JP5892594B2 - 複数点照明による培養細胞観察システム - Google Patents

Description

本発明は、培養細胞を経時的に観察するための複数点照明による培養細胞観察システムに関する。

現在、再生医療で行われている自家細胞培養による細胞組織の生産では、細胞培養プロセスに対する管理方法および細胞品質に対する評価技術が必要不可欠である。細胞培養プロセスの可視化を目的として、経時的な細胞画像を解析することで非侵襲かつ定量的な評価が可能である。

従来では、主に位相差顕微鏡による位相差画像を用いた観察システムや１点照明の明視野顕微鏡が用いられてきた。

また、従来の技術として、例えば、特許文献１が知られている。特許文献１の細胞培養装置では、収納容器内に、培養器を挟んで、光源とカメラとを対向して配置するとともに、カメラ或いは培養器を相対的に移動可能な構造とし、任意の焦点で培養器内の細胞の画像を取得していた。

特開２００６−０５１８１３号公報

しかしながら、従来の位相差顕微鏡では、細胞組織に厚みや色がある場合には、鮮明な細胞画像が得られず、画像処理による評価が困難であった。また、従来の１点照明の明視野顕微鏡や特許文献１では、観察機構が単純で色や厚みの観察に優れているが、細胞のエッジが不鮮明で細胞の認識が困難であった。

本発明の課題は、細胞組織に厚みや色がある場合でも鮮明な細胞画像を得るとともに、細胞のエッジも鮮明な画像を得ることができる複数点照明による培養細胞観察システムを提供する。

上記課題を解決するために、本発明に係る複数点照明による培養細胞観察システムは、円周上に略等間隔に配置され、順番に点灯する複数のＬＥＤと、培養細胞が収納された容器を挟んで前記複数のＬＥＤと対向し且つ前記円の中心軸上に配置され、順番に点灯された前記複数のＬＥＤの異なる方向からの光により前記培養細胞を順番に撮像する撮像部と、前記撮像部により順番に撮像された前記異なる方向からの複数の細胞画像の階調値をピクセル毎に加算合成し、ピクセル毎の加算合成階調値から所定のしきい値を減算して加算合成画像を得る画像処理部とを備えることを特徴とする。

本発明によれば、細胞組織に厚みや色がある場合でも鮮明な細胞画像を得るとともに、細胞のエッジも鮮明な画像を得ることができる。

本発明の実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの構成を示すブロック図である。 実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの４つのＬＥＤより得られた４つの画像と合成画像とを示す図である。 実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの処理を示すフローチャートである。 実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの４点照明観察での元画像を示す図である。 実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の加算合成処理を示す図である。 実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の加算合成処理して得られた加算合成の階調値を示す図である。 実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの加算合成画像を示す図である。 実施例２に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の偏り度利用処理を示す図である。 実施例２に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の偏り度利用処理して得られた偏り度利用の階調値を示す図である。 実施例２に係る複数点照明による培養細胞観察システムの偏り度利用画像を示す図である。 実施例３に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の最大値と最小値との差分処理を示す図である。 実施例３に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の最大値と最小値との差分処理して得られた差分の階調値を示す図である。 実施例３に係る複数点照明による培養細胞観察システムの最大値と最小値との差分画像を示す図である。 各画像合成法における細胞検出を示す図である。 本発明の実施例４に係る複数点照明による培養細胞観察システムの主要部の構成を示すブロック図である。 本発明の実施例５に係る複数点照明による培養細胞観察システムの主要部の構成を示すブロック図である。

以下、本発明の実施の形態に係る複数点照明による培養細胞観察システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。

図１は、本発明の実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの構成を示すブロック図である。図１において、培養された細胞が収納された培養容器５を挟んで、４つのＬＥＤ１〜ＬＥＤ４とＣＣＤカメラ（撮像部）６とが対向して配置されている。

４つのＬＥＤ１〜ＬＥＤ４は、照明用の白色ＬＥＤであり、円周上に等間隔に配置され、順番に１つずつ点灯するようになっている。ＣＣＤカメラ６には円筒状の鏡筒７が取り付けられ、この鏡筒７の先端部にはレンズ８が配置されている。４つのＬＥＤ１〜ＬＥＤ４の円の中心Ｏとレンズ８の中心と鏡筒７の中心とＣＣＤカメラ６の中心とは同一直線上に配置されている。

培養容器５は、シャーレ、フラスコなどである。ＣＣＤカメラ６は、電荷結合素子であり、順番に点灯されたＬＥＤ１〜４の異なる方向からの光により培養細胞を撮像して細胞画像を得る。画像処理部１０は、ＣＣＤカメラ６で撮像された４つの細胞画像を合成して合成画像を得た後、所定の処理を施す。画像処理部１０の詳細な処理については、後述する。画像メモリ１２は、画像処理部１０で処理された合成画像を格納する。

図２は、実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの４つのＬＥＤより得られた４つの画像と合成画像とを示す図である。図３は、実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの処理を示すフローチャートである。図４は、実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの４点照明観察での元画像を示す図である。

図４（ａ）は、２４時間後の元の細胞画像、図４（ｂ）は、４８時間後の元の細胞画像、図４（ｃ）は、７２時間後の元の細胞画像、図４（ｄ）は、９６時間後の元の細胞画像である。即ち、時間の経過ととともに、細胞が培養されている様子を示す。

まず、ＬＥＤ１を点灯させると、ＣＣＤカメラ６により培養細胞を撮像して、図２に示すように右側エッジが鮮明な画像ＩＭ１が得られる。次に、ＬＥＤ２を点灯させると、ＣＣＤカメラ６により培養細胞を撮像して、図２に示すように上側エッジが鮮明な画像ＩＭ２が得られる。

次に、ＬＥＤ３を点灯させると、ＣＣＤカメラ６により培養細胞を撮像して、図２に示すように左側エッジが鮮明な画像ＩＭ３が得られる。次に、ＬＥＤ４を点灯させると、ＣＣＤカメラ６により培養細胞を撮像して、図２に示すように下側エッジが鮮明な画像ＩＭ４が得られる（ステップＳ１０）。

次に、４つの画像ＩＭ１〜ＩＭ４は、順番に画像処理部１０に入力される（ステップＳ１１）。画像処理部１０は、４つの画像ＩＭ１〜ＩＭ４の各画像について、画像サイズ、即ち、縦ピクセル数、横ピクセル数を決定する（ステップＳ１２）。

さらに、画像処理部１０は、各ピクセルの階調値（濃度値）を画像メモリ１２に格納する（ステップＳ１３）。次に、画像処理部１０は、各画像ＩＭ１〜ＩＭ４の位置を修正する（ステップＳ１４）。即ち、画像のトリミング処理を行う。

次に、画像処理部１０は、トリミング処理された各画像ＩＭ１〜ＩＭ４の加算合成処理を行う（ステップＳ１５）。

図５は、実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の加算合成の階調値を示す図である。各画像ＩＭ１〜ＩＭ４の加算合成処理は、ピクセル毎に行われる。図５において、縦軸は各ピクセルを示し、横軸は、各ピクセルにおける各画像ＩＭ１〜ＩＭ４の階調値の合計を示す。

実施例１の加算合成処理では、以下の式（１）により合成画像の階調値を算出して画像メモリ１２に格納する（ステップＳ１６）。

式（１）において、Ｏは元画像（ｎ＝１，２，３，４）、ｗは幅であり、ｈは高さであり、Ｐは処理画像であり、ｔｈはスレショルド値（所定のしきい値に対応）である。

即ち、ピクセル毎に、４つの画像ＩＭ１〜ＩＭ４を加算合成して、得られた画像からスレショルド値ｔｈを引き算して、得られた画像を加算合成画像としている。この場合、４つの画像ＩＭ１〜ＩＭ４を加算合成して得られた画像がスレショルド値ｔｈ以下のときは、加算合成画像はゼロとする。

図６は、実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の加算合成処理して得られた加算合成の階調値を示す図である。図６に示す加算合成画像の階調値は、０〜２５５となる。この場合、図５に示す７個目のピクセルの階調値の合計が最大であり、これに対応して図６に示す７個目のピクセルの階調値が最大で２５５である。このため、スレショルド値ｔｈは、図５に示す７個目のピクセルの階調値の合計値から、図６に示す７個目のピクセルの階調値である２５５を引いた値に設定されている。

図７は、実施例１に係る複数点照明による培養細胞観察システムの加算合成画像を示す図である。図７（ａ）は、２４時間後の加算合成画像、図７（ｂ）は、４８時間後の加算合成画像、図７（ｃ）は、７２時間後の加算合成画像、図７（ｄ）は、９６時間後の加算合成画像である。即ち、図７に示す加算合成画像は、図４に示す元の細胞画像よりも、細胞画像の輪郭がより強調される。従って、細胞組織に厚みや色がある場合でも鮮明な細胞画像が得られとともに、細胞のエッジも鮮明な画像を得ることができるので、細胞を容易に認識できる。

また、加算合成画像は、コントラストが良いので、細胞領域を認識するのに最適な方法である。

さらに、全てのピクセルを終了したかどうかが判定され（ステップＳ１７）、合成画像が確認され（ステップＳ１８）、画像位置の修正が適正がどうかが判定される（ステップＳ１９）。

図８は、実施例２に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の偏り度利用処理を示す図である。画像の偏り度利用処理は、図１に示す画像処理部１０によって行われる。図８（ａ）は、ピクセル毎に各画像ＩＭ１〜ＩＭ４の加算合成処理を行ったことを示す。図８（ａ）において、縦軸は各ピクセルを示し、横軸は、各ピクセルにおける各画像ＩＭ１〜ＩＭ４の階調値の合計を示す。

図８（ｂ）は、１つのピクセル、例えば、１番目のピクセルの４つの画像ＩＭ１〜ＩＭ４（図ではＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）の階調値を示す。図８（ｃ）は、１番目のピクセルの４つの画像ＩＭ１〜ＩＭ４（図ではＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）の階調値の平均値（ａｖｅ）を求める。平均値（ａｖｅ）は、点線部分で示されている。この場合、式（２）の演算が行われる。

式（２）において、Ｏは元画像（ｎ＝１，２，３，４）、ｗは幅であり、ｈは高さであり、Ｐは処理画像である。

即ち、各画像毎に、画像の階調値と平均値との差分の絶対値を偏り度とし、この偏り度を４つの画像について加算して１つのピクセルの偏り度利用画像としている。そして、各ピクセルについて、式（２）の画像の偏り度利用処理を行うことで、図９に示す偏り度利用の階調値が得られる。

図１０は、実施例２に係る複数点照明による培養細胞観察システムの偏り度利用画像を示す図である。図１０（ａ）は、２４時間後の偏り度利用画像、図１０（ｂ）は、４８時間後の偏り度利用画像、図１０（ｃ）は、７２時間後の偏り度利用画像、図１０（ｄ）は、９６時間後の偏り度利用画像である。

即ち、図１０に示す偏り度利用画像は、図４に示す元の細胞画像よりも、細胞画像の輪郭がより強調される。従って、細胞組織に厚みや色がある場合でも鮮明な細胞画像が得られとともに、細胞のエッジも鮮明な画像を得ることができるので、細胞を容易に認識できる。また、この方法では、細胞の輪郭をさらに明確にできるので、細胞の形状をさらに明確に認識できる。

図１１は、実施例３に係る複数点照明による培養細胞観察システムの画像の最大値と最小値との差分処理を示す図である。

画像の最大値と最小値との差分処理は、図１に示す画像処理部１０によって行われる。図１１は、ピクセル毎に各画像ＩＭ１〜ＩＭ４の加算合成処理を行ったことを示す。また、図１１では、ピクセル毎に、各画像ＩＭ１〜ＩＭ４の内の最大値と最小値とを求める。太枠で囲んだ部分が最大値と最小値とを示している。図１１において、縦軸は各ピクセルを示し、横軸は、各ピクセルにおける各画像ＩＭ１〜ＩＭ４の階調値の合計を示す。

この場合、式（３）の演算によりピクセル毎に、最大値と最小値との差分処理が行われる。

式（３）において、ｍａｘは最大値、ｍｉｎは最小値、Ｏは元画像（ｎ＝１，２，３，４）、ｗは幅であり、ｈは高さであり、Ｐは処理画像である。

即ち、式（３）の画像の最大値と最小値との差分処理を行うことで、図１２に示す差分の階調値が得られる。図１２に示す差分画像の階調値は、０〜２５５としている。

図１３は、実施例３に係る複数点照明による培養細胞観察システムの最大値と最小値との差分画像を示す図である。図１３（ａ）は、２４時間後の差分画像、図１３（ｂ）は、４８時間後の差分画像、図１３（ｃ）は、７２時間後の差分画像、図１３（ｄ）は、９６時間後の差分画像である。

即ち、図１３に示す差分画像は、図４に示す元の細胞画像よりも、細胞画像の輪郭がより強調される。従って、細胞組織に厚みや色がある場合でも鮮明な細胞画像が得られとともに、細胞のエッジも鮮明な画像を得ることができるので、細胞を容易に認識できる。また、この方法では、細胞の輪郭をさらに明確にできるので、細胞の形状をさらに明確に認識できる。

図１４は、各画像合成法における細胞検出を示す図である。図１４において、横軸（ｘ軸）は目視による測定細胞密度を示し、縦軸（ｙ軸）は画像処理での測定細胞密度を示している。●は単純合成処理を示し、○は加算合成処理を示し、■は偏り度処理を示し、□は最大値と最小値との差分処理を示す。○で示される加算合成処理は、ｙ＝ｘの直線に最も近づいており、より鮮明な細胞画像を取得できることがわかる。

図１５は、本発明の実施例４に係る複数点照明による培養細胞観察システムの主要部の構成を示すブロック図である。図１５に示す実施例４に係る複数点照明による培養細胞観察システムは、円周上に略等間隔に配置された白色のＬＥＤ１〜ＬＥＤ４を円の中心Ｏから等距離に移動させるためのＬＥＤ移動調整部を設けたことを特徴とする。

なお、図１５に示すその他の構成は、図１に示す構成と同一構成であるものとする。

このＬＥＤ移動調整部は、以下のように構成される。凹凸が形成されたギア２０〜２４が設けられ、ギア２０には略等間隔の位置にギア２１〜２４が噛合されている。ギア２１〜２４の半径及び凹凸数は、互いに同じである。

ギア２０には中心にシャフト２０ａが取り付けられ、シャフト２０ａが例えば時計方向に回転することでギア２０が時計方向に回転し、ギア２１〜２４が反時計方向に回転するようになっている。

ギア２１〜２４の中心にはワイヤ３１〜３４の一端が取り付けられ、ワイヤ３１〜３４の他端はネジ４１〜４４の一端に取り付けられている。ネジ４１〜４４の他端にはＬＥＤ１〜ＬＥＤ４が取り付けられている。ネジ４１〜４４は、ピッチが互いに同じであり、ボルト５１〜５４と螺合している。ボルト５１〜５４は、略正方形状の固定部材５５に固定されている。

次に、このように構成されたＬＥＤ移動調整部の動作を説明する。まず、シャフト２０ａを時計方向に回転させると、ギア２０が時計方向に回転し、ギア２１〜２４が反時計方向に回転する。すると、ギア２１〜２４の反時計方向の回転に伴って、ワイヤ３１〜３４およびボルト４１〜４４も反時計方向に回転する。このため、ボルト４１〜４４およびＬＥＤ１〜ＬＥＤ４は、中心Ｏから離れる方向に移動する。

ギア２１〜２４の半径及び凹凸数は、互いに同じであり、ネジ４１〜４４のピッチが互いに同じであるので、中心ＯからＬＥＤ１〜ＬＥＤ４までの距離ｒ１〜ｒ４は、同じ値となる。従って、異なる４つの方向で且つＬＥＤ１〜ＬＥＤ４から培養細胞までの距離が一定値となるので、容易にトリミングでき、より鮮明な細胞画像を得ることができる。

なお、シャフト２０ａを反時計方向に回転すると、上記動作とは逆の動作となり、ボルト４１〜４４およびＬＥＤ１〜ＬＥＤ４が、中心Ｏに近づく方向に移動できる。

図１６は、本発明の実施例５に係る複数点照明による培養細胞観察システムの主要部の構成を示すブロック図である。図１６に示す実施例５に係る複数点照明による培養細胞観察システムは、円板６０と、円板６０のいずれかの位置に取り付けられたＬＥＤ１と、円板６０の中心Ｏに取り付けられたシャフト６１と、シャフト６１を介して円板６０を回転させる回転モータ６２と、回転モータ６２により円板６０およびＬＥＤ１が１回転される期間中に、ＬＥＤ１を等間隔毎の複数点において点灯させる点灯制御部６３とを備えることを特徴とする。

なお、図１６に示すその他の構成は、図１に示す構成と同一構成であるものとする。

図１６に示す構成によれば、回転モータ６２により円板６０が例えば、１秒間に１回転すると、点灯制御部６３は、ＬＥＤ１を０．２５秒後、０．５秒後、０．７５秒後、１．０秒後に点灯することで、図１に示す４つのＬＥＤ１〜ＬＥＤ４を順番に点灯したことと同じとなる。なお、ＬＥＤ１の点灯時間を例えば、０．１秒とする。

この場合にも、４つの細胞画像ＩＭ１〜ＩＭ４が得られるので、実施例１の効果と同様な効果が得られる。また、ＬＥＤが１個で済むという利点がある。

なお、本発明は実施例１乃至５の複数点における培養細胞観察システムに限定されるものではない。実施例１乃至４では、ＬＥＤの数を４つとしたが、ＬＥＤの数は２つ以上であっても良い。ＬＥＤの数は、偶数であって且つ円周上の等間隔の位置に配置されるのが好ましい。

実施例１乃至５では、ＬＥＤを用いたが、光を発するものであればよく、その他の光源であっても良い。

本発明は、再生医療分野における細胞組織生産プロセスにおける観察技術として広く利用できる。

１〜４ ＬＥＤ
５ 培養容器
６ ＣＣＤカメラ
７ 鏡筒
８ レンズ
１０ 画像処理部
１２ 画像メモリ
２０〜２４ ギア
２０ａ 回転シャフト
３１〜３４ ワイヤ
４１〜４４ ネジ
５１〜５４ ボルト
５５ 固定部材
６０ 円板
６１ シャフト
６２ 回転モータ
６３ 点灯制御部
ＩＭ１〜ＩＭ４ 画像
ＩＭＳｙ 合成画像

Claims (4)

1. 円周上に略等間隔に配置され、順番に点灯する複数のＬＥＤと、
   培養細胞が収納された容器を挟んで前記複数のＬＥＤと対向し且つ前記円の中心軸上に配置され、順番に点灯された前記複数のＬＥＤの異なる方向からの光により前記培養細胞を順番に撮像する撮像部と、
   前記撮像部により順番に撮像された前記異なる方向からの複数の細胞画像の階調値をピクセル毎に加算合成し、ピクセル毎の加算合成階調値から所定のしきい値を減算して加算合成画像を得る画像処理部と、
   を備えることを特徴とする複数点照明による培養細胞観察システム。
2. 円周上に略等間隔に配置され、順番に点灯する複数のＬＥＤと、
   培養細胞が収納された容器を挟んで前記複数のＬＥＤと対向し且つ前記円の中心軸上に配置され、順番に点灯された前記複数のＬＥＤの異なる方向からの光により前記培養細胞を順番に撮像する撮像部と、
   前記撮像部により順番に撮像された前記異なる方向からの複数の細胞画像の階調値の平均値をピクセル毎に求め、各細胞画像毎に、細胞画像の階調値と前記平均値との差分の絶対値を偏り度とし、この偏り度を前記複数の細胞画像について加算して各ピクセルの偏り度利用画像を得る画像処理部と、
   を備えることを特徴とする複数点照明による培養細胞観察システム。
3. 円周上に略等間隔に配置され、順番に点灯する複数のＬＥＤと、
   培養細胞が収納された容器を挟んで前記複数のＬＥＤと対向し且つ前記円の中心軸上に配置され、順番に点灯された前記複数のＬＥＤの異なる方向からの光により前記培養細胞を順番に撮像する撮像部と、
   前記撮像部により順番に撮像された前記異なる方向からの複数の細胞画像の階調値の最大値と最小値とをピクセル毎に求め、各ピクセル毎に前記最大値から前記最小値を減算して差分画像を得る画像処理部と、
   を備えることを特徴とする複数点照明による培養細胞観察システム。
4. 前記複数のＬＥＤの各々が前記円の中心から等距離になるように前記複数のＬＥＤを移動調整するＬＥＤ移動調整部を備えることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の複数点照明による培養細胞観察システム。