JP5869340B2 - 多糖−及びポリペプチド−ベースのブロック共重合体、これらの共重合体により構成されるベシクル、及びその使用 - Google Patents
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Description
前記多糖鎖の一端にアルキン官能基を導入するよう、多糖を還元的アミノ化するステップ、
前記ポリペプチド鎖の一端にニトリド官能基を導入するステップ、及び
共通の溶媒中で、前記多糖鎖及び前記ポリペプチドをカップリングするステップ、
からなるステップを含んでなる。
前記ポリペプチド鎖の一端にアルキン官能基を導入するステップ、
前記多糖鎖の一端にニトリド官能基を導入するよう、多糖を還元的アミノ化するステップステップ、及び
共通の溶媒中で、前記多糖鎖及び前記ポリペプチドをカップリングするステップ、
からなるステップを含んでなる。
−医療画像化:診断剤、例えば造影剤、同位元素、蛍光プローブ
−化粧品及び衛生:嗅覚分子、色素、着色料、抗酸化剤、抗細菌剤、防臭剤、皮膚軟化剤、角質除去剤、水和剤等;
−クリーニング及び洗浄:界面活性剤、着色料、抗酸化剤、抗細菌剤、防臭剤、漂白剤等;
−植物保護化学:殺有害生物剤、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、増殖促進剤等、
−食品工業:着色物質、香味促進剤等、
−有機化学:有機、金属又は無機触媒誘導体等、
又はミセルベシクルに分子を封入することが望まれる任意の他の活動分野、ここで任意の他の活動分野は、生体吸収性又は生分解性及び生体適合性の利点を提供する分野である。
ニトリド官能基を有するポリ(L−グルタミンγベンジル)(PBLG−ニトリド)の調製
6 g (22.81 mmol)のL−グルタミンγベンジル N−カルボキシアンヒドリドを、真空下で事前に炎に当てたSchlenk型のフラスコに、アルゴン雰囲気下導入し、60 mlの無水DMF中に溶解させる。溶液を10分間攪拌し、57 μLの1−アジド−3−アミノプロパン(570 μmol)を窒素でパージしたシリンジを用いて添加する。溶液を、室温真空下で40時間攪拌する。ポリマーをジエチルエーテルから沈殿により回収し、その後真空下で乾燥させる。回収した生成物の質量は4.2 g(収率70%)である。プロトンNMR分光分析による解析から、数平均重合度23であることがわかる。1H NMR分析(CDCl3: 重水素化トリフルオロ酢酸, 85: 15): 1.8 ppm (N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 1.9 及び 2.1 ppm (-CH2-CH2-CH-, 2H); 2.5 ppm (-CH2-CO, 2H); 2.6 ppm (N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 3.4 ppm (N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 4.6 ppm (-NH-CH-CO-, 1H); 5.1 ppm (-CH2-C6H5, 2H); 7.3 ppm (-C6H5, 5H); 7.9 ppm (NH, 1H)。
数平均重合度が10であるヒアルロン酸(2.2 g; 6×10-4 mol)を、酢酸塩バッファ(pH=5.6)に溶解させ、2重量%の濃度とする。2.82 mL (4.4×10-2 mol)のプロパルギルアミン及び2.77 g (4.4×10-2 mol)のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを、混合物を攪拌させながら添加する。50℃で攪拌しながら5日間の反応後、反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、400 mLの冷メタノールから沈殿させる。固体を遠心分離により除去し、冷却メタノールで洗浄し、過剰なプロパルギルアミン及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムを除去する。その後、真空下で2日沈殿物を乾燥させる。回収した生成物の質量は、2.2 g(収率100%)である。1H NMR分析 (D2O): 3.35 ppm (C(2)H, GlcA); 3.59 ppm (C(3)H, GlcA); 3.72 ppm (C(5)H, GlcA); 3.73 ppm (C(4)H, GlcA); 4.48 ppm (C(1)H, GlcA); 2.03 ppm (CH3, 3H, GlcNAc); 3.50 ppm (C(5)H, GlcNAc); 3.55 ppm (C(4)H, GlcNAc); 3.72 ppm (C(3)H, GlcNAc); 3.86 ppm (C(2)H, GlcNAc); 3.90 ppm (C(6)H, GlcNAc); 4.54 ppm (C(1)H, GlcNAc); 8.22 (NH, GlcNAc); 3.72 ppm (C(3)H, β, GlcNAc); 3.83 ppm (C(2)H, β, GlcNAc); 3.91 ppm (C(3)H, α, GlcNAc); 4.05 ppm (C(2)H, α, GlcNAc); 4.73 ppm (C(1)H, β, GlcNAc); 5.16 ppm (C(1)H, α, GlcNAc); 8.41 ppm (NH, α, GlcNAc); 8.47 ppm (NH, β, GlcNAc)。
2等量のアルキン化ヒアルロン酸(2.1 g; 4.2×10-4 mol)及び1等量のPBLGニトリド(1.05 g; 2.1×10-4 mol)を、70 mLの無水DMSOに溶解させる。混合物を20分間攪拌し、その後、87.04 μLのペンタメチルジエチレントリアミン(4.1×10-4 mol)を窒素雰囲気下で添加する。その後、混合物を凍結/融解のサイクルにより3回脱気し、窒素下でCuBr(60 mg; 4.18×10-4 mol)を含有するSchlenk型フラスコに移す。反応混合物を60℃で3日間攪拌し、その後、50kDaのカットオフ閾値を特徴とする6 Spectra/Pro(登録商標)透析膜を用いて、pH 3.5 のmilliQ水に対して透析する。その後、共重合体を遠心分離により回収し、真空下で2日間乾燥させる。回収した生成物の質量は、1.5 g(収率70%)である。1H NMR分析 (DMSO d6 - 60°C): 1.8 ppm (CH3, GlcNAc); 1.9 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 2.05 及び 2.25 ppm (-CH2-CH2-CH-, 2H); 2.5 ppm (CH2-CO-, 2H); 2.65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 3.1 ppm (C(2)H, GlcA); 3.2 ppm (C(3)H, GlcA); 3.1-3.7 ppm (C(3)H, C(4)H, C(5)H, 3H, GlcNAc); 3.5 及び 3.7 ppm (C(6)H, GlcNAc); 3.1-3.7 ppm (C(4)H, C(5)H, 2H, GlcA); 3.5 及び 3.7 ppm (C(2)H, α 及び β, GlcNAc); 4.2 及び 4.35 ppm (C(1)H, α 及び β, GlcA); 4.58 ppm (C(1)H, GlcNAc); 4.6 ppm (-NH-CH-CO, 1H); 5 ppm (-CH2-C6H5, 2H); 7.25 ppm (-C6H5, 5H); 7.6 ppm (-N3-C(CH2)=CH-, 1H); 8.2 ppm (-NH-CH-CO-, 1H)。
アルキン官能基を有するデキストラン(アルキン化デキストラン)の調製
数平均重合度が40である3 gのデキストラン(4.54×10-4 mol)を、コンデンサーを備えるフラスコに導入し、pH=5に調整した酢酸塩バッファ中でマグネチックスターラ攪拌により溶解させ、ポリマーの最終濃度を2重量%とする。プロパルギルアミンを大過剰に(2.5 g; 4.54×10-4 mol)攪拌しながら添加する。培地が均一になったら、還元剤(NaBH3CN)を大過剰(2.85 g; 4.54×10-4 mol)、反応混合物に添加する。溶液を、槽内で、還元剤の既定量(デキストランに対して25モル等量)を毎日添加しながら、50℃で5日間勢いよく攪拌する。その後、反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、その後、2kDaのカットオフ閾値を特徴とする6 Spectra/Pro(登録商標)透析膜を用いて水に対して透析する。最終的にポリマーを凍結乾燥により回収する。得られたポリマーの質量は2.24 gであり、収率は74重量%である。1H NMR分析(DMSO d6): 3.17 ppm (C(4)H); 3.2ppm(C(2)H); 3.42ppm (C(3)H); 3.5 and 3.75 ppm (C(6)H, 2H); 3.62ppm (C(5)H); 4.5 ppm (C(2)OH); 4.65 ppm (C(1)H); 4.85 ppm (C(3)OH); 4.95 ppm (C(4)OH)。
2等量のアルキン化デキストラン(0.4 g; 6.06×10-5 mol)及び1等量のPBLGニトリド(0.147 g; 3.03×10-5 mol)を。25mLの無水DMSOに溶解させる。混合物を20分間攪拌し、その後、12.6 μLのペンタメチルジエチレントリアミン(6.06×10-5 mol)を窒素雰囲気下添加する。その後、混合物を凍結/融解のサイクルにより3回脱気し、窒素下でCuBr(9 mg; 6.06×10-5 mol)を含有するSchlenk型フラスコに移す。反応混合物を室温で3日間攪拌し、その後、50kDaのカットオフ閾値を特徴とする6 Spectra/Pro(登録商標)透析膜を用いて、milliQ水に対して透析する。その後、共重合体を凍結乾燥により回収する。回収した生成物の質量は0.302 g(収率87%)である。1H NMR分析 (DMSO d6): 1.9 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 2 及び 2.15 ppm (-CH2-CH2-CH-, 2H); 2.45 ppm (CH2-CO-, 2H); 2.65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 3.1 ppm (N3-CH2-CH2-CH2, 2H); 3.15 ppm (C(4)H); 3.17 ppm (C(2)H); 3.42 (C(3)H); 3.5 及び 3.75 ppm (C(6)H, 2H); 3.62 ppm (C(5)H); 4.5 ppm (C(2)OH); 4.65 ppm (C(1)H); 4.88 ppm (C(3)OH)); 4.9-5 ppm (C(4)OH); 7.2 ppm (C6H5, 5H); 8.25 ppm (-NH-CH-CO-, 1H)。
ニトリド官能基を有するポリ(ε−トリフルオロアセチル−L−リジン)(ポリ(ε−トリフルオロアセチル−L−リジン)−ニトリド)の調製
2 g (7.46×10-3 molのε−トリフルオロアセチル−L−リジン N−カルボキシアンヒドリドを、真空下で事前に炎に当てたSchlenk型のフラスコに、アルゴン雰囲気下導入し、21 mlの無水DMF中に溶解させる。溶液を10分間攪拌し、9 μLの1−アジド−3−アミノプロパン(94 μmol)を窒素でパージしたシリンジを用いて添加する。溶液を、室温真空下で40時間攪拌する。ポリマーをジエチルエーテルから沈殿により回収し、その後真空下で乾燥させる。回収した生成物の質量は1.5 g(収率70%)である。プロトンNMR分光分析による解析から、数平均重合度64であることがわかる。1H NMR分析(DMSO d6): 1.1-2 ppm (-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H); 3.12 ppm (CO-NH-CH2-, 2H); 3.8ppm (CO-CH-NH, 1H); 8.2 ppm (-NH-CH-CO-, 1H); 9.3 (CF3-CO-NH-, 1H)。
2等量のアルキン化デキストラン(0.4 g; 6.06×10-5 mol)及び1等量のポリ(ε−トリフルオロアセチル−L−リジン)ニトリド(0.271 g; 3.03 10-5 mol)を、30 mLの無水DMSOに溶解させる。混合物を20分間攪拌し、その後、12.6 μLのペンタメチルジエチレントリアミン(6.06×10-5 mol)を窒素雰囲気下で添加する。その後、混合物を凍結/融解のサイクルにより3回脱気し、窒素下でCuBr(9 mg; 6.06×10-5 mol)を含有するSchlenk型フラスコに移す。反応混合物を室温で3日間攪拌し、その後、50kDaのカットオフ閾値を特徴とする6 Spectra/Pro(登録商標)透析膜を用いて、milliQ水に対して透析する。凍結乾燥後、回収した生成物の質量は、0.320 g(収率67%)である。1H NMR分析 (DMSO d6): 1.1-2 ppm (-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H); 3.12 ppm (CO-NH-CH2-, 2H); 3.15 ppm (C(4)H); 3.17 ppm (C(2)H); 3.42 (C(3)H); 3.5 及び 3.72 ppm (C(6)H, 2H); 3.62 ppm (C(5)H); 3.8ppm (CO-CH-NH, 1H); 4.5 ppm (C(2)OH); 4.65 ppm (C(1)H); 4.88 ppm (C(3)OH)); 4.9-5ppm (C(4)OH); 8.2 ppm (-NH-CH-CO-, 1H); 9.3 (CF3-CO-NH-, 1H)。
実施例1から得たヒアルロン酸−連結基−ポリ(L−グルタミン酸γベンジル)を、5 mg/mの濃度で、55℃でDMSOに溶解させ、トリスバッファ(10 mM, pH=7.4; [NaCl] = 145 mM)の1容量中に、シリンジポンプ(18 mL/h)を用いて、共重合体の終濃度が1 mg/mLまで注入する。有機溶媒を、2kDaのカットオフ閾値を特徴とする透析膜(6 Spectra/Pro(登録商標))を用いて、milliQ水に対して透析する。ベシクル溶液を得て、これを動的及び静的光散乱、小角中性子散乱、及び透過型電子顕微鏡で特徴付けする。
実施例2から得られたデキストラン−連結基−ポリ(L−グルタミン酸γベンジル)共重合体を、0.5 mg/mLの濃度で1mLのDMSOに溶解させ、その後、9mLのmilliQ水を、攪拌しながらシリンジポンプ(18 mL/h)を用いて徐々に添加する。その後、DMSOを、2kDaのカットオフ閾値を特徴とする6 Spectra/Pro(登録商標)透析膜を用いて、milliQ水に対して透析することにより除去する。形成されたベシクルを、動的及び静的光散乱、及び透過型電子顕微鏡で分析する。
ドキソルビシン及びドセタキセルを、ナノ沈殿により、実施例1から得られたヒアルロン酸−連結基−ポリ(L−グルタミン酸γベンジル)に基づくミセルベシクルに封入した。
封入の効率=(充填されたベシクル中の活性成分の質量/活性成分の初期質量)×100
結果を以下の表1に示す。
所望の量(例えば、1 mg/mLの濃度で4 mL量)の、ドキソルビシン及びドセキタキセルを封入したベシクルを、透析チューブ(Spectra/Por(登録商標)、Float−Lyzer(登録商標)、透析チューブ、25kDaの分子量カットオフ閾値、直径10mm、容量10mL)に注ぐ。透析チューブを50mL測定シリンダー中に垂直に置く。系を37℃±2に維持し、蒸発を防ぐためにパラフィンで覆う。所望の浸透圧条件を維持するために、各サンプル時間で、透析チューブの外部から2mLを取り、同じ容量のトリスバッファで置き換えた。
毒性及びインビトロでの放出の試験を、11%のドキソルビシンを含有する、実施例6で調製したヒアルロン酸−連結基−ポリ(L−グルタミン酸γ−ベンジル)ジブロック共重合体に基づくベシクルを用いて行った。
細胞相互作用を、蛍光顕微鏡によりインビトロで観察した。このため、C6細胞を16mmの4ウェルを有するプレート中でインキュベートした(15×104細胞)。4.54 μMの濃度でドキソルビシンを含有するベシクルを、5%CO2の制御雰囲気中、37℃で、4時間、6時間及び24時間インキュベートした。各々の観察時間について、細胞をPBSバッファで2回洗浄し、PBSバッファ中の4%のパラホルムアルデヒド(PF4)で顕微鏡カバースリップに固定し、30分間暗所で室温中に置き、その後、PBSバッファで1回、純水で1回洗浄する。顕微鏡観察を、Zeiss蛍光顕微鏡(倍率×63;λ励起 = 546nm and λ発光 = 590nm)を用いて行う。
実施例1から得られるヒアルロン酸−連結基−ポリ(L−グルタミン酸γ−ベンジル)ジブロック共重合体の1%(w/v)分散体を使用した。
この分散体を、3匹のウサギの健常な皮膚の領域に4時間、半密封包帯下0.5mLの用量で塗布した。
実験プロトコルは、2002年4月24日付けのOECD指令番号404、及び指令EC440/2008の検査方法B.4である。
実施例1から得られるヒアルロン酸−連結基−ポリ(L−グルタミン酸γ−ベンジル)ジブロック共重合体の1%(w/v)分散体を使用した。
共重合体の分散体を、メスマウス系列の耳背部表面に塗布した。
各々4匹の動物からなる3群を、3連続日(D1、D2、D3)、未希釈検査分散体(100%)の50μl(1耳当たり25μl)で処置し、一方で、ジメチルホルムアミド(DMF)で希釈した検査分散体を25%及び50%の濃度で処置した。4匹の動物からなる補助的群を、DMFで処置した。
6日目に、耳に流れるリンパ節のリンパ球の増殖が、細胞計数により決定付けられた。
実験プロトコルは、2002年4月24日付けのOECD指令番号429、及び指令EC440/2008の検査方法B.42に従って確立された。
a)検査動物及びコントロール動物のいずれにも、致死又は全身毒性の兆候は観察されなく、
b)25%、50%及び100%の濃度で皮膚反応は観察されなかった。
結果は、本発明による共重合体の分散体は、3つの検査濃度で非刺激性であることを示す。
実施例1から得られるヒアルロン酸−連結基−ポリ(L−グルタミン酸γ−ベンジル)ジブロック共重合体の1%(w/v)分散体を使用した。
共重合体の分散体を、10mL/kgの投与量で、オス及びメスのスイスマウスに静脈から投与した。調製物の密度を考慮すると、この投与は、10g/kgの容量に相当する。
結果は、本発明による共重合体の分散体の静脈経路による最大耐性容量(MTD)は、マウスにおいて10g/kg超であることを示す。
CD44受容体を大量に発現するMCF−7ヒト細胞系列を使用した。
ヒアルロン酸の特定受容体を介するエンドサイトーシスによる、封入されたドキソルビシンの細胞内在化を確認するために、細胞の表面上のヒアルロン酸受容体の一定限度ブロックするように、インキュベーション培地に遊離ヒアルロン酸を最初に添加することにより競合的阻害検査を行った。血清無し培地中の40mm直径のディッシュに、濃度2mg/mLで遊離ヒアルロン酸(MW=5000 g/mol)の存在下又は不存在下、純ドキソルビシン又は実施例6から得られるミセルベシクル中に封入されたドキソルビシン(ドキソルビシン濃度=10 μM)と共に、37℃で1時間インキュベートした。
その後、細胞をPBSバッファで2回洗浄し、遠心分離より(1000rpmで10分)回収した。その後、細胞を測定前に300μLのPBSバッファ中に再懸濁した。
サンプルを、FACS Caliburフローサイトメーター(Beckton Dickinson)で回収し、製造業者により供給されるCell Questソフトウェアを用いて分析した。各分析について、少なくとも10000細胞を計数した。
図9は、遊離ヒアルロン酸の存在下又は不存在下で、封入ドキソルビシン(黒カラム)及び遊離ドキソルビシン(灰色カラム)の存在下、及びドキソルビシン無し(斜線カラム)でのインキュベーション後に測定されたMCF−7細胞中、任意単位(AU)で測定した相対蛍光強度を示す。
結果は、遊離ドキソルビシンについては、遊離ヒアルロン酸の存在下でのインキュベーションは、内在化に対して効果がほとんど無いか、全く無いことを示す(平均蛍光強度の顕著な減少はない)。
反対に、封入ドキソルビシンについて、遊離ヒアルロン酸の存在下で、蛍光強度が顕著に減少する。
これらの結果は、ドキソルビシンの細胞内送達をさせる、本発明のヒアルロン酸に基づくミセルベシクルのエンドサイトーシスにおける、ヒアルロン酸受容体の役割を示す。
1/実験プロトコル
8週齢のメスSprague-Dawleyラット(120-140 g)を腫瘍退縮の研究に使用した。
治療後30日で研究を終了した。
治療された腫瘍を有する動物の生存率の観察を、治療後60日まで継続した。
図10は、遊離ドキソルビシン(記号−▽−により表される曲線)、封入ドキソルビシン(記号−□−により表される曲線)又はPBS(記号−●−により表される曲線)での処置後、時間の関数による腫瘍容量の変化を示す。
図11に提示されるKaplan-Meier生存曲線は、各点が平均±平均(n=6)の標準誤差を示し、静脈投与により、封入ドキソルビシン(実直線)、遊離ドキソルビシン(破直線)及びコントロール群(点直線)を投与された動物について、処置開始後の動物の生存時間を示す。
結果は、封入ドキソルビシンで処置した動物については、60日で致死が無いことを示す。
ドキソルビシンの主要で周知な副作用の一つは、その心臓毒性である。これは、特定の酵素の産生、主に乳酸脱水素酵素及びクレアチンキナーゼを測定することにより評価することができる。
この心臓毒性の減少は、封入ドキソルビシンを用いた場合に観察された副作用及び致死の顕著な低減と一致する。
Claims (9)
- 5〜100単位を含んでなる天然又は合成単糖単位のブロック、及び5〜100単位を含んでなる天然又は合成ペプチド単位のブロックにより構成される、多糖−連結基(block)−ポリペプチドであるジブロック共重合体であって、前記多糖がヒアルロン酸であり、前記共重合体が直線構造であり、多糖のブロックとペプチドのブロックがそれらの末端で連結されている、前記ジブロック共重合体。
- 10〜100単糖単位、及び10〜100ペプチド単位を含んでなる、請求項1に記載の共重合体。
- 10〜50単糖単位、及び10〜50ペプチド単位を含んでなる、請求項2に記載の共重合体。
- 前記ポリペプチドを構成するアミノ酸が光学活性体L又はD、又はラセミ体DLであり得るポリペプチドが、ポリ(グルタミン酸ベンジル)、ポリ(グルタミン酸アルキル)、ポリ(トリフルオロアセチル−リジン)、ポリ(サルコシン)、ポリ(ヒドロキシエチル−アスパラギン)、ポリ(ヒドロキシアルキル−アスパラギン)、ポリ(ヒドロキシアルキル−アスパルトアミド(aspartamide))、ポリ(アスパラギン酸ベンジル)、及びその誘導体から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の共重合体。
- 生理的条件下で、前記多糖が親水性であり、且つ前記ポリペプチドが疎水性である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の共重合体。
- 前記ポリペプチドが、ポリ(L−グルタミン酸γ−ベンジル)及びポリ(ε−トリフルオロアセチル−L−リジン)から選択される、請求項5に記載の共重合体。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の多糖−連結基−ポリペプチドであるジブロック共重合体の調製方法であって、
前記多糖鎖の一端にアルキン官能基を導入するよう、多糖を還元的アミノ化するステップ、
前記ポリペプチド鎖の一端にニトリド官能基を導入するステップ、及び
共通の溶媒中で、前記多糖鎖及び前記ポリペプチドをカップリングするステップ、
からなるステップを含んでなる方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の多糖−連結基−ポリペプチドであるジブロック共重合体の調製方法であって、
前記ポリペプチド鎖の一端にアルキン官能基を導入するステップ、
前記多糖鎖の一端にニトリド官能基を導入するよう、多糖を還元的アミノ化するステップステップ、及び
共通の溶媒中で、前記多糖鎖及び前記ポリペプチドをカップリングするステップ、
からなるステップを含んでなる方法。 - 前記ニトリド又はアルキン官能基の導入を、二官能性剤により行う、請求項7又は8に記載の方法。
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