KR100792587B1 - 유레아 화합물을 유효성분으로 함유하는 포유동물세포의노화방지제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 화학식 1로 표시되는 유레아 화합물을 유효성분으로 함유하는 포유동물세포의 노화방지제에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 선별된 화학식 1로 표시되는 유레아 화합물은 포유동물세포의 수명을 연장시킬 뿐 아니다, 복제노화(replicative senescence) 및 미성숙노화(premature senescence)를 억제시켜 노화를 방지하고 상기 포유동물세포의 노화에 따른 다양한 질환의 치료제 또는 예방제로 유용하게 사용될 수 있다.

유레아 화합물, 포유동물세포, 노화방지

Description

유레아 화합물을 유효성분으로 함유하는 포유동물세포의 노화방지제 {Anti-senescence agent containing urea compounds}

도 1은 유레아 화합물에 의해, ATR 단백질에 의한 p53 단백질의 인산화가 저해됨을 보여주는 웨스턴 블랏 사진이다.

도 2는 유레아 화합물에 의해, ATM 단백질에 의한 p53 단백질의 인산화가 저해됨을 보여주는 웨스턴 블랏 사진이다.

도 3은 RKO 세포와 GM847 세포에서 유레아 화합물에 의해, ATM 단백질에 의한 p53 단백질의 Ser15 인산화가 저해됨을 보여주는 웨스턴 블랏 사진이다.

도 4는 시험관내에서 유레아 화합물에 의해, ATM 및 ATR 단백질에 의한 p53 단백질의 인산화가 저해됨을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 5는 시험관내에서 유레아 화합물이 농도 의존적으로 ATM 및 ATR의 활성은 저해하지만, DNA-PK 혹은 PI3K의 활성은 저해하지 못함을 보여주는 그래프이다.

도 6는 시험관내에서 유레아 화합물에 의해, 다양한 다른 단백질 인산화 효소에 의한 p53 단백질의 인산화가 저해되지 않음을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 7은 인위적으로 유도된 노화 세포에 대해 유레아 화합물이 노화를 억제하여 세포의 수를 증가시키고, 크기를 감소시키는 것을 보여주는 세포 형광 사진이다.

도 8은 유레아 화합물에 의하여 인위적으로 유도된 노화 세포의 수적 변화와 크기 변화를 보여주는 확대된 세포 형광 사진이다. 붉은 삼각형은 노화가 억제된 세포를 나타내고, 흰색 삼각형은 노화 상태에 있는 세포를 가리킨다.

도 9는 유레아 화합물에 의한 노화 세포의 수적 변화와 크기 변화를 정량적으로 나타낸 그래프이다.

도 10은 유레아 화합물에 의해 복제노화에 의한 SA-β-gal 염색이 저해되는 것을 보여주는 세포 사진이다.

도 11은 유레아 화합물의 농도에 따른 노화 세포의 수적 변화를 보여주는 그래프이다.

도 12는 복제노화가 일어난 BJ 세포에 유레아 화합물을 처리하여 복제노화가 억제되고 그 결과, 세포의 수가 증가하는 것을 보여주는 그래프이다.

도 13은 복제노화가 일어난 BJ 세포에 유레아 화합물을 처리한 후, 시간이 경과됨에 따라 동일 세포를 추적하여 그 변화를 관찰한 세포 위상차 현미경 사진이다. 붉은 삼각형은 유레아 화합물을 처리한 시점을 나타내며, d는 관찰을 시작한 이후의 일자를 나타낸다.

도 14는 세포의 핵형 분석 결과는 보여주는 도표이다.

도 15는 복제노화가 일어난 인간의 유방상피세포에 유레아 화합물을 처리한 후 세포의 수가 증가하고, SA-β-gal 염색이 억제되는 것을 보여주는 그래프와 세포 사진이다.

도 16은 미성숙 노화의 결과 나타난 SA-β-gal 염색이 유레아 화합물의 처리 에 의해 저해되는 것을 보여주는 세포 사진이다.

기술분야

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 유레아 화합물을 유효성분으로 함유하는 포유동물세포의 노화방지제에 관한 것이다.

종래기술

진핵 생물의 유전체는 끊임 없이 부정확하게 복제된 DNA나 활성 산소 중간체(reactive oxygen intermediates) 등과 같은 대사 부산물은 물론이고 자외선이나, 활성 화합물, 이온화 방사선 등과 같은 외부 인자에 의한 손상에 노출되어 있다. 유전체 내의 DNA가 이 같은 요인들에 의해 손상 받게 되면, 세포의 생존을 위협하게 되고, 더 나아가 조직의 손상, 면역 결핍, 세포의 노화, 암의 발생 등과 같은 병리 현상을 초래하게 된다 [참고문헌: Abraham, R. T. (2001) Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes & Dev. 15, 2177-2196]. 정상 세포에서는 세포 주기 동안, DNA 손상을 감시하고 이를 수정하여 정상적인 DNA를 유지할 수 있는 "세포 주기 체크포인트(cell-cycle checkpoint)" 라고 하는 작용기작이 있어, 세포 주기가 반복되더라고 정상적인 유전체가 유지되도록 한다.

세포 주기 체크포인트에 관여하는 주요 효소들 중 PIKKs(phosphoinositide 3-kinase related kinases)라고 불리는 일련의 단백질 계열(protein family)이 알려져 있으며, 특히 PIKK 단백질 계열 중 ATM(ataxia-telangiectasia mutated) 단백질과 ATR(ATM and Rad 3-related) 단백질이 세포 주기 체크포인트의 전과정에서 초기 신호 전달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

ATM은 모세혈관 확장성 운동실조증(AT)과 관련하여 돌연변이된 유전자 산물로서 약 350 kDa의 폴리펩타이드이고[참고문헌: Savitsky, K. et al. (1995) A single ataxia telangiectasiz gene with a product similar to PI-3kinase. Science 268, 1749-1753], 세린/쓰레오닌 단백질 인산화 효소로서 p53, NFKBIA, BRCA1, CTIP, NIBRIN(NBS1), TERF1, RAD9 등의 단백질을 인산화시킨다[참고문헌: Jung, M. et al. (1997) ATM gene product phosphorylates I kappa B-alpha. Cancer Res. 57, 24-27].

PIKK 단백질 계열과 유사성을 갖는 것으로 클로닝된 ATR 단백질은 약 300 kDa의 세린/쓰레오닌 단백질 인산화 효소로서, BRCA1, CHEK1, H2AFX, MCM2, RAD17, RPA2, SMC1, p53 등의 단백질을 인산화시킴으로써 DNA 복제(replication)와 유사분열(mitosis)을 억제하고 DNA 수복(repair)과 재조합(recombination) 및 세포자살(apoptosis)을 촉진한다[참고문헌: Cimprich, K. A. et al. (1996) cDNA cloning and gene mapping of a candidate human cell cycle checkpoint protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 2850-2855].

정상적인 인간의 체세포는 대부분 제한된 수명을 갖는다 [참고문헌: Hayflick, L. and Moorhead, P. S. (1961) The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 25, 585-621]. 시간이 지남에 따라 세포의 증식능력이 떨어지는 현상을 세포 노화 (senescence)라고 하며, 텔로미어 길이의 감소에 의한 복제 노화 (replicative senescence)와 다양한 스트레스 또는 신호체계의 불균형에 의한 미성숙 노화 (premature senescence)가 알려져 있다. 복제노화 현상은 노화의 근본원인으로 추정되고 있으며[참고문헌: Watanabe, Y. et al. (1997) Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor (VPF/VEGF) delays and induces escape from senescence in human normal microvascular endothelial cells. Oncogene, 14, 2025-2032], 노화된 세포들이 체내에 축적되어 여러 가지 노화와 관련된 병리현상이 나타나는 것으로 추정되고 있다[참고문헌: Dimri G. D. et al. (1995) A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9363-9367]. 복제노화는 세포분열(cell division)이 누적되어 일어나는 것으로, 최근 텔로미어 길이의 감소가 ATM에 의한 세포 노화를 일으키고, ATM 단백질을 저해할 경우 세포 주기가 재개되는 것이 보고되었다 [참고문헌: Herbig, U. et al. (2004) Telomere shortening triggers senescence of human cells through a pathway involving ATM, p53, p21CIP1, but not p16INK4a. Mol. Cell 14, 501-513). 방사선 조사나 산화성 스트레스 등과 같이 DNA 손상을 유발하는 다양한 스트레스는 복제 노화와 유사한 미성숙 노화를 일으킨다 [참고문헌: Ben-Porath, I. and Weinberg, R. A. (2004) When cells get stressed: an integrative view of cellular senescence. J. Clin. Invest. 113, 8-13]. 비록, 이 같은 세포 내외의 스트레스가 모두 ATM/ATR 의존적인 세포 노화를 야기하는 것은 아니지만, ATM/ATR이 세포 노화 과정에서 매우 중요한 역할을 하고 있으며, ATM/ATR의 기능을 방해하면 세포 주기가 재개되는 것으로 보고된 바 있다 [참고문헌: d' Adda di Fagagna, F. et al. (2003) A DNA damage checkpoint response in telomere-initiated senescence. Nature 426, 194-198]. 따라서, ATM/ATR 저해제는 세포 노화에 의한 이상 증상의 조절에 사용될 수 있다.

이에 본 발명자들은 유레아 구조를 모핵으로 하여 다양한 치환체를 도입하였고 이들의 유의성 있는 ATM/ATR 활성 저해 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 ATM 및 ATR의 단백질 인산화 효소 기능을 특이적으로 저해하는 화학식 1의 유레아 화합물을 유효성분으로 함유하는 포유동물세포의 노화방지제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 ATM 및 ATR의 단백질 인산화 효소 기능을 특이적으로 저해하는 화학식 1의 유레아 화합물을 유효성분으로 함유하는 인간세포의 노화방지제를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 화학식 1의 유레아 화합물을 유효성분으로 하는 인간 섬유모세포(fibroblasts) 및 인간 상피세포(epithelial cells)의 노화방지제를 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 화학식 1의 유레아 화합물을 유효성분으로 하는 인간 음경포피 섬유모세포(foreskin fibroblasts) 및 인간 유방상피세포(mammary epithelial cells)의 노화방지제를 제공하는 데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 화학식 1의 유레아 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

또한 본 발명은 화학식 1의 유레아 화합물 및 이를 유효성분으로 하는 약학 조성물을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 하기 화학식 1의 유레아 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

화학식 1

상기 식에서,

R₁은 하기 구조들 중 어느 하나이고,

;

R₂는 하기 구조들 중 어느 하나이며,

;

X는 H, CH₃, CF₃, 또는 CCl₃ 이고,

Y는 O 또는 S이다.

이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상기 화학식 1의 유레아 화합물은 광학 이성질체를 포함하며 유리 형태 또는 산 또는 염기의 부가염 형태로 존재할 수 있다. 바람직한 산부가염에는 염산염, 황산염, 아세트산염, 트리플루오르아세트산염, 인산염, 푸마르산염, 말레산염, 시트르산염 또는 락트산염이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 화학식 1의 화합물에 있어서, 바람직하게는,

R₂는 하기 구조들 중의 어느 하나이고

X는 CF₃, 또는 CCl₃ 이며;

Y는 O 또는 S이다.

상기 화학식 1의 화합물에 있어서, 더욱 바람직하게는,

R₁은 하기 구조들 중 어느 하나이고

;

R₂는 하기 구조들 중 어느 하나이며;

X는 CCl₃ 이고;

Y는 S이다.

본 발명의 포유동물세포는 인간 섬유모세포(fibroblasts) 및 상피세포(epithelial cells)를 포함하고, 구체적으로 상기 인간 섬유모세포는 인간의 음경포피세포(human foreskin fibroblast)인 BJ 세포(이하 'BJ'라 함)임을 특징으로 하며, 상기 인간 상피세포는 인간의 유방 상피세포(human mammary epithelial cells, 이하 'HMEC'라 함)임을 특징으로 한다. 본 발명의 유레아 화합물은 상기 포유동물세포의 복제노화(replicative senescence) 및 미성숙노화(premature senescence)를 억제하며 세포의 수명을 연장시키는 활성을 갖는다.

본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "유레아 화합물"은 ATM 또는 ATR 단백질의 활성을 저해할 수 있고, 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화를 억제하여 세 포의 수명을 연장시키는 활성을 갖는 화합물을 나타내며, 상세하게는 이러한 화합물의 프로드러그(prodrug) 화합물은 물론이고, 고유 활성을 갖는 화합물 모두를 포함하고, 이때 프로드러그 자체는 활성이 적거나 고유 활성을 갖지 않는다.

특정 화합물에 의해 제공되는 ATM 또는 ATR 단백질의 활성 저하 평가와 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화 억제를 평가하기 위해 사용될 수 있는 일부 분석법은 이하 실시예에서 기술한다.

본 발명은 유효한 양의 유레아 화합물을, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 조성물의 형태로 세포와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포내 ATM 또는 ATR 단백질을 저해하는 방법 및 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화를 억제하는 방법을 추가로 제공한다. 일례로 세포 시료(예를 들어, 정상 인간세포)는 시험관내에서 배양할 수 있으며, 유레아 화합물을 포유동물세포에 접촉시켜, 해당 세포들에 대한 화합물의 노화방지 효과의 증진을 관찰하였다.

본 발명은 또한 세포에 유효량의 화합물을 접촉시키는 것을 포함하는, 시험관내 또는 생체내에서, 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화를 억제하는 방법은 물론, 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화를 억제하는 유레아 화합물을 추가로 제공한다.

본 발명은 또한 화학식 1로 표시되는 유레아 화합물의 제조 방법을 제공한다.

상기 화학식 1로 표시되는 유레아 화합물은 하기 반응식 1에 의해 합성할 수 있다. 본 발명의 화합물은 광학 활성 이성질체 또는 부분입체 이성질체 형태일 수 있고 통상적인 기술로 분리 및 회수 될 수 있다.

A) 화학적 실시예

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 하기 반응식 1로 표시되는 합성경로에 따라 제조된다.

반응식 1

상기 식에서, R₁, R₂, X 와 Y는 상기 정의한 바와 같다. 상기 반응식 1에서, 화학식 2의 산화합물을 Boc₂O, 에틸 클로로포르메이트 (ethyl chloroformate), 이소부틸 클로로포르메이트 (isobutyl chloroformate) 등과 트리에틸아민 (triethylamine), 피리딘 (pyridine)과 같은 적당한 염기 존재 하에 질소 하에서 교반시킨 후 NH₃, NH₄HCO₃를 가하면 화학식 3의 화합물을 합성할 수 있다. 반응이 종료되는 시점은 상기 화학식 2의 화합물이 전부 소비되는 때이며, 이는 박층 크로 마토그라피에 의해 쉽게 확인할 수 있다. 반응 용매는 디클로로메탄, 다이옥산 등의 용매가 바람직하며 반응 온도는 0 ℃ 에서 실온이고 반응시간은 12 내지 36 시간이 바람직하다.

화학식 3의 아미드 화합물을 클로랄 하이드레이트 (chloral hydrate), 트리플루오로아세트알데하드 헤미아세탈 (trifluoroacetaldehyde hemiacetal) 또는 아세트알데히드 (acetadehyde) 등과 벤젠 (benzene) 또는 톨루엔 (toluene) 등과 반응을 시켜 화학식 4의 화합물을 합성할 수 있다. 이때 필요에 따라서 벤조트리아졸 (benzotriazole)을 가하는 경우 반응을 촉진 시킬 수 있다. 반응 온도는 실온에서 환류조건이며 반응시간은 12 내지36 시간이 적당하다.

화학식 4의 화합물을 SOCl₂, PCl₅ 또는 옥살릴클로라이드 (oxalylchloride) 등과 벤젠 또는 톨루엔 등과 반응을 시켜 화학식 5의 화합물을 합성할 수 있다. 이때 반응 온도는 실온에서 환류조건이며 반응시간은 1 내지 24 시간이 적당하다.

화학식 5의 화합물에 KSCN 또는 KOCN을 가하고, 디클로로메탄, 다이옥산 또는 아세토 니트릴 등과 반응시킨 후 여기에 적당한 아민 유도체(R₂NH₂)와 반응시켜 화학식 1의 화합물을 합성할 수 있다. 이때 반응 온도는 실온에서 환류조건이며 반응시간은 1 내지 24 시간이 적당하다.

화학식 1의 화합물에서 Y=S인 경우, 아세트산 조건하에서 과산화수소수를 가하면 Y=O인 화학식 1의 화합물을 합성할 수 있다. 이때 반응 온도는 실온에서 환류 조건이며 반응시간은 1 내지 24 시간이 적당하다.

본 발명은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 및 치료 유효량의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 산 부가염을 포함하는 약학 조성물, 예를 들면, 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화를 억제하는데 유용한 조성물을 포함한다.

본 발명은 치료유효량의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 산 부가염을 세포의 복제노화 및 미성숙노화 방지를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 세포의 복제노화 및 미성숙노화 방지 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 치료 유효량의 화학식 1의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 산 부가염을 세포의 복제노화 및 미성숙노화에 의해 매개되는 질환의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 세포의 복제노화 및 미성숙노화에 의해 매개되는 이상 증상에 대한 치료방법을 제공한다.

본 발명에 따른 화학식 1로 표시되는, 유레아 화합물의 대표적인 예의 구조 및 NMR 스펙트럼 데이터를 하기 표 1에 나타내었다.

표 1. 유레아 화합물의 구조와 활성

각 화합물 번호에 따른 화합물의 이름은 다음과 같다.

1) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

2) 3-메틸-N-{2,2,2-트로클로로-1-[3-(2-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-벤즈아미드

3) 3-니트로-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-벤즈아미드

4) 4-니트로-N-[2,2,2-트리클로로-1-(3-페닐-티오유레이도)-에틸]-벤즈 아미드

5) 2-페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

6) 2-페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

7) 2-나프탈렌-1-일-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

8) 2-나프탈렌-1-일-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

9) 2-나프탈렌-1-일-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(2-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

10) 2-메틸-4-니트로-펜타-2,4-디에노산 {2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아미드

12) 3-메틸-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-벤즈아미드

13) 3,5-디니트로-N-[2,2,2-트리클로로-1-(3-페닐-티오유레이도)-에틸]-벤즈아미드

14) N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-벤즈아미드

15) 2-니트로-N-[2,2,2-트리클로로-1-(3-페닐-티오유레이도)-에틸]-벤즈 아미드

16) 2-니트로-N-[2,2,2-트리클로로-1-(3-m-톨릴-티오유레이도)-에틸]-벤즈아미드

17) 2-니트로-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-벤즈아미드

18) 3,5-디니트로-N-[2,2,2-트리클로로-1-(3-o-톨릴-티오유레이도)-에틸]-벤즈아미드

19) 3-니트로-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(2,5-디메틸-페닐)-티오유레이도]-에틸}-벤즈아미드

20) N-{1-[3-(4-아세틸아미노-페닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리클로로-에틸}-2-니트로-벤즈아미드

21) 2,2-디페닐-N-[2,2,2-트리클로로-1-(3-페닐-티오유레이도)-에틸]-아세트아미드

22) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(2-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

23) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(1H-[1,2,4]트리아졸-3-일)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

24) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(2-메톡시-5-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

25) 푸란-2-카르복실산 {2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-니트로-페닐)-티오유 레이도]-에틸}-아미드

27) 2-페닐-3-비닐-펜트-3-에노산 {2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-하이드록시-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아미드

28) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-시아노-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

29) 3-[3-(2,2,2-트리클로로-1-디페닐아세틸아미노-에틸)-티오유레이도]-벤즈아미드

30) N-{1-[3-(3-아세틸아미노-페닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리클로로-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드

31) N-{1-[3-(3-아미노-페닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리클로로-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드

32) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-하이드록시-3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

33) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-플루오로-3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

34) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리플루오로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드

35) N-{1-[3-(3-시아노-페닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리플루오로-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드

36) 9H-잔텐-9-카르복실산 {2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오 유레이도]-에틸}-아미드

37) 9H-잔텐-9-카르복실산 {2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-시아노-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아미드

38) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-유레이도]-에틸}-아세트아미드

39) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-시아노-페닐)-유레이도]-에틸}-아세트아미드

40) N-{1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드

41) N-{1-[3-(3-시아노-페닐)-티오유레이도]-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드

본 발명의 화학식 1로 표시되는 유레아 화합물, 프로드러그 화합물, 광학 이성질체, 부분입체이성질체 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화를 억제하는 작용을 나타내므로, 이들을 유효성분으로 하는 약학 조성물은 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화 억제제로 유용하다.

따라서, 본 발명은 상기 화학식 1의 유레아 화합물, 프로드러그 화합물, 광학 이성질체, 부분입체이성질체 및 이의 염을 유효성분으로 하는 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화의 방지제용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.　경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경.연질 캅셀제, 액제, 현 탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제(elixirs) 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다.　 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효 성분으로 하는 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

유효 성분으로서 화학식 1의 화합물은 사람을 포함하는 포유동물에 대해 하루에 0.1 내지 500 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.5 내지 100 ㎎/㎏(체중)의 양으로 1일 1회 또는 분할하여 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여할 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 좀더 상세하게 설명하고자 한다.　 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 A-1

표 1의 화합물 1의 합성 (2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드)

(단계 1) 2,2-디페닐-아세트아미드 합성

디페닐 아세트산 10 g(47.1 mmol)을 넣고 (Boc)₂O 12.34 g(56.5 mmol, 1.2 eq)을 넣었다. 피리딘 2.2 g(28.3 mmol, 0.6 eq)을 넣고, NH₄HCO₃ 5.6 g(70.7 mmol, 1.5 eq)을 넣었다. 1,4-디옥산 100 ml을 넣어 녹였다. 그런 다음 상온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 완료되면 EA/H₂O를 사용하여 유기층으로 추출하였다. 유기층을 농축하고 디에틸 에테르를 넣어 결정화한 다음 1시간 교반 시킨 후 여과하여 2,2-디페닐-아세트아미드 9.49 g(95%)을 수득했다. ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 7.35~7.27(m, 10H) 5.99(brs, 1H) 5.60(brs, 1H)

(단계 2) 2,2-디페닐-N-(2,2,2-트리클로로-1-하이드록시-에틸)-아세트아미드 합성

화합물 2,2-디페닐-아세트아미드 4 g(18.9 mmol)을 넣고, 클로랄 하이드레이 트 3.4 g(20.7 mmol, 1.1 eq)을 넣고 벤젠 30 ml을 넣어　녹였다. 그런 다음 12시간 환류교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하였다. 디에틸 에테르를 넣어 남아있는 출발물질을 결정화한 후 여과하여 제거하고, 모액을 농축하여 2,2-디페닐-N-(2,2,2-트리클로로-1-하이드록시-에틸)-아세트아미드 6.13 g(91%)을 수득했다. ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 7.41~7.23(m, 10H) 6.50~6.45(m, 1H) 5.95~5.87(m, 1H) 5.02(s, 1H) 4.7(brs, 1H)

(단계 3) 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)-아세트아미드 합성

화합물 2,2-디페닐-N-(2,2,2-트리클로로-1-하이드록시-에틸)-아세틸아미드 3.4 g(9.37 mmol)을 넣고 벤젠 15 ml을 넣었다. SOCl₂ 2.8 g(23.42 mmol, 2.5 eq)을 넣고 약 6시간 환류교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 완전히 농축하고, 헥산을 넣어 결정화 한 후 약 30분 교반 시켰다. 고체를 여과하여 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)-아세트아미드 2.36 g(66.9 %)을 수득했다. ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 7.43~7.25(m, 10H) 6.57(s, 1H) 5.06(s, 1H)

(단계 4) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도-에틸}-아세트아미드 합성

화합물 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)-아세트아미드 1000 mg(2.652 mmol)을 넣고 CH₃CN 40 ml을 넣었다. KNCS 284 mg(2.92 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하 고, 모액에 3-니트로아닐린 403 mg(2.92 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드 800 mg(56%)을 수득했다.

실시예 A-2

표 1의 화합물 27 의 합성 (2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-하이드록시-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드)

실시예 1에서 얻어지는 화합물 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)-아세트아미드 100 mg(0.27 mmol)을 넣고 CH₃CN 7 ml을 넣었다. KNCS 28 mg(0.28 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-하이드록시 아닐린 29 mg(0.27 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-하이드록시-페닐)-티오유레이도]-에틸-아세트아미드 41 mg(30%)을 수득했다.

실시예 A-3

표 1의 화합물 28 의 합성(2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-시아노-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드)

실시예 1에서 얻어지는 화합물 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)- 아세트아미드 100 mg(0.27 mmol)을 넣고 CH₃CN 7 ml을 넣었다. KNCS 28 mg(0.28 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-아미노벤조니트릴 31 mg(0.27 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-시아노-페닐)-티오유레이도]-에틸-아세트아미드 99 mg(72%)을 수득했다.

실시예 A-4

표 1의 화합물 29 의 합성 (3-[3-(2,2,2-트리클로로-1-디페닐아세틸아미노-에틸)-티오유레이도]-벤즈아미드)

실시예 1에서 얻어지는 화합물 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)-아세트아미드 100 mg(0.27 mmol)을 넣고 CH₃CN 7 ml을 넣었다. KNCS 28 mg(0.28 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-아미노벤즈아미드 36 mg(0.27 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 3-[3-(2,2,2-트리클로로-1-디페닐아세틸아미노-에틸)-티오유레이도]-벤즈아미드 82 mg(58%)을 수득했다.

실시예 A-5

표 1의 화합물 30 의 합성 (N-{1-[3-(3-아세틸아미노-페닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리클로로-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드)

실시예 1에서 얻어지는 화합물 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)-아세트아미드 100 mg(0.27 mmol)을 넣고 CH₃CN 7 ml을 넣었다. KNCS 28 mg(0.28 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-아미노아세트아닐리드 40 mg(0.27 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 N-{1-[3-(3-아세틸아미노-페닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리클로로-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드 94 mg(65%)을 수득했다.

실시예 A-6

표 1의 화합물 31 의 합성 (N-{1-[3-(3-아미노-페닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리클로로-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드)

실시예 1에서 얻어지는 화합물 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)-아세트아미드 100 mg(0.27 mmol)을 넣고 CH₃CN 7 ml을 넣었다. KNCS 28 mg(0.28 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-페닐렌디아민 29 mg(0.27 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 N-{1-[3-(3-아미노-페 닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리클로로-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드 94 mg(65%)을 수득했다.

실시예 A-7

표 1의 화합물 32 의 합성 (2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-하이드록시-3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드)

실시예 1에서 얻어지는 화합물 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)-아세트아미드 100 mg(0.27 mmol)을 넣고 CH₃CN 7 ml을 넣었다. KNCS 28 mg(0.28 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-아미노-2-니트로 페놀 41 mg(0.27 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-하이드록시-3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드 77 mg(52.4%)을 수득했다.

실시예 A-8

표 1의 화합물 33 의 합성 (2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-플루오로-3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드)

실시예 1에서 얻어지는 화합물 2,2-디페닐-N-(1,2,2,2-테트라클로로-에틸)-아세트아미드 100 mg(0.27 mmol)을 넣고 CH₃CN 7 ml을 넣었다. KNCS 28 mg(0.28 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남 은 KNCS를 제거하고, 모액에 4-플루오로-2-니트로 아닐린 41 mg(0.27 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(4-플루오로-3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드 71 mg(48%)을 수득했다.

실시예 A-9

표 1의 화합물 34 의 합성 (2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리플루오로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드)

(단계 1) 2,2-디페닐-N-(2,2,2-트리플루오로-1-하이드록시-에틸)-아세트아미드 합성

화합물 2,2-디페닐-아세트아미드 1.5 g(7.1 mmol)을 넣고, 트리플루오로아세트알데히드 에틸 헤미아세탈 1.1 g(7.8 mmol, 1.1 eq)을 넣은 다음 1,4-디옥산 30 ml을 넣어　녹였다. 그런 다음 48시간 환류교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하였다. 디에틸 에테르를 넣어 남아있는 출발물질을 결정화한 후 여과하여 제거하고, 모액을 농축하여 2,2-디페닐-N-(2,2,2-트리플루오로-1-하이드록시-에틸)-아세트아미드 6.13 g(91%)을 수득했다. ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 9.43~9.40(m, 1H) 7.48~7.46(m, 1H) 7.33~7.21(m, 10H) 5.73~5.66(m, 1H) 5.13(s, 1H)

(단계 2) N-(1-클로로-2,2,2-트리플루오로-에틸)-2,2-디페닐-아세트아미드 합성

화합물 2,2-디페닐-N-(2,2,2-트리플루오로-1-하이드록시-에틸)-아세트아미드 1 g(3.23 mmol)을 넣고 벤젠 15 ml을 넣었다. SOCl₂ 0.96 g(8.085mmol, 2.5 eq)을 넣고 약 6시간 환류교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 완전히 농축하고, 헥산을 넣어 결정화 한 후 약 30분 교반 시켰다. 고체를 여과하여 N-(1-클로로-2,2,2-트리플루오로-에틸)-2,2-디페닐-아세트아미드 0.57 g(53.9 %)을 수득했다. ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 7.43~7.23(m, 10) 6.39(s, 1H) 5.03(s, 1H)

(단계 3) 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리플루오로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드 합성

화합물 N-(1-클로로-2,2,2-트리플루오로-에틸)-2,2-디페닐-아세트아미드 225 mg(0.69 mmol)을 넣고 CH₃CN 10 ml을 넣었다. KNCS 74 mg(0.76 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-니트로 아닐린 95 mg(0.69 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리플루오로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드 85 mg(25%)을 수득했다.

실시예 A-10

표 1의 화합물 35 의 합성 (N-{1-[3-(3-시아노-페닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리플루오로-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드)

실시예 9에서 얻어지는 화합물 N-(1-클로로-2,2,2-트리플루오로-에틸)-2,2- 디페닐-아세트아미드 225 mg(0.69 mmol)을 넣은 다음 CH₃CN 10 ml을 넣었다. KNCS 74 mg(0.76 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-아미노벤조니트릴 82 mg(0.69 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 N-{1-[3-(3-시아노-페닐)-티오유레이도]-2,2,2-트리플루오로-에틸}-2,2-디페닐-아세트아미드 241 mg(75%)을 수득했다.

실시예 A-11

표 1의 화합물 36의 합성 (N-(2,2,2-트리클로로-1-(3-(3-니트로페닐)티오유레이도)에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드)

(단계 1) 9H-잔텐-9-카르복스아미드 합성

잔텐-9-카르복실산 10 g(44.2 mmol)을 넣고 (Boc)₂O를 11.6 g(53.0 mmol, 1.2 eq)을 넣었다. 그런 다음 피리딘 2.1 g(26.5 mmol, 0.6 eq)을 넣고, NH₄HCO₃ 5.3 g(66.3 mmol, 1.5 eq)을 넣었다. 1,4-디옥산 100 ml을 넣은 다음 녹였다. 상온에서 12시간 교반시켰다. 반응이 완료되면 EA/H₂O를 사용하여 유기층으로 추출하였다. 유기층을 농축하고 디에틸 에테르를 넣어 결정화하고 1시간 교반 시킨 후 여과하여 9H-잔텐-9-카르복스아미드를 8.47 g(85%)을 수득했다. ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 7.8(brs, 1H) 7.33~7.24(m, 4H) 7.13~7.05(m, 5H) 4.88(s, 1H)

(단계 2) N-(2,2,2-트리클로로-1-하이드록시에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 합성

화합물 9H-잔텐-9-카르복스아미드 1 g(4.44 mmol)을 넣고, 클로랄 하이드레이트 2.2 g(13.32 mmol, 3 eq)을 넣은 다음 벤젠 30 ml을 넣어　녹였다. 그런 다음 12시간 환류교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하였다. 디에틸 에테르를 넣어 남아있는 출발물질을 결정화한 후 여과하여 제거하고, 모액을 농축하여 N-(2,2,2-트리클로로-1-하이드록시에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 1.5 g(90%)을 수득했다. ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 7.43~7.26(m, 4H) 7.18~7.07(m, 4H) 6.25~(m, 1H) 5.75~5.68(m, 1H) 4.94(s, 1H) 4.46~4.44(m, 1H)

(단계 3) N-(1,2,2,2-테트라클로로에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 합성

화합물 N-(2,2,2-트리클로로-1-하이드록시에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 1 g(2.68 mmol)을 넣고 벤젠 15 ml을 넣었다. SOCl₂ 1.6 g(13.42 mmol, 5 eq)을 넣고 약 6시간 환류교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 완전히 농축하고, 헥산을 넣어 결정화 한 후 약 30분 교반 시켰다. 고체를 여과하여 N-(1,2,2,2-테트라클로로에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 0.65 g(62.2 %)을 수득했다. ¹H NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 7.42~7.34(m, 4H) 7.22~7.13(m, 4H) 6.40(s, 1H) 5.03(s, 1H)

(단계 4) N-(2,2,2-트리클로로-1-(3-(3-니트로페닐)티오유레이도)에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 합성

화합물 N-(1,2,2,2-테트라클로로에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 150 mg(0.3 8mmol)을 넣고 CH₃CN 7 ml을 넣었다. KNCS 41 mg(0.42 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-니트로 아닐린 53 mg(0.38 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반하였다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 N-(2,2,2-트리클로로-1-(3-(3-니트로페닐)티오유레이도)에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 142 mg(67%)을 수득했다.

실시예 A-12

표 1의 화합물 37의 합성 (N-(2,2,2-트리클로로-1-(3-(3-시아노페닐)티오유레이도)에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드)

실시예 11에서 얻어지는 화합물 N-(1,2,2,2-테트라클로로에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 150 mg(0.3 8mmol)을 넣고 CH₃CN 7 ml을 넣었다. KNCS 41 mg(0.42 mmol, 1.1 eq)을 넣고 1시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하여 남은 KNCS를 제거하고, 모액에 3-시아노 아닐린 46 mg(0.38 mmol, 1eq)을 넣고, 상온에서 12시간 교반 시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 농축하고, 디에틸 에테르를 넣어 결정화 시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 N-(2,2,2-트리클로로-1-(3-(3-시아노페닐)티오유레이도)에틸)-9H-잔텐-9-카르복스아미드 126 mg(62%)을 수득했다.

실시예 A-13

표 1의 화합물 38의 합성 (2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-유레이도]-에틸}-아세트아미드)

실시예 1에서 얻어지는　화합물 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드 50 mg(0.09 mmol)을 아세트산 2 ml에 넣어 얻어진 용액에, 아세트산 3 ml와 30% 과산화수소 2 ml 혼합물을 만들어 적가하였다. 그런 다음 상온에서 4시간 교반시켰다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하고 H₂O로 세척하였다. 고체를 에틸 아세테이트에 녹이고 소금물로 세척하여 유기층으로 추출하였다. 유기층을 MgSO₄로 건조시키고 여과한 후 모액을 농축하였다. 디에틸 에테르를 넣어 결정화시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-유레이도]-에틸}-아세트아미드 3mg(6%)을 수득했다.

실시예 A-14

표 1의 화합물 39의 합성 (2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-시아노-페닐)-유레이도]-에틸}-아세트아미드)

실시예 3에서 얻어지는　화합물 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-시아노-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드 50 mg(0.09 mmol)을 아세트산 2 ml에 넣어 얻어진 용액에, 아세트산 3 ml와 30% 과산화수소 2 ml 혼합물을 만들어 적가하였다. 상온에서 4시간 교반하였다. 반응이 완료되면 반응액을 여과하고 H₂O로 세척하였다. 고체를 에틸 아세테이트에 녹이고 소금물로 세척하여 유기층으로 추출하였다. 유기층을 MgSO₄로 건조시키고 여과한 후 모액을 농축하였다. 디에틸 에테르를 넣어 결정화시켰다. 상온에서 약 30분 교반 후 여과를 하여 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-시아노-페닐)-유레이도]-에틸}-아세트아미드 3mg(6%)을 수득했다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물의 분자구조는 핵자기공명스펙트럼, 질량 분광법과 대표적인 화합물의 원소분석의 계산치와 실측치의 비교에 의해 확인했다.

본 발명의 약학 조성물은 하기와 같은 제형으로 제조될 수 있으나 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

제제예 1: 시럽제의 제조

본 발명의 유레아 화합물 또는 이의 염을 유효성분 2% (중량/부피)로 함유하는 시럽을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

대표적인 유레아 화합물인 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드(화합물 1) 또는 9H-잔텐-9-카르복실산 {2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아미드(화합물 36)의 산부가염, 당, 사카린을 온수 80 g에 용해시키고, 이 용액을 냉각시킨 다음 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 소르브산 및 물로 이루어진 용액을 제조하여 병에 넣었다.　이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되도록 했다.　상기 부가염은 상기 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

제제예 2 : 정제의 제조

상기 유효성분이 15 mg 함유된 정제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다. 2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}-아세트아미드(화합물 1)의 염산염 250g을 락토오스 175.9g, 감자 전분 180g　및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다.　이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 다음, 분쇄하여 14 메쉬체를 통과시켰다.　이것을 건조시키고 여기에 감자 전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 3 : 주사액제의 제조

상기의 유효성분이 10 ㎎ 함유된 주사액제는 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

2,2-디페닐-N-{2,2,2-트리클로로-1-[3-(3-니트로-페닐)-티오유레이도]-에틸}아세트아미드(화합물 1)의 염산염 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르빈산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100 ml를 만들었다.　이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

또한, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 유레아 화합물이 ATM/ATR 작용 억제제로서 우수한 효과를 나타내는 것을 확인하기 위하여, 생물학적 약리 활성을 검색하였다.

B) 생물학적 실시예

실시예 B-1: 세포내 ATM 및 ATR 저해 분석

p53 단백질의 15번째 세린 잔기(Ser15)에 대한 인산화는 ATM 또는 ATR 단백 질의 활성에 의존적임이 잘 알려져 있다[참고문헌: Canman, C. E. et al. (1998) Activation of the ATM kinase by ionizing radiation and phosphorylation of p53. Science 281, 1677-1679; Banin, S. et al. (1998) Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science 281, 1674-1677; Tibbetts, R. S. et al. (1999) A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53]. 따라서, 세포 내에서 ATM 및 ATR 단백질의 활성 변화를 분석하기 위하여, p53 단백질의 Ser15에 대한 인산화 여부를 RKO 세포(ATCC에서 구입)와 GM847 세포(ATCC에서 구입)를 이용하여 분석하였다. 인간의 대장암 세포에서 유래한 RKO 세포는 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, Invitrogen사에서 구입)이 함유된 McCoy's 5A 배지(Invitrogen에서 구입)에서 배양하였다. SV40 바이러스에 의해 불멸화된 인간 섬유모세포(fibroblast)인 GM847 세포는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM 배지(Invitrogen에서 구입)에서 배양하였다.

배양된 RKO 세포에 유레아 화합물이 함유된 배지를 첨가하여 2 시간 동안 전배양 한 후, 1 μM의 독소루비신(doxorubicin)을 첨가하여 20 시간 동안 배양하였다. 배양된 GM847 세포에 유레아 화합물이 함유된 배지를 첨가하여 2 시간 동안 전배양하였다. 전배양된 GM847 세포에 1 μM의 독소루비신(doxorubicin)을 첨가하거나, 30 J/m²의 자외선(UV)를 조사한 후 2 시간 동안 추가로 배양하였다. 배양된 세포를 수득하여 세포 파쇄액을 수득한 후, SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 단백질을 전개하고, 웨스턴 블랏을 수행하였다.

웨스턴 블랏은 항-액틴 항체(C-11; Santa Cruz Biotechnology에서 구입), 항-p53 항체 DO-1(Santa Cruz Biotechnology에서 구입), 및 항-p53 Ser15 항체(Cell Signaling Technology에서 구입)을 이용하여 수행하였다. 덴시토메터 분석은 다음과 같이 수행하였고 그 결과는 표1에 표시하였다.

(각 화합물의 상대적인 Ser15의 덴시티 (density)) = (p53 Ser15의 덴시티)/(액틴의 덴시티)

(p53 Ser15 인산화 억제 정도)(%) = (각 화합물의 상대적 Ser15의 덴시티)/(독소루비신 처리 시 상대적 Ser15 덴시티)*100

실시예 B-2: 시험관내 ATM 및 ATR 저해 분석

시험관내에서 ATM 및 ATR 단백질의 활성 저해 분석은 기존의 방법에 따라 수행하였다 [참고문헌: Kim, S.T. et al., (1999) Substrate specificities and identification of putative substrates of ATM kinase family member. J. Biol. Chem. 274, 37538-37543; Tibbetts, R.S. et al. (1999) A role for ATR in the DNA damage-induced phosphorylation of p53. Genes Dev. 13, 152-157]. 시험관내에서 DNA-PK 단백질의 활성 저해 분석은 기존의 방법에 따라 수행하였다[참고문헌: Shieh, S.Y. et al. (1997) DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2. Cell 91, 325-334]. 비특이적인 단백질 인산화효소(protein kinase) 저해를 분석하기 위하여, ERK, CK1, CDK2, JNK, PKC, CAK, Chk, PKR, p38, PI3K 등의 단백질 인산화효소에 대한 시험관내 분석은 기존의 방법을 따라 수행하였다 [참고문헌: She, Q.-B. et al. (2000) ERKs and p38 kinase phosphorylate p53 protein at serine 15 in response to UV radiation. J. Biol. Chem. 275, 20444-20449; Knippschild, U. et al. (1997) p53 is phosphorylated in vitro and in vivo by the delta and epsilon isoforms of casein kinase 1 and enhances the level of caseine kinase 1 delta in response to topoisomerase-directed drugs. Oncogene 15, 1727-1736; Blaydes, J. P. et al. (2001) Stoichiometric phosphorylation of human p53 at ser315 stimulated p53-dependent transcription. J. Biol. Chem. 276, 4699-4708; Buschmann, T. et al. (2001) Jun NH₂-terminal kinase phosphorylation of p53 on Thr-81 is important for p53 stabilization and transcriptional activitires in response to stress. Mol. Cell. Biol. 21, 2743-2754; Baudier, J. et al. (1992) Characterization of the tumor suppressor p53 as a protein kinase C substrate and a S100b-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 11627-11631; Ko, L. J. et al. (1997) p53 is phosphorylated by CDK7-cyclin H in a p36MAT1-dependent manner. Mol Cell. Biol. 17, 7220-7229; Shieh, S.-Y. et al. (2000) The human homologs of checkpoint kinases Chk1 and Cds1 (Chk2) phosphorylate p53 at multiple DNA damage-inducible sites. Genes Dev. 14, 289-300; Cuddihy, A. R. et al. (1999) The double-stranded RNA activated protein kinase PKR physically associates with the tumor suppressor p53 protein and phosphorylates human p53 on serine 392 in vitro. Oncogene 18, 2690-2702; Huang, C. et al. (1999) p39 kinase mediates UV-induced phosphorylation of p53 protein at serine 389. J. Biol. Chem. 274, 12229-12235; Aoki, M. et al. The catalytic subunit of phosphoinositide 3-kinase: requirements for oncogenicity. J. Biol. Chem. 275, 6267-6275].

상기 방법으로 준비된 단백질 인산화효소들을 이용하여 단백질 인산화효소 분석을 다음과 같이 수행하였다. 준비된 단백질 인산화효소들은 10μCi [γ-³²P] ATP와 1 ㎍ GSTp53 단백질 (Santa Cruz Biotechnology에서 구입)가 함유된 완충용액[10 mM Hepes (pH7.5), 50 mM 글리세로포스페이트(glycerophosphate), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂, 10 μM ATP, 및 1 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)]에 첨가하여 30℃에서 30분간 반응하였다. 단백질 인산화효소들의 활성 저해 여부를 확인하기 위하여 상기 반응액에 유레아 화합물을 첨가하여 반응하였다. 반응 후 단백질을 SDS-PAGE 전기영동한 후, 겔을 건조하여 X-ray 필름에 노출시켰다.

실시예 B-3: 세포의 복제 노화(replicative senescence) 억제 분석

인체의 음경포피 세포인 BJ 세포(ATCC에서 구입)는 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. 인위적인 복제노화를 유도하기 위하여 텔로미어 단백질인 TRF2의 돌연변이형 TRF2^ΔBΔM 단백질을 이용하였다. 돌연변이형 TRF2^ΔBΔM 단백질을 정상세포에 과발현시키면 노화현상이 유도된다[참고문헌: van Steensel, B. et al. (1998) TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusion. Cell 92, 401-413; Takai, H. et al. (2003) DNA damage foci at dysfunctional telomeres. Curr. Biol. 13, 1549-1556]. TRF2^ΔBΔM 유전자(The Rockefeller University, NY의 T. de Lange 박사로부터 입수)를 pBabe-puro 벡터에 클로닝(pBabe-puro-TRF2^ΔBΔM) 하고, pBabe-puro-TRF2^ΔBΔM 벡터에 IRES-EGFP (Clonetech사의 pIRES2-EGFP로부터 분리)를 클로닝(pBabe-puro-TRF2^ΔBΔM-IRES-EGFP)하여 하나의 발현벡터에서 TRF2^ΔBΔM 단백질과 EGFP 단백질이 발현되도록 하였다(도 7). pBabe-puro-TRF2^ΔBΔM-IRES-EGFP를 BJ 세포에 도입하여 노화 현상이 유도되도록 하고, 유레아 화합물을 배양배지에 첨가하여 노화 현상의 억제를 관찰하였다.

정상 BJ 세포는 1:4 비율로 계대 배양하였고, 각 계대마다 세포수를 계수하여 얻은 누적 세포수를 이용하여 세포분열수(PD, population doubling)를 계산하였다. 복제 노화에 이른 세포에 1 μM의 유레아 화합물을 처리하고, 앞서와 동일한 방법으로 세포분열수를 계산하여 유레아 화합물이 노화된 세포의 세포분열에 미치는 영향을 분석하였다.

인간의 유방상피세포(human mammary epithelial cells; HMEC)는 로렌스 버클리 국립연구소의 M.R. Stampfer 박사로부터 입수하였다. HMEC은 bovine pituitary extract(Cambrex사에서 구입)와 5 mg transferring 및 10 mM isopreterenol이 첨가된 MEGM 배지(Cambrex사에서 구입)에서 배양하였다. 각 계대마다 세포수를 계수하여 얻은 누적 세포수를 이용하여 세포분열수(PD, population doubling)를 계산하였다. 복제 노화에 이른 세포에 1 μM의 유레아 화합물을 처리하고, 앞서와 동일한 방법으로 세포분열수를 계산하여 유레아 화합물이 노화된 세포의 세포분열에 미치는 영향을 분석하였다.

노화된 세포는 특징적으로 발현되는 베타-갈락토시다아제(SA-β-galactosidase; SA-β-gal)로 인해 양성적으로 염색된다 [참고문헌: Dimiri, G. D. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 9363-9367]. 배양된 BJ 세포를 PBS로 세척한 후, 2% 포름알데히드와 0.2% 글루타르알데히드가 포함된 PBS로 5분간 처리하여 고정하였다. PBS로 고정된 세포를 세척한 후, 1 mg/ml의 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside)이 들어있는 완충용액[150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM K₃Fe(CN)₆, 5 mM K₄Fe(CN)₆, 40 mM 시트르산, Na₂HPO₄ (pH 6.0)]을 세포에 첨가하여 12시간 동안 염색하였다.

실시예 B-4: 세포의 미성숙 노화(premature senescence) 억제 분석

인체의 음경포피 세포인 BJ 세포는 10% 우태아 혈청이 함유된 DMEM 배지에서 배양하였다. BJ 세포는 1:4 비율로 계대 배양하였고, 각 계대마다 세포수를 계수하여 얻은 누적 세포수를 이용하여 세포분열수(PD, population doubling)을 계산하였다. 세포의 미성숙 노화는 세포분열수가 30(PD30)인 BJ 세포에 100 μM의 과산화수소(H₂O₂)를 처리하여 유도하였다. 미성숙 노화에 이른 세포에 1 μM의 유레아 화합물을 처리하고, 앞서와 동일한 방법으로 세포분열수를 계산하여 유레아 화합물이 노화된 세포의 세포분열에 미치는 영향을 분석하였다.

배양된 BJ 세포를 PBS로 세척한 후, 2% 포름알데히드와 0.2% 글루타르알데히드가 포함된 PBS로 5분간 처리하여 고정하였다. PBS로 고정된 세포를 세척한 후, 1 mg/ml의 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside)이 들어있는 완충용액[150 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 5 mM K₃Fe(CN)₆, 5 mM K₄Fe(CN)₆, 40 mM 시트르산, Na₂HPO₄ (pH 6.0)]을 세포에 첨가하여 12시간 동안 염색하였다.

실시예 B-5: 면역형광분석(Immunofluorescence analysis)

면역형광분석은 기본적으로 기존의 방법을 따랐다[참고문헌: Herbig, U. et al. (2004) Telomere shortening triggers senescence of human cells through a pathway involving ATM, p53, and p21^CIP1, but not p16^INK4a. Mol. Cell 14, 501-513]. 챔버 슬라이드(chamber slide)에 배양된 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)가 함유된 PBS와 20분간 반응하여 고정시켰다. 고정된 세포를 0.2%의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 함유된 TBS와 반응시킨 후, 1% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)가 함유된 TBS와 1시간 동안 반응시켰다. 이와 같이 처리된 세포를 항체가 희석된 TBS와 12시간 반응시킨 후, TBS로 3회 세척하였다. FITC가 표지된 2차 항체를 1시간 반응시킨 후, TBS로 3회 세척하였다. 세포내의 DNA는 Hoechst 33342 염료를 이용하여 염색하였다.

실시예 B-6: 핵형 분석(Cytogenetics)

염색체의 G-band 염색은 기본의 방법으로 수행하였다[참고문헌: Gustashaw, K.M. (1997) The AGT cytogenetics laboratory manual (eds Barch, M.J. et al) 259-324]. 염색체 분석은 기존의 방법에 의한 분류에 따라 수행하였다[참고문헌: Morales, C.P. et al. Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase. Nat. Genet. 21, 115-118].

결과

세포내 ATM 및 ATR 단백질 활성의 저해

화합물의 세포내 ATR 활성 저해 여부는 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 GM847 세포를 이용하여 확인하였다. 배양 중인 GM847 세포에 유레아 화합물을 2시간 동안 전처리한 후, 30 J/m²의 자외선을 조사하고, 다시 2시간 동안 세포를 배양한 후 p53 단백질의 Ser15에 대한 인산화 여부를 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 도 1에서 보는 바와 같이, GM847 세포에 자외선(UV)을 조사하면, p53 단백질의 Ser15에 인산화가 일어난다. GM847 세포에서 자외선 조사에 의해 일어나는 Ser15의 인산화는 p53 단백질의 양적 변화는 일으키지 않으며, ATR 단백질에 의해 매개되는 것으로 보고되어 있다 [참고문헌: Lowndes, N. F. and Murguia, J. R. (2000) Sensing and responding to DNA damage. Curr. Opin. Genet. Dev. 10, 17-25; Abraham, R. T. (2001) Cell cycle checkpoint signaling through the ATM and ATR kinases. Genes Dev. 15, 2177-2196]. 화합물 28과 33를 농도를 달리하여 GM847 세포에 전처리한 경우, 자외선 조사에 의하여 유도되는 Ser15 인산화가 화합물의 농도에 의존적으로 저해되는 것을 확인하였다. 또한, p53 단백질에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 이 같은 Ser15 인산화 저해는 p53 단백질의 양을 변화시킨 결과에 의한 것이 아님이 확인되었다(도 1).

화합물의 세포내 ATM 활성 저해 여부도 GM847 세포를 이용하였다. 배양 중인 GM847 세포에 유레아 화합물을 2시간 동안 전처리한 후, 1 μM의 독소루비신을 처리하고, 다시 2시간 동안 세포를 배양한 후 p53 단백질의 Ser15에 대한 인산화를 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 독소루비신 처리에 의하여 세포 내 p53 단백질의 Ser15이 특이적으로 인산화되었으며, 화합물 28과 33를 농도를 달리하여 전처리한 결과, 처리한 화합물의 농도에 의존적으로 Ser15의 인산화를 저해하는 것을 확인하였다(도 2). 이 또한, p53 단백질에 대한 웨스턴 블랏을 수행한 결과, 이 같은 Ser15 인산화 저해는 p53 단백질의 양을 변화시킨 결과에 의한 것이 아님이 확인되었다.

다양한 유레아 화합물에 의한 세포내 p53 단백질의 Ser15 인산화 저해 여부를 GM847 세포와 RKO 세포를 이용하여 확인하였다. GM847 세포에서와 마찬가지로, RKO 세포에 1 μM의 독소루비신을 처리하면 p53 단백질의 Ser15이 특이적으로 인산화되었다. 전처리된 화합물 중 1, 27, 28, 29, 31 등이 농도 의존적으로 독소루비신에 의한 p53 단백질의 Ser15 인산화를 저해하였으며, 특히 화합물 1, 27, 28은 GM847 세포와 RKO 세포에서 모두 Ser15의 인산화를 저해하였다(도 3). RKO 세포에서 유레아 화합물 처리에 의한 p53 Ser15 인산화의 변화 정도는 도 3에서 확인되는 바와 같다.

시험관내 ATM 및 ATR 단백질 활성의 저해

화합물의 시험관내 ATM 및 ATR 활성 저해 여부는 상기 실시예에서 설명한 바와 같이 준비된 단백질 인산화 효소를 이용하여 수행하였다. 도 4에서 보는 바와 같이 야생형(wt) ATM 및 ATR 단백질은 GST-p53 단백질을 특이적으로 인산화시키지만, 단백질 인산화효소 활성이 제거된 돌연변이형(kd) ATM 및 ATR 단백질은 GST-p53 단백질을 인산화시키지 못한다. 반응 용액에 화합물 28과 33를 첨가해 주면 농도 의존적으로 ATM 및 ATR에 의한 GST-p53 단백질의 인산화를 저해한다. 양성 대조구로 사용한 LY294002(LY) 화합물 (Calbiochem에서 구입)의 경우 역시 ATM 및 ATR에 의한 GST-p53 단백질의 인산화를 저해하였다. LY 및 화합물 28과 33는 JNK 및 p38 단백질 인산화 효소에 의한 GST-p53 단백질의 인산화는 저해하지 못하였다.

화합물 33의 농도에 따른 ATM 및 ATR 활성의 억제 정도를 측정한 결과, LY294002 보다 낮은 농도에서도 ATM 및 ATR 단백질의 활성을 저해하는 것으로 확인되었다(도 5). 그러나, ATM 및 ATR과 구조적으로 유사한 DNA-PK 단백질의 활성은 LY294002에 의해서는 농도 의존적으로 저해되나, 화합물 33에 의해서는 저해되지 않음을 확인하였다. 또한, PI3K 단백질의 활성 역시, LY294002에 의하여서는 저해되었으나, 화합물 33에 의해서는 저해되지 않았다 (도 5).

p53 단백질을 인산화시키는 것으로 알려진 일련의 단백질 인산화 효소를 이용하여 시험관내에서 유레아 화합물의 저해 능력을 확인하였다(도 6). 화합물 33는 ATM 및 ATR 이외의 다른 단백질 인산화효소에 의한 GST-p53 단백질의 인산화를 저해하지 못하였다.

ATM/ATR 저해제에 의한 세포의 복제 노화 억제

BJ 세포에 pBabe-puro-TRF2^ΔBΔM-IRES-EGFP 벡터를 도입하면, 벡터만 도입한 세포와는 달리, TRF2^ΔBΔM 단백질의 과발현에 의하여 노화가 유도되어 세포의 수가 증가하지 않고, 세포의 크기가 증가하게 된다(도 7 및 도 8, TRF2^ΔBΔM). 이와 같이 TRF2^ΔBΔM 단백질의 과발현에 의하여 인위적으로 노화가 유도되는 세포에 유레아 화합물을 처리하면, 노화 현상의 유도가 억제되어 세포의 수가 증가하고 세포의 크기는 증가하지 않음을 확인하였다 (도 7, TRF2^ΔBΔM + 1, TRF2^ΔBΔM + 14, 및 TRF2^ΔBΔM + 33 및 도 8, TRF2^ΔBΔM + 33). 유레아 화합물을 TRF2^ΔBΔM 단백질이 과발현된 세포에 처리하고 6일간 관찰한 결과, 유레아 화합물을 처리하지 않은 대조군에 비하여 세포의 수는 약 16배 증가하였고, 세포의 크기는 약 1/3로 줄었다(도 9).

TRF2^ΔBΔM 단백질의 과발현에 의해 유도된 노화 세포에 대해, 복제 노화시 발현되는 베타-갈락토시다제에 대하여 염색(SA-β-gal 염색)하게 되면 세포가 푸른색으로 염색된다(도 10). 유레아 화합물 33을 TRF2^ΔBΔM 단백질의 과발현에 의해 유도된 노화가 일어난 BJ 세포에 처리하면 SA-β-gal 염색이 억제되며, 화합물 33을 배양배지에서 제거한 후 배양하면, SA-β-gal 염색이 다시 관찰되었다. 이처럼 노화가 재개된 세포에 유레아 화합물 33을 다시 처리하면, SA-β-gal 염색이 재차 억제되어 유레아 화합물 33에 의한 노화 억제 기능은 가역적임을 확인하였다(도 10). 유레아 화합물 33은 다양한 농도에서 TRF2^ΔBΔM 단백질의 과발현에 의해 유도된 노화를 억제하여 세포의 수를 증가시켰다(도 11).

BJ 세포를 계속 계대 배양하여 세포분열수가 대략 PD90에 이르면 복제 노화가 일어나 세포가 더 이상 자라지 않고 세포의 크기는 증가하게 된다. 이때, 유레아 화합물 33을 세포에 처리하면, 세포 분열이 다시 시작되어, 세포의 수가 증가하게 된다(도 12). 화합물 처리에 의해 다시 분열하던 세포에, 화합물 33을 처리하지 않고 배양액만을 처리하게 되면, 분열하던 세포는 다시 분열을 멈추어 세포의 수가 증가하지 않게 된다(도 12, 청색 삼각형). 분열을 멈춘 세포에 다시 화합물 33를 처리하면 세포 분열이 재개되고 세포의 수가 증가하게 된다(도 12, 붉은색 역삼각형). 복제노화가 일어난 BJ 세포를 위상차 현미경으로 관찰하면, 세포의 크기가 증가되어 있고, 그 모양이 매우 납작해져 있음을 알 수 있다(도 13). 또한, 복제노화에 의하여 세포의 증식이 억제되어 있기 때문에 수일에 걸쳐 관찰하여도 세포의 수가 증가하지 않는다. 이 같이 복제노화가 일어난 BJ 세포에 유레아 화합물 33을 처리하면, 복제노화가 억제되어 매우 빠르게 세포의 형태가 변화하고 수일 이내에 세포의 수적 증가가 일어남을 확인하였다(도 13).

유레아 화합물에 의한 복제노화의 억제 현상이 세포의 암화 과정에서 흔히 관찰되는 염색체 이상에 의한 것이 아님을 확인하기 위하여 핵형 분석을 수행하였다. TRF2^ΔBΔM 단백질의 과발현에 의해 유도된 노화 세포에서는 염색체 이상이 관찰되었으나, 복제노화가 일어난 세포에서는 염색체 이상이 관찰되지 않았으며, 유레아 화합물 33을 2주간 처리한 세포에서도 염색체 이상이 관찰되지 않았다(도 14). 따라서, 유레아 화합물에 의한 복제노화의 억제는 염색체 이상에 의한 세포의 암화 과정과는 다른 것으로 확인되었다.

복제노화가 일어난 인간의 유방상피세포(HMEC)에 유레아 화합물 33을 250 nM 농도로 10일간 처리한 결과, 복제노화가 억제되어 세포의 수가 증가하고, 복제노화의 결과 나타나는 SA-β-gal 염색이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 15).

ATM/ATR 저해제에 의한 세포의 미성숙 노화 억제

BJ 세포에 100 μM의 과산화수소(H₂O₂)를 2시간 동안 처리하고, 약 1주일간 배양하면, 미성숙 노화가 일어나 세포는 더 이상 분열하지 않게 된다. 과산화수소에 의한 미성숙 노화 시에도 복제 노화에서 나타나는 것과 마찬가지로, SA-β-gal 염색에 양성 반응을 나타낸다. 미성숙 노화가 일어난 BJ 세포에 화합물 33을 처리한 결과, 미성숙 노화가 억제되어 SA-β-gal 염색에 음성 반응을 나타내며, 세포의 수도 증가함을 확인하였다(도 16).

본 발명에 따른 화학식 1의 유레아 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염은 ATM 및 ATR의 단백질 인산화 효소 기능을 특이적으로 저해하고, 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화를 억제하여, 세포의 수명을 연장하고 세포의 수를 증가시킨다. 따라서 이러한 유레아 화합물 및 이를 유효 성분으로 하는 약학 조성물은 포유동물세포의 노화방지제 및 노화와 관련된 질환의 치료제로서 매우 유용하다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1로 정의되는 유레아 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 포유동물세포의 복제노화 및 미성숙노화를 방지하는 노화방지제:

   화학식 1

   

   상기 식에서,

   R₁은 하기 구조들 중 어느 하나이고,

   

   ;

   R₂는 하기 구조들 중 어느 하나이며,

   

   ;

   X는 H, CH₃, CF₃, 또는 CCl₃ 이고,

   Y는 O 또는 S이다.
2. 제 1항에 있어서, 포유동물세포가 인간세포임을 특징으로 하는 노화방지제.
3. 제 2항에 있어서, 인간세포가 인간 섬유모세포 또는 인간 상피세포, 또는 인간 섬유모세포 및 인간 상피세포임을 특징으로 하는 노화방지제.
4. 제 3항에 있어서, 인간 섬유모세포가 인간 음경포피 섬유모세포임을 특징으로 하는 노화방지제.
5. 제 3항에 있어서, 인간 상피세포가 인간 유방상피세포임을 특징으로 하는 노화방지제.
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