JP5895290B2 - 非ヒト被験体から取得した乳腺腫瘍サンプルが悪性腫瘍である可能性を診断する方法、システムおよびキット - Google Patents
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Description
本発明者らは、マイクロサテライトマーカー12種類を選定し、これらの領域を増幅するためのプライマーを設計した。
乳腺腫瘍サンプルは腫瘍ごとに予め病理組織学的検査による診断によって、良性腫瘍および悪性腫瘍に分類した。各腫瘍に対応する同一個体の正常組織としては、血液、または腫瘍部位以外の組織を用いた。
同一個体から得た正常サンプルおよび腫瘍組織サンプルからDNAを抽出した。抽出には、サンプルが血液またはその他の新鮮組織の場合はQIAGEN QIAamp DNA mini Kitを用い、パラフィンブロックの場合はQIAGEN QIAamp DNA FFPE tissue Kitを用いた。抽出手順は抽出キットに添付されたプロトコールに従った。表2に詳細を示すとおり、20μLの反応系で2〜10ngのDNAをテンプレートとしてQIAGEN Type-it Microsatellite PCR Kitを用い、表3の反応条件にてPCR反応を行った。
フラグメント解析ソフトウエア(ベックマンコールター社)により得られたエレクトロフェログラムを確認し、各PCR産物に由来するピークの数およびサイズを決定した。特定のマイクロサテライトマーカーについて、正常組織からは、ホモ接合性であれば1つ、ヘテロ接合性であれば2つのピークが得られる。同一個体の腫瘍組織サンプルにおいて、正常組織では見られない1以上の異なるサイズのピークが得られた場合、その症例をマイクロサテライト不安定性が陽性であると判定した。また、ヘテロ接合性を示すマイクロサテライトでは、正常組織で見られる2つのピークの高さの比(サイズの小さい方のピークの高さ/サイズの大きい方のピークの高さ)をa、腫瘍組織で見られる2つのピークの高さの比(サイズの小さい方のピークの高さ/サイズの大きい方のピークの高さ)をb、としたとき、a/bの値が2以上または0.5以下であった場合、その腫瘍サンプルをヘテロ接合性の喪失が陽性であると判定した。ある腫瘍サンプルについて、検査した15のマイクロサテライトマーカーのうち少なくとも1つにおいて、マイクロサテライト不安定性またはヘテロ接合性の喪失が陽性であったものを、ゲノム不安定性が陽性であると判定した。
Claims (4)
- 非ヒト被験体から取得した乳腺腫瘍サンプルにおいて、少なくともマイクロサテライトマーカーC22.763、FH3837、FH2175およびFH2305についての配列情報を取得する工程、および、取得した配列情報をそれぞれに対応するコントロールと比較する工程を包含し、
上記非ヒト被験体は、イヌである、非ヒト被験体から取得した乳腺腫瘍サンプルが悪性腫瘍である可能性を診断する方法。 - 非ヒト被験体から取得した乳腺腫瘍サンプルにおいて、少なくともマイクロサテライトマーカーC22.763、FH3837、FH2175およびFH2305についての配列情報を取得する取得手段、
取得した配列情報をそれぞれに対応するコントロールと比較する比較手段、
取得した配列情報がコントロールと異なる場合に、該当するサンプルにおいてゲノム不安定性が陽性であると判定する判定手段、および
ゲノム不安定性が陽性であると判定されたサンプルが悪性腫瘍である可能性があると診断する診断手段が設けられ、
上記非ヒト被験体は、イヌである、非ヒト被験体から取得した乳腺腫瘍サンプルが悪性腫瘍である可能性を診断するシステム。 - 非ヒト被験体から取得した乳腺腫瘍サンプルが悪性腫瘍である可能性を診断するためのキットであって、
少なくともマイクロサテライトマーカーC22.763、FH3837、FH2175およびFH2305を、それぞれ増幅し得るプライマー対を備え、
上記非ヒト被験体は、イヌである、キット。 - 上記プライマー対は、以下の(a)〜(d)のプライマー対であることを特徴とする、請求項3に記載のキット:
(a)配列番号3に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号4に示す塩基配列からなるプライマー;
(b)配列番号15に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号16に示す塩基配列からなるプライマー;
(c)配列番号19に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号20に示す塩基配列からなるプライマー;
(d)配列番号21に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号22に示す塩基配列からなるプライマー。
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