FR2937974A1 - Copolymeres a blocs a base de polysaccharide et de polypeptide, les vesicules constituees de ces copolymeres et leur utilisation - Google Patents

Copolymeres a blocs a base de polysaccharide et de polypeptide, les vesicules constituees de ces copolymeres et leur utilisation Download PDF

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Abstract

L'invention concerne un nouveau type de copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide, biorésorbable ou biodégradable et biocompatible, son procédé de préparation, les vésicules micellaires constituées de ce copolymère, et leur utilisation pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation, et le ciblage de molécules d'intérêt.

Description

L'invention concerne un nouveau copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide, biorésorbable ou biodégradable et biocompatible, son procédé de préparation, les vésicules micellaires constituées de ce copolymère, et leur utilisation pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation, et le ciblage de molécules d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique.
Il existe naturellement chez les organismes vivants des structures vésiculaires résultant de l'assemblage de biomolécules amphiphiles formées à partir de lipides, de protéines et de carbohydrates. Ces vésicules naturelles sont de taille variable, les plus grandes jouant le rôle de membranes qui protègent le contenu intracellulaire de l'environnement extracellulaire, alors que les petites vésicules lipidiques jouent un rôle de transporteur de biomolécules à l'intérieur de la cellule. Des structures vésiculaires stables ont pu être préparées par synthèse, en commençant par les liposomes dans les années 1960, obtenus par assemblage de phospholipides naturels ou synthétiques, jusqu'aux récentes vésicules de polymères formées par l'assemblage de copolymères à blocs synthétiques, appelées polymersomes (B.M.Discher et al., Science 1999, 284, 1143). Les polymersomes semblent très prometteurs pour le développement d'applications biomédicales, notamment pour le transport d'agents thérapeutiques ou comme microréacteurs mimant le comportement des cellules vivantes. De plus, les polymersomes présentent de nombreux avantages par rapport aux liposomes, notamment une concentration critique d'agrégation plus faible, une structure vésiculaire unilamellaire ou multilamellaire associée avec une faible dispersion de taille, et une stabilité membranaire plus élevée diminuant la fuite passive des molécules encapsulées.
De plus, la diversité chimique des copolymères à blocs permet d'envisager des possibilités infinies de modification des propriétés de la vésicule pour la conformer à l'application souhaitée. La plupart des polymersomes rapportés dans la littérature ont été formés par assemblage de composés synthétiques amphiphiles, comme, par exemple, le polylactide-bloc-poly(oxyde d'éthylène), le poly(butadiène)-b/ocpoly(oxyde d'éthylène), la polycaprolactone-bloc-poly(oxyde d'éthylène) et la poly(2-méthyloxazoline)-bloc-poly(diméthylsiloxane)-bloc-poly(2-méthyloxa- zoline), très étudiés du fait de la biocompatibilité ou de la biorésorbabilité de leurs blocs respectifs. L'intérêt scientifique s'est ensuite porté sur des assemblages comportant des blocs naturels, tels que des polypeptides ou des polysaccharides. En particulier, l'intérêt pour des assemblages de polypeptides repose sur le fait qu'ils présentent des propriétés physicochimiques uniques : ils sont optiquement actifs par nature, biocompatibles et biodégradables dans certains cas, peuvent servir à mimer des séquences polypeptidiques naturelles, et sont capables de subir des transitions conformationnelles réversibles selon les conditions de pH et/ou de température. Les copolypeptides à blocs représentent une sous-classe particulière associant deux blocs synthétiques polypeptidiques qui combinent une capacité d'auto-assemblage et de structures tridimensionnelles hautement ordonnées. Ils ont été décrits dans la littérature comme des matériaux prometteurs pour des applications telles que les biocapteurs, l'ingénierie tissulaire ou la libération sélective de principes actifs. La chimie des copolymères à blocs à base de polypeptides a été étudiée de manière approfondie dans la littérature, en utilisant la polymérisation par ouverture de cycle des monomères N-carboxyanhydrides (en anglais NCA ) des acides aminés correspondants, amorcée par des dérivés aminés. En adaptant la technique de couplage par cycloaddition 1,3-dipolaire de Huisgen, communément appelée chimie-click (en anglais click-chemistry ), dont le principe repose sur la formation d'une liaison 1,2,3 triazole-1,4 disubstituée, combinant des conditions opératoires douces, la tolérance des groupes
fonctionnels et un rendement élevé, à ce type de copolymères, des copolymères à blocs à base de polypeptides ont été préparés, comme par exemple le poly(L-glutamate de y-benzyle)-bloc-poly(c-trifluoroacetyl-L-Lysine) (D. Taton et S. Lecommandoux, Macromolecular Rapid Communications, 2008, 29, 1147). En utilisant des méthodes chimiques plus conventionnelles, d'autres copolypeptides à blocs ont pu être synthétisés, tels que le poly(L-acide glutamique)-bloc-poly(L-lysine) (J. Rodriguez-Hernandez et S. Lecommandoux, J.A.C.S, 2005, 127, 2026) ou le poly(L-lysine)-bloc-poly(L-leucine) (E.G.
Bellomo et al., Nat. Mater., 2004, 3, 244) ou encore le poly(L-lysine)-bloc- poly(y-benzyl-L-glutamate)-bloc-poly(L-lysine) (H. latrou et al., Biomacromolecules, 2007, 8, 2173). Il est possible d'obtenir par cette chimie des tailles de vésicules très variables, allant de 100 nm à quelques pm, en faisant varier les conditions opératoires, jusqu'à des vésicules géantes allant jusqu'à 50 pm utilisées comme modèles des membranes de cellules vivantes. La chimie des copolymères blocs à base de polysaccharides a fait l'objet de plus rares études, du fait de sa complexité. Récemment, un procédé de synthèse de copolymère dibloc dextrane-bloc-polystyrène par polymérisation radicalaire contrôlées par transfert d'atome (en anglais ATRP ) a été rapportée (C.Houga et al., Chem. Commun., 2007, 3063). Le nombre de systèmes copolymères à blocs basés sur des sucres qui a été étudié est limité, et il existe peu d'informations disponibles sur leur comportement en solution et leurs propriétés.
Par exemple, il a été décrit que le dextrane-bloc-poly(ccaprolactone) s'auto-assemble dans l'eau en structures micellaires polydisperses ayant un diamètre moyen d'environ 100 nm (J. Liu et al., Carbohydrate Polymers, 2007, 69, 196). Cependant, il n'a jamais été décrit ni suggéré dans la littérature de 30 copolymères à blocs combinant dans une seule chaîne linéaire un segment polypeptidique et un bloc polysaccharide.
L'invention a donc pour objet, selon un premier aspect, un copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide constitué d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques.
Par copolymère à blocs , comme par copolymère dibloc , on entend une structure linéaire dans laquelle un bloc polysaccharide et un bloc polypeptide sont reliés par leurs extrémités. Avantageusement, le copolymère dibloc polysaccharide-blocpolypeptide selon l'invention est biorésorbable ou biodégradable et biocompatible. Dans la suite de la description, les expressions bloc d'unités saccharidiques , bloc polysaccharide ou polysaccharide peuvent être utilisées indifféremment pour désigner un enchaînement d'unités monomères saccharidiques formant un polysaccharide ou un dérivé de polysaccharide. De même, on utilisera indifféremment les expressions bloc d'unités peptidiques , bloc polypeptide ou polypeptide pour désigner un enchaînement d'unités monomères peptidiques formant un polypeptide ou un dérivé de polypeptide. Le copolymère dibloc selon l'invention peut comprendre tout type de polysaccharide naturel ou synthétique, ou d'un de ses dérivés, et tout type de polypeptide naturel ou synthétique, ou d'un de ses dérivés. Par dérivés de polysaccharide , on entend les composés issus d'une modification chimique d'un polysaccharide, susceptible de conférer, par exemple, un caractère hydrophobe à un polysaccharide naturellement hydrophile, ou, éventuellement, d'ajouter de nouveaux groupes fonctionnels sur la molécule. De tels dérivés peuvent être, par exemple, des dérivés esters ou éthers, en particulier des esters organiques; des esters inorganiques tels que les phosphates ou les sulfates; des dérivés éthers non ioniques, tels que, par exemple, les dérivés alkyles, hydroxyalkyles ou les hydroxyalkylaryles ; les dérivés éthers ioniques, tels que, par exemple, les dérivés sulfopropyles, carboxyméthyles ou les (diéthylamino)éthyles ; ou encore d'autres dérivés tels que les conjugués de polysaccharides, les dérivés para-toluènesulfonate, thiols ou sylilés. Des polysaccharides préférés peuvent être, par exemple, choisis parmi le dextrane, l'acide hyaluronique et leurs dérivés.
Des dérivés de polysaccharides et des procédés de modification de polysaccharides sont décrits, par exemple, dans les ouvrages de référence Polysaccharides I , Adv. Polym. Sci. (2005), 186, et Polysaccharides II , Adv. Polym. Sci. (2006), 205. Par dérivés de polypeptide , on entend les composés issus d'une modification chimique d'un polypeptide, susceptible de conférer, par exemple, un caractère hydrophobe à un polypeptide naturellement hydrophile, ou, éventuellement, d'ajouter de nouveaux groupes fonctionnels sur la molécule. De tels dérivés peuvent être, par exemple, des dérivés esters ou éthers, en particulier des esters organiques; aliphatiques ou aromatiques, des esters inorganiques; des dérivés éthers, tels que, par exemple, les dérivés alkyles ou hydroxyalkyles, des dérivés amides ou imines, etc. Selon un aspect préféré, le copolymère dibloc polysaccharidebloc-polypeptide peut comprendre un bloc polysaccharide qui présente un caractère hydrophile et un bloc polypeptide qui présente un caractère hydrophobe en conditions physiologiques, soit par nature ou par modification chimique lui conférant une hydrophobicité. Selon un autre aspect préféré, le copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide peut comprendre un bloc polysaccharide qui présente un caractère hydrophobe, notamment par modification chimique susceptible de conférer une hydrophobicité à un polysaccharide naturellement hydrophile, et un bloc polypeptide qui présente un caractère hydrophile en conditions physiologiques. De ce fait, les copolymères dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide selon l'invention sont des composés amphiphiles aptes à s'auto-assembler pour former un nouveau type de vésicules micellaires assemblées à base de polymères naturels ou synthétiques. Par rapport aux vésicules existantes,
notamment les liposomes, les applications de ces vésicules à base de copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide offrent de nouvelles possibilités grâce aux propriétés intrinsèques des polymères utilisés. En effet, les vésicules à base de copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide présentent notamment les avantages suivants : un caractère biocompatible et biorésorbable ou biodégradable, une stabilité élevée en solution aqueuse, une capacité à encapsuler des espèces hydrophiles et hydrophobes, et une diversité de fonctions chimiques pouvant être aisément mise à profit pour modifier la surface des vésicules et leur conférer ainsi une propriété particulière telle que l'affinité pour un récepteur biologique. L'utilisation de polysaccharides ou de polypeptides particuliers présentant la propriété d'être des ligands de récepteurs cellulaires permet également de préparer des vésicules micellaires permettant la libération ciblée de molécules d'intérêt, ledit polysaccharide pouvant, de par sa nature, être impliqué dans des mécanismes d'endocytose contrôlée par un récepteur (en anglais Receptor mediated endocytosis ou RME). Les copolymères selon l'invention peuvent comprendre, par exemple, d'environ 10 à environ 50 unités saccharidiques et d'environ 10 à 50 unités peptidiques. Le rapport massique polymère hydrophile/polymère hydrophobe peut être, par exemple, d'environ 1/1. Des copolymères avantageux selon l'invention présentent une masse molaire de 1000 à 50000 g/mole. Le polysaccharide peut être choisi, par exemple, parmi le dextrane, la chitine, le chitosane, l'acide hyaluronique, le pullulane, le fucane, le fucane sulfaté, le succinoglycane, le galactane, l'arabinogalactane, le galactane sulfaté, les alginates, le glucane, l'acide polysialique, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroitine sulfate, l'acharane sulfate, le kératane sulfate, le dermatane sulfate, le xanthane, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, la cellulose, l'agarose, le mannane, les galactomannanes, le curdlane, l'arabinane, les carraghénanes, le schizophyllane et leurs dérivés. : a Iue}slsuoo sadelp sel puaadwoo oc apaooad llpat 'u011uanu1,I uolas apeooad np aniTeweTIe aun uoles •snssap - p s}Iaoap salgl}edw000lq selgepea6apolq no selgegaosaaoiq amdedi(lod -oo/q-aplaegooesi(lod oolglp saaawi(lodoo sep uoi.eaedaad ap apaoaad un 'anaualin }oedse un uolas 'luewale69 awaouoo uol1uanul,1 ~neg sntd a}lo 'Tuepuodsauoo autwe apioe,I ap (VON) aplapAgueÀxogaeo - N aaawouow np 8IOAo ep aanluanno aed uoijesuawÀlod ap apaooad un aed nue qo aa}a inad aplldadAlod al 'u011u9nui,l ep su!J xnV
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Selon une autre alternative du procédé selon l'invention, ledit 10 procédé comprend les étapes consistant à : - introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polypeptidique, - soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne 15 polysaccharidique, et - coupler la chaîne polypeptidique et la chaîne polysaccharidique dans un solvant commun. Le couplage de la chaîne polypeptidique et de la chaîne polysaccharidique, ou inversement, ainsi que les copolymères dibloc à structure 20 linéaire ainsi obtenus, sont représentés schématiquement sur la figure 1. Les aspects préférés de l'invention relatifs aux copolymères dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide, tels que mentionnés plus haut, s'appliquent également à leur procédé de préparation. L'amination réductive peut être effectuée, par exemple, à l'aide 25 d'une amine telle que la propargylamine en présence d'un agent réducteur tel que le borocyanohydrure de sodium. La fonction azoture peut être introduite à l'extrémité de la chaîne polypeptidique à l'aide d'un agent bifonctionnel, tel que le 3-azidoaminopropane, la fonction amine servant à amorcer la polymérisation par 30 ouverture de cycle du monomère NCA de l'acide aminé correspondant. La longueur du bloc polypeptide peut ainsi être contrôlée par le rapport molaire monomère NCA/agent bifonctionnel.
En tant que solvant pour l'étape de couplage de la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique, on peut utiliser, par exemple, un solvant organique tel que le diméthylsulfoxyde (DMSO). Cette réaction est, de préférence, catalysée par des dérivés de cuivre, tel que, par exemple,CuBr, en présence d'un ligand, par exemple le pentaméthyldiéthylènetriamine. La chaîne hydrophile, polypeptide ou polysaccharide, peut être ajoutée en léger excès, de l'ordre de 2 équivalents molaire, puis éliminée par dialyse, afin d'assurer une réaction de couplage quantitative et la formation de copolymères à blocs purs. L'invention concerne également, selon un aspect ultérieur, de nouvelles vésicules micellaires formées à partir de copolymères dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide constitués d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques, reliés par leur extrémité dans une structure de chaîne linéaire, tel que décrits plus haut.
Avantageusement, lesdits copolymères sont biorésorbables ou biodégradables, et biocompatibles. En tant que polysaccharide et polypeptide préférés, il y a lieu de se référer aux aspects préférés de l'invention relatifs aux copolymères dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide, tels que mentionnés plus haut, qui s'appliquent également auxdites vésicules micellaires. Les vésicules micellaires selon l'invention peuvent être préparées par différents procédés usuels tels que, par exemple, la dissolution directe, l'hydratation de film, le procédé d'émulsification/diffusion ou la nanoprécitation. On utilisera de préférence la nanoprécipitation, qui consiste à mélanger une solution de polymère dans un solvant organique miscible à l'eau. L'introduction d'une solution organique du copolymère dibloc selon l'invention dans l'eau sous agitation modérée induit simultanément une séparation de phases et un procédé d'auto-assemblage qui progresse au fur et à mesure que le solvant organique diffuse dans la phase aqueuse, celle-ci étant en excès par rapport à la phase organique. Un solvant organique approprié est, par exemple, le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le formamide. Après élimination du solvant organique par évaporation et/ou dialyse, on récupère les vésicules directement en solution aqueuse. Elles peuvent ensuite être lyophilisées afin de les obtenir sous la forme d'un extrait sec redispersable. Leur taille peut être modulée en ajustant le procédé d'émulsification/diffusion ou de nanoprécitation (sens d'ajout, nature du solvant organique, volume des phases, concentration en copolymère...). Leur taille peut aussi être facilement contrôlée et adaptée en fonction de l'application souhaitée. Elle peut être notamment réduite jusqu'à environ 100nm après formation par action d'ultrasons ou par extrusion sur des membranes de porosité contrôlée lorsqu'on envisage une application biomédicale. Dans d'autres applications, par exemple dans le domaine de la cosmétique, de l'hygiène, du nettoyage ou autres, les vésicules selon l'invention peuvent présenter une taille de l'ordre du pm ou de plusieurs dizaines de pm. Les vésicules micellaires selon l'invention peuvent être caractérisées par diffusion dynamique et statique de la lumière, diffusion de neutrons aux petits angles et microscopie électronique en transmission. De telles techniques pour la caractérisation des systèmes micellaires sont décrites, par exemple, dans G.Riess, Progress in Polymer Science, 2003, 28, 1107. Dans un aspect avantageux, ladite vésicule micellaire formée à partir de copolymères dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide contient au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique. Cette molécule peut être introduite, en fonction de sa polarité, dans la phase aqueuse ou dans la phase organique avant le procédé de nanoprécipitation. Elle est ainsi encapsulée durant le processus de fabrication de la vésicule. Elle peut aussi être introduite après la formation des vésicules par des méthodes de gradient de pH ou d'émulsification/diffusion. Par molécule ayant une activité thérapeutique , on entend, par exemple, une molécule naturelle ou synthétique utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées. De telles molécules peuvent être, par exemple, un principe actif de médicament, tel qu'un antibiotique, un antalgique, un antiinflammatoire, un antitumoral, etc. ou encore un peptide, une protéine, une hormone, une enzyme, un acide nucléique, un oligonucléotide, un antigène, un anticorps, un interféron, un facteur de croissance, un modulateur d'activité enzymatique, un activateur ou un inhibiteur de récepteur cellulaire, une vitamine etc. De telles molécules ayant une activité thérapeutique peuvent être utilisées, par exemple, dans le domaine pharmaceutique ou médical. Par molécule d'intérêt n'ayant pas d'activité thérapeutique , on entend, par exemple, une molécule naturelle ou synthétique qui n'est pas utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées. Le cas échéant, une telle molécule peut néanmoins présenter une activité biologique, notamment vis-à-vis des végétaux ou des microorganismes. On peut citer, à titre d'exemples non limitatifs, les domaines d'application suivants : - l'imagerie médicale : agents de diagnostic, tels que, par 15 exemple, des agents de contraste, des isotopes, des sondes fluorescentes - la cosmétique et l'hygiène : molécules olfactives, pigments, colorants, antioxydants, agents antibactériens, agents antiseptiques, agents émollients, agents exfoliants, agents hydratants, etc; - le nettoyage et la détergence : tensioactifs, colorants, 20 antioxydants, antibactériens, antiseptiques, agents blanchissants, etc; - la phytopharmacie : pesticides, fongicides, herbicides, insecticides, accélérateurs de croissance, etc, - l'agroalimentaire : agents colorants, exhausteurs de goût etc, - la chimie organique : dérivés catalytiques organiques, 25 métalliques ou inorganiques, etc, ou dans tout autre domaine d'activité dans lequel on souhaite encapsuler une molécule dans une vésicule micellaire, celle-ci présentant l'avantage d'être biorésorbable ou biodégradable et biocompatible. L'utilisation des vésicules micellaires formées à partir de 30 copolymères dibloc polysaccharide-b/oc-polypeptide constitués d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités polypeptidiques naturelles ou synthétiques, tel que décrits plus haut pour
l'encapsulation, le transport, la vectorisation et/ou le ciblage d'au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique, représente un autre aspect de l'invention. Avantageusement, les vésicules micellaires selon l'invention sont utilisables aussi bien pour l'encapsulation de molécules hydrophobes que de molécules hydrophiles, car elles possèdent deux compartiments de polarité différente, à savoir la membrane qui est hydrophobe et la cavité interne qui est hydrophile. Par ailleurs, comme l'auto-assemblage des copolymères en vésicules se fait par des interactions faibles, la dissociation des vésicules et la libération concomitante de la molécule d'intérêt encapsulée peut être obtenue dans des conditions définies (salinité, température, pH, hydrolyse, etc.) Selon un aspect préféré de l'invention, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide dans lequel le polysaccharide présente une affinité pour au moins un récepteur cellulaire. Selon un autre aspect préféré de l'invention, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-blocpolypeptide dans lequel le polypeptide présente une affinité pour au moins un récepteur cellulaire.
Dans de tels cas, les vésicules micellaires pourront, avantageusement, être utilisées pour le ciblage d'une molécule d'intérêt. Parmi les polysaccharides de ce type, on peut citer, par exemple, l'acide hyaluronique, qui présente une affinité pour les récepteurs CD44. Les récepteurs CD44 sont présents à des niveaux élevés dans les cellules tumorales de différents carcinomes, mélanomes, lymphomes etc ( Chemistry and Biology of Hyaluronan , H.G. Garg et C.A. Hales Ed. (2004), Chapitre 5, Elsevier Ltd). Des polypeptides intéressants à cet égard sont, par exemple, le poly(acide glutamique) ou le poly(glutamate). En effet, le poly(acide glutamique) ou le poly(glutamate) sont, par exemple, des ligands des récepteurs du glutamate (Mornet C, Briley M, Trends Pharmacol Sci. 1988;9:278û279) ou des récepteurs TLR4 (Poo et al. 22 (2) 517 - The FASEB Journal).
Dans un autre aspect préféré, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide dans lequel ledit polysaccharide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose contrôlée par un récepteur (en anglais Receptor mediated endocytosis ou RME). Alternativement, ladite vésicule micellaire est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide dans lequel ledit polypeptide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose contrôlée par un récepteur.
L'endocytose contrôlée par un récepteur est un mécanisme biologique par lequel des molécules présentes dans l'espace extracellulaire se lient à des récepteurs cellulaires et sont internalisées, permettant également le ciblage d'une molécule d'intérêt. Un polysaccharide intéressant aux fins de l'invention est 15 l'arabinogalactane, qui interagit avec des récepteurs hépatocytaires intervenant dans des mécanismes d'endocytose contrôlée. Des polysaccharides susceptibles d'être impliqués dans des mécanismes d'endocytose contrôlée par un récepteur sont mentionnés, par exemple, dans les brevets US 5 336 506 et 5 554 386. 20 L'invention est illustrée de manière non limitative par les exemples ci-dessous. Exemple 1: préparation d'un copolymère dibloc acide hyaluronique-bloc-pole (L-qlutamate de y-benzyle) 25 Préparation du poly(L-glutamate de y-benzyle) possédant une fonction azoture (PBL G-azoture) 6 g (22,81 mmol) de N-carboxyanhydride de L-glutamate de y-benzyle sont introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk 30 préalablement flammé sous vide, et dissous dans 60 ml de DMF anhydre. La solution est agitée 10 min et 57 pL de 1-azido-3-aminopropane (570 pmol) sont ajoutés au moyen d'une seringue purgée à l'azote. La solution est agitée 40 h sous vide à température ambiante. Le polymère est récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique puis séché sous vide. La masse de produit récupéré est 4,2 g (rendement : 70%) L'analyse par spectroscopie RMN du proton fournit un degré de polymérisation moyen en nombre de 23. Analyse 1H RMN (CDCI3 : acide trifluoroacétique deutéré, 85 : 15) : 1,8 ppm (N3-CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 1,9 et 2,1 ppm (-CH2-CH2-CH- , 2H); 2,5 ppm (-CH2-CO, 2H); 2,6 ppm (N3-CH2-CH2-CH2- , 2H); 3,4 ppm (N3-CH2-CH2-CH2- , 2H); 4,6 ppm (-NH-CHCO- , 1H); 5,1 ppm (-CH2-C6H5 , 2H); 7,3 ppm (-C6H5 , 5H); 7,9 ppm (NH, 1H).
Préparation de l'acide hyaluronique possédant une fonction alcyne (acide hyaluronique alcyné) L'acide hyaluronique (2,2 g ; 4,4.10-4 mol) est solubilisé dans un tampon acétate (pH= 5,6) à une concentration massique de 2 %. 2,82 mL (4,4.10-4 mol) de propargylamine et 2,77 g (4,4.10"4 mol) de borocyanohydrure de sodium sont ajoutés au milieu sous agitation. Après 5 jours de réaction à 50°C et sous agitation le mélange réactionnel est concentré à l'évaporateur rotatif et précipité dans 400 mL de méthanol froid. Le solide est récupéré par centrifugation et lavé au méthanol refroidi pour éliminer l'excès de propargylamine et de borocyanohydrure de sodium. Le précipité est alors séché sous vide pendant 2 jours. La masse de produit récupéré est 2,2 g (rendement : 100 %). Analyse 1H RMN (D2O) : 3,35 ppm (C(2)H, GIcA); 3,59 ppm (C(3)H, GIcA); 3,72 ppm (C(5)H, GlcA); 3,73 ppm (C(4)H, GIcA); 4,48 ppm (C(1)H, GIcA); 2,03 ppm (CH3, 3H, GIcNAc); 3,50 ppm (C(5)H, GIcNAc); 3,55 ppm (C(4)H, GlcNAc); 3,72 ppm (C(3)H, GIcNAc); 3,86 ppm (C(2)H, GlcNAc); 3,90 ppm (C(6)H, GIcNAc); 4,54 ppm (C(1)H, GlcNAc); 8,22 (NH, GIcNAc); 3,72 ppm (C(3)H, (3, GIcNAc); 3,83 ppm (C(2)H, (3, GIcNAc); 3,91 ppm (C(3)H, a, GIcNAc); 4,05 ppm (C(2)H, a, GlcNAc); 4,73 ppm (C(1)H, p, GIcNAc); 5,16 ppm (C(1)H, a, GIcNAc); 8,41 ppm (NH, a, GlcNAc); 8,47 ppm (NH, (3, GIcNAc).
Préparation du copolymère acide hyaluronique-bloc-poly(L-glutamate de y-benzyle) Deux équivalents d'acide hyaluronique alcyné (2,1 g ; 4,2.10-4 mol) et un équivalent de PBLG azoture (1,05 g ; 2,1.10-4 mol) sont solubilisés dans 70 mL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 87,04 pL de pentaméthyldiéthylènetriamine (4,1.10-4 mol) sont ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type schlenk contenant du CuBr (60 mg ; 4,18.10-4 mol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à 60°C pendant 3 jours puis dialysé contre de l'eau milliQ à pH 3,5 en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por caractérisée par un seuil de coupure de 50kDa. Le copolymère est alors récupéré par centrifugation et séché sous vide pendant deux jours. La masse de produit récupéré est 1,5 g (rendement : 70%). Analyse 1H RMN (DMSO d6 û 60°C) : 1,8 ppm (CH3, GIcNAc); 1,9 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H); 2,05 et 2,25 ppm (-CH2-CH2-CH-, 2H) ; 2,5 ppm (CH2-CO-, 2H) ; 2,65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 3,1 ppm (C(2)H, GIcA) ; 3,2 ppm (C(3)H, GIcA) ; 3,1-3,7 ppm (C(3)H, C(4)H, C(5)H, 3H, GlcNAc) ; 3,5 et 3,7 ppm (C(6)H, GlcNAc) ; 3,1-3,7 ppm (C(4)H, C(5)H, 2H, GIcA) ; 3,5 et 3,7 ppm (C(2)H, a et R, GIcNAc) ; 4,2 et 4,35 ppm (C(1)H, a et R, GlcA) ; 4,58 ppm (C(1)H, GlcNAc) ; 4,6 ppm (-NH-CH-CO, 1 H) ; 5 ppm (-CH2-C6H5, 2H) ; 7,25 ppm (-C6H5, 5H) ; 7,6 ppm (-N3- C(CH2)=CH-, 1H) ; 8,2 ppm (-NH-CH-CO- , 1H).
Exemple 2 : préparation d'un copolymère dibloc dextrane-b/ocpoly(L-glutamate de y-benzyle) Préparation du dextrane possédant une fonction alcyne (dextrane alcyné) 3g de dextrane (4,54.10-4 mol) sont introduits dans un ballon équipé d'un réfrigérant et dissous par agitation magnétique dans un tampon acétate ajusté à pH=5 à une concentration finale de polymère de 2% en masse. La propargylamine est ajoutée en large excès (2,5g ; 4,54.10"4 mol) sous agitation.
Une fois le milieu homogène, l'agent réducteur (NaBH3CN) est ajouté au milieu réactionnel en large excès (2,85g ; 4,54.104 mol). La solution est laissée sous vive agitation dans un bain à 50°C pendant 5 jours avec un ajout quotidien d'une quantité définie d'agent réducteur (25 équivalents molaires par rapport au dextrane). Le milieu réactionnel est ensuite concentré par évaporation rotative puis dialysé contre de l'eau en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por caractérisée par un seuil de coupure de 2kDa. Le polymère est enfin récupéré par lyophilisation. La masse de polymère obtenue est 2,24 g, soit un rendement massique de 74%. Analyse 1H RMN (DMSO d6) : 3,17 ppm (C(4)H); 3,2ppm(C(2)H) ; 3,42ppm (C(3)H) ; 3,5 et 3,75 ppm (C(6)H, 2H); 3,62ppm (C(5)H) ; 4,5 ppm (C(2)OH); 4,65 ppm (C(1)H) ; 4,85 ppm (C(3)OH) ; 4,95 ppm (C(4)OH).
Préparation du copolymère dextrane-bloc poly(L-glutamate de y'benzyle)
Deux équivalents de dextrane alcyné (0,4 g ; 6,06.10-5 mol) et un équivalent de PBLG-azoture (0,147 g ; 3,03.10-5 mol) sont solubilisés dans 25mL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 12,6 pL de pentaméthyldiéthylènetriamine (6,06.10-5 mol) sont ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type schlenk contenant du CuBr (9 mg ; 6,06.10"5 mol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 3 jours puis dialysé contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por caractérisée par un seuil de coupure de 50kDa. Le copolymère est alors récupéré par lyophilisation. La masse de produit récupéré est 0,302 g (rendement : 87%). Analyse 1H RMN (DMSO ds) : 1,9 ppm (-N3-CH2-CH2- CH2-, 2H); 2 et 2,15 ppm (-CH2-CH2-CH-, 2H) ; 2,45 ppm (CH2-CO-, 2H) ; 2,65 ppm (-N3-CH2-CH2-CH2-, 2H) ; 3,1 ppm (N3-CH2-CH2-CH2, 2H); 3,15 ppm (C(4)H); 3,17 ppm (C(2)H); 3,42 (C(3)H) ; 3.5 et 3,75 ppm (C(6)H, 2H); 3,62 ppm (C(5)H) ; 4,5 ppm (C(2)OH) ; 4,65 ppm (C(1)H); 4,88 ppm (C(3)OH)) ; 4,9-5 ppm (C(4)OH) ; 7.2 ppm (C6H5, 5H) ; 8,25 ppm (-NH-CH- CO- , 1H).
Exemple 3 : préparation d'un copolymère dibloc dextrane-blocpoly(c-trifluoroacétyl-L-lysine)
Préparation du poly(e-trifluoroacétyl-L-lysine) possédant une fonction 5 azoture (poly(r trifluoroacétyl-L-lysine)-azoture) 2 g (7,46.10"3 mol) de N-carboxyanhydride de s-trifluoroacétyl-L-lysine sont introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk préalablement flammé sous vide, et dissous dans 21 mL de DMF anhydre. La solution est agitée 10 min et 18 pL de 1-azido-3-aminopropane (187 pmol) sont 10 ajoutés au moyen d'une seringue purgée à l'azote. La solution est agitée 40 h sous vide à température ambiante. Le polymère est récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique puis séché sous vide. La masse de produit récupéré est 1,5 g (rendement : 75%). Analyse 1H RMN (DMSO d6) : 1,1-2 ppm (-CHCH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H); 3,12 ppm (CO-NH-CH2-, 2H); 3,8ppm ( CO-CH- 15 NH, 1H) ; 8,2 ppm (-NH-CH-CO- , 1H) ; 9,3 (CF3-CO-NH-, 1H)
Préparation du copolymère dextrane-bloc-poly(s trifluoroacétyl-L-lysine)
Deux équivalents de dextrane alcyné (0,4 g ; 6,06.10-5 mol) et un équivalent de 20 poly(c-trifluoroacétyl-L-lysine)-azoture (0,271 g ; 3,03 10-5 mol) sont solubilisés dans 30mL de DMSO anhydre. Le mélange est agité 20 min puis 12,6 pL de pentaméthyldiéthylènetriamine (6,06.10-5 mol) sont ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange est alors dégazé 3 fois par des cycles de congélation/décongélation et transféré sous azote dans un ballon de type 25 schlenk contenant du CuBr (9 mg ; 6,06.10"5 mol). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 3 jours puis dialysé contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por caractérisée par un seuil de coupure de 50kDa. La masse de produit récupéré après lyophilisation est 0,320 g (rendement : 67%). Analyse 1H RMN (DMSO 30 d6) : 1,1-2 ppm (-CH-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-, 6H); 3,12 ppm (CO-NH-CH2-, 2H) ; 3,15 ppm (C(4)H); 3,17 ppm (C(2)H); 3,42 (C(3)H) ; 3,5 et 3,72 ppm (C(6)H, 2H) ; 3,62 ppm (C(5)H) ; 3,8ppm (CO-CH-NH, 1 H) ; 4,5 ppm (C(2)OH) ;
4,65 ppm (C(1)H); 4,88 ppm (C(3)OH)) ; 4,9-5ppm (C(4)OH) ; 8,2 ppm (-NHCH-CO-, 1 H) ; 9,3 (CF3-CO-NH-, 1H).
Exemple 4: préparation de vésicules micellaires à base de copolymère acide hyaluronique-bloc-poly(L-qlutamate de y-benzyle) Le copolymère acide hyaluronique-b/oc-poly(L-glutamate de y-benzyle) de l'exemple 1 est dissous dans le DMSO à 55°C à une concentration de 5 mg/mL et injecté au moyen d'un pousse seringue à 18mL/h dans un volume de tampon Tris (10 mM, pH=7,4 ; [NaCl] = 145 mM) jusqu'à atteindre une concentration finale en copolymère de 1 mg/mL. Le solvant organique est éliminé par dialyse contre un tampon tris (10 mM, pH=7,4 ; [NaCI] = 145 mM) en utilisant une membrane de dialyse (6 Spectra/Por ) possédant un seuil de coupure en masse molaire de 2kDa. Une solution de vésicules est ainsi obtenue et caractérisée par diffusion dynamique et statique de la lumière, diffusion de neutrons aux petits angles et microscopie électronique en transmission. On obtient ainsi des vésicules polymères de 200nm de rayon avec une faible distribution en taille, et possédant une épaisseur de membrane d'environ 9nm.
La figure 2 représente la distribution en taille des vésicules (rayon hydrodynamique) obtenue par diffusion de la lumière. La figure 3 représente une image de microscopie électronique en transmission obtenue sur ces mêmes vésicules.
Exemple 5: préparation de vésicules micellaires à base de copolymère dibloc dextrane-bloc-poly(L-glutamate de y-benzyle) Le copolymère dextrane-bloc-poly(L-glutamate de y-benzyle) de l'exemple 2 est dissous dans 1 mL de DMSO à une concentration de 0,5mg/mL, puis 9mL d'eau milliQ sont ajoutés progressivement à l'aide d'un pousse seringue à 18mL/h sous agitation. Le DMSO est ensuite éliminé par dialyse contre de l'eau milliQ en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por caractérisée par un seuil de coupure de 2kDa. Les vésicules alors formées sont analysées par diffusion dynamique de la lumière et microscopie électronique à transmission. On obtient ainsi des vésicules polymères de 40 nm de rayon avec une faible distribution en taille.
La figure 4 représente la distribution en taille des vésicules (rayon hydrodynamique) obtenue par diffusion de la lumière. La figure 5 représente une image de microscopie électronique en transmission obtenue sur ces mêmes vésicules.
Exemple 6 : encapsulation d'un principe actif dans une vésicule micellaire La doxorubicine et le docetaxel ont été encapsulés dans des vésicules micellaires à base du copolymère acide hyaluronique-bloc-poly(L-glutamate de y-benzyle) de l'exemple 1 par nanopréciptation.
Le principe actif a été dissous dans du DMSO ou du tampon Tris dans des rapports massiques principe actif : copolymère de 0,1 :1, 0,2 :1 et 0,3 :1. Le copolymère à blocs est solubilisé dans la phase organique de DMSO à 55°C. Cette solution est ajoutée à la solution aqueuse (tampon Tris pH = 7,4) sous agitation continue à 55°C, ou inversement. Le principe actif libre et le DMSO ont été éliminés par dialyse (seuil de coupure en masse molaire de 2kDa) contre du tampon Tris. La quantité de doxorubicine encapsulée (dans la partie hydrophobe ou hydrophile des vésicules) et l'efficacité d'encapsulation ont été déterminées en brisant les vésicules chargées dans un mélange DMSO :Tris (80 :20). Après centrifugation pendant l h, l'échantillon a été filtré et mesuré par spectroscopie UV à 485 nm. La quantification a été effectuée à partir de la courbe de calibration de la doxorubicine dans le mélange DMSO :Tris (80 :20). La quantité de docetaxel encapsulé et l'efficacité d'encapsulation ont été déterminées à partir de la reconstitution d'un extrait sec de vésicule contenant du docetaxel dans de l'éthanol. Ensuite, l'échantillon filtré a été mesuré par spectroscopie UV à 230 nm. La quantification a été effectuée à partir de la courbe de calibration de la doxorubicine dans l'éthanol.
Quantité encapsulée = (masse de principe actif dans la vésicule chargée/masse de vésicule) x100 Efficacité d'encapsulation = (masse de principe actif dans la vésicule chargée/masse initiale de principe actif) x100 Les résultats sont rapportés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 Rapport massique 0,1:1 0,2:1 0,3:1 principe actif :copolymère doxorubicine (phase DMSO) Quantité encapsulée (%) 4,95 0,49 9,74 0,95 11,82 1,12 Efficacité d'encapsulation (%) 49,47 4,94 48,70 4,74 39,41 3,72 doxorubicine (phase aqueuse) Quantité encapsulée (%) 5,32 0,58 10,51 0,32 12,43 1,19 Efficacité d'encapsulation (%) 53,50 6,21 52,56 1,60 41,45 3,97 docetaxel (phase DMSO) Quantité encapsulée (%) 2,77 0,27 9,81 0.66 13,60 0,73 Efficacité d'encapsulation (%) 27,68 2,69 49,07 3.32 46,78 2,32 Les résultats montrent des taux d'encapsulations élevés de l'ordre de 10% et une efficacité d'encapsulation aux alentours de 50%.
Exemple 7: libération d'un principe actif encapsulé dans une vésicule micellaire La quantité voulue (par exemple, un volume de 4mL à une concentration de 1 mg/mL) de vésicules chargées en doxorubicine et docetaxel est versée dans un tube de dialyse (Spectra/Por Float-A-Lyzer , Dialysis Tubes, seuil de coupure en masse molaire de 25kDa, diamètre 10mm, volume 10mL). Le tube de dialyse est introduit verticalement dans un cylindre de mesure de 50 mL. Le système est maintenu à 37°C 2 et couvert de parafilm pour éviter l'évaporation. Afin de maintenir les conditions osmotiques requises, 2 mL ont été prélevés à l'extérieur du tube de dialyse pour chaque temps d'échantillonnage et remplacés par le même volume de tampon Tris. Dans le cas de la doxorubicine, l'échantillonnage est réalisé dans le tube de dialyse, puis réinséré tel quel après analyse.
Pour le docetaxel, l'échantillonnage est réalisé à l'extérieur du tube de dialyse. Le milieu de dialyse contenait 50 mL de tampon Tris (pH 7,4) avec 2% v/v d'éthanol pour augmenter la solubilité du docetaxel libéré et éviter l'agrégation du docetaxel libre. La quantification est effectuée par la courbe de calibration des principes actifs libres dans leurs solvants respectifs. Les profils de libération exprimés en pourcentage de relargage cumulé en fonction du temps (en seconde 1/2) sont représentés sur les figures 6 (doxorubicine) et 7 (docetaxel). Le principe actif libre est représenté par symbole -o- (rond vide) et la libération du principe actif encapsulé est représentée par le symbole -•- (rond plein). Les résultats montrent clairement que la libération de ces deux principes actifs peut être contrôlée sur plusieurs jours avec une cinétique 15 beaucoup plus lente que celle du principe actif libre. La libération semble suivre un modèle de diffusion homogène.
Exemple 8 : libération et toxicité in vitro d'un principe actif encapsulé dans une vésicule micellaire 20 Les expériences de toxicité et de libération in vitro ont été réalisées à partir des vésicules à base de copolymère dibloc acide hyaluronique-bloc-poly(L-glutamate de y-benzyle) préparées dans l'exemple 6, contenant 11 % de doxorubicine. Les expériences in vitro ont été réalisées sur des cellules du 25 gliome C6 du rat, dans un milieu de culture Dulbecco's modified Eagle's (DMEM) contenant 5% de sérum de veau foetal. Les cellules C6 (5.105 cellules) sont placées dans des falcons de 10cm de diamètre et croissent dans 10mI du milieu de culture contenant de la pénicilline (10000 pg/mL), de la streptomycine (10000 pg/mL) et de l'amphotéricine B (25 pg/mL) [Invitrogen Corporation] dans 30 un incubateur à 37°C dans une atmosphère contrôlée à 5% CO2. Pour les tests de viabilité (ou toxicité) cellulaire, les cellules C6 ont été incubées dans une plaque de 24 puits (15.104 cellules par puits), pendant 10
24h. La viabilité a été déterminée par un test classique au sel de tétrazolium MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl tétrazolium). Le tétrazolium qu'il contient est réduit en formazan par la succinate déshydrogénase mitochondriale des cellules vivantes actives. La couleur du milieu passe alors du jaune au bleu-violacé. L'intensité de cette coloration est proportionnelle au nombre de cellules vivantes présentes lors du test. L'analyse est réalisée par spectrophotométrie (U-2800A, HITACHI) en mesurant l'absorbance à 570nm. Les mesures sont normées par une expérience de contrôle, pour lequel le test MTT est réalisé sans cellules. On détermine ainsi la valeur d'IC50 pour un temps de 48h, correspondant à la concentration pour laquelle la moitié des cellules restent viables. Pour la doxorubicine libre, on obtient une valeur de 0,84 pM. Pour les vésicules encapsulant la doxorubicine, une valeur 10 fois supérieure (IC50=8,4 pM) est obtenue. La vésicule seule (sans doxorubicine) n'a présentée aucune toxicité dans les conditions expérimentales (concentration jusqu'à 200 pM, temps jusqu'à 72h).
Exemple 9 : étude de l'internalisation cellulaire des vésicules micellaires contenant un principe actif Le suivi de l'internalisation cellulaire a été réalisé in vitro par microscopie de fluorescence. Pour cela, les cellules C6 ont été incubées (15.104 cellules) dans une plaque de 4 puits de 16mm. Les vésicules contenant la doxorubicine à la concentration de 4,54 pM ont été incubées à des temps de 3h, 6h et 24h à 37°C dans une atmosphère contrôlée à 5% CO2. Pour chaque temps d'observation, les cellules sont lavées 2 fois avec un tampon PBS, fixées sur un couvre-lame de microscope avec 4% de paraformaldéhyde (PF4) en tampon PBS, laissées dans le noir à température ambiante pendant 30min, puis lavées une fois au tampon PBS et une fois à l'eau pure. L'observation microscopique est réalisée avec un microscope de fluorescence Zeiss (grossissement x63 ; Nexcitation = 546nm et Àémission = 590nm). Le suivi en microscopie de fluorescence in vitro sur les cellules C6 après 24h d'incubation en présence des vésicules contenant la doxorubicine est représenté sur la figure 8. Les vésicules contenant la doxorubicine sont internalisées par endocytose. Après 24h d'incubation, on observe une forte accumulation dans les endosomes provenant de l'internalisation des vésicules contenant la doxorubicine. Les cellules montrent des excroissances importantes, qui sont caractéristiques de cette internalisation.

Claims (29)

  1. REVENDICATIONS1. Copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide constitué d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités 5 peptidiques naturelles ou synthétiques.
  2. 2. Copolymère selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend de 10 à 50 unités saccharidiques et de 10 à 50 unités peptidiques.
  3. 3. Copolymère selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit polysaccharide est choisi parmi le dextrane , la chitine, le chitosane, l'acide 10 hyaluronique, le pullulane, le fucane, le fucane sulfaté, le succinoglycane, le galactane, l'arabinogalactane, le galactane sulfaté, les alginates, le glucane, l'acide polysialique, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroitine sulfate, l'acharane sulfate, le kératane sulfate, le dermatane sulfate, le xanthane, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, la cellulose, l'agarose, le 15 mannane, les galactomannanes, le curdlane, l'arabinane, les carraghénanes ,le schizophyllane et leurs dérivés.
  4. 4. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le polypeptide, dans lequel l'acide aminé qui le constitue peut être sous forme optiquement active L ou D ou sous forme racémique DL, est choisi 20 parmi la poly(alanine), la poly(arginine), la poly(asparagine), le poly(acide aspartique), le poly(aspartate), la poly(cystéine), le poly(acide glutamique), le poly(glutamate), la poly(glutamine), la poly(glycine), la poly(histidine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(lysine), la poly(méthionine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la poly(pyrrolysine), la 25 poly(sélénocystéine), la poly(sérine), la poly(thréonine), le poly(tryptophane), la poly(tyrosine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle), la poly(trifluoroacétyl-Lysine), la poly(sarcosine) la poly(hydroxyéthyl- asparagine), la poly(hydroxyalkyl-asparagine), la poly(hydroxyalkyl- aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) et leurs dérivés. 30
  5. 5. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi le dextrane, l'acide hyaluronique et leurs dérivés. 24
  6. 6. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit polysaccharide est hydrophile et ledit polypeptide est hydrophobe en conditions physiologiques.
  7. 7. Copolymère selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit polysaccharide est hydrophobe et ledit polypeptide est hydrophile en conditions physiologiques.
  8. 8. Copolymère selon la revendication 6 caractérisé en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-glutamate de y-benzyle) et la poly(c-trifluoroacétyl-L-10 lysine).
  9. 9. Copolymère selon la revendication 7 caractérisé en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-acide glutamique) et la poly(L-lysine).
  10. 10. Procédé de préparation d'un copolymère dibloc polysaccharide-blocpolypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce 15 qu'il comprend les étapes consistant à : - soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, - introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polypeptidique, et - coupler la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique dans un 20 solvant commun.
  11. 11. Procédé de préparation d'un copolymère dibloc polysaccharide-blocpolypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à : - introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polypeptidique, 25 - soumettre ledit polysaccharide à une amination réductive de manière à introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, et - coupler la chaîne polypeptidique et la chaîne polysaccharidique dans un solvant commun. 30
  12. 12. Procédé selon l'une des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que l'introduction de la fonction azoture ou alcyne est effectuée à l'aide d'un agent bifonctionnel.
  13. 13. Vésicule micellaire formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide constitué d'un bloc d'unités saccharidiques naturelles ou synthétiques et d'un bloc d'unités peptidiques naturelles ou synthétiques.
  14. 14. Vésicule micellaire selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit copolymère comprend de 10 à 50 unités saccharidiques et de 10 à 50 unités peptidiques.
  15. 15. Vésicule micellaire selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est choisi parmi le dextrane , la chitine, le chitosane, l'acide hyaluronique, le pullulane, le fucane, le fucane sulfaté, le succinoglycane, le galactane, l'arabinogalactane, le galactane sulfaté, les alginates, le glucane, l'acide polysialique, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroitine sulfate, l'acharane sulfate, le kératane sulfate, le dermatane sulfate, le xanthane, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, la cellulose, l'agarose, le mannane, les galactomannanes, le curdiane, l'arabinane, les carraghénanes ,le schizophyllane et leurs dérivés.
  16. 16. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce que le polypeptide, dans lequel l'acide aminé qui le constitue peut être sous forme optiquement active L ou D ou sous forme racémique DL, est choisi parmi la poly(alanine), la poly(arginine), la poly(asparagine), le poly(acide aspartique), le poly(aspartate), la poly(cystéine), le poly(acide glutamique), le poly(glutamate), la poly(glutamine), la poly(glycine), la poly(histidine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(lysine), la poly(méthionine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la poly(pyrrolysine), la poly(sélénocystéine), la poly(sérine), la poly(thréonine), le poly(tryptophane), la poly(tyrosine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle), la poly(trifluoroacétyl-Lysine), la poly(sarcosine) la poly(hydroxyéthyl- asparagine), la poly(hydroxyalkyl-asparagine), la poly(hydroxyalkyl- aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) et leurs dérivés.
  17. 17. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que le polysaccharide est choisi parmi le dextrane, l'acide hyaluronique et leurs dérivés.
  18. 18. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est hydrophile et ledit polypeptide est hydrophobe en conditions physiologiques.
  19. 19. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce que ledit polysaccharide est hydrophobe et ledit polypeptide est hydrophile en conditions physiologiques.
  20. 20. Vésicule micellaire selon la revendication 18, caractérisée en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-glutamate de y-benzyle) et la poly(ctrifluoroacétyl-L-lysine).
  21. 21. Vésicule micellaire selon la revendication 19, caractérisée en ce que le polypeptide est choisi parmi le poly(L-acide glutamique) et la poly(L-lysine).
  22. 22. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisée en ce qu'elle contient au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique.
  23. 23. Vésicule micellaire selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'elle est formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide dans lequel le polysaccharide ou le polypeptide présente une affinité pour au moins un récepteur cellulaire.
  24. 24. Vésicule micellaire selon la revendication 23, caractérisée en ce que ledit polysaccharide ou ledit polypeptide est susceptible d'être impliqué dans un mécanisme d'endocytose contrôlée.
  25. 25. Vésicule micellaire selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est utilisée pour la prévention ou le traitement d'une pathologie ou la restauration d'une fonction biologique, in vitro ou in vivo, en particulier chez l'animal, y compris l'être humain, ou encore sur des cellules isolées.
  26. 26. Vésicule micellaire selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est choisie parmi un principe actif de médicament, un peptide, une protéine, une hormone, une enzyme, un acide nucléique, un oligonucléotide, un antigène, un anticorps, un interféron, un facteur de croissance, un modulateur d'activité enzymatique, un activateur ou un inhibiteur de récepteur cellulaire et une vitamine.
  27. 27. Utilisation d'une vésicule micellaire formée à partir d'un copolymère dibloc polysaccharide-bloc-polypeptide selon l'une quelconque des revendications 13 à 26 pour l'encapsulation, le transport, la vectorisation et/ou le ciblage d'au moins une molécule d'intérêt, naturelle ou synthétique, ayant ou non une activité thérapeutique.
  28. 28. Utilisation selon la revendication 27, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est utilisée dans le domaine pharmaceutique ou médical.
  29. 29. Utilisation selon la revendication 27, caractérisée en ce que ladite molécule d'intérêt est utilisée dans au moins un domaine choisi parmi l'imagerie médicale, la cosmétique, l'hygiène, le nettoyage et la détergence, la phytopharmacie, l'agroalimentaire et la chimie organique ou dans tout domaine d'activité dans lequel on souhaite encapsuler une molécule dans une vésicule micellaire .
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