KR20140028078A

KR20140028078A - 씨디씨42 억제제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140028078A
Application number: KR1020137034199A
Authority: KR
Inventors: 콴 루; 후첸 조우; 얀후아 첸
Original assignee: 온코 바이오메디컬 테크놀로지 (수조우) 코., 엘디디.
Priority date: 2011-05-23
Filing date: 2012-05-21
Publication date: 2014-03-07
Also published as: CN102796050A; JP2014515357A; WO2012159456A1; JP6001650B2; US20170334863A1; EP2716292B1; US20140194451A1; CN102796050B; US20150329496A1; EP2716292A1; EP2716292A4; US9725417B2

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I로 표현되는 화합물에 관한 것이다.
<화학식 I>

Description

씨디씨42 억제제 및 이의 용도{Cdc42 INHIBITOR AND USES THEREOF}

본 발명은 하기 화학식 I로 표현되는 화합물, 씨디씨42(Cdc42) 억제제 및 그의 활용에 관련된 것이다.

<화학식 I>

세포분열주기 단백질인 씨디씨42(Cdc42)는 작은 G단백질인 Rho GTP효소 가족 중의 한 아종이고 많은 세포생물학 기능의 중요한 제어 단백질이다. 처음에 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)에서 세포의 극화에 참여하는 것이 발견되었고, 이후 세포골격의 재조합, 세포의 엔도시토시스 운수경로, 세포의 주기조절과 세포의 전사에서 중요한 역할을 한다는 것을 알게 되었다.

대다수 효소와 같이 GDP 교환을 통하여 GTP 결합으로 되고 신호의 전도를 실현하며 Cdc42가 활성화된다. Rho GTP 효소가족의 이런 뉴클레오티드 제한형 구조 사이의 순환은 3가지 중요한 단백질로 조절한다. 즉, 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자(GEF）가 GDP의 방출과 GTP의 결합을 촉진하며 GTP효소가 활성화한 단백질（GAP）이 반대조절인자로서 Rho GTP효소의 가수 분해를 가속하고 Rho GTP효소가 활성 있는 상태로부터 활성 없는 상태로 변하며 GDP가 억제인자(GDI)에서, GDP가 Rho GTP 효소에서 분리되어 Rho GTP효소의 활성을 억제한다.

최근 연간의 연구에 의하면 Cdc42의 이상적인 활성은 중양과 신경퇴화적 질환 등 인류질환의 병리와 생리에 광범위하게 참여하는 것을 밝혀졌다. 재미있는 것은 인류의 중양에서 Cdc42의 돌연변이 유전자가 발견되지 않고 그의 이상적인 형식이 주로 조직과 의뢰한 미소 환경에서 불균형 또는 고도 과발현으로 나타나서 중양 세포의 진화 및 전이와 긴밀하게 관련되어 있다는 것이다.

신경원 형태를 형성하는데 가장 중요한 조정기로서 Cdc42는 대뇌 정상 발육의 운명을 파악하며 Cdc42를 제거한 쥐는 출생할 때까지 살 수 없고 대뇌의 기형도 나타났다. 이전 각종 연구에 의하면 Cdc42의 활성화는 상피세포 사이의 중간엽세포（EMT）의 전변과 그에 의한 세포 내 물질의 운수에 대하여 가장 중요하다고 밝히며 이런 중양세포에 대한 침입이 매우 필요하다.

그러나 3가지 가장 전형적인 Rho가족의 아종에서 Cdc42에 대한 연구가 RhoA와 Rac1에 대한 연구 보다 훨씬 떨어지고 있다. 이것은 Cdc42의 활성화/활성 상실의 형식 전환이 너무 빠르고 이 과정을 직접 요해하는 선택적 소분자 연구공구가 부족하기 때문이다.

Rho GTP효소 가족이 참여한 신호 통로가 세포막의 물질운수, 세포주기의 제어와 세포 골격조직 등 각종 세포의 생물화학적 기능을 제어하여 세포의 형태, 세포의 운동 및 세포의 운명에 관련하여 있다.

최근 연간의 연구에 의하면 많은 질환의 병리적 발생과 진행은 Rho GTP효소가족의 기능 단백질의 비정상 또는 통제불능과 상관되어 있음을 밝히고 있고 많은 약을 개발하는데 중요한 목표로 되었다.

더불어 Rho GTP효소 가족의 소분자 조절제의 활용은 그 중 기능 단백질의 연구도 촉진하였다. 예를 들면 신형 신뇌 혈관의 활성화 약인 마수디와 소분자 화합물인 Y27632는 RhoA하유 효과 신호 분자 Rho/p160^ROCK인 강력 억제제로 공인되었다.

Rac1단백질의 선택적인 억제제로서 최근에 표적 Rac1-GEF 연결된 소분자 화합물인 NSC23766에 대한 연구는 Rac1단백질의 기능에 대한 인식도 많이 촉진되었다.

그러나 Cdc42에 대하여 유효적이고 선택적인 억제제가 거의 없다. 세크라민(Secramine), 천연 물산인 갈란타민과 유사한 것으로서 최근에 RhoGDI1을 통하여 Cdc42에 의한 골지체-세포막 간 물질의 운동을 억제할 수 있다는 것을 인정하였다.

광범위하게 활용하고 있는 Y27632(1903편 관련된 문헌 존재)와 NSC23766(115편 관련된 문헌 존재)과 달리 세크라민(Secramine)은 적고 연구도 아주 적다(9편만 관련된 문헌 존재). Cdc42의 불균형은 많은 병면에서 중양의 진화와 전이를 포함한 중양의 발생과 관련되며 신경원의 발전과 유지도 정상한 Cdc42의 활성에 많이 의뢰한다.

NSC23766은 계산기가 모이한 구조로 선별한 화합물이고 Rac1 분자의 표면구조와 맞으며 Rac1이 GEF에 대한 결합은 극히 중요하다고 인정되었다 (Gao, Y., J. B. Dickerson, et al. (2004). Rational design and characterization of a Rac GTPase-specific small molecule inhibitor. Proc Natl Acad Sci USA. 101(20): 7618-7623). NSC23766은 혈청에서 생장인자가 유도한 Rac1의 활성화와 가자 편상 Rac1의 형성을 억제할 수 있다. NSC23766은 인류 전립선암 세포주에 작용하고 세포의 증식 및 비정지적 생장을 억제할 수 있고 세포의 침입 표현형을 감소하며 이런 중양세포의 표현형은 내생적인 Rac1의 활성에 의뢰한다. 그 외에 새로운 연구에 의하면 NSC23766은 Rac1로 간접 유도한 골수 손상（SCI）이 유발한 신경적 통증을 개선한다고 밝혀졌다（Tan, A. M., S. Stamboulian, et al. (2008). Neuropathic pain memory is maintained by Rac1-regulated dendritic spine remodeling after spinal cord injury. J Neurosci. 28(49): 13173-13183）.

본 발명은 하기 화학식 I로 표현되는 구조를 가진 화합물을 제공하는 데 있다.

<화학식 I>

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 화학식 I의 화합물을 포함하는 Cdc42 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 목적은 하기 화학식Ι의 구조를 가진 화합물을 제공하는데 있다.

<화학식 I>

상기 화학식 I로 표현되는 화합물은 4-(3-(2-(4-브로모-2-클로로페녹시)-아세틸)-티오우레이도)-N-(4,6-디메틸피리미딘-2-일)벤젠술폰아마이드(4-(3-(2-(4-Bromo-2-chlorophenoxy)acetyl)thioureido)-N-(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) benzenesulfonamide)로 칭할 수 있다.

설명의 편의를 위하여 본 명세서에서는 상기 화합물을 ZCL278로 명명하였다.

본 발명이 제공한 ZCL278은 Cdc42가 참여한 전 과정을 억제할 수 있고 Cdc42의 작용을 유효적으로 제어할 수 있다. Cdc42는 세포주기, 운동, 점착, 세포소멸과 세포 내 운수 등에서 모두 중요한 역할을 할 수 있기 때문이다. 더불어 암의 발전과 침입, 심혈관계통과 호흡계통의 질환, 신경계통의 질환, 그리고 기타 질환 중에서 중요한 역할을 할 수 있다.

따라서 본 발명이 제공한 ZCL278은 악성 중양을 치료하는 약을 만드는데 이용할 수 있고 구체적으로 말하면 악성 중양의 발전과 침입을 방지하는데 이용한 약을 만드는 데 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 악성 중양의 발전과 침입을 방지하는데 이용할 수 있는 약을 얻을 수 있다.

상기 화합물은 심혈관 계통 질환을 치료하는 약을 만들어 얻는데 이용할 수 있다.

상기 화합물은 호흡 계통 질환을 치료하는 약을 만들어 얻는데 이용할 수 있다.

상기 화합물은 신경 계통 질환을 치료하는 약을 만들어 얻는데 이용할 수 있다.

그 중에 상기 화합물은 Cdc42 기능을 억제함으로써 상기 역할을 발휘할 수 있다. 즉, Cdc 42 기능을 억제함으로써 상기 치료 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명이 제공한 화합물 ZCL278은 GTP가 Cdc42와 결합하는 활성을 유효적으로 억제할 수 있다. 쥐의 섬유아세포인 스위스 3T3(Swiss 3T3)세포에서 화합물 ZCL278은 Cdc42가 아세포를 조절하여 제어하는데 영향을 미칠 때 주로 세포 미세 척추골 형성의 소멸, GM130이 골지체와 결합한 구조의 파괴, 이 2가지 효과를 나타낼 수 있다.

ZCL278은 Rac의 선택적인 억제제 NSC23766보다 세포핵 변두리에 활성 Cdc42의 축적을 감소할 수 있다. ZCL278은 Cdc42가 간접 유도한 신경원의 갈라지기 및 그의 성장원뿔을 억제하는데 세포의 생존비율을 파괴하지 않는 조건에서 PC-3을 기초로 한 전이적인 전립선 암세포의 세포운동과 그의 이전을 억제할 수 있다. 따라서 ZCL278은 Cdc42가 세포의 형태와 그의 행위학적 조절과 제어를 유효적으로 억제할 수 있고 암의 발전과 침임, 심혈관계통과 호흡계통의 질환, 신경계통 등 질환에서 다 중요한 역할을 할 수 있다.

본 발명의 상기의 목적과 기타 목적, 특징과 이점을 더 잘 이해하기 위하여 다음과 같이 실시 사례와 그림으로 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 화합물은 Cdc42가 참여한 전 과정을 억제할 수 있고 Cdc42의 작용을 유효적으로 제어할 수 있다.

도 1a 내지 도 1c는 ZCL 표적 Cdc42-ITSN(가교단백질) 연결한 구조의 검정에 관한 것이다. 도 1a는 계산기가 모이한 ZCL278이 Cdc42와 결합한 분자 (실제 실험중 천연색 도면 형성)이다. 회색표면(도면의 화살표1)이 단백질, 녹색봉(도면의 화살표2)이 리간드를 표시하였다. 도 1B는 ZCL278과 Cdc42아미노산 리간드의 결합이다. 녹색봉이 ZCL278 분자(도면의 화살표3), 회색(도면의 화살표4)이 Cdc42구조, 오렌지색줄(도면의 화살표5)이 2분자 사이에 형성한 수소결합을 표시하였다. 도 1c는 Cdc42-ZCL278의 복합물이 GMP-PCP 단백질분자(단백질 데이터베이스: 2QRZ)의 구조와 중첩한 것이다. 녹색봉이 ZCL278분자, 회색이 Cdc42구조, 청색봉이 GMP-PCP 구조(GMP-PCP가 GTP의 유사물, β, γ-메틸렌 이린산염 구아닐산)를 표시하였다.
도 2a 내지 도 2c는 ZCL278의 활성특성을 표시한 것이다. 도 2a는 ZCL278이 Cdc42가 간접 유도한 세포 미세 가시(microspike)의 형성을 억제한 것이다. 도 2b는 ZCL278이 내생형 Rac/Cdc42의 활성화를 억제한 것을 표시하였다. 도 2c는 ZCL278이 자극형 Cdc42의 화성화를 억제하는 것을 표시하였다.
도 3a 내지 도 3c는 활성화한 Cdc42/인산화한 RhoA의 면역 형광 염색을 표시하였다.
도 4는 ZCL278이 세포 내 GM130단백질이 골지체와 연결한 조직을 파괴하는 것을 표시하였다.
도 5a 내지 도 5c는 ZCL278이 세포의 전이를 방해하지만 세포의 생존율에 영향하지 않은 것을 표시하였다.
도 6a 내지 도 6c는 ZCL278이 신경원의 갈아나기와 성장원뿔 동력학을 억제한 것을 표시하였다.

<실시사례: Cdc42 억제제의 가상검색>

Cdc42-ITSN 복합물의 3D 구조를 분석하면 2개 분자 사이의 주요한 결합구역을 발견할 수 있다. 즉 상기 결합구역은 ITSN분자에서 Gln1380 잔류기와 Arg1384 잔류기 사이 및 Cdc42에서 Asn39와 Phe37 사이의 수소결합, ITSN분자에서 Leu1376 및 Met1379의 잔류기와 Thr1383의 잔류기 사이, 그리고 Cdc42에 있는 Phe56, Tyr64, Leu67의 잔류기와 Leu70 사이의 2개 수소성 클라스터일 수 있다.

Cdc42 억제제를 선별하기 위하여 Cdc42 분자에 있는 결합주머니가 ITSN 단백질 표면과 Cdc42를 결합한 반경의 거리가 7Å 내인 아미노산 잔류기가 형성한 구조를 추정한다. 그 중에 Cdc42 단백질 분자에서 Thr35, Val36, Asn39, Phe56과 Asp57 등 16개 아미노산 잔류기를 포함하고 있다. 도 1a 내지 도 1c와 같이 표시하였다.

글라이드(Glide)절차로 SPECS 데이터 베이스에서 Cdc42와 ITSN을 연결한 소분자 화합물을 선별한다. Cdc42-ITSN복합물의 결정구조는 단백질 데이터베이스에 내원하고 ID번호가 1KI1이다. Cdc42의 결합점을 점거한 ISTN중의 아미노산 잔류기가 Leu376, Met379, Gln1380, Thr1383, Arg1384이며 이 5개 아미노산 잔류기의 중심까지의 거리가 7Å내인 Cdc42 아미노산 잔류기가 Cdc42의 결합주머니를 형성한다.

단백질 준비 모듈인 Protein Preparation Wizard로 활용하고 모형의 초음 구조를 처리한다. Glide/Receptor Grid Generation 모듈로 분자의 맞추어 연결한다. 리간드 준비모듈인 Ligprep로 Specs 데이터베이스 중 197000개 화합물에 대하여 높은 통과량의 화합물을 가상 선별한다. 다음 기준으로 선별한 100위 내의 화합물을 선택한다. ITSN 모양의 결합상태가 ITSN에 있는 Leu1376, Gln1380, Arg1384, Met1379와 Thr1383 잔류기의 공간구조를 점거할 수 있다. 적어도 3개 수소결합을 형성한다. Cdc42분자 중 보수적인 Asn39 또는 Phe37 잔류기와 수소결합을 형성한다. 분자 골간이 다양하다. 50000위 내의 분자에 대하여 또 기준 정밀도의 계산으로 100위 내인 분자를 선별한 후에 30개 화합물을 선택하고 Cdc42에 대한 활성 및/또는 기능의 영향을 측정한다.

Cdc42 분자에서 ZCL278 경합의 컴퓨터 모방혈식( Computed binding mode of ZCL278 in Cdc42)

도 1a와 같이 ZCL278은 Cdc42 단백질에 결합하고 Thr35, Val36, Asp38, Asn39, Phe56, Tyr64, Leu67과 Leu70 잔류기가 순서대로 주머니 구조를 형성한다. 도 1b와 같이 2개 분자 사이에 에피택셜인 양성적 상호 작용을 발견하였다. Thr35, Asn39와 Asp57 잔류기를 포함한 아미노산 기가 형성한 5개 수소결합과 관련하면서 Val36, Phe56 잔류기와 소수성 작용이 있는 구조를 형성한다. 도 1c와 같이 분자 중의 브롬벤젠은 GDP/GTP의 결합주머니에 삽입한다. 컴퓨터가 모방한 ZCL278과 Cdc42의 결합은 Cdc42-ISTN의 GDP/GTP 전환 상태를 파괴할 수 있다.

< 실시사례2 : 화합물 ZCL278 의 합성>

ZCL278은 다음의 방법으로 합성할 수 있고 이 합성방법은 하나의 예시적인 것이고, 본 발명을 제한하는 것은 아니며, 이 분야의 기술자가 이해한 후에 다른 방법으로 합성도 할 수 있고 그것도 본 발명의 보호범위에 속한다.

반응의 시약과 조건

(a) K₂CO₃, DMF(N, N-디메틸 포름아미드), 70℃;

(b)NaOH,dioxane(이산화이종고리식에탄)/H2O;

(c)SOCl2(디클로술폭시드),DMF,reflux(환류);

(d)NaSCN(티오시안산나트륨),acetone(아세톤), 0℃-rt;

(e)4-아미노-N-(4,6-디메틸피리미딘-2일)벤젠술폰아마이드(4-amino-N-(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl) benzene- sulfonamide),0℃-r.t.

반응의 시약과 조건

반응식은 다음과 같다.

화합물1 (4-브로모-2-클로로페놀)과 2-에틸 브로모아세테이트는 K₂CO₃의 존재하에서 친핵성 치환 반응을 발생하고 화합물2 (2-(4-브로모-2-클로로페녹시)아세테이트)를 얻는다. 화합물2는 알카리성 조건에서 가수 분해하고 화합물3 (2-(4-브로모-2- 클로로페녹시)아세트 산)을 얻는다. 화합물3은 N, N-디메틸 포롬아미드의 촉매작용에 의하여 디클로로술폭시드에서 환류하고 화합물4를 얻는다. 화합물4(2-(4-브로모-2-클로로페녹시)아세틸 클로라이드)는 티오시안산나트륨과 반응하고 에스테르 티오시안산염중간체를 형성하며 계속 반응체계에 4-아미노-N-(4,6-디메틸-2-피리미디닐) 벤젠술폰아마이드를 가입하고 화합물5(즉 본 발명의 ZCL278)를 얻는다.

기구와 시약

Bruker Avance III 400 MHz핵자기공명기;

SGWX-4용해점기;

Agilent 1200형 고성능액체크로마토그래피;

ZORBAX Eclipse XDB-C18크로마토그래피 컬럼(4.6 mm×150 mm, 5μM);

모든 시약은 분석순도 또는 화학순도로 한다.

절차1 : 2-(4- 브로모 -2- 염화벤전산소기 )초산에틸( 화합물2 )의 합성

반응병에 순서대로 화합물1(4-브로모-2-클로로체놀)(5.2g, 25.0 mmol), N,N-디메틸 포름아미드(DMF)(50mL), 2-브롬 초산메틸(4.3, 25.7mmol)과 K₂CO₃　(3.45 g, 25.0 mmol)을 가입하고 70℃에서 교반하며 다음 날에 반응의 혼합체를 150 mL의 물에 가입하고 초산에틸로 추출한다(70 mL×4). 유기상을 합병하고 포화한 소금물(100mL×3)로 세척한 후에 무수 황산나트룸으로 건조하며 려관한 후에 감압하여 용제를 제거하고 컬럼 크로마토그래피 정화한 후에 연한 색의 기름상 물질2(6.18g)를 얻는다. 출산율 또는 수율이 84.1%이었다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 7.53 (s, 1H), 7.30 (d, 1H,　J　= 8.4 Hz), 6.72 (d, 1H,　J　= 8.4 Hz), 4.68 (s, 2H), 4.26 (q, 2H,　J　= 7.2 Hz) and 1.29 (t, 3H,　J　= 7.2 Hz)

절차2 : 2-(4- 브로모 -2-클로로벤젠산소기)초산( 화합물3 )의 합성

반응병에 화합물2(5.0g, 17.0mmol), 디옥산 50 mL와 1M　NaOH (50 mL)을 가입하고 실내온도 하에 교반하며 다음 날에 반응 혼합물을 1M　HCl로 pH=3까지 산성화한다. 산성화한 반응액은 초산에틸(50 mL×4)로 추출하고 유기상을 합병한 후에 포화한 소금물　(50 mL)로 세척하고 무수 황산나트륨으로 건조한다. 건조제를 제거하고 감압 농축한 후에 흰 색 고체물3 (4.69 g)을 얻는다. 출산율 또는 수율이 94.3%이었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 7.66 (s, 1H), 7.44 (d, 1H,　J　= 8.8 Hz), 6.97 (d, 1H,　J　= 8.8 Hz), 4.72 (s, 2H)

절차3 : 4-(3-(2-(4- 브로모 -2-클로로벤젠산소기)아세틸) 티오우레아기 )-N-(4,6-디메틸-2-피리미딘염기) 벤젠술폰아미드 ( 화합물5 )의 합성

반응병에 순서대로 화합물3, 25 mL의 디클로로술폰시드와 한 방울 DMF를 가입하고 이 반은체계가 환류할 때까지 가열한다. 환류한 3시간 후에 상압에서 증류하여 디클로로술폰시드를 제거하며 남어진 액체를 기름 펌프로 가압 건조한 5분 후에 화합물4 (2-(4-브로모-2-쿨로로벤젠산소기)염화아세틸)을 얻는다.

다른 반응병에서 티오시안산 나트륨(326.8mg, 4.0mmol)을 10mL의 아세톤에 용해하고 얼음 육조에서 0℃까지 냉각하며 화합물4는 10mL의 아세톤으로 희석한 후에 한 방울씩으로 상기 반응액에 가입하고 끝난 후에 얼음 육조를 철거하여 기름 육조로 30℃까지 가열한다. 30℃에서 2시간 반응하고 이 반응액을 다시 0℃까지 냉각하고 4-아미노기-N-(4,6-디메틸-2-피리미딘연기)-벤젠 술폰아마이드　(556mg, 2.0mmol)를 가입한 후에 실내 온도 하에 한 밤 교반한다.

반응이 끝나고 여과한 후에 얻은 고체는 물과 아세톤으로 세척하고 황색분말5(276mg)를 얻는다. 수율이 23.6%이었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): 12.19 (s, 1H), 11.68 (s, 1H), 11.52 (br s, 1H), 7.99 (d, 2H,　J　= 8.4 Hz), 7.86 ( d, 2H,　J　= 8.4 Hz), 7.70 (d, 1H,J　= 1.6 Hz), 7.49 (d, 1H,　J　= 8.8 Hz), 7.10 (d, 1H,　J1　= 8.8 Hz,　J2　= 1.6 Hz), 6.75 (s, 1H), 5.02 (s, 2H), 2.25 (s, 6H).　HPLC의 순도가 95.9% (254nm)이다.

< 실시사례3 : ZCL278 활성의 특징>

1.ZCL278은 Cdc42가 간접 유도한 미세 가시의 형성을 억제한다.

혈청을 제거하고 배양한 쥐의 섬유세포 Swiss 3T3으로 30개 화합물이 Cdc42이 간접 유도한 세포의 미세가시(microspike)/사상가족(filopodia)의 형성에 대한 작용을 측정한다. 도 2a와 같이 대조조 세포의 가장자리에서 소수 미세 가시(작은 화살표로 표시)와 특징적인 RhoA로 간접 유도에 의하여 형성한 응력섬유(별표로 표시)를 볼 수 있다.

1단위(unit)/mL의 Cdc42 작용약(cytoskeleton회사의 제품)으로 세포를 잠시 자극하고 미세 가시의 증가와 응력섬유의 감소를 뚜렷하게 볼 수 있다. 상기 작용제로 2분간 작용하고 50μM의 ZCL278로 1시간 동안 세포를 처리하며 단독 작용약으로 ZCL278에 작용한 것보다 미세가시의 형성을 뚜렷하게 억제하였다.

이 결과는 그 화합물이 Cdc42의 억제제로 계속 연구하는데 활용할 수 있다고 밝혔다. 30개 화합물에서 ZCL278은 가장 강한 억제작용을 나타낸다.도 2a가 구체적으로 표시하였다. 도 2a에는 ZCL278이 Cdc42가 간접 유도한 세포 미세가시의 형성을 억제하는 것을 표시하였다. 계산기로 모방하고 선별한 소분자 배합체는 혈청 없이 배양한 Swiss3T3세포에 각별히 작용하였다.

DMSO는 음성 대조로서 1단위/mL의 Cdc42 작용약 (cytoskeleton회사 제품)으로 세포를 잠시(1분간) 자극한다. 작용약이 1분 작용한 후에 50μM ZCL278로 세포를 1시간 처리한다. 같은 조건에서 10μM의 NSC23766인 작용 세포를 참고 대비로 한다.

세포를 고정한 후에 rhodamine- Phalloidin 형광항체로 교잡하며 F-액틴(F-actin)을 표지한다. 세포의 가장자리에서 가장 적은 미세가시(화살표로 표시)를 나타내고 별표가 정상한 응력섬유의 분포를 표시하였다. Bar: 5 μM.

2. ZCL278이 Cdc42의 활성을 억제한다.

Cdc42활성에 관련된 형태학 측정에서 ZCL278의 표현이 가장 좋고 다음 생물화학 수준에서 그의 활성을 측정한다. 먼저 Cdc42 작용약과 ZCL278(50 μM)로 사람 전이성 전립선암 세포 PC3에 각각 5, 10, 15분간 작용하고 세포 용해액에서 추출한 단백질을 웨스턴 블록(Westernblot)하며 그 중의 인산화 Rac/Cdc42(윗 부분), 인산화 WAS 단백질 수즌(중간 부분), GAPDH단백질(아래 부분)을 측정하여 배교한다. 71위 세린 잔류기의 산성화는 RAC/Cdc42단백질의 음성제어이기 때문에 인산화 Rac/Cdc42단백 표현의 증가는 활성 Rac/Cdc42(GTP결합형)의 감소를 표시하였다.

도 2b와 같이 작용약이 작용한 인산화 Rac/Cdc42단백의 표현이 계속 하강하고 50 μM의 ZCL278은 시간에 따라 그 단백의 표현 수중이 계속 높아지고 있다. WASP단백은 Cdc42활성화의 하유 효과기구이고 Arp2/3 복합물의 작용을 통하여 세포골간 액틴(actin)의 재조합, 사상가족의 형성을 유도하고 그 타이로신 인산화는 Cdc42가 활성화한 후에 빨리 사라지는 것과 관련한다. 도 2b가 표시한 바와 같이 작용약이 15분간 작용한 후에 인산화 WASP단백의 표현을 감소하고 같은 시간에 ZCL278이 그 단백의 표현을 억제하지 않았다. 이 결과는 ZCL278이 인산화 Rac/Cdc42단백의 내생수준을 시간에 따라 억제할 수 있고 타이호신 인산화 WASP단백의 수준도 유지할 수 있다.

Rac와 Cdc42단백은 다 71위 세린 잔류기의 인산화를 다 나타날 수 있다. Cdc42의 활성화와 불활성화를 직접 측정하기 위하여 G-LISA시약 세트로 GTP결합형 Cdc42의 수준을 정량적으로 측정한다. 1단위/mL의 Cdc42작용약으로 세포를 1분간 자극한 후에 50 μM의 ZCL278 또는 10 μM의 Rac작용약 NSC23766으로 swiss 3T3세포를 1시간 동안 처리하고 세포 단백견품을 추출하며 G-LISA 시약세트로 GTP결합형 Cdc42의 수준을 측정한다. 아무 처리를 하지 않은 세포가 음성 대조로 하고 작용약으로만 처리한 세포를 양성 대조로 하며 완충용액과 화성화한 Cdc42단백은 각각 음성과 양성 대조로 한다.

그림2c(도면의 숫자는 3번 실험의 평균수이고 ±가 평균차이를 표시하며 **: p<0.01, * p<0.05)가 표시한 바와 같이 음성과 대조하면 작용약의 작용으로 활성화한 Cdc42단백의 수준이 뚜렷하게 증가하고(70%) 양성과 대조하면 ZCL278이 활성화한 Cdc42단백의 수준이 뚜렷하게 강하하였다(80%). NSC23766은 기대하는 것과 같이 Cdc42에 대하여 영향을 미치지 않았다. 이들 수치들은 2가지 종류의 세포에서 ZCL278은 자극형을 억제할 수 있으면서 내생형 Cdc42의 화성도 억제할 수 있다고 설명하였다.

< 실시사례4 : 활성화한 Cdc42 /인산화한 RhoA 의 면역형광 염색>

1. ZCL278, NSC23766 아님, 화성화Cdc42 세포핵 주변 분포의 파괴

면역형광염색: Swiss3T3세포는 커버 글라스에서의 성장밀도가 30%이고 약을 첨가할때 혈청을 제거하며 1단위/mL의 Cdc42작용약 (cytoskeleton회사 제품)을 가입하여 1분간 작용한 후에 50μM의 ZCL278 또는 10μM의 NSC23766으로 각각 1시간 동안 처리한다. 각별 적용약으로 가입하고 양성대조로하고 DMSO를 음성대조로 한다. 4%파라포름알데히드로 세포 커버 글라스에 15분간 공정하고 0.2% Triton X-100로 15분간 투화하고 10% BSA로 37 ℃하에 30분간 밀페한다.

항체 부화: 1항: 활성화Cdc42 (쥐 항체, Neweast Biosciences 회사); 인산화RhoA항체(토끼 항체, Santa Cruze Biotechnology 회사); GM130항체(쥐 항체, BD Biosciences 회사), 1：100로 희석하고 이용한다. 2항에 해당하여 교잡하고 로다민 팔로이단(rhodamine Phalloidin) 온실에서 1시간 부화한 후에 actin을 관찰하는데 이용한다. Zeiss Axiovert 전자현미경으로 세포염색을 관찰한다. 그림처리 소프트 웨어를 이용하여 임의의 5개 세포와 5개 점의 pixel을 선택하고 평균수 계산한 후에 각 조의 평균 화소 강도 수치를 얻는다.

Westernblot: PC3세포를 70%의 밀도로 배양하고 혈청을 제거한 후에 계속 16시간 배양하며 각별로 1단위/mL의 Cdc42작용약 (cytoskeleton 회사 제품)과 5 μM, 50 μM의 ZCL278을 가입하고 5, 10, 15분간 세포를 처리한다. 세포용해 완충액(배합방법: 50mM Tris완충액 PH7.5, 10mM 염화마그네슘, 0.5M 염화나트륨, 1%Triton X-100, 단백질분해효소 억제제)으로 세포를 용해하고 14000 회전속도, 4차원의 원심기로 단백질 견품을 추출한다. 같은 농도의 단백질 견품은 Westernblot분석하고 항체: 인산화 Rac1/Cdc42 (Milipore회사), 인산화WASP (Assay Biotech 회사), 1:1000의 비율로 희석 교잡하며 GAPDH항체 (Calbiochem 회사) 1:2000의 비율로 희석 교잡한다. PVDF막이 화학 발광법으로 현상한다.

G-LISA 시약세트 분석: Swiss3T3세포는 40%의 성장밀도까지 배양하고 혈청을 제거하여 48시간 배양한 후에 Cdc42작용약을 가입하여 1분간 처리하며 50 μM의 ZCL278과 10 μM의 NSC23766우로 각별 처리한다. 시약세트의 설명서에 따라 용해한 세포에서 정량 총 단백 농도가 0.15mg/ml인 단백을 추출하고 분석한다. 아무 처리하지 않은 세포와 완충액이 음성대조로 하고 작용약으로만 처리한 세포와 활성화한 Cdc42단백이 양성 대조로 한다. 효소결합면역흡착측정법으로 각각 견품이 광파 490nm일 경우의 흡광도 수치를 측정한다.

세포수준에서 ZCL278이 Cdc42활성화에 대한 선택작인 억제를 측정한다. 혈청을 제거한 Swiss3T3세포에 1단위/ml의 Cdc42작용약을 가입하고 2분간 작용한 후에 50μM의 ZCL278 또는 10μM의 NSC23766으로 각별 처리하고 DMSO와 음성대조로 한다. ZCL278의 작용이 선택적으로 Cdc42활성을 억제하고 RhoA에 작용하지 않은 것을 측정하기 위하여 세포는 활성화한 Cdc42(도 3a, 도 3b)와 인산화한 RhoA(도 3c)항체를 각별로 면역 교잡한다. 화살표: 세포핵 가장자리에 있는 골지체-세포질 망상구조; Hoechest 염색제 표시한 세포핵. Bar: 15 μm. 그림3a가 표시한 바와 같이 세포 화학 형광염색: 쥐의 GTP항체 결합형 Cdc42항체와 Hoechest (호스트) 염색제 (세포핵 표시).

대조조의 세포는 세포핵 주변에 조직적으로 활성화한 Cdc42를 분포되어 있으며 작용약의 작용에 의하여 그 분포가 훨씬 증가하는 뿐만 아니라 세포핵 안에도 분포되어 있고 Cdc42가 골지체 단백질의 운수 적작에 참여하는 것과 일치한다. ZCL278은 이런 조직적인 분초를 파괴하고 활성화를 저항한 Cdc42항체의 면역 반응성을 강하하였다. 그러나 NSC23766은 이에 대하여 영향을 미치지 않는다.

도 3b는 각조 골지체 모양으로 분포한 세포수를 표시함: 활성화한 Cdc42항체로 식별한 세포핵 주변에 골지체-세포질 망상구조가 조직적으로 분포한 것의 양자화: 임의로 선별한 세포의 6개 각자 독립한 구간을 선택하고 골지체-세포질 망상구조(*:p<0.05)를 계산한다.

도 3c: 인산화한 RhoA신호의 평균 화소 강도치로 정량하고 그 수치를 5개 독립한 세포의 임의 5개 신호의 화소 강도수치의 평균치로 한다. ±는 평균차를 표시하고 *:p<0.03: 작용약, ZCL278, NSC23766은 인산화 RhoA에 대한 영향을 나타나지 않았다. 이 결과는 ZCL278이 선택적으로 Cdc42의 활성을 억제하는 것을 표시하였다.

2. ZCL278, NSC23766 아님, 세포내 GM130단백과 골지체 조직과 연결의 파괴

ZCL278이 세포핵 주변에 활성화한 Cdc42의 분포에 대한 파괴가 골지체 조직에 대해도 작용이 있는 여부를 알기 위하여 한 실험을 설계하고 한 가지 세포질 가장자리에 있는 단백질인 GM130단백이 골지체 막과 긴밀히 연결하여 골지체의 Cis구조를 유지하는 것을 측정한다.

Swiss3T3세포는 혈청을 제거하고 배양하며 Cdc42작용약, ZCL278, NSC23766을 각별로 가입하고 DMSO를 음성대조로 한다. 세포는 Rhodamine-phalloidin(붉은 색), GM130에 저항한 항체 (녹색), Hoechest(남색) 면역형광으로 염색한다.

도 4가 표기한 바와 같이 화살표가 미세가시(실제 실험에서 붉은 형광), 별표가 GM130 항체로 표시한 골지체의 구조(실제 실험에서 녹섹 형광)를 표시한다. Cdc42를 작용약으로 처리한 세포에는 미세가시가 증가하고 GM130이 세포핵의 가장자리에 분포한 것도 많아졌다. ZCL278을 처리한 세포는 미세가시의 감소와 GM130의 감소(ZCL278: 실제 실험에서 붉은 형광을 나타냄)를 나타나면서 세포핵의 양측에 몰아내는 것(도면의 별표가 표시하는 바와 같음, 실제 실험에서 녹색 형광임)을 보였다. NSC23766이 GM130의 표현과 분포에 대하여 뚜렷한 영향이 없다. Bar: 10μm. 이 결과는 ZCL278이 Cdc42에 대한 선택적인 적제작용을 더욱 더 설명하는 것뿐만 아니라 Cdc42가 골지체의 조직과 물질의 운수에서 중요한 역할이 있다는 것을 증명하였다.

< 실시사례5 : 세포 상처 유합실험 : ZCL278 이 세포 상처의 유합을 방해하지만 세포의 생존율에 영향을 미치지 않다.>

사상가족은 세포의 운동구조이고 세포 이동의 유도와 성장 경로의 선도이며 주로 Cdc42의 활성으로 제어한다. PC3세포 단분자층에 6오리피스 판이 온통 생기고 있고 혈청을 제거하여 배양하며 1ml인 창으로 매개 구멍에 각별로 3개 상처유합구역을 만들고 무혈청 배양기에서 벗겨진 세포를 씻는다. 1단위/mL Cdc42작용약, 50μM, 5μM의 ZCL278과 10μM의 NSC23766으로 세포를 24시간동안 처리한다.

Cdc42 작용약을 양성대조로 하고, 아무 처리하지 않은 것을 음성대조로 한다. 약이 작용한 0시와 24시 때 각 별로 세포를 촬영하고 MetaMorph 도형소프트웨어로 세포이동의 거리를 분석한다. 검은 줄은 상처유합구역의 경계선을 표시한다. 매번 실험결과는 가상 p수치 검사 분석(p>0.05)을 한다.

세포 생존율의 측정: 75000/ml인 세포민도로 심고 PC3 세포를 48 시간동안 배양하며 혈청을 제거하고 50μM의 ZCL278 또는 10μM의 NSC23766과 같이 계속 24 시간동안 배양한 후에 태반 생체염료로 세포의 생존율을 계산한다.

도 5a와 도 5b(상처유합규역 경계선 사이의 가장 짧은 거리로 구역 너비를 정량하며 주상도가 초음 상처유합구역과 대비한 비율을 표시하고 3번 독립 실험에서 평균 수치를 선택하여 ±가 평균 차이를 표시함. **: p<0.01, *: p<0.05)가 표시하는 바와 같이 음성 대조조(41%의 유합비율)와 대비하면 적용약이 세포 상처의 유합 능력(59%)을 현저히 강해지며 ZCL278이 2가지 농도조건에서 세포의 이동을 다 억제할 수 있고 높은 농도에 효과가 더 강하다(50μM-8%; 5μM-30%)고 나타낸다.

NSC23766도 세포의 이동을 억제하는 효과(세포운동의 구조의 형성과 같이 Rac단백이 세포의 편상 가족을 제어하는 것)가 뚜렷하게 나타낸다.

이 결과는 생물화학 측정한 수치와 일치하고 ZCL278이 Cdc42의 억제제뿐만 아니라 Cdc42에 의뢰한 세포운동을 효과적으로 억제할 수 있다. ZCL278로 세포의 이동을 억제하는 것은 Cdc42의 활성을 억제하는 작용에서 발원하고 세포의 사망이 초래하는 것이 아니라고 설명하기 위하여 태반 푸른 스테이닝 방법으로 세포의 생존율을 측정한다. PC3세포는 G0기간에 지체하고 50μM의 ZCL278과 10μM의 NSC23766으로 24시간동안 세포를 처리하며 도 5c (PC3세포를 75000/ml의 세포밀도로 심어 48시간동안 배양하고 혈청을 제거한 후에 50μM의 ZCL278 또는 10μM의 NSC23766으로 계속 48시간동안 배양하며 태반 생색염료로 세포의 샌존율을 계산함)가 표시하는 바와 같이 음성 대조조와 대비하고 약이 처리한 세포의 생존율과 차이가 없다.

따라서 약이 세포의 성장에 영향을 미치지 않고 Cdc42 또는 Rac단백의 활성을 적제하며 세포의 이전작용을 초래하는 것을 인정할 수 있다.

< 실시사례6 : ZCL278 이 신경원의 갈아나기와 성장원뿔 동력학을 억제한다.>

Cdc42가 신경돌기의 갈아나기와 성장을 조절하여 제어한다. Garvalor 등은 Cdc42유전자의 제거기술을 통하여 Cdc42가 신경원 형태의 발생에 대하여 관건적인 역할이 있고 신경원의 운명을 결정하며 수집한 신경원중 Cdc42의 결손이 신경돌기 수량의 감소를 초래하고 사상가족의 기능을 엄중하게 파괴하는 것을 증명하였다. 따라서 ZCL278이 신경원의 갈아나기를 억제한 작용을 측정한다.

초대 배양한 1일짜리 쥐의 대뇌조직을 추출하고 0.25%의 췌효소를 함유한 HBSS완충액에서 37 ℃조건에 15분간 배양한 후에 신경원 세포를 Poly-L-lysine로 싼 세포 커버글라스에 세심하게 분리하고 소태아혈청을 함유한 DMEM배양액으로 16시간동안 배양한 후에 Neurobasal 배양액 (Invitrogen회사)으로 계속 배양한다.

배양한 5 일째 날에 DMSO 또는 50μM의 ZCL278로 세포에 각별히 5, 10분간 작용하고 4%의 파라포름알테히드로 세포를 15분간 고정시키며 형광 항체 Fluorescein-phalloidin으로 교잡하고 F-actin 구조를 표지하며 Zeiss현미경에서 신경원의 형태를 관찰한다.

ZCL27이 신경원 성장원뿔 동력학에 대한 작용을 관찰하기 위하여 현미경 하의 시간축소촬영기술을 활용하여 Hamamatsu Orca 디지탈 카메라로 10분 내에 63배로 확대한 세포의 영상을 기록하고 300 미리초의 노출촬영으로 세포에 대한 광독성을 최대한으로 낮추며 MetaMorph소프트웨어로 영상과 통계를 분석한다.

초대 배양한 신생 중추의 신경원은 도 6a이 표시한 바와 같이 배양한 5 일째 날에 신경원이 일정한 갈아나기를 자라난 것을 볼 수 있고 50μM의 ZCL278으로 각별히 5, 10분간 신경을 처리하며 DMSO를 음성대조로 대조한다.

시간에 따라 ZCL278이 신경원의 갈아나기를 억제하고 정량분석에 의하면 약이 처리한 후에 신경원의 갈아나기를 뚜렷하게 감소한다는 것을 나타낸다.(그림6b: 정량한 ZCL278이 처리한 후 신경원의 갈아나기 수량:3번 독립한 실험의 평균수치를 택함. ±가 평균차이를 표신한다.*: p<0.01)

Cdc42가 성장원뿔의 유도한 쪽에 미세가시와 사상가족의 형성을 조절하여 제어할 수 있다는 것을 공인하였다. 시간 단축 촬영한 영상(도 6c)은 대조조 신경원 세포가 성장원뿔에서 많은 미세가시 또는 사상가족이 자라난 것을 표현하지만 ZCL278이 4분 내에 사상가족의 쾌속 회수를 야기한다. Bar: 1μm.

따라서 ZCL278이 Cdc42가 간접 유도한 신경원의 갈아나기와 성장원뿔 동력학을 효과있게 조절하여 제어한 소분자 억제제어는 것을 진일보 설명하였다.

본 발명은 대용량계산 모방하는 방법으로 Cdc42분자구조를 삽입한 GEFs의 관건적인 구조를 가진 화합물을 선별한다. Cdc42가 특이성 GEF분자 intersectin(ITSN)의 구조특징을 기초로 하고 화합물의 3D구조는 intersectin분자와 연결한 주머니를 마침 매운 것을 계속 관련된 연구를 한다. 이리하여 세포투과성을 가진 Cdc42 특이성 억제제인 화합물ZCL278을 성공적으로 선별한다.

본 발명은 ZCL278의 활성특성을 증명하고 초음의 소분자 Cdc42 억제제로서선택적이고 표적적으로 Cdc42와 그의 GEF연결에 작용한다. 세포 상처유합 실험을 활용하고 Cdc42를 활성화한 후에 유합규역의 합치를 추진한 것을 볼 수 있어서 Cdc42를 활성화한 후에 중양세포의 이전을 추진한다고 증명하였다.

ZCL278은 PC3세포의 이전을 현저히 억제하고 농도에 대한 의뢰성을 가진다. 그리고 ZCL278은 세포의 독성물질이 아니고 중양세포의 사망으로 세포의 이전효과를 야기하는 것도 아니다.

본 발명에서 신생중추신경원의 실험으로 Cdc42가 신경원의 발전에서 중요한 역할도 있다는 것을 증명하였다. Garalov등의 실험은 Cdc42가 부족한 쥐의 대뇌와 신경원의 발전을 엄중히 파괴된 것을 밝히고 이런 죄가 축색돌기 빛줄기의 감소, 신경원 사상가족 동력학의 강하, 성장원뿔의 커짐, 축색돌기 발생의 억제 등을 포함한 일련의 대뇌 기형을 나타낸다. 사실상 축색돌기와 수상돌기의 운동은 주로 액틱(actin)을 기초로 하고 이 진도가 Cdc42로 조절하여 제어한다.

ZCL278은 신생 중추신경원의 갈아나는 수량을 감소하면서 성장원뿔의 동력학을 억제할 수 있다. 이상을 종합하여 ZCL278은 초음으로 Cdc42-ITSN연결을 표적으로 한 소분자 억제제이고 중양과 신경질환중 Cdc42분자기능 연구에 효과있게 활용할 수 있다고 한다.

본 발명은 상기와 같이 좋은 실시사례로 밝히지만 본 발명에 한하여 활용하기뿐만 아니라 속한 분야의 기술자가 본 발명의 정신과 범위에서 벗어나지 않을 경우에 조금 변경하거나 개선할 수 있기 때문에 본 발명의 보호범위는 특허청구범위에서 계정한 것을 기준으로 해야 한다.

Claims

하기 화학식 I로 표현되는 화합물.
<화학식 I>
제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 악성 중양 치료용 약제를 제조하는데 이용되는 화합물.
제 2 항에 있어서,
상기 악성 중양 치료용 약제는 악성 중양의 발전과 침입을 방지하는 화합물.
제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 심혈관 계통 질환 치료용 약제를 제조하는데 이용되는 화합물.
제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 호흡 계통 질환 치료용 약제를 제조하는데 이용되는 화합물.
제 1 항에 있어서,
상기 화합물은 신경 계통 질환 치료용 약제를 제조하는데 이용되는 화합물.
제 2 항 내지 제 7 항 중 어느 하나에 있어서,
상기 화합물은 Cdc42의 기능을 억제하는 화합물.
하기 화학식 I로 표현되는 화합물을 포함하는 Cdc42 억제제.
<화학식 I>