JP5858455B2

JP5858455B2 - 免疫賦活剤、当該免疫賦活剤の製造方法及び茶抽出物の免疫賦活力を増進する方法

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Publication number: JP5858455B2
Application number: JP2011005654A
Authority: JP
Inventors: 真奈美物部; 山本　万里; 万里山本
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2010-01-21
Filing date: 2011-01-14
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2031-01-14
Also published as: JP2011168579A

Description

本発明は、免疫賦活剤、当該免疫賦活剤の製造方法及び茶抽出物の免疫賦活力を増進する方法に関する。

病気予防に関する予防医学という概念が知られており、最近の予防医学において、免疫機能が特に注目されている。免疫機能は生体の恒常性維持に役立っており、この免疫機能を向上させて病気を予防しようという提案がなされている。例えば基礎免疫機能を向上させることにより種々の感染症にかからないようにしたり、非特異的な免疫機能を向上させることにより癌や種々の抗原・微生物・ウイルス等を排除するようにしたり、初期免疫機能を向上させることで、免疫機能全体の改善や、免疫機能の調節、さらに特異的免疫機能のバランスを改善したり、異常な免疫作用によって引き起こされる種々の病態、例えば花粉症、アトピー、自己免疫疾患等を予防又は治療しようとする試みが行われている。

病気予防のための免疫機能の向上には、免疫賦活作用を有する免疫賦活剤が使用される。免疫賦活剤としては、天然由来のものが望まれている。日常的に摂取することが可能であり、副作用の心配が少ないという点で、天然由来のものが望まれている。

免疫賦活作用を有する天然由来の物質として、茶由来成分が知られている。例えば、特許文献１には、ヒト末梢血単核球のＩｇＡ産生増強作用をもつ分子量１万以上の茶葉多糖類が開示されている。特許文献２には、ＩｇＡ産生増強、ＩｇＧ産生増強作用をもつ茶葉カテキン類が開示されている。特許文献３には、ケール加工物と茶を複合したマクロファージ増強剤が開示されている。特許文献４には、大麦若葉と茶を複合したマクロファージ増強剤が開示されている。

特開２００５−２３９５７１号公報特開２００５−２３２１１５号公報特開２００２−２０９５５２号公報特開２００２−０６５２０６号公報特開２００２−２５５８１１号公報特開２００４−０７５６６６号公報

しかし、茶に含まれるカテキン類は免疫抑制作用を有する場合もあることが知られている（例えば、特許文献５、６）。このように茶由来成分の機能としては、免疫賦活作用及び免疫抑制作用が知られているが、いかなる場合にいずれの機能を奏するかは不明である。

本発明は、以上の課題を解決するためになされたものであり、その目的は、茶由来の成分を含み、優れた免疫賦活作用を有する免疫賦活剤、当該免疫賦活剤の製造方法、及び茶抽出物の免疫賦活力を増進する方法を提供することにある。

本発明者らは、エピガロカテキンとエピガロカテキンガレートとの質量比が免疫賦活活性と高い相関を有することを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のものを提供する。

（１）エピガロカテキンとエピガロカテキンガレートとを含み、質量比（エピガロカテキン／エピガロカテキンガレート）が２以上である免疫賦活剤。

（２）前記質量比は２以上３以下である（１）に記載の免疫賦活剤。

（３）前記エピガロカテキン及び前記エピガロカテキンガレートの少なくとも一部が核酸と複合体の状態で存在する（１）又は（２）に記載の免疫賦活剤。

（４）前記核酸がＲＮＡである（３）に記載の免疫賦活剤。

（５）さらに、高分子茶多糖類を含み、前記茶多糖類が核酸と複合体の状態で存在する（１）から（４）のいずれかに記載の免疫賦活剤。

（６）さらに、茶抽出成分を含有する（１）から（５）のいずれかに記載の免疫賦活剤。

（７）貪食能増進剤、ＩｇＡ産生促進剤の群から選ばれる少なくとも一種である（１）から（６）のいずれかに記載の免疫賦活剤。

（８）免疫賦活剤を製造する方法であって、Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓに属する茶葉、Ｃａｍｅｌｌｉａｔａｌｉｅｎｓｉｓに属する茶葉及びＣａｍｅｌｌｉａｉｒｒａｗａｄｉｅｎｓｉｓに属する茶葉から選択される少なくとも一種の茶葉から−４℃以上３０℃以下の抽出溶媒で茶抽出物を得る茶抽出物製造工程と、前記茶抽出物から免疫賦活剤を製造する免疫賦活剤製造工程と、を有する免疫賦活剤の製造方法。

（９）前記抽出溶媒が２０℃以下の水である（８）に記載の免疫賦活剤の製造方法。

（１０）前記茶抽出物製造工程において、抽出時間が１時間以上２４時間以下である（８）又は（９）に記載の免疫賦活剤の製造方法。

（１１）前記茶葉は、幼葉である（８）から（１０）のいずれかに記載の免疫賦活剤の製造方法。

（１２）茶抽出物中のエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートとの、質量比を調整することにより茶抽出物の免疫賦活力を増進する方法。

（１３）さらに、前記エピガロカテキン及び前記エピガロカテキンガレートの少なくとも一部を核酸と複合体の状態で存在させる（１２）に記載の茶抽出物の免疫賦活力を増進する方法。

本発明の免疫賦活剤は、天然由来成分である特定のカテキンを含み、その特定のカテキンの組み合わせにより優れた免疫賦活作用を有する。このため、本発明の免疫賦活剤によれば、体内の免疫機能を充分に高めることができ、副作用の問題が少なく、効果的に病気にかかることを予防することができる。

本発明の免疫賦活剤の製造方法は、茶葉から特定の種類のカテキンを特定の質量比で抽出できる。その結果、本発明の免疫賦活剤の製造方法によれば、優れた免疫賦活作用を有する免疫賦活剤を容易に製造できる。

本発明の茶抽出物の免疫賦活力を増進する方法は、茶抽出物中のエピガロカテキンとエピガロカテキンガレートとの、質量比を調整することで、茶抽出物の免疫賦活力を容易に高めることができる。

評価Ａのマクロファージの貪食作用活性化評価結果を示す図である。評価ＢのＩｇＡ産生促進評価結果を示す図である。評価Ｃのマクロファージの貪食作用活性化評価結果を示す図である。評価Ｃの分子量分画カラムを用いたＨＰＬＣ分析結果を示す図である。評価Ｃの核酸量の測定結果、核酸の種類の確認結果を示す図である。評価Ｄのマクロファージの貪食作用活性化評価結果を示す図である。評価Ｅのカテキンの種類の分析結果を示す図である。評価ＥのＩｇＡ産生促進評価結果を示す図である。評価Ｆの分泌型ＩｇＡ含量の変化を示す図である。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略する場合があるが、発明の要旨を限定するものではない。

以下、本発明について、免疫賦活剤、免疫賦活剤の製造方法、茶抽出物の免疫賦活力を増進する方法の順で説明する。

＜免疫賦活剤＞
本発明の免疫賦活剤は、エピガロカテキン（ＥＧＣ）とエピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）とを含み、これらのカテキンの質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２以上である。これにより、本発明の免疫賦活剤は、マクロファージの貪食作用を活性化でき、マクロファージによるウイルス等の異物を取り込む効果を促進できる。そして、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が１の場合にはこれらのカテキンが核酸と複合体を形成してもマクロファージの貪食作用を充分には活性化しない。

ＥＧＣ、ＥＧＣＧは、従来公知の茶等の天然物質に含まれる成分である。このため、本発明の免疫賦活剤は、副作用の問題が少なく、日常的に摂取することができる。

ＥＧＣ、ＥＧＣＧとしては、茶等の天然物質から抽出したものを用いてもよいし、合成したものを用いてもよい。茶等の天然物質から抽出した場合には、ＥＧＣ、ＥＧＣＧ以外の成分も含まれる可能性が高いが、ＥＧＣとＥＧＣＧの質量比が上記の範囲内であれば、本発明の効果を奏する。なお、本発明の免疫賦活剤においては、茶葉から抽出して得られたものを用いることが好ましい。茶葉にはＥＧＣ、ＥＧＣＧの両者が含まれ、茶葉から所定の抽出条件で茶抽出物を得ることで、容易に所望のＥＧＣ、ＥＧＣＧの混合物が得られるからであり、また、茶葉に含まれるＲＮＡは、後述する通り、ＥＧＣ及びＥＧＣＧと複合体を形成して、免疫賦活力の増進に寄与するからである。茶葉としては、例えば、Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓに属する茶葉、Ｃａｍｅｌｌｉａｔａｌｉｅｎｓｉｓに属する茶葉及びＣａｍｅｌｌｉａｉｒｒａｗａｄｉｅｎｓｉｓに属する茶葉が挙げられる。

上記質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）は、ＩｇＡの産生も促進できる点で３以下であることが好ましい。ＩｇＡは、強力な病原性をもつ微生物の腸管粘膜への結合を阻害する作用、細菌毒素と特異的に結合してその作用を不活化する作用、アレルゲンとして作用する食餌性の抗原と結合し消化管壁を通過することを防止してアレルギ−反応を抑制する作用等を有することが知られている。ただし、マクロファージの貪食作用を活性化する用途に着目すると、上記質量比は３以上であることが好ましい。

本発明の免疫賦活剤に含まれるＥＧＣ及びＥＧＣＧは、ＥＧＣ及びＥＧＣＧの少なくとも一部が核酸と複合体の状態で存在することが好ましい。これにより、マクロファージの貪食作用がさらに活性化できるため、本発明の免疫賦活剤はさらに優れる。

免疫賦活剤に含まれるＥＧＣとＥＧＣＧとの質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）と、複合体を形成するＥＧＣとＥＧＣＧとの質量比（複合体の状態で存在するＥＧＣの質量／複合体の状態で存在するＥＧＣＧの質量）とは、ほぼ等しいと推測される。

ここで、複合体とは、ＥＧＣ、ＥＧＣＧと核酸とが化学的、電気的等の相互作用を介して挙動を共にする集合体を指し、必ずしも結合体である必要は無い。

ＥＧＣ、ＥＧＣＧと複合化する核酸は、特に限定されないが、例えばＲＮＡ、ＤＮＡが挙げられる。これらの中でもＲＮＡが好ましく、複合体の形成によるマクロファージの貪食作用活性化の効果がさらに高まる点で高分子茶多糖類に含まれるｓｓＲＮＡが最も好ましい。なお、核酸はＥＧＣ、ＥＧＣＧ等のカテキン類とともに茶葉から抽出してもよいし、ＥＧＣ、ＥＧＣＧを所定の質量比で含む混合物に核酸を外部から添加してもよい。なお、分子量分画カラムに通す条件は実施例に記載の条件とする。

本発明の免疫賦活剤は、高分子茶多糖類をさらに含み、その高分子の茶多糖類が核酸と複合体を形成した状態で存在していることが好ましい。これにより、マクロファージの貪食作用を活性化する効果が高まる。核酸の種類、好ましい核酸は上記のものと同様である。なお、高分子の茶多糖類と核酸の複合体の存在は、茶多糖類を分子量分画カラムに通したときに検出されるピークの中で、最も大きなピークと同じ位置に核酸のピークが検出されることで確認できる。

本発明では、上記成分の含有量は特に限定されないが、本発明の効果を充分に得るためには、ＥＧＣは４０ｍｇ以上（より好ましくは６０ｍｇ以上）含み、ｓｓＲＮＡを１０質量％以上（より好ましくは１５質量％以上）含む茶多糖類を５ｍｇ以上（より好ましくは１５ｍｇ以上）含む組成物が好ましい。

本発明の免疫賦活剤は、さらに茶抽出成分を含むことが好ましい。これにより、上記マクロファージの貪食作用を活性化する作用、ＩｇＡの産生を促進する作用が向上する。茶抽出成分としては、茶に含まれるＥＧＣ、ＥＧＣＧ以外のカテキン類、茶に含まれるアミノ酸、たんぱく質等が挙げられる。

本発明の免疫賦活剤は、本発明の効果を害さない範囲であれば、上記以外の成分を含有してもよい。上記以外の成分としては、例えば、Ｌ−アスコルビン酸やアスコルビン酸ナトリウムのような酸化防止剤、香料、各種エステル類、有機酸類、有機酸塩類、無機酸類、無機酸塩類、無機塩類、色素類、乳化剤、保存料、調味料、甘味料、酸味料、果汁エキス類、野菜エキス類、花蜜エキス類、ｐＨ調整剤、品質安定剤等の添加剤が挙げられ、これらを単独、あるいは併用してもよい。

本発明の免疫賦活剤の製造方法としては、特に限定されず、従来公知の方法で茶等の天然物質からＥＧＣ、ＥＧＣＧ等の各成分を単離してもよいし、各成分の一部又は全部を合成してもよいし、全ての所望成分を含む天然物質から成分を抽出することにより製造してもよい。全ての所望成分を含む天然物質から抽出する方法は、本発明の免疫賦活剤を容易に製造することができるため好ましい。その一例について、以下説明する。

＜免疫賦活剤の製造方法＞
免疫賦活剤の製造方法は、茶抽出物製造工程と免疫賦活剤製造工程とを有する。以下、茶抽出物製造工程、免疫賦活剤製造工程の順で説明する。

茶抽出物製造工程では、Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓに属する茶葉、Ｃａｍｅｌｌｉａｔａｌｉｅｎｓｉｓに属する茶葉及びＣａｍｅｌｌｉａｉｒｒａｗａｄｉｅｎｓｉｓに属する茶葉から選択される少なくとも一種の茶葉から−４℃以上３０℃以下の水で茶抽出物を得る。

使用する茶葉は幼葉、成熟葉のいずれであってもよいが、カテキンや茶多糖類と複合体を形成する活性の高いＲＮＡ（例えば、ｓｓＲＮＡ）を多く含み、免疫賦活剤の貪食作用をさらに高める点で、幼葉であることが好ましい。ここで言う幼葉とは、芽（心）から三葉までを指す。

上記の茶葉について、種苗法に基づいて登録されている茶品種を例示すると、星野緑、おくゆたか、司みどり、たかねわせ、さとう早生、おくひかり、めいりょく、ふくみどり、いなぐち、寺川早生、みねかおり、みなみかおり、しゅんめい、さえみどり、茶中間母本農１号、ふうしゅん、みなみさやか、さわみずか、べにふうき、ほくめい、みねゆたか、松寿、摩利子、三重緑萌１号、あさのか、藤かおり、山の息吹、茶中間母本農２号、さがらひかり、さがらみどり、香駿、さがらかおり、さがらわせ、さきみどり、りょうふう、みどりの星、むさしかおり、りょくふう、茶中間母本農３号、成里乃、奥の山、はるみどり、つゆひかり、みえうえじま、そうふう、さいのみどり、みやまかおり、はるもえぎ、きら香、鳳春、展みょう、さやまかおり、さやまみどり、おくみどり、やまとみどり等が挙げられる。

また、茶葉は、生葉であっても、萎凋処理等の前処理したものであってもよい。前処理は、不発酵、半発酵等の、いずれの方法によるものでもよい。半発酵茶までは単量体カテキンが残存しているという理由から不発酵茶、半発酵茶のいずれも使用できる。不発酵茶としては緑茶（煎茶、玉露、かぶせ茶、番茶、玉緑茶、碾茶、抹茶、ほうじ茶等）、半発酵茶としてはウーロン茶、包種茶等が挙げられる。本発明においては、単量体カテキンが生葉とほとんど変わらず保持されているという理由で緑茶、包種茶が好ましい。

また、上記温度範囲の水を用いることで、茶抽出物に含まれるＥＧＣ、ＥＧＣＧの質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）は、２以上３以下になりやすい。上記質量比が２以上３以下の範囲にあれば、ＩｇＡの産生も促進されるため、茶抽出物は優れた免疫賦活剤になる。特に、−４℃以上２０℃以下の水で上記茶葉を抽出することで、上記質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）を３に近づけることができ、ＩｇＡの産生を促進する作用がさらに高まるため、さらに優れた免疫賦活剤が得られる。なお、０℃以上１０℃以下の温度範囲の水を用いることが、より効果の高い免疫賦活剤を得る観点から最も好ましい。

また、−４℃以上３０℃以下の温度範囲の水を用いることで、茶葉から抽出されるＲＮＡは活性が高くなる。活性の高いＲＮＡは、単独では茶抽出物中で不安定であり、カテキンと複合化しやすい傾向にあるため、茶抽出物中に質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２以上の状態で存在するＥＧＣ及びＥＧＣＧと複合体を形成すると推測される。そして、この複合体がマクロファージの貪食作用を活性化させるため、優れた免疫賦活剤が得られる。特に、４℃以上２０℃以下、好ましくは４℃以上１０℃以下、より好ましくは約４℃の水を用いることで、茶多糖類と活性の高いＲＮＡとの複合体により奏されるマクロファージの貪食作用活性の効果が高まる。

本工程において、茶葉から茶抽出物を抽出する時間（抽出時間）は特に限定されないが、１時間以上２４時間以内であることが好ましい。抽出時間が１時間以上であれば、ＥＧＣ、ＥＧＣＧを充分な量抽出しやすく、ＥＧＣ／ＥＧＣＧを３以下に抑えやすいため好ましい。抽出時間が４時間以内であればＥＧＣに遅延してＥＧＣＧが抽出されることを防ぎやすいため好ましい。

抽出溶媒としては、有効物質が水溶性の点で水を単独で使用することが好ましいが、本発明の効果を害さない範囲で、抽出溶媒である水に水以外の溶媒を含有させて用いることができる。水以外の溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール等の極性有機溶媒が挙げられる。また、酸化重合等によるカテキン類の減少を防ぐ為にアスコルビン酸等の抗酸化性物質を添加してもよい。

抽出に用いる抽出溶媒の量は、特に限定されず、使用する茶葉の種類、茶葉の量等によって、適宜好ましい量に設定できるが、茶葉（質量）の１０倍量以上４０倍量以下の抽出溶媒を用いることが、充分な溶出率を得られるという理由で好ましい。

なお、茶葉から茶抽出物を得る具体的な抽出手順は特に限定されず、静置抽出、振とう抽出、抽出機を用いた抽出等従来公知の方法に従ってよい。

次いで、免疫賦活剤製造工程について説明する。免疫賦活剤製造工程では、上記の茶抽出物製造工程で得られた茶抽出物から免疫賦活剤を製造する。

本工程で得る免疫賦活剤の剤型としては、液剤、散剤、顆粒、錠剤、糖衣錠、カプセル、トローチ剤、シロップ剤等が挙げられる。目的となる剤型に応じて、茶抽出物を従来公知の方法で加工することにより、所望の剤型の免疫賦活剤を得ることができる。

また、本工程では、茶抽出物又は茶抽出物を粉末化等させたものを、医薬品、医薬部外品、動物用飼料に含有させてもよい。茶抽出物等の医薬品等への添加は、特に限定されず従来公知の方法で行うことができる。

＜免疫賦活力を増進する方法＞
本発明の免疫賦活力を増進する方法は、ＥＧＣ、ＥＧＣＧの質量比を調整することで茶抽出物の免疫賦活力を増進する。従来からカテキン類の中には免疫賦活作用を有するもの、免疫抑制作用を有するものが知られているが、特定のカテキン、特定のカテキンの組み合わせが免疫賦活作用、免疫抑制作用を有することが知られているのみである。どのカテキンをどのような組み合わせで使用すれば、免疫賦活力が増進するかについて知られていなかったため、免疫賦活力を増進させるためには無数の組み合わせを検討する必要があり、多大な時間と手間がかかっていた。本発明者は、ＥＧＣとＥＧＣＧの質量比を調整することで、マクロファージ貪食作用を活性化できること、ＩｇＡの産生を促進できることを見出した。本発明によれば、ＥＧＣとＥＧＣＧの質量比を調整するという容易な工程で、茶抽出物の免疫賦活力を増進することができる。

ＥＧＣとＥＧＣＧの質量比を調整する方法は、特に限定されないが、例えば、使用する茶葉、茶抽出物の抽出条件（抽出温度、抽出時間等）を調整すればよい。また、例えば、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が１の茶抽出物にＥＧＣを添加する方法、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が１．５の茶抽出物にＥＧＣを添加する方法、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２の茶抽出物にＥＧＣを添加する方法、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が３の茶抽出物にＥＧＣを添加する方法、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が４の茶抽出物にＥＧＣＧを添加する方法、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が３の茶抽出物にＥＧＣＧを添加する方法等、茶抽出物にＥＧＣ、ＥＧＣＧ等のカテキンを添加する方法でも調整可能である。

茶抽出物中のＥＧＣの質量をＥＧＣＧの質量に対して増加させることで、茶抽出物の免疫賦活力は増進される。免疫賦活力が増進されるＥＧＣとＥＧＣＧの好ましい質量比等は、上記の免疫賦活剤の発明で説明したものと同様であるため、説明を省略する。

本発明の方法においては、ＥＧＣ及びＥＧＣＧの少なくとも一部を核酸と複合体の状態で存在させることにより、茶抽出物の免疫賦活力をさらに増進することができる。本発明者は、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２以上で茶抽出物中に含まれるＥＧＣと核酸、ＥＧＣＧと核酸が複合体を形成することで、マクロファージの貪食作用が活性化される点を見出した。本発明の方法によれば、ＥＧＣと核酸、ＥＧＣＧと核酸とが複合体の状態で茶抽出物中に存在することで、容易に茶抽出物の免疫賦活力を増進することができる。

ＥＧＣと核酸とを複合体の状態にする方法、ＥＧＣＧと核酸とを複合体の状態にする方法は、特に限定されない。通常、茶葉から抽出された核酸は、茶抽出物中で不安定であり、カテキンと核酸とは複合化しやすいため、特別な操作を行わなくても、カテキンと核酸とが混合した状態にあれば、カテキンと核酸とは複合化すると推測される。

核酸、複合体等については、本発明の免疫賦活剤で説明したものと同様であるため説明を省略する。

以下、本発明の実施例について説明するが、この実施例は現時点で最良と考えられるデータ等を挙げたものである。したがって、本発明はこの実施例に限定されるものではない。

＜評価Ａ＞
［実施例１Ａ〜３Ａ、比較例１Ａ］
評価Ａで使用したＥＧＣ、ＥＧＣＧは、茶から分離して得られたカテキンであり、茶に含まれる活性の高いｓｓＲＮＡは含まない。評価Ａでは培養液中のＥＧＣとＥＧＣＧの合計が１００μｇ／ｍＬになるように、実施例１Ａ〜３Ａ、比較例１Ａを表１に示すように調製した。

［貪食作用活性化の評価］
実施例１Ａ〜３Ａ、比較例１Ａの免疫賦活剤について、マクロファージの貪食作用の活性化評価を行った。具体的には以下の方法で行った。
１０％ＦＢＳ及び１２０ｎｍｏｌカルシトリオールを含有させたＲＰＭＩ１６４０培地でＨＬ−６０細胞を７日以上培養し、４８ｗｅｌｌプレートに２．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ／２５０μＬになるよう分取した。分取した細胞を３７℃に加温し、濃度調整したＹＧ蛍光ビーズを２５μＬずつ加え、さらに実施例１Ａ〜３Ａ及び比較例１Ａ〜４Ａの免疫賦活剤を２５μＬ（培養液中で必要な濃度の１２倍量濃度。例えばＥＧＣを培養液中で５０μｇ／ｍＬにしたい場合は６００μｇ／ｍＬ濃度のＥＧＣを２５μＬ添加する。）添加し、シェイカー（１１００ｒｐｍ、３０秒）で混和した。３７℃、５％ＣＯ_２の環境下で１６時間培養し、培養終了後、２％ホルムアルデヒドを用いて細胞を固定し、フローサイトメーター（ＦＣＭ（ＦＬ１）；ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ製）にて蛍光ビーズから貪食した細胞を測定した。結果は、総細胞数に対する蛍光ビーズ貪食細胞数の比を、対照品を１００％として相対値で表し、対照品より高い値を示すものを活性ありとし、対照品との有意差検定にはＰａｉｒｅｄ−ｔ−ｔｅａｔを用いた。評価結果を図１に示した。なお、対照品には滅菌水（ＤＷ）を用いた。

図１の結果から明らかなように、ＥＧＣとＥＧＣＧの質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２以上であれば、マクロファージの貪食作用が活性化されることが確認された。

＜評価Ｂ＞
［実施例１Ｂ〜３Ｂ、比較例１Ｂ〜６Ｂ］
評価Ｂでは、ＥＧＣ、ＥＧＣＧの質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）を、以下の表２に記載される通り調製した。使用したＥＧＣ、ＥＧＣＧは評価Ａで使用したものと同様である。

実施例１Ｂ〜３Ｂ及び比較例１Ｂ〜６Ｂについて、ＩｇＡの産生促進効果の評価を行った。具体的には以下の方法で行った。
使用動物は、ＢＡＬＢ／ｃマウス雌７週齢で、２４℃、６０％湿度のコンベンショナル環境下で飼育した。明期は７：００−１９：００、暗期は１９：００−７：００までとし、飼料と水はマウスに自由に摂取させた。マウスには、２週間連続で、１日１回１ｍＬ（ＥＧＣ、ＥＧＣＧの総量１ｍｇ相当）の実施例及び比較例の免疫賦活剤、対照品のＤＷを経口投与した。屠殺後、小腸からパイエル板を分離し、注射器用プランジャーの底を利用して潰し、パイエル板細胞を得た。パイエル板細胞をナイロンメッシュでろ過後、２回洗浄し、１０％非働化ＦＢＳ含有のＲＰＭＩ１６４０培養液に浮遊させ、９６ウエルプレートに５×１０^５ｃｅｌｌｓ／２００μＬとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータ内で５日間培養した。５日後、細胞上清中のＩｇＡ含量をＥＬＩＳＡ法で測定した。（ｃａｐｔｕｒｅ抗体：ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＡ（Ｚｙｍｅｄ）、１０００倍希釈，ｂｌｏｃｋｉｎｇ：１％ＢＳＡ，ｄｅｔｅｃｔ抗体：ｇｏａｔａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅＩｇＡｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（Ｚｙｍｅｄ）、２０００倍希釈、ＡＢＴＳ溶液で発色、１．５％シュウ酸で反応停止）。ＩｇＡは免疫賦活の指標として使用した。評価結果は図２に示した。なお、効果はＤＷの効果を１００％としたときの、それぞれの効果を％で表した。

図２から明らかなように、ＥＧＣとＥＧＣＧの質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２以上３以下の範囲にあれば、ＩｇＡの産生が促進されることが確認された。
評価Ａ、Ｂの結果から明らかなように、ＥＧＣとＥＧＣＧの質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２以上３以下であれば、マクロファージの貪食作用を活性化するとともにＩｇＡの産生も促進する。したがって、ＥＧＣとＥＧＣＧの質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２以上３以下の免疫賦活剤であれば、さらに優れた免疫賦活剤になる。

＜評価Ｃ＞
［実施例１Ｃ］
幼葉から茶抽出物を抽出した。抽出条件は以下の通りである。
幼葉としてはやぶきた緑茶の芽（心）から三葉を用い、抽出溶媒としては４℃の水を茶葉の質量に対して１０倍量用い、抽出時間は６０分とした。
上記の方法で得られた茶抽出物から茶多糖類をエタノール沈殿法で抽出した。得られた茶多糖類を実施例１Ｃとした。なお、後述する通り、茶多糖類には、ｓｓＲＮＡが含まれている。

［実施例２Ｃ］
成熟葉から茶抽出物を抽出した。抽出条件は幼葉の代わりに成熟葉（四〜五葉）を用いた以外は、実施例１Ｃと同様である。また、実施例１Ｃと同様にして茶抽出物から茶多糖類を抽出した。

［比較例１Ｃ］
緑茶の茎から茶抽出物を抽出した。抽出条件は幼葉の代わりに緑茶の茎を用いた以外は、実施例１Ｃと同様である。また、実施例１Ｃと同様にして緑茶の茎の抽出物から茶多糖類を抽出した。なお、緑茶の茎は実施例１Ｃ、２Ｃで使用したものと同じ品種の茶の茎である。

実施例１Ｃ、２Ｃ、比較例１Ｃについて、マクロファージの貪食作用の活性化評価を行った。具体的には評価Ａと同様の方法で行った。

実施例１Ｃ、２Ｃ、比較例１Ｃについて、分子量分画カラムを用いたＨＰＬＣ分析を行った。茶多糖類の分析結果を図４（ａ）に示し、ＲＮＡの分析結果は図４（ｂ）に示した。なお、分析条件は以下の通りである。
装置：ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ−１０ｓｙｓｔｅｍ（ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ）
カラム：ＳｈｏｄｅｘＯＨｐａｋＳＢ−８０６ＭＨＱｃｏｌｕｍｎ
溶離液：ＤＷ
検出器：茶多糖類については示差屈折率検出器（商品名「ＲＩＤ−１０Ａ」、島津製作所社製）
ＲＮＡについてはＵＶ検出器（商品名「ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ」、島津製作所社製）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：２５℃
注入量：１０μＬ

実施例１Ｃ、２Ｃ、比較例１Ｃについて、エチジウムブロマイド染色による核酸量の測定を行った。測定結果を図５（ａ）に示した。なお、多糖の濃度が１０ｍｇ／ｍＬの水溶液を用い、測定はアガロースゲル電気泳動で行った。

実施例１Ｃについて、茶多糖類をＤＮａｓｅ（ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ分解酵素、タカラバイオ社製）、ＲＮａｓｅ（ｓｓＲＮＡ特異的分解酵素、ニッポン・ジーン社製）で処理して核酸がｓｓＲＮＡであることを確認した。確認はアガロースゲル電気泳動で行った。確認結果を図５（ｂ）に示した。

図３に示される通り、幼葉から抽出した茶多糖類は、貪食作用の活性化効果に優れることが確認された。そして、図４（ａ）から明らかなように、実施例１Ｃ（図４（ａ）中のＩ）、２Ｃ（図４（ａ）中のＩＩ）、比較例１Ｃ（図４（ａ）中のＩＩＩ）では、茶多糖類の分子量分布にほとんど差が無いことが確認された。これに対して、図４（ｂ）の結果から明らかなように、ｓｓＲＮＡの量は実施例１Ｃ（図４（ｂ）中のＩ）が最も多く、次いで、実施例２Ｃ（図４（ｂ）中のＩＩ）、比較例１Ｃ（図４（ｂ）中のＩＩＩ）の順で多い。ｓｓＲＮＡは抽出物中で不安定であり、また、茶多糖類と複合化しやすい性質を有しているため、図４（ａ）に示される実施例１Ｃ、２Ｃ、比較例１Ｃにおける貪食作用を活性化する効果の差は、ｓｓＲＮＡと茶多糖類との複合体の量に関係していることが確認された。

＜評価Ｄ＞
［実施例１Ｄ］
実施例１Ｃと同様の方法で茶多糖類を抽出した。抽出物を実施例１Ｄとした。

［比較例１Ｄ］
抽出温度を１００℃に変更した以外は、実施例１Ｃと同様の方法で茶多糖類を抽出した。抽出物を比較例１Ｄとした。

実施例１Ｄ、比較例１Ｄについて、マクロファージの貪食作用の活性化評価を行った。具体的には評価Ｃと同様の方法で行った。評価結果を図６に示した。

図６（ａ）に示される通り、茶葉から低温の水を用いて得た抽出物から取り出した茶多糖類とＲＮＡとの複合体は、高温の水を用いた場合と比較して、高い貪食作用の活性化効果を示した。

図６（ｂ）には、茶の品種をやぶきたからさえみどりに変更した以外は、上記評価Ｄと同様の方法で、マクロファージの貪食作用の活性化評価を行った結果を示す。図６（ａ）、（ｂ）から、マクロファージの貪食作用の活性化効果は、茶の品種によらず奏することが確認された。

＜評価Ｅ＞
［実施例１Ｅ〜３Ｅ、比較例１Ｅ〜６Ｅ］
やぶきた緑茶の芽（心）から四葉までの葉を用い、抽出溶媒としては４℃の水を茶葉の質量に対して４０倍量用い、抽出時間は６０分として、実施例１Ｅ茶抽出物を作製した。実施例２Ｅ〜３Ｅ、比較例１Ｅ〜６Ｅについても表３に示す抽出温度、抽出時間の条件で同様に行った

実施例１Ｅ〜３Ｅ、比較例１Ｅ〜５Ｅについて、含有するカテキンの種類及び各カテキンの含有率（ｍｇ／１００ｍｌ）について、ＨＰＬＣ分析で評価した。評価結果を図７（ａ）に示した。なお、分析条件は以下の通りである。
（分析条件）
上記抽出液をＤＷで１０倍希釈し、以下の分析条件で測定した。
装置：ＳｈｉｍａｄｚｕＬＣ−１０ｓｙｓｔｅｍ（ＬＣｓｏｌｕｔｉｏｎ）
ガードカラム：ＷａｋｏｐａｋＮａｖｉＣ１８−５（４．６＊１０）
カラム：ＷａｋｏｐａｋＮａｖｉＣ１８−５（４．６＊１５０）
溶離液：移動相Ａ：ＤＷ：アセトニトリル：リン酸を体積比で４００：１０：１
移動相Ｂ：メタノール：移動相Ａを体積比で１：２
検出器：ＳＰＤ−Ｍ１０Ａｖｐ（２４２ｎｍ，ＥＧＣ；２７２ｎｍ，ＥＧＣＧ，ＥＣＧ，＋Ｃ，ＥＣ；、島津社製）
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
注入量：２０μＬ
グラジェント：表４に示す

上記評価結果において、ＥＧＣ及びＥＧＣＧのみに着目し、抽出温度とＥＧＣの抽出量及びＥＧＣＧの抽出量との関係を確認した。確認結果を図７（ｂ）に示した。

実施例１Ｅ、比較例６Ｅについて、ＩｇＡの産生性を促進する作用の比較を行った。ＩｇＡの産生性の評価は、評価Ｂと同様の方法で行った。結果を図８に示した。

図７（ｂ）から明らかなように、抽出溶媒の温度が３０℃以下の範囲であれば、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２以上になる。図１から確認できる通り、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が２以上であれば、マクロファージの貪食作用を活性化する効果が高い。したがって、抽出溶媒の温度を３０℃以下の範囲に設定することで、マクロファージの貪食作用を活性化する効果に優れた茶抽出物が得られる。

また、抽出溶媒の温度が４℃以上３０℃以下の範囲であれば、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）がほぼ３以下である。図２から明らかなように、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）がほぼ２以上３以下であれば、ＩｇＡの産生を促進する効果が高い。したがって、抽出溶媒の温度を４℃以上３０℃以下の範囲に設定することで、ＩｇＡの産生性を高める効果に優れた茶抽出物が得られる。そして、抽出溶媒の温度が４℃以上２０℃以下の範囲であれば、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が約２以上約３以下になる。図３から明らかなように、質量比（ＥＧＣ／ＥＧＣＧ）が３に近づくほど、ＩｇＡの産生を促進する効果が高まるので、抽出溶媒の温度を４℃以上２０℃以下の範囲に設定することが好ましいことが確認された。

また、図６に示される通り、茶葉から低温の水を用いて得た抽出物から取り出した高分子の茶多糖類とＲＮＡとの複合体は、高温の水を用いた場合と比較して、高い貪食作用の活性化効果を示す。したがって、抽出溶媒の温度を低温にすることで、マクロファージの貪食作用もＩｇＡ産生促進作用も極めて高いことが確認された。

＜評価Ｆ＞
被験者に、下記試験食を１日２回（朝（朝食後）・晩（夕食後））摂取させた。試験食摂取前の１４日間と試験食摂取中の１７日間の計３１日間、ほぼ毎日、同時刻（１５時頃）に被験者の唾液を採取した。唾液中の分泌型ＩｇＡ含量を、ＥＬＩＳＡ法で測定した。具体的な測定方法は下記の通りである。なお、採取した唾液は、専用チューブ（Ｓａｌｉｍｅｔｒｉｃｓ社製）に入れて、測定まで−２０℃で保存した。

［試験食］
試験食として、７００ｍｇの煎茶水抽出液乾燥物を用いた。煎茶水抽出液乾燥物７００ｍｇは、水溶性多糖約４０ｍｇ（ｓｓＲＮＡを約１６質量％含む）、総カテキン９０ｍｇ（うち約３０ｍｇがＥＧＣ、約１５ｍｇがＥＧＣＧ）を含む。

煎茶水抽出液乾燥物の製造は、以下の方法で行った。原料として緑茶葉の幼葉を用い、抽出溶媒として４℃の水を茶葉の質量に対して３３倍量用い、抽出時間を６０分とする条件で、茶抽出物を製造した。この茶抽出物を粉末化することで煎茶水抽出乾燥物を得た。

［分泌型ＩｇＡ含量の測定］
捕捉抗体であるＧｏａｔａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ分泌型ＩｇＡ（Ｃａｐｐｅｌ社製）を５０ｍＭの炭酸緩衝溶液で１０００倍に希釈し、９６穴マイクロプレート（住友ベークライト株式会社製、「ＭＳ−８８９６Ｆ」）の各穴に、希釈した捕捉抗体を１００μｌずつ入れ４℃で一晩静置した。静置後各穴を、０．０５％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）溶液を用いて洗浄し、１％ウシ血清アルブミン溶液（１％ＢＳＡ溶液）でブロッキングした。

唾液、又は標準溶液であるＰｕｒｉｆｉｅｄＨｕｍａｎ分泌型ＩｇＡ（Ｃａｐｐｅｌ社製）を、各穴に１００μｌ入れ３７℃で１時間静置した。静置後各穴を、０．０５％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ溶液を用いて洗浄した。

洗浄後の各穴に、検出抗体であるｇｏａｔａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ分泌型ＩｇＡｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（Ｃａｐｐｅｌ社製）を１％ＢＳＡ溶液で２０００倍に希釈したものを、１００μｌずつ入れ３７℃で１時間静置した。静置後各穴を、０．０５％のＴｗｅｅｎを含むＰＢＳ溶液を用いて洗浄した。

洗浄後の各穴に、ＡＢＴＳ溶液（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸をクエン酸緩衝液で２０倍に希釈した溶液）を１００μｌずつ入れ、７分間反応させた。その後、各穴に１．５％のシュウ酸を１００μｌずつ入れ、反応を停止させた。

４１５ｎｍでの吸光度をプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にて測定し、標準試料から作製した校正曲線に照らして、唾液中の分泌型ＩｇＡ含量を算出した。なお、分泌型ＩｇＡ含量とは、唾液１ｍｌあたりの分泌型ＩｇＡの含量を指す。

被験者から採取した唾液中の分泌型ＩｇＡ含量の変化をグラフにし図９に示した。グラフ中のＡＶＥ（破線）は、試験食摂取前の１４日間の唾液中の分泌型ＩｇＡ含量の平均を表す。グラフ中のＳＤ（実線（細線））は、試験食摂取前の１４日間の唾液中の分泌型ＩｇＡ含量の標準偏差を表す。グラフ中の２ＳＤ（実線（太線））は、試験食摂取前の１４日間の唾液中の分泌型ＩｇＡ含量の標準偏差の２倍を表す。

図９のグラフから、試験食の連続摂取により、唾液中に含まれる分泌型ＩｇＡ含量が上昇することが確認された。また、試験食摂取前と摂取中とで、ウェルチのｔ検定を行なったところ、ｐ値は０．０２８であった。なお、他の被験者３名についても同様の評価を行なったところ、試験食摂取により唾液中の分泌型ＩｇＡ含量が上昇する結果が得られた。また、これら３名の分泌型ＩｇＡ含量の変化の傾向は、図９に示されるものと同様であった。

Claims

エピガロカテキンとエピガロカテキンガレートとを含み、
前記エピガロカテキンガレートに対する前記エピガロカテキンの質量比が２以上３以下である免疫賦活剤。
前記エピガロカテキン及び前記エピガロカテキンガレートの少なくとも一部が核酸と複合体の状態で存在する請求項１に記載の免疫賦活剤。
前記核酸がＲＮＡである請求項２に記載の免疫賦活剤。
さらに、高分子茶多糖類を含み、前記高分子茶多糖類が核酸と複合体の状態で存在する請求項１から３のいずれかに記載の免疫賦活剤。
さらに、茶抽出成分を含有する請求項１から４のいずれかに記載の免疫賦活剤。
貪食能増進剤、ＩｇＡ産生促進剤の群から選ばれる少なくとも一種である請求項１から５のいずれかに記載の免疫賦活剤。
エピガロカテキンとエピガロカテキンガレートとを含み、
前記エピガロカテキンガレートに対する前記エピガロカテキンの質量比が２以上である貪食能増進剤。
免疫賦活剤を製造する方法であって、
Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓに属する茶葉、Ｃａｍｅｌｌｉａｔａｌｉｅｎｓｉｓに属する茶葉及びＣａｍｅｌｌｉａｉｒｒａｗａｄｉｅｎｓｉｓに属する茶葉から選択される少なくとも一種の茶葉から４℃以上２０℃以下の水または水に極性有機溶媒を含有する抽出溶媒で茶抽出物を得る茶抽出物製造工程と、
前記茶抽出物から免疫賦活剤を製造する免疫賦活剤製造工程と、を有する、エピガロカテキンガレートに対するエピガロカテキンの質量比が２以上である免疫賦活剤の製造方法。
免疫賦活剤を製造する方法であって、
Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓに属する茶葉、Ｃａｍｅｌｌｉａｔａｌｉｅｎｓｉｓに属する茶葉及びＣａｍｅｌｌｉａｉｒｒａｗａｄｉｅｎｓｉｓに属する茶葉から選択される少なくとも一種の茶葉から４℃以上２０℃以下の水で茶抽出物を得る茶抽出物製造工程と、
前記茶抽出物から免疫賦活剤を製造する免疫賦活剤製造工程と、を有する免疫賦活剤の製造方法。
前記茶抽出物製造工程において、抽出時間が１時間以上２４時間以下である請求項８又は９に記載の免疫賦活剤の製造方法。
前記茶葉は、幼葉である請求項８から１０のいずれかに記載の免疫賦活剤の製造方法。
免疫賦活剤の製造にあたり、その貪食能を増進またはＩｇＡ産生を促進する方法であって、
前記免疫賦活剤は水または水に極性有機溶媒を含有する抽出溶媒で抽出される茶抽出物を含み、
前記茶抽出物中のエピガロカテキンガレートに対するエピガロカテキンの質量比を２以上に調整することを含む方法。
さらに、前記エピガロカテキン及び前記エピガロカテキンガレートの少なくとも一部を核酸と複合体の状態で存在させる請求項１２に記載の方法。