JP5954883B2 - 真核生物細胞での遺伝毒性物質のハイスループットスクリーニングのためのｉｎｖｉｔｒｏ方法 - Google Patents

真核生物細胞での遺伝毒性物質のハイスループットスクリーニングのためのｉｎｖｉｔｒｏ方法 Download PDF

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Description

本発明は、一般には分子生物学および毒物学の分野、詳細には、DNA傷害の検出のための多成分リポーター系を有する分子操作細胞系に関する。本発明は、創薬分野にも直接関連し、標的外の遺伝毒性作用を有する潜在的薬剤のためのフィルターとして役立つ。
遺伝毒性は、DNAとの化学的相互作用を通して直接に、または細胞の構造的もしくは酵素的機構に対する干渉を通して間接に引き起こされる、その細胞によって運ばれる遺伝情報の遺伝性欠陥につながる可能性を有する細胞DNAの完全性への何らかの傷害と一般に定義される。遺伝毒性またはDNA傷害は、紫外線、X線、遊離基、メチル化剤および他の突然変異誘発物質などの様々な因子によって引き起こされ得る。これらのDNA傷害物質は、遺伝毒性物質として知られる。微生物では、そのような突然変異は、微生物の新しい望ましくない株の発生につながることがある。例えば、抗生物質または除草剤に耐性の菌が現れることがある。動物では、これらの突然変異は発癌につながるか、生殖体に傷害を及ぼして子孫の先天性欠損を発生させることがある。
したがって、これらのDNA傷害物質は、DNAを含むヌクレオチドを化学的に改変し、さらに、ヌクレオチドを連結するホスホジエステル結合を切断するか、塩基間(T-AまたはC-G)の結合を破壊することもできる。これらのDNA傷害物質の作用に対抗するために、細胞はいくつかの機構を発展させた。例えば、大腸菌(E. coli)でのSOS応答はDNA傷害によって誘導される非常に特徴的な細胞性応答であり、そこでは、損傷を受けたDNAを修復するDNA修復酵素を含む一連のタンパク質が発現される。同様に、真核生物の細胞は、DNA修復を可能にするために、ヌクレオチド除去修復、塩基除去修復、非相同的末端接続、相同組換えおよび細胞周期停止などの機構を示す。
したがって、どの物質がDNA傷害を引き起こしまたは強化するのか確認することが重要である。例えば、これらの物質を検出する方法は、対象の化合物がDNA傷害を誘導するかどうか評価するために、候補の医薬、食品添加物または化粧品である化合物をスクリーニングするための突然変異誘発アッセイとして用いることができる。あるいは、DNA傷害物質を検出する方法は、突然変異誘発物質を含有する汚染物質による給水の汚染をモニターするために用いることができる。
規制毒性試験のために用いられる遺伝毒性アッセイの大半は、1970年代に開発された。それらのスループットは、現在の創薬必要条件の要求を満たすことができなかった(Krishnaら、1998年)。大部分の場合、試験下で化合物によって遺伝毒性が生成される部位および機構は未知である。試験系での標的部位が新たな化学的実体の毒作用の同じ標的部位ではないということが起こり得る。
現在、遺伝毒性を検出するために様々なin vitroおよびin vivoアッセイがある。in vitroアッセイには、エームス試験、in vitro小核試験、in vitro染色体異常試験、コメットアッセイおよびマウスリンパ腫アッセイが含まれる。in vivoアッセイは、薬剤に曝露させたときの動物モデルでの腫瘍塊のサイズの測定を含む。全てのこれらの前述のアッセイは、数日から数週の間試料をインキュベートすることを要するが、より短い時間枠で遺伝毒性データを得ることがしばしば望ましい。「エームス試験」などのアッセイは、持続するDNA傷害をエンドポイントとみなす(突然変異を起こしたDNAまたは断片化DNAの形の未修復の傷害)。しかし、そのような状態は、修復機構が消耗する激しい場合だけで起こる。ほとんどの場合、DNA傷害はそのようなエンドポイントを測定できる前に修復される。したがって、そのようなアッセイは時間がかかり、比較的感度が低い。さらに、予備的スクリーニングのためでさえ動物を関与させることは、遺伝毒性実体を除去する新規ツールを設計し実行することが即座に要求されることの正当な理由である。
遺伝毒性化合物をスクリーニングするために、umu試験およびSOSクロモテストなどの一部の短期方法も利用できる。umu試験およびSOSクロモテストでは、試験する試料の存在下で宿主微生物が培養され、その後宿主微生物が破壊される。これらの試験は、エームス試験の長時間帯の問題を克服する。しかし、それら独自の欠点を有する。感度が低く、特に、ニトロアレーンおよび多環式芳香族炭化水素の検出感度が低い。さらに、この検出方法は、多数の作用および様々な試薬の添加を必要とし、それによってその方法を複雑で高価にする。いかなる誘導の検出を実行するためにも細胞を破壊しなければならないという事実のために、細胞で1つの測定を実行することが可能なであるにすぎない。
遺伝毒性物質への細胞の曝露は、いくつかの傷害応答遺伝子の調節をもたらす。したがって、細胞で早期の遺伝毒性応答を検出するアッセイを開発するために、DNA傷害の後のそのような遺伝子の発現の変化を用いることができる。p53シグナル伝達経路の活性化は、遺伝毒性ストレスによって誘発される非常に特徴的な事象の1つである。がん抑制遺伝子p53は、DNA傷害への早期応答としてのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤p21WAF1/Cip1遺伝子プロモーターの活性化を通して細胞周期停止を誘導することによってゲノム安定性を維持する。p53は、複数であるがおそらく互いに関係する機構によってp21WAF1/Cip1およびGADDなどのその標的遺伝子の発現を活性化することが示唆されている。
遺伝毒性物質による哺乳動物細胞の処理は、いくつかの「傷害応答」遺伝子のmRNAレベルの増加を引き起こす(HolbrookおよびFornaceによってレビューされている)。これらの遺伝子の多くは、ホルボールエステル処理によっても誘導可能である。ホルボールエステル処理に応答しないものの中のいくつかは、WAF1およびGADD45などのがん抑制遺伝子p53によって活性化することができる。しかし、DNA傷害によって誘導可能な、活性化シグナルが知られていないいくつかの遺伝子もあり、GADD153はこれらの遺伝子の1つである。細胞損傷の後のGADD153 mRNAの増加の大きさは、他のほとんどの「傷害応答」遺伝子より大きいので、GADD153は特に興味深い。
GADD153は、当初W処理対増殖チャイニーズハムスター卵巣細胞の減算ハイブリダイゼーションによってクローニングされた。GADD153遺伝子は、熱ショックまたはホルボールエステル処理でなく、UV照射および他の形のDNA傷害によって誘導されたサブセットの遺伝子の1つであった。この遺伝子サブセットは、DNAに傷害を及ぼすか細胞周期停止を誘導するいくつかの物質によって統合的に調節されることが見出された。GADD153は、哺乳動物の種で高度に保存される。ハムスターGADD153は、ヒトエクソン(Parkら、1992年)と78%およびマウスエクソン(RonおよびHabener、1992年)と>85%のヌクレオチド配列同一性を共有する。Gadd153は、突然変異体のp53またはp53の不在によって、細胞内でDNA傷害物質によって誘導され、誘導はp53のwt細胞でより大きい(HollanderおよびFornace、1995年)。哺乳動物細胞で過剰発現されるハムスターGADD153遺伝子プロモーターは、MMSおよびTPAで処理したときにより優れた相対的誘導倍率を示すことがこれまでに示されている(Luethyら、1990年)。
米国特許第6,344,324号は、GFP(緑色蛍光性タンパク質)をコードするDNA配列に連結している、広範囲の細胞性ストレス条件に応じて遺伝子発現を活性化するハムスターGADD153上流プロモーター領域の調節エレメントを含む組換えDNA分子を開示している。このリポーター系は、ヒト頭頸部扁平上皮がん細胞系で実行される。しかし、このリポーター系に関する問題は、10%未満の細胞生存率をもたらす試験物質濃度での4日の処理期間と、それに続くフローサイトメトリーによる蛍光分析を、少なくとも必要とすることである。さらに、この毒性レベルの物質で試験したときの任意の遺伝子誘導の生物学的関連性は論争中である。さらに、この開発は、DNA傷害を引き起こすか強化することができる物質の存在を特異的にモニターする手段を開示しておらず、GADD153誘導の機構は不明なままである。したがって、この系は、ヒトDNA傷害バイオセンサーとしての利用が非常に限られている。
別の特許国際公開第O2010/112821号は、ヒトGADD45a遺伝子プロモーターおよびヒトGADD45α遺伝子調節エレメントに作動可能に連結しているGaussiaルシフェラーゼ(GLuc)リポータータンパク質をコードするDNA配列を開示している。これは、ゲノム傷害に応じるGaussiaルシフェラーゼ(GLuc)リポータータンパク質をコードするDNA配列の発現を活性化するように設計されている。この系の利点は、GLucが分泌性であり、アッセイの間に細胞の溶解を必要としないことである。リポーターアッセイとして発光を用いる利点は、蛍光ベースのアッセイで必要とされるような、入射光の必要性がないことである。したがって、GFPリポータータンパク質からのシグナルをさもなければ覆い隠す、望ましくない蛍光を避けることができる。したがって、発光の使用は、着色したおよび蛍光性の試験化合物のスクリーニングを可能にする。上述のアッセイは、特定のDNA傷害応答経路を誘発する試験化合物を同定することが可能なスクリーニングであることに限定される。
米国特許第6,344,324号 国際公開第2010/112821号
上記の理由で、化学発光アッセイに付随する単純さを保持することによって、真核の哺乳動物細胞で広範囲の遺伝毒性物質を検出することができるハイスループットin vitroアッセイが求められている。本発明は、単一の細胞で3つの遺伝毒性早期応答遺伝子プロモーターを使用するものであり、そのことは今日利用できる他のアッセイと比較して本発明をより高感度で効率的にする。
本発明は、多様な遺伝毒性ストレスシグナル伝達事象を検出するための、複数の型のDNA傷害応答遺伝子プロモーターの利用を開示する。これらの遺伝子プロモーターは、哺乳動物細胞系で安定して発現され、遺伝子を異所的に送達するためにレンチウイルス系を使用する。レンチウイルスをベースとした安定した細胞系の生成は、遺伝子送達の優れた効率を、宿主ゲノムへの遺伝子の安定した組込みに組み合わせたものである。
第1の態様により、本発明は、遺伝子プロモーターに作動可能に連結するリポータータンパク質をコードするDNA配列を含む3つの発現カセットを提供する。第1の発現カセットは、ヒトp21遺伝子プロモーターに作動可能に連結するリポータータンパク質として、レニラルシフェラーゼ(RLuc)およびその誘導体をコードするDNA配列を含む。第2の発現カセットは、ハムスターGADD153遺伝子プロモーターに作動可能に連結するリポータータンパク質として、ヒト化ホタルルシフェラーゼ(hFLuc)およびその誘導体をコードするDNA配列を含む。第3の発現カセットは、プロモーターとしてp53応答エレメントおよびポリオーマウイルスUTRに作動可能に連結するリポータータンパク質として、βガラクトシダーゼ(Bgal)およびその誘導体をコードするDNA配列を含む。この系は、ゲノム傷害に応じるリポータータンパク質をコードするDNA配列の発現を活性化するように配置されている。
第2の態様により、本発明は、発現カセットを含む組換え体ベクターを提供する。
第3の態様により、本発明は、本発明の第2の態様による組換え体ベクターを組み込むための、安定した細胞系の生成方法を提供する。
第4の態様により、本発明は、DNA傷害を引き起こすか強化する遺伝毒性物質の存在を検出する方法であって、細胞系を遺伝毒性物質にさらすステップ、および細胞からの発光リポータータンパク質の発現をモニターするステップを含む方法を提供する。第4の態様による遺伝毒性化合物のスクリーニング方法は、遺伝毒性について物質を試験することを必要とする医薬品工業または他の領域のために、化合物の規制前スクリーニングを提供するために用いることができる、新規の費用効果がよい、ハイスループットの迅速遺伝毒性アッセイである。さらに、その添加は原遺伝毒性物質または代謝活性のある遺伝毒性化合物を判定する感度を増加させるので、肝ミクロソームまたはS9分画の存在下で遺伝毒性化合物のスクリーニングを実行することもできる。本発明は、既存のin vitroおよびin vivoの哺乳動物の遺伝毒性アッセイよりも化合物消費が少なく、かつ広範囲の遺伝毒性物質に感受性である、ハイスループットアッセイについて記載する。
図1は、本発明の好ましい実施形態による、RLucおよびhFLucを含むPromegaからのベクターpsiCHECK 2の制限地図を表す。 図2は、本発明の好ましい実施形態による、ベクターpCDH puro-RLucの制限地図を表す。 図3は、本発明の好ましい実施形態による、ベクターpCDH puro-hFLucの制限地図を表す。 図4は、本発明の好ましい実施形態による、ベクターpCDH CMV-MCS-PGK-hygroの制限地図を表す。 図5は、本発明の好ましい実施形態による、ベクターpCDH puro-p21-RLucの制限地図を表す。 図6は、本発明の好ましい実施形態による、ベクターpCDH puro-GADD153-hFLucの制限地図を表す。 図7は、本発明の好ましい実施形態による、ベクターpCDH-hygro-p53の制限地図を表す。 図8は、本発明の好ましい実施形態による、ベクターpCDH hygro-p53-Bgalの制限地図を表す。 図9は、本発明の好ましい実施形態により、異なる濃度のメチルメタンスルホネート(直接作用の遺伝毒性物質)で処理したHCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal細胞のリポーター誘導および細胞生存率を表す。 図10Aは、本発明の好ましい実施形態により、異なる濃度のシクロホスファミド(原遺伝毒性物質)で処理したHCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal細胞のリポーター誘導および細胞生存率を表す。 図10Bは、本発明の好ましい実施形態による、S9分画で前処理し異なる濃度のシクロホスファミドで処理したHCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal細胞のリポーター誘導および細胞生存率を表す。
表1は、本発明の好ましい実施形態により、Genotoxアッセイを用いてスクリーニングした化合物を掲載する。
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明が所属する分野の当業者によって通常理解される意味を有する。当業者は、本発明の実施で用いることができるであろう、本明細書に記載されるものに類似または均等の多くの方法および物質を認識するであろう。実際、本発明は、記載される方法および物質にいかなる場合も限定されない。明暸性のために、本明細書では以下の定義が用いられる。
用語「作動可能に連結する」は、DNA傷害に応じてプロモーターがそれぞれのリポータータンパク質の発現を誘導することができることを意味する。
「ゲノム傷害」は、ヒストン脱アセチル阻害剤を含むDNAの構造成分(例えばヒストン)に影響を及ぼす物質、核および細胞分裂の機構(例えばスピンドル形成)、またはトポイソメラーゼおよびポリメラーゼおよびDNA修復系などのゲノム維持系、ヌクレオチドの任意の化学的改変、ヌクレオチドの任意の挿入/欠失/置換、染色体数の変化ならびにDNA合成に起因するDNA傷害を指す。
「リポータータンパク質」は、細胞内で発現されると、蛍光性またはリン光性のシグナルなどの検出可能な標識、アッセイで検出可能な酵素活性、または特殊染色、抗体もしくはレクチンによって細胞の上もしくは中で検出可能な抗原を細胞に提示させる、任意の核酸配列を指す。
用語「レニラルシフェラーゼ(RLuc)リポータータンパク質およびその誘導体」には、発現されるとルシフェラーゼアッセイによって検出可能である、レニラ・レニフォルミス(Renilla reniformis)、すなわちウミシイタケに由来するタンパク質が含まれる。RLucの誘導体には、発光活性を保持する、RLucのポリペプチド類似体またはポリペプチド断片をコードするDNA配列が含まれる。RLucタンパク質をコードする核酸配列はいくつかの異なる会社から市販され、例えば、PromegaからPsiCHECK2が市販されている。そのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えばGenBank受託番号M63501.1など、いくつかの異なる供給源から得ることができる。
用語「ホタルルシフェラーゼ(FLuc)リポータータンパク質およびその誘導体」には、発現されるとルシフェラーゼアッセイによって検出可能である、フォチヌス・ピラリス(Photinus pyralis)、すなわち北米産ホタルに由来するタンパク質が含まれる。FLucの誘導体には、発光活性を保持する、FLucのポリペプチド類似体またはポリペプチド断片をコードするDNA配列が含まれる。FLucタンパク質をコードする核酸配列はいくつかの異なる会社から市販され、例えば、PromegaからPsiCHECK2が市販されている。そのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えばGenBank受託番号M15077.1など、いくつかの異なる供給源から得ることができる。
用語「βガラクトシダーゼ(Bgal)リポータータンパク質およびその誘導体」には、単糖へのβガラクトシドの加水分解を触媒するヒドロラーゼ酵素が含まれる。Bgalタンパク質をコードする核酸配列は、いくつかの異なる会社から市販されている。そのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、例えばGenBank受託番号AF105229.1など、いくつかの異なる供給源から得ることができる。
本発明は、同じ細胞での複数の遺伝毒性早期応答遺伝子プロモーターの利用を提供し、そのことは他の従来の遺伝毒性アッセイと比較して本発明をより高感度で効率的にする。我々のアッセイで用いられる試験化合物は、発光性が非常に弱く、したがってより少ない対照反応しか必要とせず、そのことはより多くの試験化合物を並行して分析することができることを意味する。384ウェルマイクロタイタープレートを用いて生物発光アッセイを実施することができるが、これらの384ウェルマイクロタイタープレートは類似した蛍光ベースのリポーターアッセイのために用いることができない。用いると、それは減じられた容量のアッセイ液しか含有せず、そのことは、細胞数の減少、したがって劣っている「信号対雑音」比を意味する。「信号対雑音」比が低いほど、試験系の感度は低い。したがって、生物発光ベースの遺伝毒性アッセイは、蛍光ベースのアッセイより高いスループットのスクリーニング系でより容易に用いることができる。
生物発光は、エネルギーが化学反応によって発光という形で放出される、化学発光の天然に存在する形である。それは、生体による光の生成および放散である。別々の進化の歴史を通して誘導された、生物発光の多くの異なる種類がある。これらの種類は、それらの化学的特性によって広く多岐にわたるが、それらは全て類似した化学反応、すなわちジオキセタン構造の形成および破壊を経る。これらの種類は、酵素ルシフェラーゼと発光基質ルシフェリンとの相互作用に全て基づく。ルシフェリンは酸素と反応して光を形成する。ルシフェラーゼは反応速度を上げる触媒として作用し、それはカルシウムイオンまたはATPなどのコファクターによって時に媒介される。ルシフェラーゼ遺伝子は、細菌、甲虫(例えば、ホタルおよびコメツキムシ)、ウミシイタケ属(Renilla)、オワンクラゲ属(Aequorea)、ウミホタル属(Vargula)およびゴニオウラクス属(Gonyaulax)および甲殻類を含む、非常に広い範囲の異なる生物体からクローニングされている。レニラルシフェラーゼ(RLuc)、ホタルルシフェラーゼ(FLuc)などの生物発光アッセイで利用できる、多くの異なるルシフェラーゼ酵素が現在存在する。ホタルルシフェラーゼ(FLuc)は、最も一般に用いられる生物発光リポータータンパク質である。
発光化学反応では、光はルシフェリン(色素)の酸化によって生成される。例えば、レニラルシフェラーゼ(RLuc)リポータータンパク質は、セレンテラジンの酸化を以下の発光反応:
セレンテラジン+O2→セレンテラミド+CO2+光の光子
で触媒し、放散測定が可能な発光をもたらす。
加えて、ホタルルシフェラーゼ(FLuc)リポータータンパク質は、光を生成する化学反応でルシフェリンの酸化を触媒する。以下の反応:
ルシフェリン+ATP+O2→オキシルシフェリン+AMP+光
ではコファクターとしてマグネシウムが必要とされ、放散測定が可能な発光をもたらす。
βガラクトシダーゼリポーター遺伝子活性は、Galacton-starなどの化学発光基質を用いて測定することができる。βガラクトシダーゼは基質からガラクトシド部分を切断し、同時に起こる光の放散でさらに分解する中間体が生成される。この光放散は、Galacton-Star加水分解およびβガラクトシダーゼ活性の定量測定を提供する。βガラクトシダーゼリポーター遺伝子活性は、o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシドなどの基質を用いて、420nmでの吸光度によって測定することもできる。βガラクトシダーゼがONPGを切断するとき、o-ニトロフェノールが放出される。この化合物は黄色を呈し、420nm光を吸収する。βガラクトシダーゼ活性を測定するために、1分あたりの黄色(420nm吸光度を増加させる)の蓄積がモニターされる。
RLucは光の高い量子収率を生成してATPを必要としないが、FLucはATPを必要とし、これらのリポータータンパク質の両方ともが、市販されているルミノメーターによって検出可能である。RLucおよびFLucは2つの異なる基質を使用し、それらの光放散は異なる時間動力学に従うので、それらは任意の二重リポーター系で理想的な組である。RLucおよびFLucリポータータンパク質をコードするDNA分子は、ゲノム傷害を引き起こすか強化する物質を検出するために用いることができる。
「ヒト化」レニラルシフェラーゼ(hRLuc)リポータータンパク質またはヒト化ホタルルシフェラーゼ(hFLuc)をコードする核酸配列が、ヒト細胞系での発現のために最適化される。それを得るためにいくつかの供給源がある。例えば:クローニングベクターpGL3-プロモーター(GenBank受託番号U47298)、またはPromega製の、構築物pRL-TK、hFLuc(1650塩基対)またはhRLuc(933塩基対)cDNAを含有するpHGCX構築物、両コドンは哺乳動物細胞での発現のために最適化されている(Promega、Madison、WI、USA)。
さらに、本発明の第1の態様によるプロモーター-リポーター系を含む発現カセットが、細胞系でのリポータータンパク質の安定した発現のためのレンチウイルス系を通して送達される。均質の細胞集団を得るために、安定した単細胞クローンが生成される。さらに、これらの細胞は試験物質または化合物にさらすことができ、細胞でのリポータータンパク質の発現は試験物質がゲノム傷害を引き起こすかどうかを示す。
したがって、本発明は、本発明の第1の態様に従ってカセットを作り、次に本発明の第4の態様による遺伝毒性試験でさらに用いるために、3つのリポータータンパク質、RLuc、FLucおよびBgalに作動可能に連結する、ヒトp21、ハムスターGADD153およびポリオーマウイルス非翻訳領域(UTR)遺伝子プロモーターを有するヒトp53応答エレメント(p53RE)をコードする3つのDNAの使用を記載する。
好ましくは、ヒトp21遺伝子プロモーターおよび/またはハムスターGADD153遺伝子プロモーターおよび/またはp53応答エレメント配列は、DNA分子に結合してリポータータンパク質、Rlucおよび/またはFLucおよび/またはBgalをコードするDNAの転写を開始するようにRNAポリメラーゼを誘導する。ヒトp21のプロモーター配列は、図5に例示されるpCDH-puro-p21-RLucプラスミドから得ることができ、ハムスターGADD153は、図6に例示されるpCDH-puro-GADD153-hFLucプラスミドから得られ、ヒトp53は、図8に例示されるpCDH-hygro-p53-Bgalプラスミドから得られる。ヒトp21遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列は、配列リストの配列番号2のヌクレオチド1961から4456で示され、ハムスターGADD153遺伝子プロモーターのそれは、配列番号3の1961から2741で示され、ポリオーマUTRを有するp53応答エレメントのそれは、配列番号7の1932から2380で示される。プロモーターは上記の塩基の各々を含むことができるか、代わりにその機能的誘導体または機能的断片であってもよい。機能的誘導体および機能的断片は、トランスクリプターゼが推定上のプロモーター領域に結合し、その後マーカータンパク質の転写をもたらすかどうか評価することによって、容易に同定することができる。あるいは、そのような機能的誘導体および断片は、前述のプロモーターで突然変異誘発試験を実行することによって検査することができる。
したがって、本発明の第1の態様による好ましい発現カセットは、レニラルシフェラーゼ(RLuc)リポータータンパク質をコードするDNA配列に作動可能に連結するヒトp21遺伝子プロモーター、ホタルルシフェラーゼ(FLuc)をコードするDNA配列に作動可能に連結するハムスターGADD153遺伝子プロモーター、およびβガラクトシダーゼ(Bgal)をコードするDNA配列に作動可能に連結するポリオーマウイルスUTRプロモーターを有するヒトp53応答エレメントを含む。
本発明の第2の態様に従って、組換え体ベクターは、レンチウイルスベクター、pCDH(System Biosciences)であってよい。そのような組換え体ベクターは、安定した細胞系の生成のために非常に役立つ。そのような複製するベクターは、形質転換体でDNA分子の複数のコピーを生成することができ、したがって、Lucリポータータンパク質の過剰発現およびそれによる光放散の増加の間、有用である。ベクターが少なくとも1つの選択マーカーを含むことが好ましい。選択マーカーは、抗生物質、例えば、ピューロマイシン、ハイグロマイシンまたはネオマイシンへの耐性を付与することができる。
好ましい実施形態では、組換え体ベクターは、好ましくは図5、図6および図8に例示される、pCDH-puro-p21-RLuc、pCDH-puro-GADD153-hFLucおよびpCDH-hygro-p53-Bgalである。
本発明の第3の態様に従って、本発明の発現カセットまたは組換え体ベクターが細胞の中に組み込まれる。細胞が真核生物の細胞および細胞系であることが好ましい。好ましい哺乳動物細胞には、ヒト、霊長類、マウスまたはイヌの細胞が含まれる。宿主細胞は、マウスリンパ腫細胞などの、リンパ腫細胞または一次細胞もしくは細胞系であってよい。発明者らはいかなる仮説によっても縛られることを望まないが、本発明の方法による使用のためにHCT116ヒト大腸がん細胞が特に好ましい細胞系であることを発明者らは見出した。
DNA分子によってコードされるタンパク質の発現のために用いられる宿主細胞は、理想的には安定してトランスフェクトされるが、不安定にトランスフェクトされた(一過性)細胞の使用は排除されない。本発明の第3の態様によるトランスフェクションされた細胞は、実施例に記載される手順に従って形成することができる。細胞は、理想的にはヒト細胞系、例えばHCT116である。そのような安定して形質導入された細胞は、物質がDNA傷害を誘導または強化するかどうか評価するために、本発明の第4の態様の方法によって用いることができる。RLucおよびFLuc発現はDNA傷害に応じて誘導され、RLucおよびFLucによって放射される光は、公知の適当な技術を用いて容易に測定することができる。本発明の第3の態様による最も好ましい細胞は、レンチウイルス系によって安定して形質導入されたHCT116細胞である。これらの細胞は、本明細書でHCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgalと呼ばれる。
本発明の第4の態様に従って、ゲノム傷害を誘導する物質を低濃度で検出するために特に有益な方法が記載される。この方法は、DNA傷害を誘導する、食品添加物、候補医薬品または化粧品で用いられる化合物をスクリーニングする突然変異誘発アッセイとして用いることができる。この方法は、生体、特にヒトをそのような化合物に曝露させることが安全かどうか評価するために用いることもできる。あるいは、本発明の第4の態様の方法は、供給水中および環境中の遺伝毒性物質を検出するために使用することができる。例えば、この方法は、汚染に晒される人々または他の生物体でゲノム傷害の増加をもたらすことができる汚染物質の存在について産業廃水をモニターするために用いることができる。
本発明の方法は、好ましくは本発明の第2の態様による組換え体ベクターでトランスフェクトされる細胞を生育させ、ゲノム傷害を推定上引き起こす物質と一緒に細胞を所定時間インキュベートし、処理された細胞の試料からのRLucおよび/またはFLucリポーターおよび/またはβガラクトシダーゼタンパク質の活性をモニターすることによって実施される。発光/吸光検出および定量化の適する方法は当業技術者に公知であり、一方法を実施例に記載する。
本発明の方法の好ましい実施形態により、マイクロプレートウェルでの薬剤処理の後、HCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgal細胞溶解物から発光読取値を記録することができる。適するマイクロプレートの例は、96ウェルの白い透明底滅菌マイクロプレートである(Nalgene Nuncカタログ番号136101が最適性能のために推奨される)。発光および吸光度測定値は、適するマイクロプレートリーダー、例えばBioTekプレートリーダーを用いて記録することができる。本発明の第4の態様の方法を実行するための最も好ましいプロトコルは、付随する実施例に記載される。
本発明の第4の態様による好ましい方法は、本発明の第3の態様による細胞を利用する(例えばHCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgal)。好ましくは本発明の第4の態様の方法では、RLuc、FLucおよびBgalリポータータンパク質の発現は、試験化合物への曝露から8〜24時間後、最も好ましくは16時間後にモニターされる。
本明細書(あらゆる添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む)に記載される特徴の全て、および/またはそのように開示される任意の方法または工程のステップの全ては、そのような特徴および/またはステップの少なくとも一部が互いに相容れない組合せを除いて、上記の態様のいずれかといかなる組合せで組み合わせてもよい。
本発明がより完全に理解されるように、以下に準備的および試験的実施例を示す。これらの実施例は例示のみが目的であり、本発明の範囲を限定するものと決してみなすべきではない。
以下の実施例は、本発明の第1、第2および第3の態様による、DNA傷害を検出するためのHCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgalの安定した細胞系の構築を例示する。さらに、それは、本発明の第4の態様に記載される方法によって用いられるときの遺伝毒性物質、例えばエトポシドを試験するために、この安定した細胞系がどのように用いられるかも概説する。
この系の構成成分:
1)プロモーター-ヒトp21、ハムスターGADD153およびヒトp53
2)リポーター遺伝子-レニラルシフェラーゼ(RLuc)、ホタルルシフェラーゼ(FLuc)およびβガラクトシダーゼ(Bgal)
バイオセンサーリポーターカセットをコードするレンチベクターの構築:
ステップ1:リポータータンパク質のクローニング-レニラルシフェラーゼ(RLuc)、ホタルルシフェラーゼ(FLuc)。
RLucの供給源はpSiCHECK2(Promega)であり、それを図1に示す。RLucには、Nhe I(5')およびNot I(3')部位が連なっていた。これをベクターpCDH-CMV-MCS-EF1-puro(System Biosciences)に挿入し、生じたプラスミドをpCDH-puro-RLucと呼び、それを図2に示す。FLucはpSiCHECK2(Promega)からPCRによって増幅し、それを図1に示す。プライマーの配列は、配列リストに配列番号3および配列番号4で示される。FLucには、Nhe I(5')およびEcoRI(3')部位が連なる。これをベクターpCDH-CMV-MCS-EF1-puro(System Biosciences)に挿入し、生じたプラスミドをpCDH-puro-hFLucと呼び、それを図3に示す。
ステップ2:レンチベクターへのハイグロマイシン選択マーカーのクローニング
ハイグロマイシン耐性マーカー遺伝子と一緒のPGKプロモーターを、隣接酵素部位Not I(5')およびSal I(3')で合成した。このカセットを消化してpCDH-CMV-EF1-puro(system Biosciences)にクローニングし、EF1-ピューロマイシン領域を置換した。生じた構築物をpCDH-CMV-MCS-PGK-hygroと呼び、それを図4に示す。
ステップ3:プロモーターのクローニング-ヒトp21、ハムスターGADD153およびp53応答エレメント
配列リストに配列番号1および配列番号2で示すプライマーを用いて、ヒトp21プロモーターをHEK293細胞から増幅した。このプロモーターには、Cla I(5')およびNhe I(3')部位が連なる。これを、pCDH-puro-RLucに挿入した。これは、レンチベクターからのCMVプロモーターの除去をもたらした。このプラスミドをpCDH-puro-p21-RLucと呼び、それを図5に示す。ハムスターGADD153を合成してpCDHベクターにクローニングし、それを図6に示す。GADD153プロモーターには、Cla I(5')およびXba I-Nhe I(3')部位が連なっていた。このプロモーターを、pCDH-puro-hFLucに挿入した。これは、レンチベクターからのCMVプロモーターの除去をもたらした。このプラスミドをpCDH-puro-GADD153-hFLucと呼び、それを図6に示す。p53応答エレメントを、ポリオーマUTR配列と一緒に合成した。この配列には、Cla I(5')およびXba I-Nhe I(3')部位が連なっていた。この構築物を、pCDH-CMV-PGK-hygroベクターに挿入した。これは、このレンチベクターからのCMVプロモーターの除去をもたらした。このプラスミドをpCDH-hygro-p53と呼び、それを図7に示す。リポーター遺伝子βガラクトシダーゼは、隣接酵素部位Xba I-Nhe I(5')およびNot I(3')で合成され、pCDH-hygro-p53にクローニングされて、図8に示すpCDH-hygro-p53-Bgalベクターを与えた。
ヒトp21遺伝子プロモーターをHEK293細胞系から増幅するために用いたプライマーを、配列リストに配列番号1および配列番号2で示す。プラスミドpCDH-puro-p21-RLuc、pCDH-puro-GADD153-hFLucおよびpCDH-hygro-p53-Bgal中の発現カセットの各々のDNA配列を、配列リストに配列番号5、6および7でそれぞれ示す。
ステップ4:バイオセンサーリポーターカセットを発現する安定した細胞系の処理
pPACKプラスミド(System Biosciences)を、パッケージング、形質導入および発現のために必要とされる遺伝子エレメントを含有した発現構築物pCDH-puro-p21-RLucと一緒にHEK 293T産生細胞に同時トランスフェクトさせ、細胞(「パッケージング」または「産生」細胞と呼ばれる)は、高度に形質導入可能なVSV-Gシュードタイプレンチウイルス粒子に発現構築物を効率的にパッケージした。レンチウイルス粒子を超遠心技術によって濃縮し、HCT116細胞系、ヒト結腸がん細胞系を形質導入させるために用いた。バイオセンサーリポーターカセットを抱える単細胞クローンを、ピューロマイシン(2μg/ml)の下で2週間選択した。pCDH-puro-p21-RLucで形質転換させたHCT116細胞は、本明細書でHCT116-p21RLucと呼ぶ。
pPACKプラスミド(System Biosciences)を、パッケージング、形質導入および発現のために必要とされる遺伝子エレメントを含有した発現構築物pCDH-puro-GADD153-hFLucと一緒にHEK 293T産生細胞に同時トランスフェクトさせ、細胞(「パッケージング」または「産生」細胞と呼ばれる)は、高度に形質導入可能なVSV-Gシュードタイプレンチウイルス粒子に発現構築物を効率的にパッケージした。レンチウイルス粒子を超遠心技術によって濃縮し、HCT116-p21RLucを形質導入させるために用いた。バイオセンサーリポーターカセット、p21-RLucとGADD153-hFLucの両方を抱える単細胞クローンを、ピューロマイシン(2μg/ml)の下で2週間にわたって選択した。生じた安定した細胞系を、本明細書でHCT116-p21RLuc-GADD153hFLucと呼ぶ。
pPACKプラスミドを、パッケージング、形質導入および発現のために必要とされる遺伝子エレメントを含有した発現構築物pCDH-hygro-p53-Bgalと一緒にHEK 293T産生細胞に同時トランスフェクトさせ、細胞(「パッケージング」または「産生」細胞と呼ばれる)は、高度に形質導入可能なVSV-Gシュードタイプレンチウイルス粒子に発現構築物を効率的にパッケージした。レンチウイルス粒子を超遠心技術によって濃縮し、HCT116-p21RLuc-GADD153hFLucを形質導入させるために用いた。3つのバイオセンサーリポーターカセット、p21-RLuc、GADD153-hFLucおよびp53-Bgalの全てを抱える単細胞クローンを、ハイグロマイシン(0.2mg/ml)の下で2週間にわたって選択した。生じた安定した細胞系を、本明細書でHCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgalと呼ぶ。
本発明は、プロモーター、p21、GADD153およびp53を有する細胞系HCT116-p21RLuc-GADD153FLuc-p53Bgalを用いて試験化合物の遺伝毒性を測定するための、好ましいアッセイを記載する。アッセイは、発光読取が可能なマイクロプレートリーダーを用いて、96ウェルプレートで実施される。
マイクロプレート調製
アッセイは、96ウェルの白い透明底マイクロプレートで実行される。例えば、Nalgene Nunc、USAからのF96 MicroWell(商標)プレート、カタログ番号136101。マイクロプレートは、マルチチャンネルピペットを用いて効果的に充填される。
アッセイプロトコル
我々が標準化したアッセイプロトコルを、ここに記載する。試験化合物のストックを2%v/v溶媒(それらに限定されないがDMSOまたはPBSを含む)で調製し、このストックはアッセイのための連続希釈を作製するために用いる。化合物の最大試験用量は、1mMか、溶解性もしくは細胞毒性によって制限される場合は500μg/ml以下に設定する。試験化合物は、標準の細胞生存力/細胞毒性アッセイによって細胞生存力について分析する(例えばグラフに示すMTTアッセイ)。
PBSに溶解した(5mg/ml)MTT試薬(Sigma)を用いて、MTTアッセイを実施する。簡潔には、96ウェルマイクロプレートでGenotoxセンサー細胞を試験化合物の10倍連続希釈液とインキュベートする。24時間のインキュベーションの後、10μlのMTT溶液を96ウェルプレートの各ウェルに加え、37℃で1時間インキュベートする。培地を廃棄し(換気フード内で)、100μlのDMSOをウェルに加える。プレートを10分間振盪し、吸光度を540nmで測定する。
遺伝毒性アッセイのために、化合物処理の16時間前に、処理されたAnthemのGenotoxセンサー細胞を96ウェルマイクロプレートに播種する(1ウェルにつき10,000個の細胞)。以下の対照、未処理の細胞、1%DMSOだけ(希釈剤の吸光の欠如を確認するために)、いかなる汚染もないことを確認するために増殖培地だけ、ビヒクル対照(溶媒対照)および連続希釈の陽性試験対照が含まれる。試験化合物を2倍連続希釈で加え、マイクロプレートを実験要件に従い24時間または48時間、37℃、5%CO2および95%湿度でインキュベートする。
24時間または48時間の後に、1ウェルにつき60μlの溶解緩衝液で細胞を溶解する(ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼアッセイに適合するようにAnthem Biosciencesで溶解緩衝液組成を最適化した;50mlの溶解緩衝液は、pH8.0の7.5mlの1M HEPES、125μlのTriton X100、50mgのブタゼラチン、5mlのグリセロールおよび25μlの泡止め剤を含有する)。ルシフェラーゼアッセイ(レニラおよびホタルルシフェラーゼ)の各々のために10μlの溶解物を用いるが、βガラクトシダーゼアッセイのために30μlの溶解物を用い、総タンパク質は溶解物の残りの10μlを用いてBradford試薬により推定される。
1μg/ウェルのセレントラジン(1mg/mlのストックが100%メタノールで調製される)を含有するルシフェラーゼアッセイ緩衝液(0.5M NaCl、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液pH7.2、1mM二ナトリウムEDTA、1mg/mLブタゼラチン、50mMヨウ化カリウム)を用いて、レニラルシフェラーゼアッセイを実施する。100μM Dルシフェリン、150μM ATPおよび80μMコエンザイムAを含有する同じルシフェラーゼアッセイ緩衝液で、ホタルルシフェラーゼアッセイを実施する。マイクロプレート振盪機で、アッセイプレートを10分の間静かに振盪する(各ウェルの内容物を完全に混ぜるために)。次にプレートをマイクロプレートリーダーにとり、発光データをマイクロプレートから収集する。発光機能を有するマイクロプレートリーダーが選択される(例えば、BioTekからのSynergy HT多重検出マイクロプレートリーダー)。発光データは、10秒の積分時間および2秒の遅延時間で収集する。
Zアッセイ緩衝液(50ml緩衝液は0.4265gのNa2HPO4、0.275gのNaH2PO4、500μlの1M KCl、50μlの1M MgSO4を含有する;10mlごとに、27μlのベータメルカプトエタノールを加える)および基質o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼONPG(1mlの10X ONPGストック-20mg/ml)で、βガラクトシダーゼアッセイを実行する。黄色が発生すると、1ウェルにつき50μlの1M Na2CO3を加え、A420で読み取る。
発光および吸光度データをMicrosoftのエクセル表計算ソフトに移し、ビヒクル処理対照ウェルからのデータで標準化してリポーター遺伝子発現の変化倍率を計算する。グラフは、X軸に試験化合物の濃度、一次Y軸に細胞生存率(MTTアッセイから)および二次Y軸にリポーター遺伝子の誘導倍率をプロットする。細胞生存閾値は80%に設定され、細胞毒性LECは、未処理対照と比較して細胞生存率を20%低減した最も低い有効試験濃度と定義される。
遺伝毒性閾値は1.5倍変化(すなわち、ビヒクル処理対照より50%多い)に設定される。遺伝毒性LECは、1.5を超える閾値のリポーター遺伝子誘導の少なくとも1つを生成した最も低い有効試験濃度である。遺伝毒性閾値は、50%未満の細胞生存率をもたらす試験濃度については計算されない。
本発明は、S9分画で化合物を処理することによる、原突然変異原物質または原遺伝毒性物質の検出のためのアッセイも含む。S9分画は、肝臓で化合物から生成される代謝産物の検出を可能にする肝臓抽出物(当業者に公知である)である。
試験化合物の代謝産物の遺伝毒性の可能性は、Moltox、カタログ番号11-101.5、から入手したアロクロル1254で処理したラット(1%ミックス)のS9と一緒にAnthemのGenotoxセンサー細胞で化合物を3時間インキュベートすることによって評価される。S9分画は、酵素補因子(例えば、5mMのグルコース6リン酸および0.5mMのβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸)と組み合わせて用いられる。S9ミックスは、アッセイマイクロプレートで1%v/vで用いられる。S9分画を除去するために3時間後に細胞をPBSで洗浄し、24時間後に遺伝毒性について試験する。アッセイ条件、アッセイ時点、S9への曝露時間、S9分画の供給源は、試験化合物および実験に従って変更することができる。
代謝活性化アッセイは、陽性対照(シクロホスファミド、公知の原突然変異原物質)および溶媒対照を常に含む。上で述べたように、遺伝毒性閾値は、リポーター遺伝子の発現の溶媒対照の1.5倍(すなわち50%の増加)の誘導に設定される。リポーター遺伝子の誘導が1.5倍超である場合、試験化合物は陽性遺伝毒性物質と断定される。Table 1(表1)は、このアッセイを使用してスクリーニングした化合物の見本を示し、表中、「+」は遺伝毒性陽性;「-」は遺伝毒性陰性; MAはS9分画ミックスを用いる代謝活性化を表す。
したがって、本発明は、複数のリポーター遺伝子タンパク質の発現を促進する、DNA傷害によって誘導可能な複数の遺伝子プロモーターを発現させる方法を特徴とする。多様な遺伝毒性シグナル伝達経路は、遺伝毒性攻撃に応答することが知られている複数の型のプロモーターの可能性を利用することによって検出することができる。したがって、本発明は、ハイスループットスクリーニングの補助の役割をするように適合させることができるプラットホームを記載する。
公知の遺伝毒性物質を用いるバイオセンサーの誘導
リポーター誘導の実施例として、図9、図10Aおよび図10Bに、異なる濃度のメチルメタンスルホネート(直接作用の遺伝毒性物質)およびシクロホスファミド(原遺伝毒性物質)で処理したHCT116-p21RLuc-GADD153hFLuc-p53Bgal細胞を示す。これらの2つの化合物は遺伝毒性物質として当業者に公知であり、本発明の方法を用いるときに陽性対照として用いることができる。
10%FBSを含む100μlのMcCoy培地に1ウェルにつき103個の細胞を播種し、96ウェルプレート(2セットとして)で一晩インキュベートした(37℃、5% CO2、100%湿度)。その翌日、1%v/vのDMSO水溶液に溶解させたMMSおよびシクロホスファミドの連続2倍希釈溶液と一緒に細胞を24時間インキュベートした。シクロホスファミドで処理した細胞は、前記のS9分画ミックスと3時間インキュベートして、その後PBSで洗浄した。24時間のインキュベーションの後、細胞をPBSで洗浄し、細胞生存力を評価するために1セットのプレートでMTTアッセイを実施した。他のセットのプレートの細胞は、100μlの溶解緩衝液(50mlの溶解緩衝液は、pH8.0の7.5mlの1M HEPES、125μlのTriton X100、50mgのブタゼラチン、5mlのグリセロールおよび25μlの泡止め剤を含有する)で溶解した。10μlの細胞溶解物を、96ウェル白色マイクロプレートで100μlのルシフェラーゼアッセイ緩衝液(ルシフェラーゼアッセイ緩衝液組成:0.5M NaCl、0.1Mのリン酸カリウム緩衝液pH7.2、1mM二ナトリウムEDTA、1mg/mLブタゼラチン、50mMヨウ化カリウム)と混合した。各ウェルに、1μgのRLuc基質、セレンテラジン(1mg/mlのセレンテラジン保存溶液を100%メタノールで調製して、-80℃のフリーザーに保存する)を加えた。マイクロプレート振盪機の上でプレートを10分の間静かに振盪し、その後発光読取値を得るためにマイクロプレートリーダーにとった。10μlの細胞溶解物を96ウェル白色マイクロプレートで100μlのFLucアッセイ緩衝液と混合した。10μlの細胞溶解物と、100μM Dルシフェリン、150μM ATPおよび80μMコエンザイムAを含有する100μlのルシフェラーゼアッセイ緩衝液で、ホタルルシフェラーゼアッセイを実施する。30μlの溶解物およびZアッセイ緩衝液(50ml緩衝液は0.4265gのNa2HPO4、0.275gのNaH2PO4、500μlの1M KCl、50μlの1M MgSO4を含有する;10mlごとに、27μlのベータメルカプトエタノールを加える)および基質o-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシダーゼONPG(1mlの10X ONPGストック-20mg/ml)で、βガラクトシダーゼアッセイを実行した。黄色が発生すると、1ウェルにつき50μlの1M Na2CO3を加え、A420で読み取った。
これを3回繰り返し、平均誘導および標準誤差を計算した。図9および図10Aおよび図10Bに結果を図示する。

Claims (7)

  1. 真核生物細胞であって、ヒトp21遺伝子プロモーターに作動可能に連結するリポータータンパク質として、レニラルシフェラーゼ(RLuc)またはその誘導体をコードするDNA配列を含む、第1の発現カセットと;ハムスターGADD153遺伝子プロモーターに作動可能に連結するリポータータンパク質として、ヒト化ホタルルシフェラーゼ(hFLuc)またはその誘導体をコードするDNA配列を含む、第2の発現カセットと;プロモーターとしてp53応答エレメントおよびポリオーマウイルスUTRに作動可能に連結するリポータータンパク質として、βガラクトシダーゼ(Bgal)またはその誘導体をコードするDNA配列を含む、第3の発現カセットとを含む細胞。
  2. ゲノム傷害に応じてリポータータンパク質をコードするDNA配列の発現が活性化される、請求項1に記載の細胞。
  3. 前記ヒトp21遺伝子プロモーターおよび/または前記ハムスターGADD153遺伝子プロモーターおよび/または前記p53応答エレメント配列が、前記DNA配列に結合し前記リポータータンパク質であるRLucおよび/またはFLucおよび/またはBgalをそれぞれコードするDNA配列の転写を開始するようにRNAポリメラーゼを誘導する、請求項1に記載の細胞。
  4. ヒトp21のプロモーター配列が、配列番号５に記載されたpCDH-puro-p21-RLucプラスミドの1961位から4456位に示されるものである、請求項3に記載の細胞。
  5. ハムスターGADD153のプロモーター配列が、配列番号６に記載されたpCDH-puro-GADD153-hFLucプラスミドの1961位から2741位に示されるものである、請求項3に記載の細胞。
  6. レンチウイルス系によって、発現カセットが細胞に異所的に送達される、請求項1に記載の細胞。
  7. DNA傷害をもたらす遺伝毒性物質の存在を検出するためのハイスループットスクリーニング方法であって、以下の行為；
    a. 請求項１に記載の細胞を遺伝毒性物質にさらすステップ、および
    b. 細胞からの発光リポータータンパク質の発現をモニターしてDNA損傷をもたらす遺伝毒性物質の存在を検出するステップを含む、方法。
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