JP5928308B2 - 画像取得装置および画像取得方法 - Google Patents
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Description
第1の実施形態では、蛍光顕微鏡により撮像する生体サンプルSPL内の細胞密度が低く、その細胞を蛍光標識により染色して得られる蛍光像の輝点1個1個が明確に区別して識別できる状態を想定している。それ故、第1の実施形態における本技術の特徴は、蛍光像の輝点の1個1個を区別して識別し、それぞれの輝点の形状を分析することである。
最初に、本実施形態において予備撮影および本撮影を行う画像取得装置の構成について説明する。図1は、本技術の一実施形態に係る画像取得装置を示す模式図である。同図に示すように、本実施形態における画像取得装置100は、顕微鏡10と、データ処理部20とを有する。以下では、顕微鏡10およびデータ処理部20の構成の詳細について説明する。
顕微鏡10は、ステージ11、光学系12、光源13及び撮像素子14を有する。ステージ11は、例えば組織切片、細胞、染色体等の生体高分子等の生体サンプルSPLを載置可能な載置面を有し、当該載置面に対してその平行方向(x−y平面方向)及び垂直方向(z軸方向)へ移動可能とされている。
図2は、上記ステージ11に載置される生体サンプルSPL(プレパラート)をステージ11の側面方向から示した図である。同図に示すように、生体サンプルSPLは、Z方向に例えば数μmから数十μmの厚さを有し、スライドガラスSG及びカバーガラスCGに挟まれて所定の固定手法により固定されている。スライドガラスSGの厚さは例えば約1mmである。カバーガラスCGの厚さは例えば約0.15〜0.17mmである。
データ処理部20は、光源13を駆動させ、撮像素子14を用いて生体サンプルSPLの蛍光像を取得し、これをサンプルデータとして保存する。
本実施形態では、本撮影用の焦点位置を割り出すために、予備撮影において、生体サンプルSPLのうち撮像対象となる部分の厚さの範囲を含む撮影範囲で、光学系12の焦点位置が移動される。焦点位置が移動する間、撮像素子14が露光されることで生体サンプルSPLの予備撮影蛍光像が取得される。この予備撮影蛍光像をもとに撮像対象の厚さ方向における蛍光標識の分布情報が算出される。蛍光標識の分布情報は、蛍光マーカ55により標識されるターゲットの生体組織50の分布情報に相当する。
データ処理部20のCPU21はROM22や記憶部27に格納された複数のプログラムのうち、操作入力部24から与えられる命令に対応するプログラムをRAM23に展開する。CPU21は、この展開されたプログラム(画像取得プログラム)に基づいて生体サンプル像取得処理を実行する。
ここで、2種類あるステージ11の移動についてまとめる。1種類目のステージ11の移動は、x−y平面内において生体サンプルSPL上の各区画を順に予備撮影するために、ステージ11をx軸方向またはy軸方向に順送りする移動である。これは、図5に示すものである。
1種類目のステージ11移動毎に行われる焦点位置調整用の蛍光像の撮像では、ステージ制御部31によるステージ11の移動と、画像取得部32による撮像素子14の露光とが同期して行われる。
焦点位置調整用の蛍光像の撮像では、上記のように、z軸方向の焦点位置をzstartから、移動終了位置であるzendまで移動させるが、一度のz軸方向の移動により、z軸方向の全ての撮像範囲をカバー出来るとは限らない。そのため、z軸方向の撮影範囲を複数に分け、複数回、焦点位置調整用の蛍光像の撮像を行う。
図9は、複数の分割撮影範囲(Zscan_1〜3)のそれぞれにおいて撮影されたサンプル部位の蛍光像を示す模式的な図である。また、図10は、本実施形態の実施例として撮影された写真であり、図9に示すそれぞれの蛍光像に相当するものである。これらの写真は、撮影条件として、円軌道の半径Rが15μm、z軸方向の移動量(zend−zstart)が20μm、撮像素子14の露光時間が1secの条件で撮影された蛍光像である。その他、ガンマ値等の撮影条件も適宜調整されている。
次に、蛍光マーカ55の分布情報を算出する処理について説明する。
ここでは、蛍光マーカ55の分布情報算出の際に行われる蛍光マーカの形状解析でのマーカ色について説明する。
ここでは、蛍光マーカ55の分布情報算出の際に行われる蛍光マーカの形状解析の具体例について説明する。
ここでは、蛍光マーカ55の分布情報算出の際に行われる角度θの算出方法の具体例について説明する。
ここでは、蛍光マーカの分布情報の具体例と利用方法について説明する。
以上、本実施形態に係る画像取得装置100は、サンプル部位の厚さの範囲Tを少なくとも含む撮影範囲Lで光学系12の焦点位置が移動させられる。当該移動の間撮像素子14が露光され生体サンプルSPLの蛍光像が取得される。そして生体サンプルSPLの蛍光像をもとに、サンプル部位の厚さ方向(z軸方向)における蛍光マーカ55の分布情報が算出される。これにより例えば撮影モードや撮影目的に合った、蛍光マーカ55を適切に撮影するための焦点位置を容易に算出することが可能となる。この結果、蛍光マーカ55が付された生体サンプルSPLを効率よく撮影することが可能となる。
例えば焦点深度よりも小さい間隔で焦点位置を変えてその都度画像を撮影し、各撮影画像を分析することで焦点位置を探し出す方法を想定する。この方法では多数の画像を撮影する必要があり、撮影枚数分の画像データを保存するための大容量のメモリが必要となる。また焦点位置を算出するために複数の画像データを参照しなければならず、多くの工数がかかり非効率である。
本実施形態では、図8に示すように、3つの分割撮影範囲としてZscan_1〜3が設定された。このように焦点深度よりも大きい範囲が設定され、少ない回数の撮影により分布情報が算出される。これにより大幅に撮影枚数を削減した焦点位置の探索が可能となる。
図8Aでは、生体サンプルSPLが位置しない範囲も含めて撮影範囲Lが設定されている(Zscan_1及び3)。例えば図16に示すように、スライドガラスSGとステージ11との間に毛髪等のゴミ90(例えば約20μm〜50μmの大きさ)等が挟まってしまう場合がある。このような場合に、例えばスライドガラスSGの厚さのみを考慮して撮影範囲Lを設定すると焦点位置を見失ってしまう可能性が高い。従って生体サンプルSPLが位置しない範囲も含めて撮影範囲Lを適宜設定することで、蛍光マーカ55の分布情報を高精度に算出することが可能となる。上記したように少ない撮影枚数で焦点位置を探索することが可能なので、撮像範囲Lを大きく設定することが可能である。
自動的に焦点位置を探索及び調整する場合においては、イメージャ上のゴミやイメージャの欠陥を、スライドガラスGS上の蛍光の輝点と誤認識してしまい、本来の焦点位置と異なる位置を合焦点位置であると判断してしまうというエラー発生もあり得る。
本技術に係る実施形態は、上記で説明した実施形態に限定されず種々変形される。
上記の実施形態では、図8Aに示すように、撮影範囲Lを分割する複数の分割撮影範囲が設定され、当該分割撮影範囲ごとに蛍光像が撮影された。しかしながら撮影範囲L全体を1回の撮影でスキャンするようにステージを移動させて、蛍光像が生成されてもよい。そしてその蛍光像をもとに蛍光マーカ55の分布情報が算出されてもよい。
上記では、撮影モードや撮影目的に合わせて適宜分布情報を利用することができることを説明した。逆に分布情報に基づいて、最適な撮影モードや撮影目的が選択されてもよい。
また蛍光マーカ55のうち、標的マーカ(赤色)のみ、あるいは対照マーカ(緑)のみが、分布情報算出の対象として設定されてもよい。これらの設定は、例えばユーザの操作により入力されてもよい。
また蛍光像に写されている蛍光マーカ55の全てにおいて位置情報が算出されなくてもよい。すなわち蛍光マーカ55が間引かれて選択され、その位置情報をもとに分布情報が算出されてもよい。
なお、上述の実施形態の顕微鏡10の構成において、対物レンズ12Aは接眼レンズとすることもできる。
第2の実施形態では、蛍光顕微鏡により撮像する生体サンプルSPL内の細胞密度が高く、その細胞を蛍光標識により染色して得られる蛍光像の輝点1個1個が明確には区別できない状態を主に想定している。
まず、第1の実施形態との具体的な相違点を説明する。第1の実施形態との具体的な相違点は、第1の実施形態において角度θの算出方法を記述した[露光開始位置zstartから合焦像60までの角度θの算出について]の項の部分である。第1の実施形態では、焦点位置調整用の蛍光像70から切り出されたトリミング画像75と、0度から359度までの角度にそれぞれ紐付けられた複数の理論的な画像80との相関係数を、トリミング画像75ごとに計算した。
ここでは、予備撮影と、第1の実施形態による解析と、第2の実施形態による解析と、本撮影との関係を整理するため、全体の処理の流れについて説明する。
ここでは、予備撮影により得られた焦点位置調整用の蛍光像を全体として解析できる根拠を説明する。
次に、テクスチャー解析により角度θを求める第1の方法について説明する。
次に、テクスチャー解析により角度θを求める第2の方法について説明する。
その他、本技術は、上述の実施形態にのみ限定されるものではなく、本技術の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
BL …輝点の軌跡の最も明るく直線に近い部分
CG …カバーガラス
FP …焦点面
image_Zscan1〜3…蛍光像
L …撮影範囲
O …円
R …円軌道の半径
SG …スライドガラス
SPL…生体サンプル
T …サンプル部位の厚さの範囲
zend …露光終了位置
Zscan_1〜3…分割撮影範囲
zstart …露光開始位置
10…顕微鏡
11…ステージ
12…光学系
13…光源
14…撮像素子
17…撮像制御部
20…データ処理部
31…ステージ制御部
32…画像取得部
33…分布情報算出部
40…ぼやけた発光色の像
41…軌跡
42…焦点が合った像
43…ぼやけた発光色の像
50…生体組織
55…蛍光マーカ
60…合焦像
70…蛍光像
75…トリミング画像
80…理論的な画像
100…画像取得装置
Claims (5)
- 生体サンプルの蛍光標識を発光させる励起光を発生する光源と、
像が結像される撮像素子と、
前記光源からの前記励起光を前記生体サンプルの、前記蛍光標識を含む少なくとも一部の領域に照射させ、当該領域の蛍光像を前記撮像素子に結像させる光学系と、
前記光学系の焦点位置を当該光学系の光軸方向およびこの光軸に直交する方向に移動させる移動制御部と、
前記光学系の焦点位置を移動させる間、前記撮像素子を連続的に露光させ、前記領域の長時間露光像を生成する生成部と、
前記生成された長時間露光像の周波数解析を行い、少なくともこの解析結果を用いて前記蛍光標識の前記光軸方向での位置情報を算出する算出部と
を具備する画像取得装置であって、
前記算出部は、
前記長時間露光像の面内の予め定められた直交する2方向と、前記面内で当該2方向に対して傾斜した少なくとも1方向とを含む少なくとも3方向について、前記方向ごとに前記長時間露光像の周波数解析を行い、最大周波数成分が最も高い前記方向を判定し、この判定方向をもとに位置情報を算出する
画像取得装置。 - 請求項1に記載の画像取得装置であって、
前記算出部は、
前記判定の対象の方向と前記位置情報との相関情報を予め記憶し、
この相関情報をもとに前記判定した方向から前記位置情報を算出する
画像取得装置。 - 生体サンプルの蛍光標識を発光させる励起光を発生する光源と、
像が結像される撮像素子と、
前記光源からの前記励起光を前記生体サンプルの、前記蛍光標識を含む少なくとも一部の領域に照射させ、当該領域の蛍光像を前記撮像素子に結像させる光学系と、
前記光学系の焦点位置を当該光学系の光軸方向およびこの光軸に直交する方向に移動させる移動制御部と、
前記光学系の焦点位置を移動させる間、前記撮像素子を連続的に露光させ、前記領域の長時間露光像を生成する生成部と、
前記生成された長時間露光像の周波数解析を行い、少なくともこの解析結果を用いて前記蛍光標識の前記光軸方向での位置情報を算出する算出部と
を具備する画像取得装置であって、
前記算出部は、
前記長時間露光像の面内の予め定められた直交する2方向と、前記面内で当該2方向に対して傾斜した少なくとも1方向とを含む少なくとも3方向について、前記方向ごとに、前記長時間露光像を予め定めた画素数だけ移動させた移動画像を生成し、前記長時間露光像と個々の前記移動画像との相関を求め、相関が最も低い方向を判定し、この判定方向をもとに位置情報を算出する
画像取得装置。 - 生体サンプルの蛍光標識を発光させる励起光を発生させ、
光学系が前記励起光を前記生体サンプルの、前記蛍光標識を含む少なくとも一部の領域に照射して当該領域の蛍光像を撮像素子に結像させ、
前記光学系の焦点位置を当該光学系の光軸方向およびこの光軸に直交する方向に移動させ、
前記光学系の焦点位置を移動させる間、前記撮像素子を連続的に露光させて前記領域の長時間露光像を生成し、
前記生成された長時間露光像の周波数解析を行い、少なくともこの解析結果を用いて前記蛍光標識の前記光軸方向での位置情報を算出する
画像取得方法であって、
前記位置情報の算出では、
前記長時間露光像の面内の予め定められた直交する2方向と、前記面内で当該2方向に対して傾斜した少なくとも1方向とを含む少なくとも3方向について、前記方向ごとに前記長時間露光像の周波数解析を行い、最大周波数成分が最も高い前記方向を判定し、この判定方向をもとに位置情報を算出する
画像取得方法。 - 生体サンプルの蛍光標識を発光させる励起光を発生させ、
光学系が前記励起光を前記生体サンプルの、前記蛍光標識を含む少なくとも一部の領域に照射して当該領域の蛍光像を撮像素子に結像させ、
前記光学系の焦点位置を当該光学系の光軸方向およびこの光軸に直交する方向に移動させ、
前記光学系の焦点位置を移動させる間、前記撮像素子を連続的に露光させて前記領域の長時間露光像を生成し、
前記生成された長時間露光像の周波数解析を行い、少なくともこの解析結果を用いて前記蛍光標識の前記光軸方向での位置情報を算出する
画像取得方法であって、
前記位置情報の算出では、
前記長時間露光像の面内の予め定められた直交する2方向と、前記面内で当該2方向に対して傾斜した少なくとも1方向とを含む少なくとも3方向について、前記方向ごとに、前記長時間露光像を予め定めた画素数だけ移動させた移動画像を生成し、前記長時間露光像と個々の前記移動画像との相関を求め、相関が最も低い方向を判定し、この判定方向をもとに位置情報を算出する
画像取得方法。
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