ｃｄｃ４２に対する研究はＲｈｏＡとＲａｃ１より大幅に遅れている。これは、Ｃｄｃ４２の活性化／非活性化形態の転換が非常に速いためであり、また、直接的にこの転換を理解する手助けとなる選択的な低分子の研究も不足しているためである。

ＲｈｏＧＴＰ酵素ファミリーが関連するシグナル伝達経路は、細胞の様々な生化学機能を調節し、例えば、細胞膜の材料輸送、細胞周期の調節と細胞骨格組織、これは、細胞形態、細胞運動及び細胞の生死に関する、に関連している。近年の研究では、ＲｈｏＧＴＰ酵素ファミリータンパクの機能異常が、多くの疾患の病因と進行に関係していることが明らかとなっており、医薬品開発の重要なターゲットとなっている。

同時に、小分子調節剤の応用も、ＲｈｏＧＴＰ酵素ファミリータンパク質の機能の研究を促進した。たとえば、新型脳、心血管系活性薬物であるファスジルと小分子化合物Ｙ２７６３２はＲｈｏＡ下流のエフェクターシグナル分子をターゲットとし、Ｒｈｏ／ｐ１６０^ＲＯＣＫに対する強力な抑制剤として知られている。Ｒａｃ１タンパクの選択的な抑制剤として、近年のＲａｃ１−ＧＥＦが連接する小分子化合物ＮＳＣ２３７６６に対する研究も、Ｒａｃ１タンパクの機能の認識を大幅に促進した。しかし、Ｃｄｃ４２に対する有効で選択的な抑制剤はほとんどない。天然物であるガランタミンの類似物であるＳｅｃｒａｍｉｎｅは、近年ＲｈｏＧＤＩ１によりＣｄｃ４２に依存するゴルジ体−細胞膜の間の材料輸送を抑制できると見なされている。広く使われているＹ２７６３２（１９０３篇の関連文献）、ＮＳＣ２３７６６（１１５篇の関連文献）と異なり、Ｓｅｃｒａｍｉｎｅの研究は限られており、甚だ少ない（関連文献は９篇のみである）。Ｃｄｃ４２の変異は、腫瘍の転化と転移を含む、多くの面で腫瘍発生と関係があり、さらに、ニューロンの増殖と維持も通常のＣｄｃ４２の活性化に大きく依存している。

ＮＳＣ２３７６６は、化合物構造のコンピュータシミュレーションにより選別された化合物であり、Ｒａｃ１分子の表面構造と結合し、Ｒａｃ１とＧＥＦとの結合が非常に重要であることが報告されている（Gao, Y., J. B. Dickerson, et al. (2004). Rational design and characterization of a Rac GTPase-specific small molecule inhibitor. Proc Natl Acad Sci USA. 101(20): 7618-7623）。ＮＳＣ２３７６６は血清の中のあるいは成長因子が誘導するＲａｃ１活性化とＲａｃ１の葉状仮足形成を抑制することができる。ＮＳＣ２３７６６は、ヒト前立腺癌細胞株に作用し細胞増殖を阻害し、足場非依存性増殖を阻害し、腫瘍細胞の細胞浸潤性の表現型を減少させ、腫瘍細胞のこれらの表現型がすべて内因性Ｒａｃ１活性に依存する。さらに、新たな研究により、ＮＳＣ２３７６６がＲａｃ１から導かれる脊髓損害（ＳＣＩ）が誘導する神経性疼痛を改善することができることが明らかにされた（Tan, A. M., S. Stamboulian, et al. (2008). Neuropathic pain memory is maintained by Rac1-regulated dendritic spine remodeling after spinal cord injury. J Neurosci. 28(49): 13173-13183）。

本発明の目的は下記の化合物を提供する。本化合物は次の式Ιの構造を持つ：

その名称は以下のとおりであり：
４−（３−（２−（４−Ｂｒｏｍｏ−２−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙ）ａｃｅｔｙｌ）ｔｈｉｏｕｒｅｉｄｏ）−Ｎ−（４，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ、即ち４−（３−（２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）アセチル）チオウレイド）−Ｎ−（４，６−ジメチルピリミジン−２−イル）ベンゼンスルホンアミドである。本明細書ではＺＣＬ２７８と略す。

本発明のＺＣＬ２７８は、Ｃｄｃ４２が関連する全ての過程を抑制でき、有効的にＣｄｃ４２の作用を抑制する。Ｃｄｃ４２は細胞周期、細胞運動、細胞接着、細胞死、細胞内輸送等で重要な役割を担うと同時に、癌の増殖と浸潤、心臓血管系と呼吸器疾患、神経系疾患及び他の多くの疾患において重要な役割を担っており、本発明が提供するＺＣＬ２７８は、悪性腫瘍の治療薬の調製、開発のために用いられる。特に、悪性腫瘍の増殖と浸潤を、予防治療するための薬物の調製に用いられる。
前記化合物は心臓血管疾患の治療薬に調製される。
前記化合物は呼吸器疾患の治療薬に調製される。
前記化合物は神経系疾患の治療薬に調製される。
前記化合物はＣｄｃ４２を抑制する機能により前記の作用を発揮する。
本発明のもう一つの目的は上記の式Ιに示された化合物を含むＣｄｃ４２抑制剤を提供することである。

本発明が提供する化合物ＺＣＬ２７８は、Ｃｄｃ４２を活性化する、ＧＴＰとの結合を有効的に抑制する。マウス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３の中で、化合物ＺＣＬ２７８は、Ｃｄｃ４２の最も重要な２つの機能である、マイクロスパイクの形成を妨げ、ＧＭ１３０が結合したゴルジ体の構造を破壊する、細胞内構造の制御に影響を及ぼす。Ｒａｃの選択的な抑制剤ＮＳＣ２３７６６に比べ、ＺＣＬ２７８は、細胞核外縁への活性Ｃｄｃ４２の蓄積を減らすことができる。ＺＣＬ２７８は、Ｃｄｃ４２が関連するニューロンの枝分かれ及び成長円錐の運動を抑制し、細胞の生存を阻害することなく転移性前立腺癌細胞ＰＣ−３のアクチンに基づく細胞運動及び移動を抑制できる。したがって、ＺＣＬ２７８は、Ｃｄｃ４２による細胞形態及び運動の調整を有効的に抑制し、癌の増殖と浸潤、心臓血管系、呼吸器疾患、及び神経系疾患等で重要な役割を果たす。

本発明の上記と上記以外の目的、特徴、利点をさらに明らかに分かりやすく把握するための、本発明の特に好ましい実施形態と、図面とは、以下のとおりである。

図１Ａ−図１Ｃ：Ｃｄｃ４２−ＩＴＳＮ（クロスタンパク）連結をターゲットとするＺＣＬの構造。
図１Ａは、コンピュータシミュレーションによるＣｄｃ４２分子中に結合したＺＣＬ２７８を示す。（実際に得られたカラーチャート：灰色表面（図の中の矢印１）がタンパク質を示し、緑の線（図の中の矢印２）がリガンドを示す。）図１ＢはＺＣＬ２７８とＣｄｃ４２のアミノ酸残基との間の相互作用を示す図であり：ＺＣＬ２７８分子は緑の線（図の中の矢印３）で表され、Ｃｄｃ４２は灰色で描画され、Ｃｄｃ４２の残基は灰色の線（図の中の矢印４）で表され、２つの分子間の水素結合はオレンジの破線（図の中の矢印５）で表される。図１Ｃは、Ｃｄｃ４２−ＺＣＬ２７８複合体と、ＧＭＰ−ＰＣＰタンパク質分子（タンパク質データベースＩＤ：２ＱＲＺ）の構造を重ねた図を示す：緑の線がＺＣＬ２７８分子を示し、灰色がＣｄｃ４２の構造を示し、青い線がＧＭＰ−ＰＣＰ構造を示す（ＧＭＰ−ＰＣＰはＧＴＰ類似物、β，γ−メチレン二リン酸グアニルである）。
図２Ａ−図２ＣはＺＣＬ２７８の活性特性を表示している。その中：図２Ａは、ＺＣＬ２７８がＣｄｃ４２によるマイクロスパイク形成を抑制することを示す。図２Ｂは、ＺＣＬ２７８が内生型Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２の活性化を抑制することを示す。図２Ｃは、ＺＣＬ２７８が刺激型Ｃｄｃ４２の活性化を抑制することを示す。
図３Ａ−図３Ｃは、活性化Ｃｄｃ４２／リン酸化ＲｈｏＡの免疫蛍光染色を示す。
図４は、ＺＣＬ２７８が、ＧＭ１３０タンパクが結合したゴルジ体を破壊することを示す。
図５Ａ−図５Ｃは、ＺＣＬ２７８が、細胞の生存に影響を与えることなく、細胞の運動を抑制することを示す。
図６Ａ−図６Ｃは、ＺＣＬ２７８がニューロンの枝分かれと成長円錐の運動を抑制することを示す。

実施例１：Ｃｄｃ４２抑制剤の仮想スクリーニング。

Ｃｄｃ４２−ＩＴＳＮ複合体の三次元構造を分析により、二つの分子の間の主要的な結合を明らかにした。ＩＴＳＮ分子中のＧｌｎ１３８０残基とＡｒｇ１３８４残基の間及びＣｄｃ４２上のＡｓｎ３９とＰｈｅ３７間の水素結合、ＩＴＳＮ分子の中のＬｅｕ１３７６、Ｍｅｔ１３７９残基とＴｈｒ１３８３残基の間及びＣｄｃ４２の上Ｐｈｅ５６、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７とＬｅｕ７０間の二つの疎水性クラスターが発見された。Ｃｄｃ４２抑制剤をスクリーニングするため、Ｃｄｃ４２の分子の上の結合ポケットが、ＩＴＳＮタンパク表面とＣｄｃ４２と結合する半径距離７Å内のアミノ酸残基形成構造を推定する。結合ポケットは、図１Ａ−図１Ｃに示すように、Ｃｄｃ４２タンパク分中のＴｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ａｓｎ３９、Ｐｈｅ５６とＡｓｐ５７等の１６個のアミノ酸残基を含む。

Ｇｌｉｄｅプロセスにより、ＳＰＥＣＳデータベースの中でＣｄｃ４２とＩＴＳＮの結合を破壊する小分子化合物を選別することができる。Ｃｄｃ４２−ＩＴＳＮ複合物の結晶構造はタンパク質データベースから求めた（ＩＤ番号：１ＫＩ１）。Ｃｄｃ４２との結合点を占有するＩＴＳＮアミノ酸残基はＬｅｕ３７６、Ｍｅｔ３７９、Ｇｌｎ１３８０、Ｔｈｒ１３８３、Ａｒｇ１３８４である。この五つのアミノ酸中心から７Å以内のＣｄｃ４２のアミノ酸残基にＣｄｃ４２の結合ポケットを形成する。タンパク準備モジュール（ＰｒｏｔｅｉｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＷｉｚａｒｄ）処理モデルにより初期構造を準備し、Ｇｌｉｄｅ／ＲｅｃｅｐｔｏｒＧｒｉｄＧｅｎｅｒａｔｉｏｎモジュールを使用して分子結合させた。リガンド準備モジュールＬｉｇｐｒｅｐでＳＰＥＣＳデータベース中の１９７０００個の化合物をＨＴＶＳ（ハイスループットスクリーニング）し、以下の基準でスクリーニングされたトップ１００個の化合物を選んだ：ＩＴＳＮ種類の結合、ＩＴＳＮの上のＬｅｕ１３７６、Ｇｌｎ１３８０、Ａｒｇ１３８４、Ｍｅｔ１３７９とＴｈｒ１３８３残基を占有する空間構造；すくなくとも三つの水素結合を形成し；Ｃｄｃ４２分子中の安定的なＡｓｎ３９またはＰｈｅ３７残基と水素結合を形成し；分子骨格の多様性。トップ５００００の分子は標準的な精度の計算をし、トップ１００の分子をはじき出し、最後に３０の化合物を選択し、それらのＣｄｃ４２の活性及び／または機能の影響をテストした。

Ｃｄｃ４２分子上に結合したＺＣＬ２７８のコンピュータシミュレーション：図１Ａに示すように、ＺＣＬ２７８はＣｄｃ４２のキメラタンパク質の中のＴｈｒ３５、Ｖａｌ３６、Ａｓｐ３８、Ａｓｎ３９、Ｐｈｅ５６、Ｔｙｒ６４、Ｌｅｕ６７とＬｅｕ７０残基配列の順に形成されるポケット構造に結合する。図１Ｂが示すように、二つの分子の間に良好な相互作用も発見される。Ｔｈｒ３５、Ａｓｎ３９及びＡｓｐ５７残基であるアミノ酸残基と五つの水素結合を形成し、同時にＶａｌ３６及びＰｈｅ５６残基と疎水性相互作用の構造を形成する。図１Ｃが示すように、分子中のブロモベンゼン環がＧＤＰ／ＧＴＰの結合ポケットの中に挿入される。コンピュータシミュレーションによると、ＺＣＬ２７８とＣｄｃ４２の結合はＣｄｃ４２−ＩＴＳＮのＧＤＰ／ＧＴＰ転換態結合を阻害できる。

実施例２：化合物ＺＣＬ２７８の合成

ＺＣＬ２７８は次の方法により合成できる。次の合成方法は例示であり、本発明はこの方法に限られない。当業者は、ＺＣＬ２７８のほかの合成方法を採用することができるが、それも本発明の保護範囲に属している。

試薬および条件：（ａ）Ｋ_２ＣＯ_３、ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）、７０℃；（ｂ）ＮａＯＨ、ｄｉｏｘａｎｅ（ジオキサン）／Ｈ_２Ｏ；（ｃ）ＳＯＣｌ_２（チオニル）、ＤＭＦ、ｒｅｆｌｕｘ（還流）；（ｄ）ＮａＳＣＮ（チオシアン酸ナトリウム）、ａｃｅｔｏｎｅ（アセトン）、０℃−ｒｔ；（ｅ）４−ａｍｉｎｏ−Ｎ−（４，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌ）ｂｅｎｚｅｎｅ−ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ（４−アミノ−Ｎ−（４，６−ジメチル−２−ピリミジニル）ベンゼンスルホンアミド）、０℃−ｒ．ｔ．
反応式は以下のとおりである。：

化合物１（４−ブロモ−２−クロロフェノール）とエチルブロモアセテートはＫ_２ＣＯ_３の存在下、求核置換反応し、化合物２（２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）酢酸エチル）が合成される。化合物２は、塩基性条件の下で加水分解し化合物３（２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）酢酸）となる。化合物３はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを触媒としてチオニルを還流させることで化合物４となる。化合物４（２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）アセチルクロリド）は、チオシアン酸ナトリウムと反応した後、対応するイソチオシアネート中間体を形成し、さらに、反応系内に４−アミノ−Ｎ−（４，６−ジメチル−２−ピリミジニル）ベンゼンスルホンアミドを加えることにより、化合物５（本発明のＺＣＬ２７８）が合成される。

装置と試薬：ＢｒｕｋｅｒＡｖａｎｃｅＩＩＩ４００ＭＨｚ核磁気共鳴装置；ＳＧＷＸ−４融点測定装置；Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高速液体クロマトグラフィー；ＺＯＲＢＡＸＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ−Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、５μＭ）；すべての試薬は、分析グレードであり化学的に純粋である。

ステップ１：２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）酢酸エチル（化合物２）の合成

反応フラスコに化合物１（４−ブロモ−２−クロロフェノール）（５．２ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍｌ、エチルブロモアセテート（４．３ｇ、２５．７ｍｍｏｌ）及びＫ_２ＣＯ_３（３．４５ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）を加える。７０℃で一晩撹拌した後、反応混合物を１５０ｍＬ水の中に入れ、酢酸エチルで抽出する（７０ｍＬ×４）。有機相を集めて、飽和食塩水（１００ｍＬ×３）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、減圧して溶媒を除去し、カラムクロマトグラフィーで精製して、油状物２（６．１８グラム）が得られた。収率８４．１％。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：７．５３（ｓ，１Ｈ），７．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），４．６８（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），１．２９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）。

ステップ２：２−（４−ブロモ−３−クロロフェノキシ）酢酸（化合物３）の合成

反応フラスコに化合物２（５．０ｇ、１７．０ｍｍｏｌ）、ジオキサン５０ｍＬと１ＭＮａＯＨ（５０ｍＬ）を加え、室温で一晩撹拌し、反応混合物を１ＭＨＣｌでｐＨ＝３に調整する。反応液を酢酸エチル（５０ｍＬ×４）で抽出し、有機相を集めて、飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。乾燥剤を濾過して除去した後、減圧し濃縮して白色固体３（４．６９グラム）が得られた。収率９４．３％。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：７．６６（ｓ，１Ｈ），７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），６．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），４．７２（ｓ，２Ｈ）。

ステップ３：４−（３−（２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）アセチル）チオウレイド）−Ｎ−（４，６−ジメチル−２−ピリミジニル）ベンゼンスルホンアミド（化合物５）の合成

反応フラスコの中に、順次に化合物３を添加し、チオニル２５ｍＬと、ＤＭＦを１滴加え、反応系を加熱還流する。３時間還流させた後、常圧蒸留でチオニルを除去し、残る液体を５分間、減圧乾燥した後、化合物４（２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）アセチルクロリド）が得られた。もう一つの反応フラスコの中に、チオシアン酸ナトリウム（３２６．８ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）をアセトン１０ｍＬに溶解し、氷浴で０℃に冷却した後、アセトン１０ｍＬで希釈した化合物４を滴下し、滴加終了後に氷浴を除去し、反応系を３０℃の油浴で加熱する。３０℃で２時間反応した後、反応液を０℃に冷却し、４−アミノ−Ｎ−（４，６−ジメチル−２−ピリミジニル）−ベンゼンスルホンアミド（５５６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加えた。室温で一晩攪拌した後、反応液を濾過し、水とアセトンで洗浄して、黄色粉末５（２７６ｍｇ）が得られた。収率２３．６％。^１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：１２．１９（ｓ，１Ｈ），１１．６８（ｓ，１Ｈ），１１．５２（ｂｒｓ，１Ｈ），７．９９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．８６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．４９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），７．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ_１＝８．８Ｈｚ，Ｊ_２＝１．６Ｈｚ），６．７５（ｓ，１Ｈ），５．０２（ｓ，２Ｈ），２．２５（ｓ，６Ｈ）．ＨＰＬＣ純度９５．９％（２５４ｎｍ）。

実施例３：ＺＣＬ２７８活性特性

１、ＺＣＬ２７８による、Ｃｄｃ４２が関連するマイクロスパイク形成の抑制。

無血清で培養されたマウス線維芽細胞Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３で３０種の化合物を候補としてＣｄｃ４２による細胞マイクロスパイク／糸状仮足の形成をテストした。線維芽細胞のアクチンから成るマイクロスパイク／糸状仮足の形成はＣｄｃ４２活性の特徴である。図２Ａが示すように、対照群の細胞セル端に少数のマイクロスパイク（矢印）と、ＲｈｏＡが関連して形成する特徴的なストレスファイバー（アスタリスク）が見られる。１単位／ｍｌのＣｄｃ４２アゴニスト（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）で短時間細胞を刺激した後、明らかなマイクロスパイク数量の増加とストレスファイバーの減少が見られた。アゴニストを加えて２分間作用させた後、５０μＭのＺＣＬ２７８で細胞を１時間処理すると、アゴニスト単独での作用と比べてＺＣＬ２７８が明らかにマイクロスパイクの形成を阻害した。この結果は、前記化合物がＣｄｃ４２抑制剤の候補として、更なる研究対象であることを示す。３０種の化合物の中で、ＺＣＬ２７８が最も強力な抑制作用を示した。

具体的には、図２Ａに示す。図２Ａは、ＺＣＬ２７８がＣｄｃ４２による細胞マイクロスパイク形成を抑制することを示す。コンピュータでスクリーニングした小分子体を、それぞれ無血清で培養したＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に作用させた。ＤＭＳＯを陰性対照とし、１単位／ｍＬのＣｄｃ４２アゴニスト（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）で短時間（１分）細胞を刺激した。アゴニストは１分間作用し、その後、５０μＭのＺＣＬ２７８で細胞を１時間処理した。同じ条件で１０μＭのＮＳＣ２３７６６を作用させた細胞を対照とする。細胞を固定した後、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎハイブリダイゼーション蛍光抗体でＦ−ａｃｔｉｎを標識した。細胞セルの端に極少量のマイクロスパイク（矢印）が見え、アスタリスクは正常のストレスファイバーを示す。Ｂａｒ：５μｍ。

２、ＺＣＬ２７８による、Ｃｄｃ４２活性化の阻害。

Ｃｄｃ４２の活性化と関係がある形状テストの中で、ＺＣＬ２７８が最高の効果を示し、次は生化学レベルでその活性をテストした。まず、Ｃｄｃ４２アゴニストとＺＣＬ２７８（５０μＭ）のそれぞれを、人転移性前立腺癌細胞ＰＣ３に５、１０、１５分間、作用させ、細胞溶解液からタンパクサンプルを抽出し、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔを行いその中のリン酸化Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２（上段）、ＷＡＳＰタンパクのリン酸化レベル（中段）を検出して、ＧＡＰＤＨタンパク（下段）を参照とした。７１位のセリン残基のリン酸化はＲＡＣ／Ｃｄｃ４２タンパク活性の負の調節システムであり、したがって、リン酸化Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２タンパクの発現の増加は活性化Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２（ＧＴＰ結合型）の減少を示す。図２Ｂに示すように、アゴニストの作用によりリン酸化Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２タンパクの発現が持続的に低下し、しかも５０μＭのＺＣＬ２７８は時間依存的に前記タンパクの発現レベルを強める。

ＷＡＳＰタンパクはＣｄｃ４２活性化の下流エフェクターであり、Ａｒｐ２／３複合物の作用により、アクチン細胞骨格の再編成とマイクロスパイク、糸状仮足の形成を引き起こし、そのチロシンリン酸化とＣｄｃ４２が活性化した後、すぐに分解することと関係がある。図２Ｂに示すように、アゴニストを作用させて１５分後、リン酸化ＷＡＳＰタンパクの発現レベルは減少し、しかも対応する時間内でＺＣＬ２７８は前記タンパクの発現を抑制しない。このデータは、ＺＣＬ２７８が、時間依存的に内因性のリン酸化Ｒａｃ／Ｃｄｃ４２タンパクのレベルを抑制でき、しかもチロシンリン酸化ＷＡＳＰタンパクのレベルを維持することができることを示している。

ＲａｃとＣｄｃ４２タンパクは７１位のセリン残基のリン酸化を発生させることができる。直接にＣｄｃ４２の活性化と不活化を検出し、次にＧ−ＬＩＳＡキットでＧＴＰ結合型Ｃｄｃ４２の水準を定量検出する。１単位／ｍＬのＣｄｃ４２アゴニストで細胞を１分間刺激し、その後５０μＭのＺＣＬ２７８あるいは１０μＭのＲａｃアゴニストであるＮＳＣ２３７６６で、それぞれｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に１時間処理し、細胞タンパクサンプルを抽出し、Ｇ−ＬＩＳＡキットで定量にＧＴＰ結合型Ｃｄｃ４２の水準を検出する。いかなる処理も加えていない細胞を陰性対照とし、アゴニストだけで処理した細胞を陽性対照とし、バッファーと活性化Ｃｄｃ４２タンパクはそれぞれ陰性対照と陽性対照とした。図２Ｃに示すように（図の中のデータベースは三回独立実験の平均結果であり、±マークされた平均差、＊＊：ｐ＜０．０１，＊：ｐ＜０．０５）、陰性対照と比較し、アゴニストが作用して、活性化Ｃｄｃ４２タンパク水準が明らかに増加し（７０％）、陽性対照と比べ、ＺＣＬ２７８により活性化Ｃｄｃ４２タンパク水準が明らかに低下する（８０％）。ＮＳＣ２３７６６は予想通り、Ｃｄｃ４２に影響がない。これらのデータは、二つタイプの細胞上で、ＺＣＬ２７８が刺激型を抑制するだけではなく、内生型のＣｄｃ４２活性も抑制することもできる。

実施例４：活性化Ｃｄｃ４２／リン酸化ＲｈｏＡの免疫蛍光染色。

１．ＺＣＬ２７８、ＮＳＣ２３７６６ではなく、活性化Ｃｄｃ４２が細胞核外周の分布を破壊する。

免疫蛍光染色：Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞はカバーグラス上での成長密度が約３０％であり、薬を加え、無血清培養で、１単位／ｍＬのＣｄｃ４２アゴニスト（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）を加えて１分間作用させ、その後５０μＭのＺＣＬ２７８あるいは１０μＭのＮＳＣ２３７６６で細胞をそれぞれ１時間処理した。アゴニスト単独を加えて陽性対照とし、ＤＭＳＯを陰性対照とする。４％のパラホルムアルデヒドでカバーグラス上の細胞を１５分間固定し、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１５分間透化し、１０％ＢＳＡで３７度、３０分間密閉した。

抗体インキュベーション：一抗：活性化Ｃｄｃ４２（マウス抵抗、ＮｅｗｅａｓｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）；リン酸化ＲｈｏＡ抗体（ウサギ抵抗、ＳａｎｔａＣｒｕｚｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）；ＧＭ１３０抗体（マウス抵抗、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を、１：１００の希釈で使用する。相応二次抗体がハイブリッドした後、ｒｈｏｄａｍｉｎｅＰｈａｌｌｏｉｄｉｎを室温で１時間培養し、アクチンを観察した。ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｖｅｒｔ電子顕微鏡で細胞染色を観察する。画像処理ソフトＭｅｔａＭｏｒｐｈでランダムに５つの細胞を選択し、五つの点の画素を選択し、平均数計算をし、各組の平均像素強度値を得る。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ：ＰＣ３細胞を約７０％の密度に育て、血清を除去し、続いて１６時間培養し、それぞれに薬物を加え：１単位／ｍＬのＣｄｃ４２アゴニスト（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ社製）、５μＭ、５０μＭのＺＣＬ２７８で細胞を５、１０、１５分間処置した。細胞溶解バッファー（処方：５０ｍＭＴｒｉｓ溶解バッファーＰＨ７．５、１０ｍＭ塩化マグネシウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、プロテアーゼ抑制剤）で細胞を溶解し、毎分１４０００回転のスピードで、４度の傾斜で、遠心分離機により細胞タンパクサンプルを抽出した。等濃度のタンパクサンプルをＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析し、抗体：リン酸化Ｒａｃ１／Ｃｄｃ４２（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ会社）、リン酸化ＷＡＳＰ（ＡｓｓａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）を、すべて１：１０００の比率で希釈しハイブリダイゼーションをし、ＧＡＰＤＨ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を１：２０００希釈しハイブリダイゼーションをする。ＰＶＤＦメンブレンの化学発光方法現像。

Ｇ−ＬＩＳＡキット分析：Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を４０％の成長密度まで育て、血清を除去し４８時間培養し、Ｃｄｃ４２アゴニストを加え１分間作用させ、またそれぞれに５０μＭのＺＣＬ２７８と１０μＭのＮＳＣ２３７６６で処理した。キット説明書に従って溶解細胞よりタンパク質を抽出し、定量総タンパクの濃度０．１５ｍｇ／ｍｌで分析する。いかなる処理も加えていない細胞と溶解バッファーを陰性対照とし、アゴニスト処理だけ施した細胞と活性化したＣｄｃ４２タンパクを陽性対照とする。ＥＬＩＳＡ法は、各サンプルの光波４９０ｎｍの時の吸光度値を測定する。

細胞レベルでＺＣＬ２７８が活性化したＣｄｃ４２を選択的に抑制することを検出：無血清のＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に１単位／ｍｌのＣｄｃ４２アゴニストを加え２分間作用させ、５０μＭのＺＣＬ２７８または１０μＭのＮＳＣ２３７６６で処理し、ＤＭＳＯを陰性対照とする。ＺＣＬ２７８の作用が選択的な活性化Ｃｄｃ４２の抑制であり、ＲｈｏＡに対する作用ではないことを検出するために、細胞を活性化Ｃｄｃ４２（図３Ａ、図３Ｂ）とリン酸化ＲｈｏＡ（図３Ｃ）でハイブリッド抗体する。矢印：細胞核外縁ゴルジ体−小胞体ネットワーク；Ｈｏｅｃｈｅｓｔ染色剤ロゴ細胞核。Ｂａｒ：１５μｍ。図３Ａに、細胞化学免疫蛍光染色を示す：マウスモノクローナル抗体ＧＴＰ結合型Ｃｄｃ４２抗体とＨｏｅｃｈｅｓｔ（ハースト）染色剤（ロゴ細胞核）。対照群の細胞は活性化したＣｄｃ４２が、細胞核外周で組織の分布があり；アゴニストはその分布を明らかに増加させ、しかも核内にも分布させており、Ｃｄｃ４２が関連するゴルジ体タンパク輸送作用と一致し；ＺＣＬ２７８が明らかにこの組織の分布を破壊し、しかも抗活化Ｃｄｃ４２抗体との免疫反応性を低下させ；ＮＳＣ２３７６６はそれに対し影響がない。図３Ｂは、各組のゴルジ体が分布する細胞数を示し：活性化Ｃｄｃ４２抗体が識別する細胞核外周ゴルジ体−小胞体ネットワークには組織分布の量化があり：細胞の六つの各自独立する区間係数ゴルジ体−小胞体ネットワーク（＊：ｐ＜０．０５）をランダムに選択する。図３Ｃ：リン酸化ＲｈｏＡ信号の平均画素強度値の定量であり、データは五つの独立した細胞のランダムな五つの信号の画素強度値の平均値から算出される。±マークされた平均差、＊：ｐ＜０．０３：アゴニスト、ＺＣＬ２７８、ＮＳＣ２３７６６は全部リン酸化ＲｈｏＡに対する影響を示さない。この結果は、ＺＣＬ２７８により選択的にＣｄｃ４２の活性を抑制されていることを明らかに示す。

２．ＮＳＣ２３７６６ではなく、ＺＣＬ２７８が、細胞内のＧＭ１３０タンパクとゴルジ体とが結合した組織を破壊する。

ＺＣＬ２７８破壊細胞核外周の活性化Ｃｄｃ４２の分布がゴルジ体の組織に作用もあることを反映するかどうか理解するため実験をデザインし、ＧＭ１３０タンパク−細胞質外縁のタンパク質を検出し、ゴルジ体膜をクローディンして、ゴルジ体のシス型構造を維持する。

Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を無血清で培養し、それぞれにＣｄｃ４２アゴニスト、ＺＣＬ２７８、ＮＳＣ２３７６６、を加え、ＤＭＳＯを加えたものを陰性対照とする。細胞用Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（赤色）、抗ＧＭ１３０抗体（緑色）、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（青色）免疫蛍光染色。図４で、矢印が細胞マイクロスパイク（実際の試験で赤色蛍光である）を示し、アスタリスクはＧＭ１３０抗体がマークしたゴルジ体構造を示す（実際の試験で緑色蛍光である）。無血清のＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞対照群が特徴的なストレスファイバーを示し（図中の矢印で示し、実際の試験で赤色蛍光である）、細胞核片側のＧＭ１３０抗体分布と対応する（図中のアスタリスクで示し、実際の試験で緑色蛍光である）。Ｃｄｃ４２アゴニストで処理した細胞にマイクロスパイクの増加が見られ、ＧＭ１３０の細胞核外周の分布は増加している。ＺＣＬ２７８で処理した細胞は明らかなマイクロスパイク減少とＧＭ１３０の減少を示し、（ＺＣＬ２７８：実際の試験で赤色蛍光である）しかも、そして細胞核の両側に分散している（図中のアスタリスクで示し、実際の試験で緑色蛍光である）。ＮＳＣ２３７６６はＧＭ１３０の発現と分布に明らかに影響していない。Ｂａｒ：１０μｍ。この結果は、ＺＣＬ２７８がＣｄｃ４２に対する選択的な抑制作用を説明するだけでなく、Ｃｄｃ４２がゴルジ体の組織と材料輸送の中で重要な役割を果たしていることを証明する。

実施例５：細胞創傷治癒実験：ＺＣＬ２７８が細胞創傷治癒を阻害し、細胞の生存率に影響しない。

糸状仮足は細胞の運動構造であり、細胞の移動方向と成長経路の誘導をし、おもに、Ｃｄｃ４２により活性化される。ＰＣ３細胞を単層で６穴プレートに満たし、無血清で培養し、１ｍｌピペットチップで穴毎にそれぞれに三つの創傷をし、無血清培地で剥落した細胞を洗う。それぞれに１単位／ｍｌのＣｄｃ４２アゴニスト、５０μＭ、５μＭのＺＣＬ２７８と１０μＭのＮＳＣ２３７６６で細胞を２４時間に処置する。Ｃｄｃ４２アゴニストを陽性対照とし、いかなる処置も加えていないものを陰性対照とする。薬物作用させて０時間と２４時間でそれぞれに細胞の画像を撮影し、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ図形ソフトで細胞移動の距離を測定した。黒色ラインは創傷区域の境界を示す。実験結果はすべて仮説検定ｐ値分析をした（ｐ＞０．０５）。

細胞生存率検出：７５０００／ｍｌの細胞密度で４８時間ＰＣ３細胞を培養し、血清と５０μＭのＺＣＬ２７８あるいは１０μＭのＮＳＣ２３７６６を取り除いて２４時間継続して培養し、胎盤ブルー染色により細胞の生存率を検出した。

図５Ａと図５Ｂ（創傷区域限界の最短の距離を取り、区域バンドを定量する。柱状図は、初期創傷区域の百分比、三回独立実験で平均値を取り、±マークされた平均差を示す、＊＊：ｐ＜０．０１、＊：ｐ＜０．０５）に示すように、陰性対照組（４１％治癒率）と対比して、アゴニストが明らかに細胞傷の治癒能力（５９％）を高め、；ＺＣＬ２７８の二つの濃度条件下で細胞移動を全て阻害し、高濃度で阻害能がさらに強く（５０μＭ−８％；５μＭ−３０％）；ＮＳＣ２３７６６も明らかな細胞移動阻害を示した（Ｒａｃタンパクが細胞の葉状仮足、同様に細胞運動構造の形成を調節するためである）。この結果は生化検出データの結果と同じであり、ＺＣＬ２７８はＣｄｃ４２の阻害剤であるだけではなく、効果的にＣｄｃ４２に依存する細胞運動を阻害する。

ＺＣＬ２７８による細胞移動阻害は、Ｃｄｃ４２の活性化阻害が作用の元であり（ＮＳＣ２３７６６がＲａｃ活性作用を阻害し）、胎盤ブルー染色法による細胞生存率測定の結果から細胞死亡を導かない。ＰＣ３細胞をＧ０期に留まらせ、それぞれに５０μＭのＺＣＬ２７８と１０μＭのＮＳＣ２３７６６で細胞を２４時間処置し、図５Ｃに示すように（ＰＣ３細胞を７５０００／ｍｌの細胞密度で４８時間培養し、続いて血清と５０μＭのＺＣＬ２７８あるいは１０μＭのＮＳＣ２３７６６を取り除いて２４時間継続して培養した後、胎盤ブルー染色により細胞活率を計算する）、陰性対照群と対比し、薬物処理による細胞生存率に差異はない。したがって、薬物が細胞成長に影響を与えることなく、Ｃｄｃ４２又はＲａｃタンパク質活性による細胞移動作用を阻害すると見なされている。

実施例６：ＺＣＬ２７８はニューロン枝分かれと成長円錐のダイナミクスを阻害する。

Ｃｄｃ４２は神経突起の枝分かれと成長を調節する。Ｇａｒｖａｌｏｒ等は、Ｃｄｃ４２遺伝子ノックアウト技術により、Ｃｄｃ４２がニューロン形態の形成に対して重要な役割を果たすことを明らかにした。神経細胞の自死を決定し、採集した神経細胞（ニューロン）中のＣｄｃ４２の不足が明らかな神経突起数量の減少をもたらし、糸状仮足の機能が深刻な損傷を受けた。よって、ＺＣＬ２７８がニューロンの枝分かれを阻害する作用が確かめられた。

初代培養で１日齢マウスの大脳組織を取り、０．２５％のトリプシンを含むＨＢＳＳ溶解バッファーの中に３７度、１５分静置し、ニューロンを分離した細胞をＰｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ包被の細胞カバー上で慎重に吹き付け、ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地で１６時間培養し、そのあと、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に変更して引き続き培養した。５日間培養し、ＤＭＳＯまたは５０μＭのＺＣＬ２７８で５、１０分間、細胞を処理し、そのあと、４％のパラホルムアルデヒドで１５分間細胞を固定し、蛍光抗体Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ条件下で、ハイブリッドＦ−ａｃｔｉｎ構造を、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡で、ニューロン形態を観察した。

ＺＣＬ２７８はニューロン成長円錐のダイナミクスの作用を観察するために、顕微鏡下の微速撮影技術を採用し、ＨａｍａｍａｔｓｕＯｒｃａデジタルカメラを用いて十分間以内で６３倍に拡大する細胞映像を記録し、３００ミリ秒の露光撮影により、細胞に対する光毒性を最大限に減らし、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ図形ソフトで影像を分析し且つ統計分析をする。

新生中枢ニューロンを初代培養し、図６Ａに示すように、培養五日目に、ニューロンに一定の分枝が見られ、５０μＭのＺＣＬ２７８でニューロンを５、１０分処理し、ＤＭＳＯを陰性対照とした。時間の経過とともに、ＺＣＬ２７８はニューロンの枝分かれを抑制し、定量分析によると、薬物処置した後、ニューロンの枝分かれ数量が明らかに減少することを示す。（図６Ｂ：定量のＺＣＬ２７８で処置した後のニューロンの枝分かれ数量：３回の独立実験で平均数を取る。）±マークされた平均差、＊：ｐ＜０．０１）。

Ｃｄｃ４２は、成長円錐端のマイクロスパイクと糸状仮足の形成を調整していることが知られている。微速撮影画像（図６Ｃ）は、対照群のニューロン細胞が成長円錐のところからマイクロスパイク突起または糸状仮足が生まれ、しかし、ＺＣＬ２７８が４分間以内に糸状仮足が早く収縮することを示す。Ｂａｒ：１μｍ。したがって、ＺＣＬ２７８は、Ｃｄｃ４２が関連するニューロンの枝分かれと成長円錐の運動ｗｐ効果的に調節する小分子抑制剤であるとさらに説明される。

本発明は、ハイスループット計算シミュレーション方法を応用し、スクリーニングＣｄｃ４２キメラ分子とＧＥＦｓ結合する重要な構造を有する化合物をスクリーニングする。Ｃｄｃ４２がその特異性ＧＥＦ分子ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ（ＩＴＳＮ）を結合する構造特徴に基づきｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｎ分子のポケットを埋める化合物の三次元構造が引き続き研究された。こうして、化合物ＺＣＬ２７８は、Ｃｄｃ４２に対する細胞透過性を持つ特異的な阻害剤としてスクリーニングされた。

本発明は、ＺＣＬ２７８の活性特性を実証した、最初の小分子Ｃｄｃ４２抑制剤であり、選択的に直接にＣｄｃ４２とＧＥＦの結合をターゲットとする。細胞創傷治癒実験により、Ｃｄｃ４２が活性化した後、創傷区域の縮小を促進し、Ｃｄｃ４２が活性化した後、腫瘍細胞の運動を促進することを説明する。ＺＣＬ２７８は明らかにＰＣ３細胞の運動を抑制し、濃度依存性がある。しかも、ＺＣＬ２７８は細胞毒性物質ではなく、腫瘍の細胞死による細胞運動阻害効果が起きない。

本発明中の応用新生中枢ニューロン実験も、Ｃｄｃ４２がニューロン発達に重要な役割を果たすことを証明した。Ｇａｒａｌｏｖ等の実験は、Ｃｄｃ４２欠損型マウスの大脳とニューロンが大きく破壊され、これらのマウスが一連の脳の奇形を示し、軸索の束の減少などを含み、ニューロン糸状仮足の運動が減少し、成長円錐が大きくなり、軸索形成が抑制されることを明らかにした。実際には、軸索と樹状突起の動きは主にアクチンに基づき、このプロセスは、Ｃｄｃ４２により調節される。ＺＣＬ２７８は、新生中枢ニューロンの枝分かれ数を減らすことができ、且つ成長円錐の運動を抑制する。要約すると、ＺＣＬ２７８はＣｄｃ４２−ＩＴＳＮ結合のＣｄｃ４２を対象とした最初の小分子阻害剤であり、腫瘍および神経疾患におけるＣｄｃ４２分子の機能研究に効果的に使用することができる。

本発明は、好ましい実施形態を上記に開示し、それは、本発明を限定するものではなく、当該技術分野における当業者が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、その変更や改善することができ、本発明の保護範囲は、請求項で特定した通りである。

Claims

次の式Ιの構造を持つ化合物を含むことを特徴とする悪性腫瘍治療用薬物。
悪性腫瘍細胞の増殖と浸潤の予防治療に用いられることを特徴とする請求項１に記載の悪性腫瘍治療用薬物。
次の式Ιの構造を持つ化合物を含むことを特徴とする心臓血管疾患治療用薬物。
次の式Ιの構造を持つ化合物を含むことを特徴とする呼吸器疾患治療用薬物。
次の式Ιの構造を持つ化合物を含むことを特徴とする神経系疾患治療用薬物。
次の式Ιの構造を持つ化合物を含むことを特徴とするＣｄｃ４２阻害剤。
４−ブロモ−２−クロロフェノールとエチルブロモアセテートとを、Ｋ _２ＣＯ _３の存在
下で反応させ、２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）酢酸とするステップ１、
ステップ１で得られた２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）酢酸エチルをアルカ
リ性条件下で加水分解し、２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）酢酸とするステッ
プ２、
ステップ２で得られた２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）酢酸を、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミドの触媒作用によって、塩化チオニルの中で還流反応を行い、２−（４
−ブロモ−２−クロロフェノキシ）アセチルクロリドとするステップ３、
ステップ３で得られた２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）アセチルクロリドと
チオシアン酸ナトリウムが、対応するイソチオシアネート中間体を形成した後、反応系に
４−アミノ−Ｎ−（４，６−ジメチル−２−ピリミジニル）ベンゼンスルホンアミドを投
入し、４−（３−（２−（４−ブロモ−２−クロロフェノキシ）アセチル）チオウレイド）−Ｎ−（４，６−ジメチルピリミジン−２−イル）ベンゼンスルホンアミドを作製するステップ４、
を含むことを特徴とする次の式Ｉの構造を持つ化合物の調製方法。