JP5852426B2 - ヘプシジンによる鉄代謝を制御するためのTGF−βスーパーファミリーの化合物の調節因子の使用 - Google Patents
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Description
本出願は、2005年2月16日に出願され、「鉄代謝を制御するための方法および組成物」と題する仮出願第60/653,479号の優先権を主張する。仮出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
鉄は、異常細菌種を除いて、ほとんどすべての生きている生物体の成長および生存にとって必須元素である(P. Aisen et al., J. Biochem. Cell Biol., 2001, 33:940-959(非特許文献1))。それは、酸素運搬および貯蔵において重要な役割を果たし(ヘモグロビンおよびミオグロビンのような酸素結合分子と共同して)、エネルギーの生成(例えば、チトクロム)、様々な代謝中間物の産生に、および宿主防御(例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸[NADPH]オキシダーゼ)に必要とされる酸化還元反応を触媒する多くの酵素の重要な成分である。鉄はまた毒性でありうる。それは、細胞膜、タンパク質、およびDNAを攻撃しうる反応性ラジカル種の発生を触媒し、NF-κB、炎症に関与する遺伝子についての原型転写因子を活性化する(S. Xiong et al., J. Biol. Chem., 2003, 278:17646-17654(非特許文献2))。高レベルにおいて、組織における鉄蓄積は有害である。
本発明は、ヒトを含む哺乳動物において鉄代謝を制御するための改善された系およびストラテジーを提供する。特に、本発明は、鉄欠乏または鉄過剰に関連した状態の処置のための試薬および方法を含む。本発明はまた、鉄代謝障害の処置に有用な化合物の同定のためのスクリーニングツールおよび方法を提供する。鉄補充、鉄キレート化、および瀉血のような現行の治療と比較して、本発明の方法および組成物は、望ましくない副作用を誘導する可能性が高くない。
本明細書中を通して、以下の段落に定義されるいくつかの用語が用いられる。
上で述べられているように、本発明は、哺乳動物において鉄代謝を制御するための改善された系およびストラテジーを提供する。特に、本発明の化合物および方法は、現行の治療より望ましくない副作用を誘導する可能性が低い。
本発明は、TGF-βスーパーファミリーの特定のメンバーが、哺乳動物における鉄代謝の重要なレギュレーターであるヘプシジンの発現を制御することができるという発見を含む。実施例1に記載されているように、本出願人らは、BMP(骨形成タンパク質)シグナル伝達がHepG2肝臓ヘパトーマ細胞においてヘプシジン発現を誘導するが、TGF-β(トランスフォーミング増殖因子-β)シグナル伝達はヘプシジンの発現を抑制することを認識している。さらに、周知のBMPアンタゴニストであるノギンを用いて、出願人らは、BMPシグナル伝達の阻害がヘプシジン発現の低下を生じることを示している。
ヘプシジンは、ごく最近になってヒト尿および血漿限外濾過液から精製された抗菌性質を有する小さなシステインに富む陽イオン性ペプチドである(C.H. Park et al., J. Biol. Chem., 2001, 276:7806-7810; A. Krause et al., FEBS Lett., 2000, 480:147-150)。アミノ酸末端切り詰めにより異なる、20個、22個、または25個のアミノ酸のこのペプチドは、はしご型様式で4つのジスルフィド架橋により連結された2つのアームを有する短いヘアピンを形成する。ヘプシジンは、種間で保存されている8個のシステイン残基を含む(G. Nicolas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, 98:878-885; C. Pigeon et al., J. Biol. Chem., 2001, 276:7811-7819)。ペプチドは最初、尿および血液から単離されたが、ヘプシジンはマウスおよびヒトの両方において肝臓で大部分は発現する。発現はまた、心臓および脳で検出可能であるが、非常に低い程度である(C.H. Park et al., 2001; C. Pigeon et al., 2001)。最近、ヘプシジンはまた、腎臓で発現していることが見出されている(H. Kulaksiz et al., J. Endocrinol., 2005, 184:361-370)。
リガンドのTGF-βスーパーファミリーは、現在、30より多いメンバーを含み、とりわけ、アクチビン、インヒビン、トランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、増殖分化因子(GDF)、骨形成タンパク質(BMP)、およびミュラー管抑制物質(MIS)を含む。これらの分子のすべては、TGF-βと構造的に関連しているペプチド増殖因子である。それらはすべて、剛構造に組織化されている7個の特に保存されたシステイン残基により構成される、システインノットと呼ばれる共通のモチーフを共有する(J. Massague, Annu. Rev. Biochem., 1998, 67:753-791)。古典的なホルモンと違い、TGF-βスーパーファミリーのメンバーは、効果が増殖因子自身と同じくらい標的細胞の型および時期に依存する多機能性タンパク質である。
本発明の特定の態様において、TGF-βスーパーファミリーメンバーはTGF-βである。TGF-βは、広範囲の生物学的過程に関与し(J. Massague, Ann. Rev. Cell. Biol., 1990, 6:597-641)、胚形成、成体組織修復、および免疫抑制中の重要事象において中心的役割を果たす細胞外ポリペプチドである(M.B. Sporn and A.B. Roberts, J. Cell. Biol. 1992, 119:1017-1021; S.W. Wahl, J. Clin. Immunol. 1992, 12:61-74; D.M. Kingsley, Genes Dev. 1994, 8:133-146)。哺乳動物において、TGF-βは生物体のほとんどすべての細胞により産生され、ほとんどすべての細胞はその効果の標的としての役割を果たすことができる。TGF-βは、細胞増殖、細胞分化、アポトーシス、および細胞外マトリックス産生の強力なレギュレーターである。
本発明の他の態様において、TGF-βスーパーファミリーメンバーはBMPである。BMPはもともとは、異所性(すなわち、非骨格)部位で骨形成を誘導するタンパク質であると同定された(A.H. Reddi, Curr. Opin. Genet. Dev., 1994, 4:737-744)。しかしながら、骨および軟骨形態形成におけるそれらの役割に加えて、BMPはまた、目、心臓、血液、肺、腎臓、筋肉、皮膚、および他の組織の生前発育ならびに生後の成長および/または修復に関与している(K.A. Waite and C. Eng, Nat. Rev. Genet., 2003, 4:763-773)。研究は、BMPが、間葉細胞、上皮細胞、造血細胞、および神経細胞を含む様々な細胞型の増殖、アポトーシス、分化、および走化性を制御するにおいて重要な役割を果たすことを示している。(J. Massague and Y.G. Chen, Genes Dev., 2000, 14:627-644; K. Miyazono et al., J. Cell Physiol., 2001, 187:265-276: N. Morrell et al., Circulation, 2001, 104:790-795; A. von Budnoff and K.W.Y. Cho, Dev. Biol., 2001, 239:1-14)。
本発明の方法における使用に適したTGF-βスーパーファミリーメンバーのアゴニストおよびアンタゴニストは、調節が結果としてヘプシジン発現または活性の制御を生じるように、TGF-βスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達活性を調節する(すなわち、増強する、または抑制する)能力を有する任意の化合物または作用物質を含む。
BMPの様々なアンタゴニストは当技術分野において公知である(例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられている、G.J. Thomsen et al., Trends Genet., 1997, 13:209-211; E. Canalis et al., Endocr. Rev. 2003, 24:218-235; V.A. Botchkarev, J. Invest. Dermatol., 2003, 120:36-47;米国特許第6,432,410号参照)。特に、BMPの効果は、BMPを結合し、それによりそれらの特異的な細胞表面受容体への結合を排除することによりBMPシグナル伝達を妨げる1群の分泌ポリペプチドにより調節されうる。本発明の実施における使用に適したBMPアンタゴニストは、限定されるわけではないが、ノギン、コーディン、ベントロプチン(ventroptin)、フォリスタチン、およびフォリスタチン関連遺伝子(FLRG)を含む。他の適したBMPアンタゴニストは、集合的にDANファミリーと名付けられている、セルベルス(cerberus)、グレムリン(gremlin)、カロンテ(caronte)、DAN、Dante、およびスクレロスチン(sclerostin)、ならびに他の構造的に関連したタンパク質を含む(その全体が参照により本明細書に組み入れられている、D. Hsu et al., Mol. Cell, 1998, 1:673-683)。DANファミリーのタンパク質は、TGF-β様因子を含む他の増殖因子にも見出されている、保存されたシステインノットモチーフを有する(J.J. Pearce et al., Dev. Biol., 1999, 209:98-110; C.R. Rodrigez Esteban et al., Nature, 1999, 401:243-251)。しかしながら、他のBMPアンタゴニストは、お互いとの配列類似性を欠く。インビボで、これらのBMPアンタゴニストは、別個の発現プロファイル、様々なBMPアイソフォームに対する異なる親和性を有し、異なる生物学的応答を制御する。
TGF-βシグナル伝達を増強または抑制する複数の天然のモジュレーターが同定されている。TGF-βリガンドの受容体へのアクセスは、リガンドを結合して隔離する可溶性タンパク質LAP、デコリン、およびα2-マクログロブリンにより阻害される(W. Balemans and W. Van Hul, Dev. Biol., 2002, 250:231-250)。TGF-βリガンドの受容体へのアクセスはまた、膜結合型受容体により調節される。BAMBIはI型受容体と競合するデコイ受容体として働く(D. Onichtchouk et al., Nature, 1999, 401:480-485);β-グリカン(TGF-β II型受容体)はTGF-βのII型受容体への結合を増強する(C.B. Brown et al., Science, 1999, 283:2080-2082; J. Massague, Annu. Rev. Biochem., 1998, 67:735-791; E. del Re et al., J. Biol. Chem., 2004, 279:22765-22772);およびエンドグリンは内皮細胞においてTGF-βのALK1への結合を増強する(D.A. Marchuk, Curr. Opin. Hematol., 1998, 5:332-338; J. Massague, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 200, 1:169-178; Y. Shi and J. Massague, Cell, 2003, 113:685-700)。クリプト(cripto)、EGF-CFC GPIアンカー型膜タンパク質はTGF-βリガンド、ノーダル(nodal)、Vg1、およびGDF1のアクチビン受容体への結合を増加させる補助受容体として働くが(S.K. Cheng et al., Genes Dev., 2003, 17:31-36; M.M. Shen and A.F. Schier, Trends Genet., 2000, 16:303-309)、同時にアクチビンシグナル伝達を遮断する。
もう一つの局面において、本発明は、TGF-βスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達活性を調節することにより鉄代謝を制御する化合物の同定のための方法を提供する。本発明はまた、TGF-βスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達活性を調節することによりヘプシジン発現または活性を制御する化合物の同定のための方法を提供する。
本発明のアッセイおよびスクリーニング方法は、任意の型の生体系、すなわち、細胞、生体液、生体組織、または動物を用いて行われうる。特定の態様において、系は、鉄欠乏もしくは鉄過剰を示すことができる生物学的実体(例えば、動物モデル、血液試料、または器官、例えば肝臓、の全体または部分);および/または少なくとも1つのTGF-βファミリーメンバーを発現する生物学的実体(例えば、細胞);および/またはヘプシジンを発現する(例えば、肝細胞)、もしくはヘプシジンを含む(例えば、血液または尿試料)生物学的実体である。
当業者により認識されているように、どんな種類の化合物または作用物質でも本発明の方法を用いて試験されうる。候補化合物は合成または天然の化合物でありうる;それは単一分子、または異なる分子の混合物もしくは複合体でありうる。特定の態様において、本発明の方法は、1つまたは複数の化合物を試験するために用いられる。他の態様において、本発明の方法は、化合物の収集物またはライブラリーをスクリーニングするために用いられる。本明細書に用いられる場合、「収集物」という用語は、化合物、分子、または作用物質の任意のセットを指し、一方、「ライブラリー」という用語は、構造的類似体である化合物、分子、または作用物質の任意のセットを指す。
本発明のスクリーニング方法に従って、鉄代謝を制御する、またはヘプシジン発現を制御する候補化合物の能力の決定は、試験系および対照系において測定されたTGF-βスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達活性を代表する少なくとも1つの因子の比較を含む。
当業者に認識されているように、本発明のスクリーニング方法により同定されたレギュレーターをさらに特徴付けることが一般的に望ましい。
本発明はまた、活性成分として、本発明のスクリーニングアッセイにより同定された、鉄代謝の少なくとも1つのレギュレーター、またはヘプシジン発現もしくは活性の少なくとも1つのレギュレーターの有効量を含む薬学的組成物を提供する。本発明の薬学的組成物は、当技術分野において周知の通常の方法を用いて製剤化されうる。そのような組成物は、活性成分に加えて、薬学的媒体、賦形剤、もしくは媒質として働き、本明細書で「薬学的に許容される担体」と呼ばれる、少なくとも1つの薬学的に許容される液体、半流動体、または固体希釈剤を含む。
もう一つの局面において、本発明は、鉄過剰と関連した状態および鉄欠乏と関連した状態を含む、鉄代謝における撹乱に関連した状態の処置および/または予防のための方法を提供する。これらの方法は、そのような状態を有する、または有する危険性がある被験体に、少なくとも1つのTGF-βスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達活性を調節する化合物の有効量を投与する段階であって、TGF-βスーパーファミリーメンバーのシグナル伝達活性の調節が結果として、被験体においてヘプシジン発現または活性の制御を生じる段階を含む。
本発明の方法を用いて処置および/または予防されうる状態は、鉄代謝における撹乱と関連した任意の疾患、障害、または症候群を含む。鉄代謝における撹乱は、鉄取り込み、鉄吸収、鉄運搬、鉄貯蔵、鉄プロセッシング、鉄動員、鉄利用の1つまたは複数における撹乱と関連しうる。一般的に、鉄代謝における撹乱は、結果として、鉄過剰または鉄欠乏を生じる。
本発明の方法による処置を受けるのに適した被験体は、限定されるわけではないが、上で列挙された疾患および障害を含む、鉄代謝における撹乱と関連した状態と診断されている個体、ならびに鉄代謝における撹乱と関連した状態になりやすい個体を含む。適した被験体は、以前にその状態についての伝統的な処置を受けたことがあってもなかってもよい。
本発明の方法による処置は、単回投与またはある期間に渡っての複数回投与からなりうる。ヘプシジン発現のレギュレーターもしくは鉄代謝のモジュレーター、またはそれらの薬学的組成物はまた、処置あたりデポー型から放出されうる。投与は、注射(皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など)、経口投与、または舌下投与によるような任意の都合の良い様式で行われうる。
研究プロコトール
HepG2肝臓ヘパトーマ細胞におけるヘプシジンmRNA発現へのBMP-2、ノギン(周知のBMPインヒビター)、およびTGF-β1の効果を、リアルタイム定量的RT-PCRを用いて研究および定量化した。
およびアンチセンスプライマーHepcR
を用いて増幅し、iTAq SYBR Green Supermix with ROX(Biorad)を用いて検出した。並行して、β-アクチンの転写産物を、センスプライマーBactF
およびアンチセンスプライマーBactR
を用いて増幅し、内部対照としての役割を果たすように同様の様式で検出した。
図1に示されているように、HepG2細胞のFe-NTAとのインキュベーションは、ヘプシジン/アクチン比発現を約6分の1(棒4)に減少させたが、以前に報告された、HepG2細胞においてFe-NTAにより引き起こされたヘプシジン発現における減少(S.G. Gehrke et al., Blood, 2003, 102:371-376)と良く相関する結果である。重要なことには、50ng/mL BMP-2とのインキュベーションは、ヘプシジン/アクチン比発現をベースラインより上に10倍(±8%)、増加させた(棒2を棒1と比較する)。対照的に、1μg/mL ノギン.Fc(内因性BMPシグナル伝達を阻害する)とのインキュベーションは、ヘプシジン/アクチン比発現をベースラインより下に50分の1(±19%)に減少させた(棒3を棒1と比較する)。
若年性ヘモクロマトーシスは、識別不可能な表現型を与える2つの遺伝子における変異により引き起こされるヘモクロマトーシスの重症の変種である。1つの遺伝子はヘプシジン(HAMP、19q13.1)をコードする。2つ目の遺伝子は、最近、ヘモジュベリン(HJV、1q21)であると同定されている。HJVの機能は未知であるが、ヘプシジンレベルが、HJV変異を有する人において抑制されており、HJVがヘプシジン発現のモジュレーターである可能性があることを示している。すでの本明細書に述べられているように、HJVもまた、RGMaおよびDRAGON、BMP補助受容体として機能することが本出願人らにより最近示されたニューロン接着分子を含む、タンパク質の反発性誘導分子(RGM)ファミリーのメンバーである(それぞれその全体が参照により本明細書に組み入れられている、J.L. Babitt et al., J. Biol. Chem., 2005, 280:29820-29827; T.A. Samad et al., J. Biol. Chem., 2005, 280:14122-14129)。下に示された研究は、HJVが同様にBMPシグナル伝達を媒介することができるかどうかを調べるために企てられた。
cDNAサブクローニング
アミノ酸313位におけるグリシンからバリンへの置換を有する変異型マウスHJVをコードするcDNA(mHJVG313V)を、重複PCRストラテジーにより作製した。2つのプライマー
および
を用いて、アミノ酸313位においてグリシンの代わりにバリンへの置換を組み込むmHJVのN末端断片を作製した。プライマー
および
を用いて、同一の置換を有するHJVのC末端断片を作製した。外側プライマーを用いてPCRの最終ラウンドを行い、変異型mHJVG313Vを作製し、その後、発現ベクターpCDNA 3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA)へサブクローニングした。
および
を用いる野生型マウスHJVの細胞外ドメインのPCRにより作製し、続いて、ヒトIgGのFc部分とインフレームで哺乳動物発現ベクターpIgplus (R & D Systems, Minneapolis, MN)へサブクローニングした。
およびリバースプライマー:
を用いてヒトゲノムDNAからのPCRにより増幅した。コード配列の残部(終止コドンを含む)に対応する下流cDNA断片を、フォワードプライマー
およびリバースプライマーとして
を用いるIMAGEクローンからのPCRにより増幅した。2つの重複断片を、PCRによりいっしょに融合させ、完全長cDNA産物を、その後、EcoR IおよびXho Iで切断し、pCDNA3.1 (Invitrogen)へクローニングし、pCDNA3.1-hHJVを作製した。N末端フラグ標識付きhHJVを作製するために、エクソン3の最初に対応する上流断片を、フォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
を用いるPCRにより作製した。Not I/Sac II消化後、断片を、pCDNA3.1-hHJVから切り出した下流Sac II/Xba I hHJV断片と共に、p3XFLAGCMV9(Sigma)のNot I/Xba I部位へライゲーションした。
CHO細胞(American Type Culture Collection ATCC #CCL-61)を、10%ウシ胎児血清(FBS)(Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA)を追加したF-12K Nutrient Mixture, Kaighn's Modification (Invitrogen)において培養した。HepG2細胞およびHep3B細胞(ATCC #HB-8065および#HB-8064)を、10%FBSを含むL-グルタミンを有するMinimal Essential Alpha Medium (α-MEM, Invitrogen)において培養した。HEK 293細胞(ATCC #CRL-1573)を、10%FBSを追加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM; Cellgro Mediatech, Herndon, VA)において培養した。すべてのプラスミドトランスフェクションは、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)またはEffecteneトランスフェクション試薬(QIAGEN Inc, Valencia, CA)で製造会社の使用説明書に従って行われた。安定的にトランスフェクションされた細胞を選択し、1mg/ml Geneticin (Cellgro Mediatech, Herndon, VA)において培養した。
HepG2またはHep3B細胞に、2.5μg BMP応答性ルシフェラーゼレポーター(BRE-Luc)、2.5μg TGF-β応答性ルシフェラーゼレポーター、(CAGA)12MPL-Luc(CAGA-Luc)(どちらもPeter ten Dijke, Leiden University Medical Center, The Netherlandsにより好意的に提供された)、または2.5μgヘプシジンプロモータールシフェラーゼレポーター構築物を、トランスフェクション効率について管理するために0.25μg pRL-TK ウミシイタケルシフェラーゼベクター(Promega)と組み合わせて、野生型もしくは変異型HJV cDNAでの同時トランスフェクションの有りまたは無しで、一過性にトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、細胞を、1%FBSを追加したα-MEMにおいて6時間、血清飢餓にさせ、1μg/ml ノギン(R & D Systems)もしくは20μg/ml中和抗BMP-2/4抗体(R & D Systems)の非存在または存在下で、様々な量のTGF-β1またはBMPリガンド(R & D Systems)で16時間、処理した。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を、Dual Reporter Assayを用いて製造会社の使用説明書(Promega)に従って測定した。実験は2連または3連のウェルにおいて行われた。相対ルシフェラーゼ活性は、ホタル(レポーター)およびウミシイタケ(トランスフェクション対照)ルシフェラーゼ値の比として計算され、レポーター単独をトランスフェクションされた非刺激細胞に対する倍増加として表されている。
mHJV.Fcを安定的に発現するCHO細胞を、5%超低IgG FBSを追加したF-12K Nutrient Mixture, Kaighn's Modification(Invitrogen)において175cm2マルチフロアフラスコ(Denville Scientific, Southplainfield, NJ)を用いて培養した。mHJV.Fcを、前に記載されているように(その全体が参照により本明細書に組み入れられている、E. del Re et al., J. Biol. Chem., 2004, 279:22765-22772)、HiTrap rProtein A FFカラム(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用いる1段階プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによって安定的にトランスフェクションされた細胞の培地から精製した。精製されたタンパク質を、前に記載されているように(E. del Re et al., J. Biol. Chem., 2004, 279:22765-22772)、100mMグリシン-HCl、pH3.2で溶出し、0.3M Tris-HCl、pH9で中和した。mHJV.Fcを、還元ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)に供し、ゲルを、Bio-safe Coomassie blue (Bio-Rad, Hercules, CA)で染色して、純度を測定し、かつタンパク質濃度を定量化した。
親和性精製されたウサギポリクローナル抗マウスHJV抗体(αHJV)は、ペプチド
、マウスHJVのC末端におけるその疎水性尾部の上流のアミノ酸292位〜310位に対して産生された(G. Papamokolaou et al., Nat. Genet., 2004, 36:77-82)。129S6/SvEvTac野生型もしくはHjv-/-マウス(F.W. Huang et al., J. Clin. Invest., 2005, 115:2187-2191)由来の肝臓、または野生型もしくは変異型HJVをトランスフェクションされた細胞を、前に記載されているように(その全体が参照により本明細書に組み入れられている、J.L. Babitt et al., J. Biol. Chem., 2005, 280:29820-29827)、プロテアーゼインヒビターの混合物(Roche, Mannheim, Germany)を含む溶解緩衝液(200mM Tris-HCl、pH8、100mM NaCl、1mM EDTA、0.5%NP-40、および10%グリセロール)においてホモジナイズ/超音波処理した。リン酸化Smad発現を調べるアッセイについて、1mMオルトバナジウム酸ナトリウム(Sigma, St. Louis, MO)および1mMフッ化ナトリウム(Sigma)をホスファターゼインヒビターとして溶解緩衝液へ添加した。精製されたmHJV.Fc、トランスフェクションされた細胞可溶化物、または肝臓可溶化物を、前に記載されているように(J.L. Babitt et al., J. Biol. Chem., 2005, 280:29820-29827)、還元ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)、および4℃で一晩、HJV抗体(1:1000、4mg/mL)、室温で1時間、ヤギ抗ヒトFc抗体(1:1000)(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)、または4℃で一晩、ウサギポリクローナル抗ホスホsmad1/5/8抗体(1:1000)(Cell Signaling, Beverly, MA)を用いるウェスタンブロットに供した。ブロットを取り出し、4℃で一晩、マウスモノクローナル抗β-アクチン抗体(1:5000)(clone AC 15, Sigma)、ウサギポリクローナル抗Smad1抗体(1:250)(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)、または負荷対照として室温で1時間、ウサギポリクローナル抗アクチン抗体(1:50)(Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, MA)で再探索した。
反応あたり2μgの担体を含まないヒトBMP-2またはBMP-4リガンド(R & D Systems)を、前に記載されているように(その全体が参照により本明細書に組み入れられている、C.A. Frolick et al., J. Biol. Chem., 1984, 259:10995-11000)、改変されたクロラミン-T方法により[125I]でヨウ素化した。125I-BMP-2を、0.1%BSAおよびプロテアーゼインヒビターの混合物(Roche Diagnostics)を含む、または緩衝液のみを含む20mM HEPES(pH7.8)において60ng mHJV.FcまたはALK5.Fc (R & D Systems)とインキュベートした。ビーズを、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、タンパク質を非還元Laemmli試料緩衝液(Bio-Rad)により溶出した。溶出されたタンパク質をSDS-PAGEにより分離し、オートラジオグラフィーにより分析した。
HepG2またはHep3B細胞を、6cm組織培養プレート上で60%集密まで増殖させた。示された所で、細胞に、hHJVまたはhG99V cDNAの様々な量をトランスフェクションした。トランスフェクションから24時間後、細胞を、1%FBSを含むα-MEMにおいて血清飢餓にし、続いて、37℃で様々な時間、50ng/mL BMP-2と、または37℃で48時間、1μg/mL ノギンとインキュベートした。シクロヘキシミド実験について、BMP-2の添加前の30分間、10μg/mlシクロヘキシミドを加えた。全RNAを、RNase-Free DNase Set (QIAGEN)でのDNアーゼ消化を含め、RNeasy Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia CA)を用いて、製造会社の使用説明書に従って単離した。mRNAの転写産物のリアルタイム定量化は、ABI Prism 7900HT Sequence Detection SystemおよびSDSソフトウェアバージョン2.0を用いる2段階逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて行われた。まず、鎖cDNA合成を、試料あたり2μgの全RNA鋳型を用い、製造会社の使用説明書に従ってiScript cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad)を用いて行った。
およびアンチセンスプライマー
を用いて増幅し、iTAq SYBR Green Supermix with ROX(Biorad)を用いて製造会社の使用説明書に従って検出した。並行して、β-アクチンの転写産物を、センスプライマー
およびアンチセンスプライマー
を用いて増幅し、内部対照としての役割を果たすように同様の様式で検出した。ヘプシジンおよびβ-アクチンについての標準曲線は、鋳型としてヘプシジンおよびβ-アクチンのcDNA配列を含むプラスミドの正確に測定された希釈溶液から作成された(Open BiosystemsからのIMAGEクローン4715540および3451917、後に、提案されている挿入断片を検証するために配列分析を行った)。試料は3連で分析され、結果は、ヘプシジンのβ-アクチンに対する平均値の比として報告されている。BMP-2およびBMP-4についての転写産物を、上で作製されたHepG2 cDNAからフォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
(BMP-2について)ならびにフォワードプライマー:
およびリバースプライマー:
(BMP-4について)を用いて増幅した。
一次肝細胞を、前に記載された方法を用いて(その全体が参照により本明細書に組み入れられている、J. Lin et al., Cell, 2004, 119:121-135)、8〜10週齢の129S6/SvEvTac野生型またはHjv-/-マウス(F.W. Huang et al., J. Clin. Invest., 2005, 115:2187-2191)由来の肝臓のコラゲナーゼ消化により単離した。簡単には、マウスを、0.5mM EDTAおよび16.7mM重炭酸ナトリウムを追加したカルシウムを含まないハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)(Mediatech Inc.)で下大静脈を通して〜1.5mL/分の速度で4分間、灌流した。マウスをその後、0.05%コラゲナーゼ(Sigma)、1%ウシ血清アルブミン、および16.7mM重炭酸ナトリウムを含むカルシウム含有HBSSで8分間、灌流した。酵素消化後、肝細胞を培養液[100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、18mM HEPES、1mMピルビン酸ナトリウム、10μg/mlインスリン、5.5μg/mlトランスフェリン、および5ng/mlセレニウム(ITS; Sigma)、2mM L-グルタミン、0.1mM非必須アミノ酸(Gibco(商標))、10%FBS(HyClone, Logan UT)を追加した1:1 ダルベッコ改変イーグル培地/Ham's F12培地(Gibco(商標), Grand Island, NY)]中へ遊離させ、100μm BD Falcon(商標)メッシュ細胞濾過器(BD Biosciences, San Jose CA)を通過させ、遠心分離し、培養液で穏やかに洗浄し、計数した。
一次肝細胞由来の全RNA(2.5μg)を、1%ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離させ、Hybond N+膜(Amersham Pharmacia Biotech)上へ転写した。膜を、80℃で真空下、2時間、ベーキングし、プライマー
および
でソアレス(Soares)マウスp3NMF19.5ハツカネズミcDNA IMAGEクローン:317863から増幅したマウスヘプシジン1およびβ-アクチンに特異的な放射標識プローブとハイブリダイズさせた(S. Alonso et al., J. Mol. Evol., 1986, 23:11-22)。発現を、リン光画像化装置(Molecular Dynamics, 現在、Amersham Biosciences)を用いて定量化し、負荷対照としてのβ-アクチンまたは28S RNAに対して標準化した。
両側スチューデントt検定が、統計学的有意性を決定するために<0.05のP値で用いられた。
HepG2細胞に、BMP応答性ルシフェラーゼレポーター(BRE-Luc、図4、パネルAおよびC)またはTGF-β応答性ルシフェラーゼレポーター(CAGA-Luc、図4、パネルB)を単独か、またはHJVをコードするcDNAと組み合わせてかのいずれかで、トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、その後、0.5nM BMP-2、BMP-4、もしくは40pM TGF-β1の有りまたは無しで16時間インキュベートし、続いて、ルシフェラーゼ活性の測定を行った。BMPまたはTGF-βでの刺激は、刺激されていない細胞と比較して、それらの応答性レポーターについての相対ルシフェラーゼ活性を増加させた(AおよびB、棒2を棒1と比較する)。HJVとの同時トランスフェクションも同様に、外因性BMP刺激の非存在下でさえもBREルシフェラーゼ活性を増加させた(A、棒3)。HJV媒介性BMPシグナル伝達は用量依存性であり(C、灰色棒)、HJVの存在は外因性BMPにより生じるシグナル伝達を増強した(D、黒色棒)。対照的に、HJV(1μgまで)との同時トランスフェクションは、ベースラインより上にCAGA-ルシフェラーゼ活性を増加させなかった(B、棒3)。総合すれば、これらの結果は、HJVがBMPシグナル伝達を媒介できるが、TGF-βシグナル伝達を媒介できないこと、およびHJVがBMP-2についての可能性のあるアクセサリー受容体と一致した様式で行動することを実証している。
外因性BMPリガンドの非存在下でさえもBMPシグナル伝達を媒介するHJVの能力は、HJVがリガンド非依存性様式で作用しているのかどうか、またはそれは内因性BMPリガンドによりシグナル伝達を増強させているのかどうかという問題を提起する。それゆえに、研究は、HJV媒介性シグナル伝達がノギン、BMPリガンドに結合し、BMP受容体に対する結合エピトープをブロックすることにより機能するBMPシグナル伝達の可溶性インヒビターにより阻害されうるかどうかを決定するために行った。
HJV.Fcを、過剰非放射性BMP-2、BMP-4、BMP-7、またはTGF-β1の有りまたは無しで125I標識BMP-2と一晩、インキュベートし、続いて、プロテインAコーティングプレート上でのインキュベーションおよび放射能の測定を行った(図6(A)および図7)。または、HJV.Fcの125I標識BMP-2との化学架橋を、無細胞系においてDSSを用いて行った(図6(B))。
HepG2細胞に、BRE-LucおよびHJVを、単独か、またはドミナントネガティブなBMP I型受容体ALK3(ALK3 DN)もしくはALK6(ALK6 DN)と組み合わせて(図8(A))、または野生型(WT)対ドミナントネガティブな(DN)R-Smad 1と組み合わせて(図8(B))かのいずれかで、同時トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、その後、0.5nM BMP-2の存在下または非存在下で16時間、インキュベートし、その後、ルシフェラーゼ活性の測定を行った。
結果として若年性ヘモクロマトーシスを生じるHJVにおける最も多く見られる変異は、アミノ酸320位(マウスHJVにおけるアミノ酸313位に対応する)においてグリシンをバリンに置換する点変異である。変異型HJVG313Vおよび可溶性HJVG313V.Fc cDNAを、上記のように、PCRおよびサブクローニング技術を用いて作製し、CHO細胞へトランスフェクションし、還元SDS PAGE、続いて、抗HJV抗体(図9(A)および(B)、左パネル)または抗Fc抗体(図9(B)、右パネル)でのウェスタンブロットにより分析した。または、非透過処理のトランスフェクションされた細胞を、抗HJV抗体を用いて免疫蛍光顕微鏡により分析した(図10)。
HepG2細胞に、BRE-Lucを単独で、または増加性濃度の野生型HJVもしくは変異型HJVG13V cDNAと組み合わせて、トランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞を、0.5nM BMP-2の存在下または非存在下で16時間、インキュベートし、続いて、ルシフェラーゼ活性の測定を行った。図11に示されているように、外因性リガンドの非存在下において、野生型HJVはBREルシフェラーゼ活性をベースラインに対して23倍まで増加させた。この刺激は、0.5nM外因性BMP-2で見られたものと類似していた。対照的に、変異型HJVG313Vは、BREルシフェラーゼ活性を最大9倍までのみ、増加させた。これは、ヒトにおいて結果として若年性ヘモクロマトーシスを生じうる変異型HJVG313Vが、肝細胞においてBMPシグナル伝達能力を減少させていることを示唆し、BMPシグナル伝達が鉄代謝において役割を果たしているかどうかという問題を提起する。
上で報告されているように、本出願人らは、(1)HJVはBMPシグナル伝達を誘導するが、TGF-βシグナル伝達を誘導しないこと;(2)HJVシグナル伝達はノギン、周知のBMPインヒビターにより阻害されること;(3)HJVは放射標識BMP-2リガンドへ直接的に結合すること;(4)HJVはBMP I型受容体、ALK-3およびALK-6を介してシグナル伝達すること;(5)HJVはBMP R-Smad、Smad1を介してシグナル伝達すること;(6)若年性ヘモクロマトーシスを引き起こすことが知られているHJV変異体はBMPシグナル伝達能力を減少させること;ならびに(7)BMPは肝細胞においてヘプシジン発現を増加させるが、ノギンは減少させることを示している。
研究プロトコール
正常なマウスに、18μgのBMP-2(1kg体重あたり1mgと等価)、または対照として担体溶液を眼窩内に注射した。4時間後、血液を採取し、血清中鉄レベルおよび総鉄結合能を比色アッセイを用いて測定した。
対応する野生型タンパク質とは対照的に、タンパク分解性切断を受けない変異体HJV、RGMa、およびDragonタンパク質を産生する可能性を実証するために実験を企てた。
本発明の他の態様は、本明細書に開示された本発明の詳述または実施の考慮から当業者にとって明らかであると思われる。詳述および実施例は例示するものとのみ、みなされ、本発明の真の範囲は特許請求の範囲により示されることが意図される。
Claims (7)
- 鉄欠乏を示すかまたは鉄欠乏を示す危険性がある被験体において鉄レベルを増加させるための医薬として使用するための、BMPに拮抗する組成物であって、
該BMPに拮抗する組成物がBMPアンタゴニストを有効成分として含み、
該BMPアンタゴニストが、
1) BMPと直接相互作用してBMPのシグナル伝達を抑制するBMPアンタゴニスト、または
2) HJVのアンタゴニストであってBMPのシグナル伝達を抑制するBMPアンタゴニスト
のいずれかである、前記組成物。 - 前記鉄欠乏が機能性鉄欠乏である、請求項1記載の組成物。
- 前記鉄欠乏が、慢性疾患の貧血、鉄欠乏性貧血、機能性鉄欠乏、および小球性貧血からなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
- 前記慢性疾患の貧血が、慢性細菌性心内膜炎、骨髄炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、腫瘍性障害、感染症、または炎症と関連する、請求項3記載の組成物。
- 前記感染症が肺膿症または結核である、請求項4記載の組成物。
- 前記炎症が、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、肝炎、または炎症性腸疾患によって引き起こされる、請求項4記載の組成物。
- 前記鉄欠乏性貧血が、妊娠、月経、または外傷による血液損失によって引き起こされる、請求項3記載の組成物。
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