JP5792766B2

JP5792766B2 - クラスｉｉｉセマフォリン／ニューロピリン複合体のペプチドアンタゴニスト

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Publication number: JP5792766B2
Application number: JP2013098799A
Authority: JP
Inventors: バグナール，ドミニク; ロートゥ，リズ; ナザール，セシル; ユベール，ピエール; デルリ−グロシュ，シルビー; クレメル，ジェラール; オーニ，ドミニク
Original assignee: アンスティテュナシオナルドゥラサントゥエドゥラルシェルシェメディカル（イーエヌエスエーエールエム）; ユニベルシテドゥストラスブール
Priority date: 2005-06-28
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2015-10-14
Anticipated expiration: 2026-06-28
Also published as: CA2613028A1; WO2007000672A3; JP2013172737A; EP1739092A1; EP1896501A2; EP1896501B1; JP5356811B2; US20150307589A1; US20100222261A1; WO2007000672A2; US8956622B2; CA2613028C; JP2008543347A

Description

本発明は、クラスＩＩＩセマフォリン／ニューロピリン複合体のペプチドアンタゴニスト、及び当該アンタゴニストの使用に関する。

その構造的及び栄養的役割とは別に、細胞外マトリクス(ＥＣＭ)は、細胞間連絡の理想的な環境を規定し、そして全ての細胞挙動、例えば増殖、移動、分化、又はアポトーシスを決定する。これらの過程を制御する分子メカニズムは、次第に理解されてきている。神経系では、拡散又は膜貫通シグナルについての３の主要なファミリー(ネトリン、セマフォリン、及びエフリン)は、胚発生のあいだのその機能を有する(TESSIER-LAVIGNE及びGOODMAN, Science, vol.274, p: 1123-33, 1996)。その中で、セマフォリンは、その構造特異性に従って８のクラスに分けられる２５超のメンバーから構成されるファミリーを規定し(KOLODKINら、Cell, vol.75, p: 1389-99, 1993)、そしてそれらは、分泌型または膜貫通型セマフォリンのいずれかに分類できる。分泌型セマフォリンはクラスＩＩ(無脊椎動物)、ＩＩＩ(脊椎動物)、及びＶ(ウイルス)であり、一方他のクラス(Ｉ、ＩＶ、及びＶＩ〜ＶＩＩＩ)は膜貫通型である。

過去５年の間に、生理的及び病理的状態における軸索ガイダンス、細胞移動、細胞分化からアポトーシスに至るセマフォリンの様々な機能の伝達を可能にする伝達経路を解明するために幾つもの研究が設計されてきた。この機能的な多様性は、アクチン細胞骨格リモデリングを導く複数の細胞内経路を選択的動員及び活性化することによりシグナルの統合を調節する高度に動的な受容体複合体を形成するために生じると現在考えられている(CASTELLANI及びROUGON, Curr. Opin. Neurobiol. , vol.12, p:532-41, 2002)。これらの全ては、１２〜１６個のシステインを有する約５００のアミノ酸からなる「ｓｅｍａドメイン」と呼ばれる共通ドメインであって、各セマフォリンの結合特異性を与える共通ドメインを有する(RAPER, Curr. Opin. Neurobiol., vol.10, p: 88-94, 2000)。これらの様々なセマフォリンの中で、クラスＩＩＩセマフォリンは、神経細胞成長円錐の崩壊を誘導しうる。クラスＩＩＩセマフォリンが当初、コラプシンと名づけられた所以である(LUOら、Cell, vol.75, p: 217-227, 1993)。他の残りのファミリーにその名称を与える分子であるｓｅｍａ３Ａは、最もよく研究されており、そして全ての場合において、知覚神経及び脊椎運動神経から皮質の錐体神経に至るまで、軸索の忌避因子として記載されてきた(MUELLER, Annu. Rev. Neurosci., vol.22, p: 351-388, 1999)。特に、このセマフォリンは、同じ細胞において２の異なる効果を発揮することができる。これは、皮質ニューロンにおいて示されており、皮質ニューロンでは、ｓｅｍａ３Ａは、軸索の忌避因子として作用し、かつ樹状突起の化学誘引物質でもある(POLLEUXら、Nature, vol.404, p:567-73, 2000; BAGNARDら、Development, vol.125(24)、p: 5043-53, 1998)。この現象を説明するために、２個の細胞の極において、区別される伝達を確保するメカニズが存在することを考慮する必要がある。区別される伝達の原理だけではなく、分子ヒエラルキーを制御するメカニズムを理解すること、並びに環境変化に応答する細胞挙動の多様性を確保する超分子構造(supra-molecular structures)の形成を解明することが必要とされる。

従って、ニューロピリンファミリーの２の既知のメンバー、ニューロピリン-１(ＮＲＰ１)及びニューロピリン-２(ＮＲＰ２)の、クラスＩＩＩセマフォリンの伝達カスケードに関与する受容体複合体のリガンド結合サブユニットとしての役割を近年の研究は示した(総説として、Bagnard D. (編) ニューロピリン: from nervous system to vascular and tumor biology. Landes Bioscience- Kluwer Academic/Plenum Publishers Hardbound, ISBN 0-306-47416-6、Advance in Experimental Medicine and Biology Vol.515, p: 140, 2002を参照のこと)。ＮＲＰ１及びＮＲＰ２は、(ｉ)二量化に重要である細胞外部分(RENZIら、J. Neurosci., vol. 19, p:7870-7880, 1999)、膜貫通部分、及び約４０のアミノ酸の短い細胞質ドメインを有する１回膜貫通タンパク質である。

興味深いことに、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２は、伝達能力を持たない短い細胞内ドメインを有する。この所見についての分子的説明は、ニューロピリンがプレキシンファミリーに属する受容体との複合体を形成するということ、並びにプレキシンがニューロピリン／プレキシン複合体の伝達要素であることが見出された際に与えられた(RHOMら、Mech. Dev. , vol.93, p: 95-104, 2000; TAMAGONEら、Cell, vol.99, p:71-80, 1999)。最終的に、クラスＩＩＩセマフォリンによるシグナル伝達は、ニューロピリンとプレキシンとのあいだの複合体形成に依存する。

それにもかかわらず、プレキシンとの複合体は、ニューロピリンにより形成される複合体の唯一のタイプではない。

ニューロピリンが、アドヘシン分子Ｌ１-ＣＡＭ及びＮｒ-ＣＡＭと安定な複合体を形成できるということ(CASTELLANIら、Neuron, vol.27, p: 237-249, 2000)、並びにＬ１の細胞外ドメインにおける突然変異又は遺伝子標的化マウスにおけるＬ１の完全な欠失が、ｓｅｍａ３Ａシグナルの途絶をもたらし、ガイダンスエラーが生じるということが見出された。

その結果、チロシン・キナーゼ受容体は、ニューロピリンが関連するシグナル伝達に役割を果たしうる。こうして、ＤＥＶ神経外胚葉細胞の移動が、Ｓｅｍａ３Ａにより停止され、そしてＮＲＰ１及びＶＥＧＦＲ-１の存在が、当該停止に必要とされるということが観察された(Bagnardら、J Neurosci. , vol.21, p:3332-41, 2001)。この相互作用は、Ｓｅｍａ３Ａを用いた血管新生のｉｎｖｉｔｒｏモデルにおいて、ＶＥＧＦによる芽形成の阻害を説明する(MIAOら、J. Cell. Biol., vol.146, p:233-242, 1999)。ニューロピリンが、ＶＥＧＦＲ-２と(SOKERら、Cell, vol.92, p:735- 45, 1998)、並びにＭＥＴ(WINBERG et al. , Neuron, vol.32, p:53- 62, 2001)と複合体を形成することも発見された。

近年、ニューロピリンが、インテグリンと複合体を形成し、そして当該複合体が、軸索の伸張を促進することができるということが示された(PASTERKAMPら、Nature, vol.424, p:398-405, 2003)。

その結果、近年分かったことであるが、上記研究は、神経変性疾患及び癌の潜在的な標的としてクラスＩＩＩセマフォリン／ニューロピリン複合体を同定することに寄与した(GUTTMANN-RAVIVら、Cancer Letter, 2006; CHEDOTALら、Cell Death and Differentiation, 2005を参照のこと)。この文脈では、複合体形成を妨げる薬剤は、明らかに治療潜在性を有し、及び／又は有用な生物学的ツールであろう。

このように、GARETHら(Journal of Neurochemistry, vol.92, p: 1180-1190, 2005)は、Ｓｅｍａ３Ａ／ＮＲＰ１複合体のペプチドアンタゴニストを設計するためにアルゴリズムを用いた。この著者は、Ｓｅｍａ３Ａ／ＮＲＰ１二量化に関与するＳｅｍａ３ＡＩｇドメインと、受容体の側面二量化を媒介するが、リガンド結合を媒介することはないＮＲＰ１ＭＡＭドメインとのあいだにおけるアンタゴニスト・ペプチドを同定した。それにもかかわらず、膜貫通ドメインに位置しないこれらのアンタゴニストは、１μＭを超えるＩＣ５０を有し、当該濃度は、かなりの濃度であるので、治療においてこのようなアンタゴニストを使用することができない。

こうして、治療に使用できるクラスＩＩＩセマフォリン／ニューロピリン複合体の新たなアンタゴニストについて、当該技術分野において認識されている変わらぬ必要性が存在する。

本発明の目的は、高い活性を有する新たなアンタゴニストを提供することにより当該必要性を満たすことである。

本発明者は、ＮＲＰ１の膜貫通ドメインに相当するペプチドが、１０^-11Ｍ未満のＩＣ５０でＳｅｍａ３Ａにより誘導される皮質軸索崩壊を阻害することができるということを思いがけずに示した。このペプチドは、２の連続したＧｘｘｘＧ二量化モチーフ(ここで、ｘは任意のアミノ酸を表す)を含み、当該ＧｘｘｘＧモチーフは、グリコフォリンＡにおいて最初に同定された(SENESら、J. MoI. Biol., vol.296, p:921-36, 2000)。このようなモチーフは、ｅｒｂＢ受容体(MENDROLAら、J. Biol. Chem. , vol.277, p.4704-12, 2002)のＴＭセグメントの二量化において働いていると示された。一般的に、小さいアミノ酸-ｘｘｘ-小さいアミノ酸からなる任意のモチーフ(ここで、小さいアミノ酸のモチーフ定義は、当業者に周知である)は、同等の性質を有する。

ＮＲＰ１のダブルＧｘｘｘＧモチーフは、高度に保存されており、そしてＮＲＰ２のダブルＧｘｘｘＧモチーフと強いホモロジーを示す(図１)。最終的に、このようなモチーフは、プレキシン・ファミリーのメンバー、Ｎｒ-及びＬ１-ＣＡＭ、並びにインテグリンを含むニューロピリンの複数のパートナーの膜貫通ドメインにおいて見つかる。全体として、本発明者により得られる結果により、これらのタンパク質の膜貫通ドメインが、セマフォリンシグナル伝達を保証する複合体の形成及び調節において重要な役割を果たすということが示唆される。

結果として、１の態様では、本発明は、ニューロピリン-１、ニューロピリン-２、プレキシン-Ａ１、プレキシン-Ａ２、プレキシン-Ａ３、プレキシン-Ａ４、Ｎｒ-ＣＡＭ、Ｌ１-ＣＡＭ、インテグリンβ１及びインテグリンβ２からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインに由来し、そして少なくとも１のＧｘｘｘＧモチーフを含むアミノ酸配列を含み、場合により異種配列に融合されるクラスＩＩＩセマフォリン/ニューロピリン複合体のペプチドアンタゴニストに関する。

本明細書に使用される場合、「異種配列」は、ニューロピリン-１、ニューロピリン-２、プレキシン-Ａ１、プレキシン-Ａ２、プレキシン-Ａ３、プレキシン-Ａ４、Ｎｒ-ＣＡＭ、Ｌ１-ＣＡＭ、インテグリンβ１又はインテグリンβ２に由来しない任意のアミノ酸配列に関する。当該異種配列は、例えば、特定の細胞内への配置を可能にするか、又は本発明のペプチドアンタゴニストの優れた精製収率(例えばＨｉｓタグ)を可能にすることができる。

本明細書に使用される場合、「クラスＩＩＩセマフォリン／ニューロピリン複合体のペプチドアンタゴニスト」という用語は、当該複合体形成を妨げ、そして最終的にこのような複合体のシグナル伝達を妨げる合成又は組換えポリペプチドに関する。結果として、本発明のペプチドアンタゴニストは、完全なニューロピリン-１、ニューロピリン-２、プレキシン-Ａ１、プレキシン-Ａ２、プレキシン-Ａ３、プレキシン-Ａ４、Ｎｒ-ＣＡＭ、Ｌ１-ＣＡＭ、インテグリンβ１、及びインテグリンβ２タンパク質を含まない。

本明細書に使用されるとき「膜貫通ドメイン」は、細胞膜を横断するペプチドドメインに相当する。当該ドメインは疎水性であり、そしてα-へリックス構造を有する。当業者は、その一般的知識に従って、当該タンパク質のドメインを簡単に同定できる。一例として、タンパク質ドメインの親水性は、Kyte ＆ Doolittle法により決定することができ、そしてα-へリックス構造を形成するタンパク質ドメインの可能性は、Chou＆Fasman法により決定することができる。このような方法は、以下のアドレス： http://www.expasy.org/tools/protscale.htmlで利用できる。

ニューロピリン-１、ニューロピリン-２、プレキシン-Ａ１、プレキシン-Ａ２、プレキシン-Ａ３、プレキシン-Ａ４、Ｎｒ-ＣＡＭ、Ｌ１-ＣＡＭ、インテグリンβ１及びインテグリンβ２の膜貫通ドメインのアミノ酸配列はよく保存されており、そしてタンパク質の完全なアミノ酸配列から簡単に同定することができる。この方法は、当業者に周知である。一例として、ニューロピリン-１アミノ酸配列であって、ムス・ムスクルス(Mus musculus)(Ｐ９７３３３)、ホモ・サピエンス(０１４７８６)、ラッタス・ノルベギクス(Rattus norvegicus)(Ｑ９ＱＷＪ９)、ゼブラフィッシュ(Zebrafish)(Ｑ８ＱＦＸ６)、及びガルス・ガルス(Gallus gallus)(Ｐ７９７９５)に由来する配列；ニューロピリン-２アミノ酸配列であって、ホモ・サピエンス(０６０４６２)、ムス・ムスクルス(０３５３７５)、ラッタス・ノベルギクス(ＮＰ＿１１０４９６)及びガルス・ガルス(ＮＰ＿９８９６１５)に由来する配列；プレキシンＡ-１アミノ酸配列であって、ホモ・サピエンス(ＮＰ＿１１５６１８、Ｑ９ＵＩＷ２)及びムス・ムスクルス(ＮＰ＿０３２９０７、Ｐ７０２０６)に由来する配列；プレキシンＡ-２アミノ酸配列であって、ホモ・サピエンス(ＣＡＩ４０１９８、Ｑ５ＪＲＬ６)及びムス・ムスクルス(ＮＰ＿０３２９０８、Ｐ７０２０７)に由来する配列；プレキシンＡ３アミノ酸配列であって、ホモ・サピエンス(ＮＰ＿０３２９０７、Ｐ５１８０５)、ゼノパス・トロピカリス(Xenopus tropicalis)(ＣＡＩ４０１９８)及びムス・ムスクルス(ＮＰ＿０３２９０９、Ｐ７０２０８)に由来する配列；プレキシンＡ４アミノ酸配列であって、ムス・ムスクルス(ＮＰ＿７８６９２６、Ｑ８０ＵＧ２)、ホモ・サピエンス(Ｑ９ＨＣＭ２)及びダニオ・レリオ(Danio rerio)(ＮＰ＿００１００４４９５)に由来する配列；Ｎｒ-ＣＡＭアミノ酸配列であって、ムス・ムスクルス(Ｑ８１０Ｕ４)、ラッタス・ノベルギクス(Ｐ９７６８６)、ホモ・サピエンス(Ｑ９２８２３)及びガルス・ガルス(Ｐ３５３３１)に由来する配列；Ｌ１-ＣＡＭアミノ酸配列であって、ホモ・サピエンス(Ｐ３２００４)、タキフグ・ルブリペス(Takifugu rubripes)(Ｑ９８９０２)、ムス・ムスクルス(Ｐ１１６２７)及びラッタス・ノベルギクス(Ｑ０５６９５)に由来する配列；インテグリンβ１アミノ酸配列であって、ムス・ムスクルス(Ｐ０９０５５)、ホモ・サピエンス(Ｐ０５５５６)、フェリス・カツス(Felis catus)(Ｐ５３７１３)、ラッタス・ノベルギクス(Ｐ４９１３４)、ゼノパス・ラエビス(Xenopus laevis)(Ｐ１２６０６)及びガルス・ガルス(Ｐ０７２２８)に由来する配列；インテグリンβ２アミノ酸配列であって、ムス・ムスクルス(Ｐ１１８３５)、ホモ・サピエンス(Ｐ０５１０７)、スス・スクロファ(Sus scrofa)(Ｐ５３７１４)、ボス・タウルス(Bos taurus)(Ｐ３２５９２)及びシグモドン・ヒスピヅス(Sigmodon hispidus)(ＡＡＬ３８５７９)に由来する配列を引用することができる。

図１は、膜貫通ドメインであって、以下のマウスの：
ニューロピリン-１(配列番号１：ILITIIAMSALGVLLGAVCGVVL)、
ニューロピリン-２(配列番号２：ILITIIAMSSLGVLLGATCAGLLLY）、
プレキシンＡ１(配列番号３:LLTLPAIVGIGGGGGLLLLVIVAVLIA）、
プレキシンＡ２(配列番号４:LLTLPAIISIAAGGSLLLIIVIIVLIAY）、
プレキシンＡ３（配列番号５：LTLPAMVGLAAGGGLLLLAITVVLVAY）、
プレキシンＡ４（配列番号６：LSLPAIVSIAVAGGLLIIFIVAVLIA）、
Ｎｒ−ＣＡＭ（配列番号７：GWFIGLMCAVALLILILLIVCF）、
Ｌ１−ＣＡＭ（配列番号８：GWFIAFVSAIILLLLILLILCFI）、
インテグリンβ１（配列番号９：IIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIW）、及び
インテグリンβ２（配列番号10：VAAIVGGTVVGVVLIGVLLLVIW）
で表される膜貫通ドメインを示す。「ＧｘｘｘＧモチーフ」という用語は、ＳＥＮＥＳら(上記、2000)に同定されるモチーフに関し、これは図１に示される(下線)。潜在的な「ＧｘｘｘＧ」モチーフも示される(点線)。

これらの膜貫通ドメインの保存は、図２に明らかに目立っており、図２は、膜貫通ドメインであって、
以下のヒトの：
ニューロピリン-１（配列番号１：ILITIIAMSALGVLLGAVCGVVL）、
ニューロピリン−２（配列番号２：ILITIIAMSSLGVLLGATCAGLLLY）、
プレキシンＡ１（配列番号３：LLTLPAIVGIGGGGGLLLLVIVAVLIA）、
プレキシンＡ２（配列番号１１：LLTLPAIVSIAAGGSLLLIIVIIVLIAY）、
プレキシンＡ３（配列番号１２：LTLPAMMGLAAGGGLLLLAITAVLVA）、
プレキシンＡ４（配列番号６：LSLPAIVSIAVAGGLLIIFIVAVLIA）、
Ｎｒ−ＣＡＭ（配列番号７：GWFIGLMCAVALLILILLIVCFI）、
Ｌ１−ＣＡＭ（配列番号１３：GWFIGFVSAIILLLLVLLIL）、
インテグリンβ１（配列番号９：IIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIW）及び
インテグリンβ２（配列番号１４：IAAIVGGTVAGIVLIGILLLVIW）
についての同じ膜貫通ドメインを示す。

この保存の別の例として、以下の種に由来するニューロピリン-１膜貫通ドメイン：
ガルス・ガルス(配列番号１４: ILITIIAMSALGVLLGAICGVVL）、及び
ゼブラフィッシュ（配列番号１５:ILITIIAMSALGVFLGAICGVVL）、並びに
ガルス・ガルス由来のニューロピリン-２膜貫通ドメイン（配列番号１６：ILVTIIAMSSLGVLLGATCAGLLLY)
を引用することができる。これらは、ヒトニューロピリン-１およびニューロピリン-２膜貫通ドメインとそれぞれ９０％超の同一性を有する。

好ましい実施態様によると、本発明は、膜貫通ドメインであって、以下のヒトの：
ニューロピリン-１(配列番号１：ILITIIAMSALGVLLGAVCGVVL）、
ニューロピリン−２（配列番号２：ILITIIAMSSLGVLLGATCAGLLLY）、
プレキシンＡ１（配列番号３：LLTLPAIVGIGGGGGLLLLVIVAVLIA）、
プレキシンＡ２（配列番号１１：LLTLPAIVSIAAGGSLLLIIVIIVLIAY）、
プレキシンＡ３（配列番号１２：LTLPAMMGLAAGGGLLLLAITAVLVA）、
プレキシンＡ４（配列番号６：LSLPAIVSIAVAGGLLIIFIVAVLIA）、
Ｎｒ−ＣＡＭ（配列番号７：GWFIGLMCAVALLILILLIVCFI）、
Ｌ１−ＣＡＭ（配列番号１３：GWFIGFVSAIILLLLVLLIL）、
インテグリンβ１（配列番号９：IIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIW）、及び
インテグリンβ２（配列番号１４：IAAIVGGTVAGIVLIGILLLVIW）
からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインに由来し、そして少なくとも１のＧｘｘｘＧモチーフを含むアミノ酸配列を含み、場合により異種配列に融合されるクラスＩＩＩセマフォリン／ニューロピリン複合体のペプチド性アンタゴニストに関する。

別の好ましい実施態様に従って、クラスＩＩＩセマフォリン／ニューロピリン複合体のペプチド性アンタゴニストは、以下の：
ニューロピリン-１(配列番号１、ILITIIAMSALGVLLGAVCGVVL)又は
ニューロピリン-２(配列番号２、ILITIIAMSSLGVLLGATCAGLLLY）膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列を含み、場合により異種配列に融合される。

さらに別の好ましい実施態様では、クラスＩＩＩセマフォリン／ニューロピリン複合体のペプチド性アンタゴニストは、少なくとも２個のＧｘｘｘＧモチーフ、好ましくは少なくとも２個の連続ＧｘｘｘＧモチーフを含むタンパク質の膜貫通ドメインに由来し、そして、以下のヒトの：
ニューロピリン-１(配列番号１：ILITIIAMSALGVLLGAVCGVVL），
インテグリンβ１（配列番号９：IIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIW）及び
インテグリンβ２（配列番号１４：IAAIVGGTVAGIVLIGILLLVIW)
の膜貫通ドメインからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、場合により異種配列に融合される。

好ましくは、本発明のペプチドアンタゴニストは、ヒトニューロピリン-１膜貫通ドメイン(配列番号１、ＩＬＩＴＩＩＡＭＳＡＬＧＶＬＬＧＡＶＣＧＶＶＬ)に由来するアミノ酸配列を含む。

有利な態様では、上記タンパク質のうちの１つの膜貫通ドメインに由来するアミノ酸配列は、１０超のアミノ酸長であり、好ましくは１４超のアミノ酸長であり、一例として１８超のアミノ酸長、そしてより好ましくは２２超のアミノ酸長である。

有利な態様では、ニューロピリン-１、ニューロピリン-２、プレキシン-Ａ１、プレキシン-Ａ２、プレキシン-Ａ３、プレキシン-Ａ４、Ｎｒ-ＣＡＭ、Ｌ１-ＣＡＭ、インテグリンβ１およびインテグリンβ２からなる群から選ばれるタンパク質のうちの１つに由来するアミノ酸配列は、１５０未満のアミノ酸長であり、好ましくは１００アミノ酸未満のアミノ酸であり、より好ましくは５０未満のアミノ酸長である。

好ましい実施態様では、ニューロピリン-１及びニューロピリン-２に由来するペプチドアンタゴニストは、クラスＩＩＩセマフォリン二量化に関与するその細胞外ドメインを含まない。これらのドメインは、当業者に周知であり、そしてNEUFELDら(TCM, vol.12(1), p: 13-19、2002)及びBAGNARD (2002, 上記)に記載されている。例えば、これらのドメインは、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２のａドメイン(ＣＵＢドメイン、セマフォリン結合を保証するａ１及びａ２ドメインとも呼ばれている)、ｂドメイン(凝集因子Ｖ／ＶＩＩＩに対するホモログドメイン；ｂ１ドメインとｂ２ドメインに分けられる。ｂ１は、ＶＥＧＦイソ型の結合に関与する)、ｃドメイン(ＭＡＭドメイン、ＮＲＰ１の二量化に関与する)を含む。

有利な態様では、当該ペプチドアンタゴニストは、以下の膜貫通ドメインであって：
プレキシンＡ１(配列番号３：LLTLPAIVGIGGGGGLLLLVIVAVLIA)、
プレキシンＡ２(配列番号１１：LLTLPAIVSIAAGGSLLLIIVIIVLIAY)、
プレキシンＡ３(配列番号１２：LTLPAMMGLAAGGGLLLLAITAVLVA)、
プレキシンＡ４(配列番号６：LSLPAIVSIAVAGGLLIIFIVAVLIA)、
Ｎｒ-ＣＡＭ(配列番号７：GWFIGLMCAVALLILILLIVCFI)、
Ｌ１-ＣＡＭ(配列番号１３：GWFIGFVSAIILLLLVLLIL)、
インテグリンβ１(配列番号９：IIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIW)及び、
インテグリンβ２(配列番号１４：IAAIVGGTVAGIVLIGILLLVIW)
の膜貫通ドメインからなる群から選ばれるアミノ酸配列又はその誘導体からなり、場合により異種配列に融合される。

第二の好ましい実施態様では、プレキシン-Ａ１、プレキシン-Ａ２、プレキシン-Ａ３、プレキシン-Ａ４、インテグリンβ１、インテグリンβ２、Ｎｒ-ＣＡＭ及びＬ１-ＣＡＭは、シグナル伝達経路に関与するその細胞内ドメインを含まない。これらのドメインは、当業者に周知であり、そしてＢＡＧＮＡＲＤ(上記、2002)に記載され、そして例えば非限定的に、Ｓｅｘ-プレキシンドメイン、ＰＨ１Ａ及びＰＨ２Ａドメイン又はＰＲＢ(プレキシンＲａｃ結合ドメイン)ドメインを含む。

有利な態様では、当該ペプチドアンタゴニストは、以下の：ニューロピリン-１(配列番号１：ＩＬＩＴＩＩＡＭＳＡＬＧＶＬＬＧＡＶＣＧＶＶＬ)及びニューロピリン-２(配列番号２：ＩＬＩＴＩＩＡＭＳＳＬＧＶＬＬＧＡＴＣＡＧＬＬＬＹ)膜貫通ドメインからなる群から選択されるアミノ酸配列又はこの誘導体からなり、場合により異種配列に融合される。好ましくは、当該ペプチド性アンタゴニストは、ニューロピリン-１膜貫通ドメイン(配列番号１：ＩＬＩＴＩＩＡＭＳＡＬＧＶＬＬＧＡＶＣＧＶＶＬ)、又はその誘導体からなり、場合により異種配列に融合される。

膜貫通ドメインであって、以下のヒトの：
ニューロピリン-１(配列番号１：ILITIIAMSALGVLLGAVCGVVL)、
ニューロピリン-２(配列番号２：ILITIIAMSSLGVLLGATCAGLLLY)、
プレキシンＡ１(配列番号３：LLTLPAIVGIGGGGGLLLLVIVAVLIA)、
プレキシンＡ２(配列番号１１：LLTLPAIVSIAAGGSLLLIIVIIVLIAY)、
プレキシンＡ３(配列番号１２：LTLPAMMGLAAGGGLLLLAITAVLVA)、
プレキシンＡ４(配列番号６：LSLPAIVSIAVAGGLLIIFIVAVLIA)、
Ｎｒ-ＣＡＭ(配列番号７：GWFIGLMCAVALLILILLIVCFI)、
Ｌ１-ＣＡＭ(配列番号１３：GWFIGFVSAIILLLLVLLIL)、
インテグリンβ１(配列番号９：IIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIW)又は
インテグリンβ２(配列番号１４：IAAIVGGTVAGIVLIGILLLVIW)
の膜貫通ドメイン「に由来する」又は「の誘導体である」アミノ酸配列は、当該膜貫通ドメイン又はその断片と６０％長の同一性、例えば７０％超又は８０％超、好ましくは８５％超、最も好ましくは９０％超、及び有利な実施態様では９５％超の同一性を有するアミノ酸配列に関する。

本明細書に使用される場合に、「膜貫通ドメインの断片」は、１０超のアミノ酸長、好ましくは１４超のアミノ酸長、一例として１８超のアミノ酸長、そしてより好ましくは２２超のアミノ酸長であるポリペプチドに関する。

上記膜貫通ドメインと、本発明のペプチドアンタゴニストのアミノ酸配列とのあいだの同一性の差異は、ペプチドアンタゴニストの膜貫通ドメインアミノ酸配列におけるアミノ酸置換から生じる。

好ましくは、これらの膜貫通ドメインにおける置換アミノ酸は、中性及び／又は疎水性アミノ酸であり、そして最も好ましくは疎水性アミノ酸である。このような中性及び疎水性アミノ酸は、当業者に周知である。

具体的な実施態様に関し、当該膜貫通ドメイン・アミノ酸配列は、当該膜貫通ドメイン又はその断片との１００％の同一性を有する。

第二態様では、本発明は、上記ペプチドアンタゴニストをコードする核酸に関する。

当該核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡ、好ましくはＤＮＡに対応する。

好ましい実施態様では、ペプチドアンタゴニストをコードする核酸は、当該核酸は、原核又は真核細胞、好ましくは真核細胞内で核酸発現を仕向ける遺伝子発現配列に作用可能なように結合されている。「遺伝子発現配列」は、任意の調節性ヌクレオチド配列であり、例えば、それが作用可能なように結合されたペプチドアンタゴニストの核酸の効率的な転写及び翻訳を促進するところのプロモーター配列又はプロモーターエンハンサーの組合せ、並びに原形質膜へペプチドアンタゴニストを適切に標的化することを保証する任意のシグナル配列である。遺伝子発現配列は、例えば、哺乳動物又はウイルスプロモーター、例えば構成的又は誘導性プロモーターであってもよい。構成的哺乳動物プロモーターは、非限定的に、以下の遺伝子：ヒポキサンチン、ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(ＨＰＴＲ)、アデノシン・デアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、βーアクチンのプロモーター、筋肉クレアチン・キナーゼプロモーター、ヒト伸張因子プロモーター及び他の構成的プロモーターを含む。真核細胞において構成的に機能する代表的なウイルスプロモーターとして、例えば、シミアン・ウイルス由来のプロモーター(例えば、ＳＶ４０)、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、ラウス・サルコーマ・ウイルス(ＲＳＶ)、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)、モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの末端反復(ＬＴＲ)、並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは、当業者に知られている。本発明の遺伝子発現配列として有用であるプロモーターとして、誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導試薬の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下において転写及び翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に知られている。

一般的に、遺伝子発現配列として、必要に応じて、転写及び翻訳の開始に関して５'非転写及び５'非翻訳配列、例えばＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列などをそれぞれ含む。特に、このような５'非転写配列として、作用可能なように結合された抗原核酸を転写調節するためのプロモーター配列を含むプロモーター領域が挙げられる。当該遺伝子発現配列として、エンハンサー配列又は上記上流アクチベーター配列が挙げられる。

本明細書に使用される場合に、ペプチドアンタゴニスト核酸配列及び遺伝子発現配列は、遺伝子発現配列の影響下又は調節下で、ペプチドアンタゴニストをコードする配列の発現、又は転写及び／又は翻訳を実行するような方法で共有結合された場合に、「作用可能なように結合される」と呼ばれる。２個のＤＮＡ配列は、５'遺伝子発現配列におけるプロモーターの導入が、ペプチドアンタゴニスト配列の転写をもたらす場合、及び２個のＤＮＡ配列のあいだの結合性質が、(１)フレームシフト突然変異の導入をもたらさないか、(２)ペプチドアンタゴニスト配列の転写を仕向けるプロモーター領域の能力と干渉しないか、又は(３)対応ＲＮＡ転写産物がタンパク質へと翻訳される能力と干渉しない場合に作用可能なように結合されるといわれる。こうして、遺伝子発現配列が、抗原核酸配列の効果的な転写を可能にし、その結果得られた転写産物が所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳される場合に、当該遺伝子発現配列は、ペプチドアンタゴニスト核酸配列に作用可能なように結合される。

ペプチドアンタゴニスト核酸は、ｉｎｖｉｖｏで単独で、又はベクターと組み合わせてデリバリーされてもよい。この最も広い意味では、「ベクター」は、ペプチドアンタゴニスト核酸を細胞、並びに好ましくはニューロピリン発現細胞へと輸送することを促進できる任意のビヒクルである。好ましくは、ベクターは、ベクターの不存在下でもたらす分解の程度に比べて低い分解性で細胞に核酸を輸送することができる。ベクターは、場合により、ニューロピリン発現細胞において、ペプチドアンタゴニスト核酸の発現を高める上記遺伝子発現配列を含む。一般的に、本発明に有用であるベクターとして、非限定的に、ペプチドアンタゴニスト核酸配列を挿入又は取込むことにより操作されたプラスミド、ファージミド、ウイルス、ウイルス又は細菌起源に由来する他のビヒクルを含む。ウイルスベクターは、好ましいタイプのベクターであり、そして非限定的に、以下のウイルス：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプステイン-バーウイルス；パピローマ・ウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニア・ウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス由来の核酸配列を含む。名前が付けられていないが当該技術分野に知られている他のベクターを簡単に使用することができる。

好ましいウイルス・ベクターは、非必須遺伝子が、目的の遺伝子で置換されている非細胞変性真核ウイルスに基く。非細胞変性ウイルスとして、レトロウイルス(例えば、レンチウイルス)が挙げられ、レトロウイルスの生活環は、ゲノム・ウイルスＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、続いて宿主細胞ＤＮＡへとプロウイルス組込みすることに関する。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療のツールとして承認された。最も有用なものは、複製-欠損型である(つまり、所望のタンパク質の合成を仕向けることができるが、感染性粒子を製造することができない)レトロウイルスである。このような遺伝子的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎｖｉｖｏにおいて遺伝子を高効率で形質導入することについて一般的に有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的なプロトコル(外来遺伝子物質をプラスミドへと取込み、パッケージング細胞株にプラスミドをトランスフェクションし、パッケージング細胞株により組換えレトロウイルスを産生し、組織培養培地からウイルス粒子を回収し、そして標的細胞をウイルス粒子で感染させることを含む)が、KRIEGLER("A Laboratory Manual," W. H. Freeman CO., New York, 1990)及びMURRY ("Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991)に与えられる。

特定の適用についての好ましいウイルスは、遺伝子治療においてヒトへの使用がすでに承認された二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損性であるように遺伝子操作され、そして、広範囲の細胞型及び種へと感染することができる。熱、及び脂質溶媒安定性；肝細胞を含む様々な細胞系統の細胞における高い形質導入効率；並びに重複感染阻害を欠如していること、そうして多重の形質導入を可能にすることといった利点をアデノ随伴ウイルスはさらに有する。報告された様に、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的な様式でヒト細胞ＤＮＡへと組み込むことができ、それにより、挿入突然変異誘導の可能性を少なくし、そしてレトロウイルス感染の挿入遺伝子発現特徴の変動を少なくする。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の不存在下で１００回超の継代のあいだ組織培養において継続されており、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが比較的安定な事象であることを示唆する。アデノ随伴ウイルスは、染色体外の様式で機能することもできる。

他のベクターとしてプラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当該技術分野においてかなり記載されており、そして当業者に周知である。例えば、SANBROOKら、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照のこと。ここ数年のあいだに、プラスミドベクターは、ｉｎｖｉｖｏにおいて抗原をコードする遺伝子を細胞へとデリバリーするＤＮＡワクチンとして使用されてきた。プラスミドベクターは、ＤＮＡワクチンについて特に利点がある。なぜなら、プラスミドベクターは、多くのウイルスベクターが有するのと同じ安全性についての懸念を有さないからである。しかしながら、宿主細胞に適合するプロモーターを有するプラスミドは、プラスミド内に作用可能なようにコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般的に使用されるプラスミドとして、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者に周知である。さらに、制限酵素及びライゲーション反応を使用してＤＮＡの特定の断片を取り除き、そして加えて、プラスミドをカスタム設計してもよい。プラスミドは、様々な非経口、粘膜、及び局所経路によりデリバリーされうる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、又は他の経路により注射できる。ＤＮＡプラスミドは、鼻腔内スプレー又はドロップ、直腸用坐剤、及び経口により投与されてもよい。ＤＮＡプラスミドは、遺伝子銃を用いて、表皮又は粘膜表面に投与されてもよい。当該プラスミドは、水溶液中に与えられてもよいし、金粒子上に乾燥されてもよいし、又は、リポソーム、デンドリマー、渦巻き型化(cochleate)、及びマイクロカプセル化を含む他のＤＮＡデリバリーシステムに関して与えられてもよい。

核酸ベクターは、細菌及び哺乳動物細胞の両方で活性である選択的マーカーを含むことができる。

１の特異的実施態様では、本発明の核酸ベクターは、「裸のＤＮＡ」様であるプラスミド、コスミド、又はファージミドに相当する。このような裸のＤＮＡは、非脂質カチオン性ポリマー(WU及びWU、J. Biol. Chem., vol.263, p: 14621-4, 1988)又はリポソーム(BRIGHMANら, Am. J. Med. Sci. vol.298, p: 278-81, 1989)を伴って、細胞取込みを高める複合体を形成した。

第二の具体的な実施態様では、核酸ベクターは、ｉｎｖｉｖｏ遺伝子治療プロトコルに適用されたウイルスベクターである。適切なウイルスベクターの例として、EP 0871459号、EP 0386882号及びEP 1222300号に記載されるレトロウイルスベクター、並びにUS 2004/ 265273号及びUS 6,638,502号に記載されるアデノウイルスベクターが挙げられる。この場合、ウイルスの内在化は、細胞表面受容体とウイルスエンベロープとの特異的相互作用、続いてウイルス／受容体複合体の受容体媒介性のエンドサイトーシスを介して生じる。

第三の態様では、本発明は、上で記載されるペプチドアンタゴニスト、それをコードする核酸、又は当該核酸を含むベクター、医薬として許容されるビヒクルと最終的に関連する核酸ベクターに関する。

医薬として許容されるビヒクルの一例として、組成物は、エマルジョン、マイクロエマルジョン、水中油型エマルジョン、無水脂質及び水中油型乳濁液、他のタイプのエマルジョンを含むこともある。当該組成物はまた、１以上の添加物(例えば、希釈剤、賦形剤、安定剤、保存剤)も含む。一般的に、Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry、第６版(共編)、1989-1998、Marcel Dekker);及びPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (ANSELら、1994、WILLIAMS & WILKINS)を参照のこと。

有利な態様では、当該組成物は、１０^-12Ｍ超、より好ましくは１０^-11Ｍ超、そして最も好ましくは１０^-10Ｍ超の濃度を含む。

ペプチドアンタゴニスト、核酸又は核酸ベクターは、緩衝液又は水中に溶解されてもよく、又はエマルジョン及びマイクロエマルジョン中に取込まれてもよい。適切な緩衝液として、非限定的に、Ｃａ²⁺／Ｍｇ²⁺フリーのリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)、リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)、通常の生理食塩水(水中の１５０ｍＭ・ＮａＣｌ)、Ｔｒｉｓ緩衝液及び界面活性剤が挙げられる。

加水分解及び変性を含む、ペプチド不安定性又は変性についての多くの原因が存在する。疎水性相互作用は、分子の集合(つまり、凝集)を引き起こしうる。この結果は、Ｔｒｅｇ応答の導入の低減を引き起こしうる。このような問題を低減又は予防するために安定剤が加えられてもよい。

安定剤として、シクロデキストリン及びその誘導体が挙げられる(例えば、米国特許第5,730,969号を参照のこと)。適切な保存剤、例えばスクロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、デキストラン、及びグリセリンは、最終的な製剤を安定化するために加えることができる。イオン性及び非イオン性界面活性剤、Ｄ-グルコース、Ｄ-ガラクトース、Ｄ-キシロース、Ｄガラクツロン酸、トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチル・スターチ、及びそれらの混合物から選ばれる安定剤は、製剤に加えられてもよい。アルカリ金属塩または塩化マグネシウムの添加は、ペプチドを安定化しうる。ペプチドは、デキストラン、硫酸コンドロイチン、スターチ、グリコーゲン、デキストリン、及びアルギン酸塩からなる群から選ばれる多糖と接触させることにより安定化されてもよい。加えられうる他の糖としては、単糖、二糖、糖アルコール、およびそれらの混合物(たとえば、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、スクロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、ザイリトール(xylitol)が挙げられる。ポリオールは、ペプチドを安定化しうるし、そして水混和性であるか、又は水溶性である。適切なポリオールは、ポリヒドロキシアルコール、単糖及び二糖、例えば、マンニトール、グリコール(glycrol)、エチレングリコール、プロピレン・グリコール、トリメチルグリコール、ビニル・ピロリドン、グルコース、フルクトース、アラビノース、マンノース、マルトース、スクロース、及びそのポリマーであってもよい。様々な賦形剤は、ペプチドを安定化し、例えば、血清アルブミン、アミノ酸、ヘパリン、脂肪酸、及びリン脂質、界面活性剤、金属、ポリオール、還元剤、金属キレート剤、ポリビニル・ピロリドン、加水分解性ゼラチン、及び硫酸アンモニウムを含む。

第四の実施態様では、本発明は、クラスIIIセマフォリン／ニューロピリン複合体シグナル伝達経路に関する疾患を患う患者の予防又は治療処置の方法であって、上記組成物を当該患者に投与するステップを含む、前記方法に関する。

本明細書に使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物、例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類などを指す。当該対象は、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、及び最も好ましくはヒトである。

クラスIIIセマフォリン／ニューロピリン複合体シグナル伝達経路に関連する疾患は、当業者により簡単に決定できる。この様な疾患の一例として、神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、中枢神経系病変、病変に伴う脱髄)、癌(例えば、肺癌、乳癌、及び中皮癌、癌腫、神経膠腫)、及び異常血管新生に関与する全ての疾患を挙げることができる。

有利な態様では、当該組成物の投与は、１０^-12Ｍ超、好ましくは１０^-11Ｍ超、そして最も好ましくは１０^-10Ｍ超のペプチドアンタゴニストの濃度に相当する。

第５態様では、本発明は、クラスIIIセマフォリン／ニューロピリン複合体シグナル伝達経路に関する疾患を患う対象の予防又は治療用の医薬の製造のための、上記ペプチドアンタゴニスト、これらをコードする核酸、又は当該核酸を含む核酸ベクターの使用に関する。

クラスIIIセマフォリン／ニューロピリン複合体シグナル伝達経路に関連する疾患は、当業者のうちの一人により簡単に決定することができる。この様な疾患の一例として、神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、中枢神経系病変、病変に伴う脱髄)、癌(例えば、肺癌、乳癌、及び中皮癌、癌腫、神経膠腫)、及び異常血管新生に関与する全ての疾患を挙げることができる。

好ましい実施態様では、本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、中枢神経系病変、及び病変に付随する脱髄を含む群から選ばれる神経変性疾患を患う対象の予防又は治療用の医薬の製造のための、上記ペプチドアンタゴニスト、これらをコードする核酸、又は当該核酸を含む核酸ベクターの使用に関する。

第二の好ましい実施態様では、本発明は、肺癌、乳癌、中皮癌、癌腫、及び神経膠腫を含む群から選ばれる癌を患う患者の予防又は治療用の医薬の製造のための、上記ペプチドアンタゴニスト、それをコードする核酸、又は当該核酸を含む拡散ベクターの使用に関する。

第三の好ましい実施態様では、本発明は、異常血管新生に関与する疾患を患う対象の予防又は治療のための医薬の製造のための、上記ペプチドアンタゴニスト、それをコードする核酸、又は当該核酸を含む核酸ベクターの使用に関する。

有利な実施態様では、当該医薬は、１０^-12Ｍ超、好ましくは１０^-11Ｍ超、そして最も好ましくは１０^-10Ｍ超のペプチドアンタゴニスト濃度の放出を許容する。

本発明は、以下の実施例によりさらに例示される。当該実施例は、その範囲を制限することを意図しない。

図１は、膜貫通ドメインであって、以下のマウスの：ニューロピリン-１(配列番号１：ILITIIAMSALGVLLGAVCGVVL)、ニューロピリン-２(配列番号２：ILITIIAMSSLGVLLGATCAGLLLY）、プレキシンＡ１(配列番号３:LLTLPAIVGIGGGGGLLLLVIVAVLIA）、プレキシンＡ２(配列番号４:LLTLPAIISIAAGGSLLLIIVIIVLIAY）、プレキシンＡ３（配列番号５：LTLPAMVGLAAGGGLLLLAITVVLVAY）、プレキシンＡ４（配列番号６：LSLPAIVSIAVAGGLLIIFIVAVLIA）、Ｎｒ−ＣＡＭ（配列番号７：GWFIGLMCAVALLILILLIVCF）、Ｌ１−ＣＡＭ（配列番号８：GWFIAFVSAIILLLLILLILCFI）、インテグリンβ１（配列番号９：IIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIW）、及びインテグリンβ２（配列番号10：VAAIVGGTVVGVVLIGVLLLVIW）で表される膜貫通ドメインを示す。図２は、以下のヒトの：ニューロピリン-１（配列番号１：ILITIIAMSALGVLLGAVCGVVL）、ニューロピリン−２（配列番号２：ILITIIAMSSLGVLLGATCAGLLLY）、プレキシンＡ１（配列番号３：LLTLPAIVGIGGGGGLLLLVIVAVLIA）、プレキシンＡ２（配列番号１１：LLTLPAIVSIAAGGSLLLIIVIIVLIAY）、プレキシンＡ３（配列番号１２：LTLPAMMGLAAGGGLLLLAITAVLVA）、プレキシンＡ４（配列番号６：LSLPAIVSIAVAGGLLIIFIVAVLIA）、Ｎｒ−ＣＡＭ（配列番号７：GWFIGLMCAVALLILILLIVCFI）、Ｌ１−ＣＡＭ（配列番号１３：GWFIGFVSAIILLLLVLLIL）、インテグリンβ１（配列番号９：IIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIW）及びインテグリンβ２（配列番号１４：IAAIVGGTVAGIVLIGILLLVIW）についての同じ膜貫通ドメインを示す。図３Ａは、異なる構築物について結果を示す。図４Ａは、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされる皮質軸索崩壊について濃度を増加させたｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチド(１０^-8、１０^-9、１０^-10、及び１０^-11Ｍ)の効果を示す。図４Ｂは、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされる皮質軸索崩壊について、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチド(１０^-8Ｍ)の効果を示す。図５Ａは、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutを伴って又は伴わずにＳｅｍａ３Ａの存在下又は不存在下でＮＲＰ１及びプレキシン-Ａ１を発現するＣＯＳ-１細胞の形態を示す。図５Ｂは、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされる細胞崩壊についてのｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチドの効果を示す(＊：ｐ＜０.００１)。図６Ａは、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutを伴うか又は伴わずにＡＰ-Ｓｅｍａとインキュベートした後の野生型ＣＯＳ細胞(対照)又はＮＲＰ１発現ＣＯＳ細胞(ＣＯＳ-ＮＲＰ１)を示す。図６Ｂは、以前に試験された条件について、細胞あたりの光学密度の平均強度を示す。図７Ａは、ｐＴＭ-ＮＲＰ１を伴って又は伴わずに、ＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａとインキュベートした後における野生型ＣＯＳ細胞(対照)、ＮＲＰ１発現ＣＯＳ細胞(ＣＯＳ-ＮＲＰ１)、又は３個の(Ｇ→Ｖ)変異を有するＮＲＰ１を発現するＣＯＳ細胞(ＣＯＳ-ＮＲＰ１^mut)を示す。図７Ｂは、前に試験された条件についての細胞あたりの光学密度の平均強度を示す。図８は、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｓｅｍａ３Ａ、ｐＴＭ-ＮＲＰ１（１０^-9Ｍ）を伴って又は伴わずにインキュベートした後におけるＰＣ１２細胞の分化アッセイの結果を示す。図８Ｂは、各条件について分化した細胞の割合を示す。図９は、ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチド(黒色棒)又は変異ペプチド(灰色棒)の存在下におけるＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａのその受容体への結合についての結果を示す(＊：ｐ＜０.００５；＊＊：ｐ＜０.０１、スチューデントｔ検定)。図１０は、プレキシン-Ａ１を含むオリゴマーを含むスクロース勾配の重分画に相当する黒色棒グラフ、ＮＲＰ１ダイマーを含む中間分画に相当する灰色棒グラフ、そしてほぼＮＲＰ１モノマーから構成される軽い分画に相当する白色棒グラフを示す。図１１は、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチドを伴うか又は伴わずにＣ６細胞を脳注射した後のマウス脳切片を示す。図１２は、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭＮＲＰ１^mutを伴って又は伴わずにＣ６細胞を脳に注射した後において、ＣＤ３４を免疫染色した後のマウス脳切片を示す。図１３は、代表的な腫瘍細胞が、ＶＥＧＦ１６５(５０ｎｇ／ｍｌ)、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭＮＲＰ１^mut(１０^-8Ｍ)の添加を伴って又は伴わずに凝集することを示す。

１) ＮＲＰ１受容体の膜貫通ドメインは、二量化能力を有する
RUSS及びENGELMAN(Proc. Natl. Acad. Sex. USA, vol. 96, p: 863-8, 1999)により記載されるＴｏｘＣａｔシステムから得られたＴｏｘＬｕｃシステムは、ＮＲＰ１膜貫通ドメイン媒介性の二量化を調査するために使用された。このシステムは、Ｅ.ｃｏｌｉ細胞内膜中での膜貫通へリックス-へリックス・オリゴマー化を計測することを可能にする。ＮＲＰ１の膜貫通ドメイン(配列番号１、ＩＬＩＴＩＩＡＭＳＡＬＧＶＬＬＧＡＶＣＧＶＶＬ)の二量化能力は、ＥＧＦ受容体(配列番号１７、ＳＩＡＴＧＭＶＧＡＬＬＬＬＬＶＶＡＬＧＩＧＬＦＭ)、Ｅｒｂ-２タンパク質(配列番号１８、ＳＩＩＳＡＶＶＧＩＬＬＶＶＶＬＧＶＶＦＧＩＬＩ)及びグリコプロテインＡ(配列番号１９、ＩＴＬＩＩＦＧＶＭＡＧＶＩＧＴＩＬＬＩＳＹＧＩ)のうちの膜貫通ドメインの二量化能力と比較される。

特異的融合タンパク質をコードする幾つかの構築体を製造した。これらの融合タンパク質は、ＮＲＰ１、ＥＧＦ受容体、Ｅｒｂ２受容体、及びグリコフォリンＡそれぞれの膜貫通ドメインに融合されたＴｏｘＲ(二量化依存性転写活性化因子)のＮ末端ＤＮＡ結合ドメイン、並びにモノマーのペリプラズム膜アンカー(マルトース結合タンパク質：ＭＢＰ)を含んだ。

ＴｏｘＲに繋げられ、そしてマルトース結合タンパク質(ＭＢＰ)に繋げられたキメラタンパク質として、目的のＴＭ配列を細菌ＤＨ５ａ(ＭＭ３９)中で発現した。ＴＭドメイン媒介性オリゴマー化は、当該システムのオリジナル・バージョンのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)をコードする受容体遺伝子のＴｏｘＲにより活性化される発現をもたらす。便宜上、発明者は、慣用される分子生物学的方法を用いて、ルシフェラーゼの遺伝子により初期のＣＡＴ遺伝子を置き換えた。ニューロピリン、ＥＧＦ受容体、及び野生型ｅｒｂＢ２に対応する合成ＴＭ配列を、ＮｈｅＩ／ＤｐｎＩＩ断片として新たなプラスミドにクローニングした。グリコプロテインＡから得られるＴＭ配列、又はそのＧ８３Ｉ突然変異配列(RUSS 及びENGELMAN, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.vol.96(3), p: 863-8、1999) を有するキメラを対照として用いた。Rocheアッセイキットを製品説明書に従って用い、そしてBerthold Microlumat Plate Luminometerを用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。

異なる構築物について結果を図３Ａに示す。

ＮＲＰ１の膜貫通ドメインを含む構築物で形質転換された細菌は、Ｅｒｂ-２又はＥＧＦＲの膜貫通ドメインを含む構築物で形質転換された細菌のルシフェラーゼ発光より有意に高いルシフェラーゼ発光を示し(Ｅｒｂ-２：４.７倍、ＥＧＦＲ：６.１倍)、そしてグリコフォリン-Ａの膜貫通ドメインを含む細菌のルシフェラーゼ発光より少し高かった(１.２倍)。興味深いことに、発明者らは、グリコフォリン-ＡのＲＭＮ構造を下にＳｗｉｓｓＰｄｂＶｉｅｗｅｒソフトウェアを用いて得られたＴＭ-ＮＲＰ１の３次元モデルにより、ＮＲＰ１のＴＭドメインの二量化能力を確認した。この論理的アプローチは、必要最低限ではあるが、二量化形成を支援するヘリックス間相互作用を示すＴＭ-ＮＲＰ１の空間的にコンパクトな構成の存在を確認した(図３Ｂ)。

結論として、ＮＲＰ１の膜貫通ドメインは、ＧｐＡ膜貫通ドメインの二量化能力よりも強い効力で二量化を誘導することができる。

２) ＮＲＰ１の膜貫通ドメインのペプチドが、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされる皮質軸索崩壊を阻害する
Ｓｅｍａ３Ａの軸索成長の阻害性性質が、成長円錐の崩壊を誘導する能力に関連すると示唆されている。Ｓｅｍａ３Ａ機能性質へのｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドの効果を調査するために、皮質ニューロンの成長を、Ｓｅｍａ３の存在下又は不存在下で、そしてｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mut(３個のＧ→Ｖ突然変異を有するＮＲＰ１ＴＭ)ペプチドの存在下又は不存在下で分析した。

ラミニン／ポリ-Ｌ-リジン基質を、９８０μｌのＧｅｙの平衡塩類溶液(ＧＢＳＳ、Sigma)を１０μｌのラミニン(１ｍｇ／ｍｌ、Sigma)及び１０μｌポリ-L-リジン(１０ｍｇ／ｍｌ、Sigma)に加えることにより製造した。滅菌カバースリップを、大ディッシュにおき、そして基質を加えた(１００μｌ)。次に、各カバースリップを第二カバースリップで覆うことにより「サンドウィッチ」を製造した。５％ＣＯ₂を含む空気の下、３７℃で少なくとも３０分間インキュベートした後に、「サンドウィッチ」を開き、そして各カバースリップを脱イオン水で洗浄した。乾燥させたカバースリップ上で組織片を培養した。

Ｅ１５マウス胚(Ｅ１を膣栓の確認による胚発達の初日として定義する)から調製された大脳新皮質を、組織破砕ディスク上に移した。最初の切断後に、ディスクを９０°回転させることにより、組織を２００×２００μｍに切断した。皮質キューブをスパチュラを用いて回収し、そしてぺトリ皿の培養倍地中に入れた。基質付のカバースリップを小ペトリ皿(５０ｍｍの直径、ＦＡＬＣＯＮ)に置いた。７５０μｌの培養培地を加えた後に、カバースリップをインキュベーター内に少なくとも１０分間静置すべきである。解剖顕微鏡を用いて、４０〜５０の皮質組織片を２０μｌの培養培地中に集め、そして注意深くカバースリップ上に置いた。室温で１５分後、多くの組織片を基質へと接着させた。２２５０μｌの培養培地をゆっくり各ディッシュに加えた。次に、組織片培養物を５％ＣＯ₂を含む空気中において３７℃で維持した。

１８〜２４時間後に培養物中で放射状の伸張が見られ、そしてその結果個々の繊維及び成長円錐を分析した。成長円錐について試験された以下の生成物：
・Ｓｅｍａ３Ａを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞の条件培地から調製された精製Ｓｅｍａ３Ａ(１００ｎｇ／ｍｌ)（ここで、抗-Ｆｌａｇシステム(Sigma)を用いることにより精製を行った。）
・ｐＴＭ-ＮＲＰ１(１０^-8、１０^-9、１０^-10、及び１０^-11Ｍ)
・１０^-8ＭのｍｐＴＭ-ＮＲＰ１
・１０^-8ＭのｐＴＭ-ＥｒｂＢ２ｗ(配列番号１８)
を直接培養培地に２時間加えた。

インキュベート後に、４％ホルムアルデヒドを１５分間培養培地(ｖ／ｖ)中に直接加えた。次に溶液を取り除き、そして４％ホルムアルデヒドに１５分間置き換えた。

図４Ａは、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされる皮質軸索崩壊について濃度を増加させたｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチド(１０^-8、１０^-9、１０^-10、及び１０^-11Ｍ)の効果を示す。

図４Ｂは、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされる皮質軸索崩壊について、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチド(１０^-8Ｍ)の効果を示す。

５０％超の崩壊皮質軸索がＳｅｍａ３Ａ処理細胞で観察される一方、対照条件では、１０％未満の皮質軸索しか崩壊形態を示さなかったということが結果により示される(図４Ａ)。さらに、高い濃度の野生型ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドの添加は、約１０^-11ＭのＩＣ₅₀で用量依存的な様式で、皮質軸索についてのＳｅｍａ３Ａの崩壊効果を抑制した。

対照的に、ｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチドの添加は、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされる皮質軸索崩壊を阻害しない(図４Ｂ)。

ペプチド希釈緩衝液を用いそしてＧｘｘｘＧモチーフを含むＥｒｂＢ２ペプチドを用いた対照実験は、Ｓｅｍａ３Ａの崩壊効果について影響を示さない。

ＮＲＰ１の膜貫通ドメインを模倣する合成ペプチドの添加が、皮質軸索へのＳｅｍａ３Ａの効果を損なわせ、皮質軸索崩壊を阻害するということがこれらの結果により示される。さらに、この生物学的活性は、ＧｘｘｘＧモチーフと関連し、そしてｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドに特有である。

３) ＮＲＰ１受容体の膜貫通ドメインペプチドは、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされるＣＯＳ細胞崩壊を阻害する
ＣＯＳ細胞は、セマフォリン受容体を発現しておらず、そしてその結果これらのガイダンスシグナルにもともと感受性ではない。それにもかかわらず、ＣＯＳ細胞にＮＲＰ１及びプレキシン-Ａ１を人工的に発現させることは、Ｓｅｍａ３Ａの細胞崩壊を引き起こさせる。ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドのＳｅｍａ３Ａ機能性質についての効果を調査するために、ＮＲＰ１及びプレキシン-Ａ１を発現するＣＯＳ細胞の形を、Ｓｅｍａ３Ａ及びｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチドの有無について分析した。

６ウェル-プレート中で、製品説明書に従いリポフェクタミン２０００(invitrogen)を用いて、ＮＲＰ１及びプレキシン-Ａ１をコードする配列を含むｐＢＫ-ＣＭＶプラスミド(STRATAGENE)１μｇをＣＯＳ-１細胞にトランスフェクションした。安定的にトランスフェクションされたＣＯＳ-１細胞を０.７％ジェネティシンを用いて選別した。安定的にトランスフェクションされたＣＯＳ-１細胞は、前もってポリ-Ｌ-リジン-皮膜されたガラスカバースリップを用いて１２ウェルプレート上で培養した。細胞を、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１ｍｕｔペプチド(１０^-9Ｍ)と１時間３７℃でインキュベートした。培養培地を取り除き、そしてＳｅｍａ３Ａ(１００μｌ／ｍｌ、Ｄ-ＭＥＭ)を発現する構築物で安定的にトランスフェクションされるか又はされていないＨＥＫ細胞の条件培地(conditioned medium)に３７℃で４時間置換した。最終的に、細胞を２％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、続いて４％で１５分間固定した。試験された各条件について、約４００個の細胞を分析した。

ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutを伴って又は伴わずにＳｅｍａ３Ａの存在下又は不存在下でＮＲＰ１及びプレキシン-Ａ１を発現するＣＯＳ-１細胞の形態を図５Ａは示す。図５Ｂは、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされる細胞崩壊についてのｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチドの効果を示す(＊：ｐ＜０.００１)。

５０％超の崩壊細胞がＳｅｍａ３Ａ処理細胞で観察される一方、対照条件では１０％未満の細胞しか崩壊形態を示さなかったことが結果により示される(図５Ｂ)。さらに、１０^-9ＭのｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドは、Ｓｅｍａ３ＡのＣＯＳ-１細胞を崩壊させる効果を完全に損なわせた。対照的に変異ＧｘｘｘＧモチーフを有するｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチドの１０^-9Mを加えることが、Ｓｅｍａ３Ａにより引き起こされる細胞崩壊を阻害することはなかった。

これらの結果により、ＮＲＰ１の膜貫通ドメインを模倣する合成ペプチドを加えることは、そのＧｘｘｘＧモチーフを有するＳｅｍａ３Ａの細胞崩壊効果を損なわせるということが示された。

ｐＴＭ-ＮＲＰ１がＳｅｍａ３Ａシグナルを遮断するメカニズムを解明するために、発明者らは結合アッセイを行った。

ＮＲＰ１発現ＣＯＳ細胞を、ＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａ、つまりＳｅｍａ３Ａと分泌型アルカリホスファターゼの融合タンパク質(ＢＡＧＮＡＲＤら、１９９８）とインキュベートした。

野生型ＣＯＳ細胞又はＮＲＰ１-発現ＣＯＳ細胞(ＣＯＳ-ＮＲＰ１)をポリ-Ｌ-リジン-皮膜ガラスカバースリップ上で１２ウェルプレート上で培養した(０.００５ｍｇ／ｍｌ)。無血清培地中のｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１ｍｕｔ(１０^-9Ｍ)で３７℃にて１時間インキュベートした後に、ＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａを安定的に発現するＨＥＫ細胞から得たアルカリ・ホスファターゼ結合Ｓｅｍａ３Ａを含む条件培地で９０分間置換した(ＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａ；Ｂａｇｎａｒｄら、１９９８)。セマフォリンを伴わない条件培地(トランスフェクションされていないＨＥＫから得られる)は、対照として役に立った。ＰＢＳで３回細胞を洗浄し、そして４％ホルムアルデヒド中で固定して、新たなディッシュに移した。ＰＢＳ中で３回洗浄後、プレートを５０分６５℃で暖めた。続いて細胞を１ｍｌのアルカリホスフェート基質(ＮＢＴ／ＢＣＩＰ、Ｓｉｇｍａ)と暗所でインキュベートした。４５分後、基質を取り除き、そしてガラスカバースリップを洗浄した。慣用される顕微鏡を用いて写真をとり、そしてＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎＬＥＺｅｉｓｓソフトウェアで分析した。試験された各条件につき、約６０個の細胞を分析して、光学密度の関数として結合レベルを測定した。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いることにより統計分析を行った。

図６Ａは、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutを伴うか又は伴わずにＡＰ-Ｓｅｍａとインキュベートした後に、野生型ＣＯＳ細胞(対照)又はＮＲＰ１発現ＣＯＳ細胞(ＣＯＳ-ＮＲＰ１)を示す。

図６Ｂは、以前に試験された条件について、細胞あたりの光学密度の平均強度を示す。

結果により、ＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａの結合が、ｐＴＭ-ＮＲＰ１の添加により有意に低減されることが示される(図６Ａ及びＢ)。驚くべきことに、ｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutの添加は、ＣＯＳ細胞に結合するＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａをブロックしなかった。

これらの結果により、ＮＲＰ１ＴＭのＧｘｘｘＧｘｘｘＧドメインが、Ｓｅｍａ３Ａ結合とそれに続く阻害効果を引き起こすのに必須でありそうであると示される。

４) ＮＲＰ１のＴＭドメインの突然変異が、受容体機能を損なわせる
ＧｘｘｘＧｘｘｘＧモチーフの重要な役割を確認するために、突然変異ペプチドとして、全長ＮＲＰ１のＴＭドメインに突然変異を導入して、３個全てのグリシン残基をバリンに置き換えた(ＮＲＰ１^mut)。

膜貫通領域中に３個の(Ｇ→Ｖ)変異を有するＮＲＰ１タンパク質をコードするプラスミドを、前に記載される様にＣＯＳ細胞にトランスフェクションした。次に前と同様に、ＮＲＰ１の当該突然変異形を発現するＣＯＳ細胞中で結合実験を行った。

図７Ａは、ｐＴＭ-ＮＲＰ１を伴って又は伴わずに、ＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａとインキュベートした後における野生型ＣＯＳ細胞(対照)、ＮＲＰ１発現ＣＯＳ細胞(ＣＯＳ-ＮＲＰ１)、又は３個の(Ｇ→Ｖ)変異を有するＮＲＰ１を発現するＣＯＳ細胞(ＣＯＳ-ＮＲＰ１^mut)を示す。

図７Ｂは、前に試験された条件についての細胞あたりの光学密度の平均強度を示す。

野生型ＮＲＰ１を発現するＣＯＳ細胞においてかなりの結合が観察された一方、ＮＰＲ１ｍｕｔを発現する細胞においてあるとしてもかなり低いＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａの結合しか検出されなかったということが結果により示される(図７Ａ）。結合のかなりの低下は、ｐＴＭ-ＮＲＰ１の存在下で得られた結合低下に類似している。驚くべきことに、ＣＯＳ細胞中で当該ＮＲＰ１突然変異(ＮＲＰ１^mut)をＰｌｅｘＡ１と一緒に発現させた場合、Ｓｅｍａ３Ａは、もはや細胞崩壊を誘導できなかった(図７Ｂ)。このことにより、機能的なＳｅｍａ３Ａ受容体の形成についてのＮＲＰ１ＴＭドメインのＧｘｘｘＧｘｘｘＧの重要性がさらに確認された。

５) ＴＭ-ＮＲＰ１を模倣する合成ペプチドは、セマフォリン受容体複合体の形成を変更する
受容体複合体形成の観点で、ＴＭ-ＮＲＰ１の生物化学的な帰結をさらに調査するために、発明者らは、ＰＣ１２神経細胞モデルにおいて複合体形成を分析した。興味深いことに、Ｓｅｍａ３Ａは、ＮＧＦから独立した経路を介してこれらの細胞において神経突起の成長を促進することが示された(Schwambornら、J.Biol.Chem., Vol.279(30), Ｐ：30923-6, 2004)。

ＰＣ１２(ＡＴＣＣ：ＣＲＬ-１７２１)を、４.５ｇグルコース／Ｌ(Gibco)、５％ＦＶＳ、１０％ウマ血清、グルタミン５８０ｍｇ／ｌ及び抗生物質を含むＤ-ＭＥＭ培地中で増殖させた。機能アッセイについて、前もってポリ-Ｌ-リジン皮膜されたガラスカバースリップを備える１２ウェルプレート上でＰＣ１２を培養した。ＰＣ１２細胞を、ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチド(１０^-9Ｍ)を伴って又は伴わずに３７℃で１時間インキュベートした。培養培地を取り除き、そしてＮＧＦ-含有(１００ｎｇ／ｍｌ；GIBCO)無血清培地に置換し、又はＳｅｍａ３Ａを安定的に発現するＨＥＫ２９３細胞から得られた、又はトランスフェクションされていない細胞から得られた条件培地により、１２時間３７℃で置換された(対照、詳細についてはBAGNARDら、1998を参照のこと)。

細胞を２％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、続いて４％ホルムアルデヒドで１５分間固定した。試験された各条件につき、約４００個の細胞を分析して、神経突起の伸張を評価した(統計分析を、χ²検定を用いて行った)。

図８は、ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｓｅｍａ３Ａ、ｐＴＭ-ＮＲＰ１（１０^-9Ｍ）を伴って又は伴わずにインキュベートした後におけるＰＣ１２細胞の分化アッセイの結果を示す。
図８Ｂは、各条件について分化した細胞の割合を示す。

ＮＧＦ又はＳｅｍａ３Ａの添加が、相乗効果を与えることなくＰＣ１２細胞の分化を誘導したということがこの結果により示される(図８Ａ及び８Ｂ)。さらに、実験がｐＴＭ-ＮＲＰ１の存在下で行われる場合、ＮＧＦ効果が維持されている一方、Ｓｅｍａ３Ａ誘導性神経突起成長の促進が有意に低下した。これは、ペプチドの添加が、他のシグナル経路に影響することなくＳｅｍａ３Ａ依存性経路の活性化を特異的に遮断するということを示す。

６) ＮＲＰ１受容体の膜貫通ドメインのペプチドが、リガンドＳｅｍａ３Ａのその受容体ＮＲＰ１への結合を拮抗作用する
ＮＲＰ１-クラスＩＩＩセマフォリンの結合におけるＮＲＰ１膜貫通ドメインの役割を調査するため、神経膠腫細胞上にある受容体ＮＲＰ１へのリガンドＳｅｍａ３Ａの結合を、ＮＲＰ１の膜貫通ドメインペプチド (ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチド；配列番号１)又は変異ペプチド(ｍｐＴＭ-ＮＲＰ１；配列番号２０、ＩＬＩＴＩＩＡＭＳＡＬＶＶＬＬＶＡＶＣＶＶＶＬＹＲＫＲ)の存在下又は不存在下で計測した。これらのｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドは、自動化ペプチド合成機(Ｆｍｏｃ化学反応、Applied System)により合成した。ペプチド純度を、ＲＰ-ＨＰＬＣ(BECKMAN)により９０％超として見積もった。

セマフォリン受容体を発現するラットＣ６神経膠腫細胞は、ＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａ、つまり分泌型のＳｅｍａ３Ａのアルカリホスファターゼバージョン(ADAMSら、1997, Bagnardら、1998)の結合能力を決定するために使用された。これらの細胞は、１０％ウシ胎児血清(PERBIO)、グルタミン０.５ｍＭ(GIBCO)、及び抗生物質：１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＭＥＭ培地(GIBCO)中で増殖させ、そしてプレーティングした。

Ｃ６細胞を、９６ウェルプレート中で培養し、そして新たに希釈されたｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチド(１０^-12Ｍ〜１０^-10Ｍ)を伴って又は伴わずに１時間３７℃でインキュベートした。次に培養培地を、ＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａを発現する構築物で安定的にトランスフェクションされたＨＥＫ細胞の条件培地に置換した(ADAMSら, EMBO J., Vol.16(20), p:6077-86, 1997;BAGNARDら、1998)。非トランスフェクション細胞であるＨＥＫから得た条件培地を内部対照として用いた。ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドは、自動化ペプチド合成(Ｆｍｏｃ化学、APPLIED SYSTEM)により合成され、そして質量分析器により分析された。ペプチド純度を、RP-HPLC(BECKMAN)により９０％超として見積もり、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして５０μｌのアルカリホスファターゼ発光基質(AMERSHAM)とインキュベートした。製品説明書に従って、MICROLUMAT PLUSシステム(BERTHOLD TECHNOLOGIES)を用いて１５分後に発光を読み込んだ。各ペプチドについて実験を４回行った。

ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチド(黒色棒)又は変異ペプチド(灰色棒)の存在下におけるＡＰ-Ｓｅｍａ３Ａのその受容体への結合についての結果を図９に示す(＊：ｐ＜０.００５；＊＊：ｐ＜０.０１、スチューデントｔ検定)。

ＡＰ-Ｓｅｍａ３ＡのＣ６細胞上におけるその受容体ＮＲＰ１への結合が、野生型ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドの濃度を増加させて加えることにより、用量依存的な様式で妨げられた。野生型ｐＴＭＮＲＰ１ペプチドの１０^-10Ｍの存在下で、ＡＰ-Ｓｅｍａ３ＡのＮＲＰ１への結合がペプチドの不存在下の場合に比べて約５０％に低下した。野生型ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドとは対照的に、ｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチドの添加が、ＡＰ-Ｓｅｍａ３ＡのＮＲＰ１への結合を妨げられなかった。

結果として、Ｓｅｍａ３Ａのその受容体ＮＲＰ１への結合に、ＮＲＰ１膜貫通ドメインが関与し、そしてダブルＧｘｘｘＧモチーフの完全性を必要とする。

７) ＮＲＰ１受容体の膜貫通ドメインペプチドは、セマフォリン受容体複合体の形成を変更する
ＮＲＰ１受容体複合体の形成において、ＮＲＰ１受容体の膜貫通ドメインの役割をさらに調査するために、ＮＲＰ１複合体の形成を、ＮＲＰ１の膜貫通ドメインペプチド(ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチド)の存在下又は不存在下で、そしてリガンドＳｅｍａ３Ａの存在下又は不存在下で、ＮＲＰ１及びプレキシン-Ａ１を発現するＣ６細胞上で測定された。

ＮＲＰ１及びプレキシン-Ａ１を発現するＣ６細胞を、ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチド(１０^-9Ｍ)と１時間インキュベートするか又はインキュベートしなかった。次に培養培地を、Ｓｅｍａ３Ａを発現する構築物で安定してトランスフェクションされるか又はされていないＨＥＫ細胞の培地と取り替えられた。コンフルエントＣ６を１０ｍＭ・ＥＤＴＡを用いて回収し、そして遠心した。ペレットをＰＢＳで洗浄し、そして次に０.１％ＳＤＳ、１ｍＭ・ＥＤＴＡ、１％ＮＰ-４０、０.５％ＤＯＣ、２ｍＭ・バナジウム塩、及びＳＤＳを伴わないプロテアーゼ阻害剤(PIERCE)を含む溶解緩衝液(Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ／ＮａＣｌ；５０／１５０；ｐＨ８.０)中に希釈した。４℃で1時間可溶化した後に、ビシンコニン酸法によりタンパク質量を見積もった(ＢＣＡタンパク質アッセイ、PIERCE)。

スクロース密度勾配沈降実験は、２５％、１７％、１０％、及び３％のスクロースを含む段階的勾配に基いた。溶液を、Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣｌ緩衝液(３０／３０、ｐＨ７.６、０.１２％トリトン)及び１Ｍスクロースを伴うＨｅｐｅｓ／ＮａＣｌ緩衝液から作成された。これらの溶液は、線形勾配を形成するために連続して充填された(LERAYら、Arch Biochem Biophys., 1992)。

細胞ライセートを超遠心管中の勾配の上に配置し、そしてＴＬ-１００超遠心機(BECKMAN)を用いて１時間１０００００ｇで遠心し、そして底から分画を回収した(１３滴／分画)。

Ｌａｅｍｍｌｉ法に従って、等体積の充填緩衝液をサンプル(６２.５ｍＭ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ６.８、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、ＤＴＴ、ブロモフェノールブルー)に加え、そしてこれらを１０分間ボイルした。次にサンプルをアクリルアミドゲル(５〜２０％)上で一定電圧及び温度で、適切な緩衝液(０.０２５Ｍ・Ｔｒｉｓ、０.１９２Ｍグリシン、ｐＨ８.３、０.０１％ＳＤＳ)中でＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけた。次にタンパク質を、４℃で、２０％エタノール、０.０２５Ｍ・Ｔｒｉｓ、０.１９２ＭグリシンｐＨ８.３、及び０.０１％ＳＤＳを含む緩衝液中で３時間メタノール活性化ポリビニリデンジフロリド(ＰＶＤＦ)膜に転写した。最後に、ＰＶＤＦ膜を１時間ＰＢＳ／ＢＳＡ５％でブロッキングした。

次に膜を２時間ポリクローナル抗ＮＲＰ１(ONCOGENE)で２時間、１：１０００の希釈率でインキュベートした。膜をＰＢＳ／０.２％ＴＷＥＥＮ２０中で３回洗浄し、そして二次抗体(Ａ／Ｇタンパク質、ＰＩＥＲＣＥ、１：１０００００又はホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合抗ラビットＩｇＧ、AMERSHAM、１：５００)とインキュベートした。次に、免疫反応性を、製品説明書に従って、高められた化学発光ウエスタンブロット検出システム(PIERCE)を用いて検出した。

結果を図１０に示す。各分画におけるＮＲＰ１の割合を、明らかにされた総ＮＲＰ１から計算した。この図では、プレキシン-Ａ１を含むオリゴマーを含むスクロース勾配の重分画は、黒色棒グラフに相当し、ＮＲＰ１ダイマーを含む中間分画は灰色棒グラフに相当し、そして軽い分画は、ほぼＮＲＰ１モノマーから構成され、白色棒グラフに相当する。

リガンドＳｅｍａ３Ａの不存在下では、ＮＲＰ１がスクロース勾配の中間分画において主に検出されたということが結果により示される。こうして、ＮＲＰ１二量体は、そのリガンドＳｅｍａ３Ａの不存在下ではオリゴマー形態として主に存在した。

対照的に、Ｓｅｍａ３Ａの存在下では、ＮＲＰ１受容体は主に重分画中にプレキシン-Ａ１を含むオリゴマー形態として存在した。

Ｓｅｍａ３Ａの存在下におけるｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドの添加は、ＮＲＰ１の分布を変更させ、ＮＲＰ１モノマーの移動レベルに相当する軽い分画中で主に検出された。こうして、ＮＲＰ１のオリゴマー化は、ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドの存在により阻害された。それゆえ、ＮＲＰ１の膜貫通ドメインは、ＮＲＰ１受容体複合体の形成に関与する。結果として、ｐＴＭ-ＮＲＰ１ペプチドの存在下における図３において観察されたＳｅｍａ３Ａ結合の低下は、ＮＲＰ１オリゴマー化の阻害に関連することもありうる。

８) 腫瘍細胞移動のあいだにおけるｐＴＭ-ＮＲＰ１-依存性のＮＲＰ１の不活性化の機能的意味
ヒト神経膠腫の優れたモデルであるラットＣ６神経膠腫細胞株(DAI及びHOLLAND、Biochim. Biophys. Acta, vol.1551, p: M19-27, 2001)は、発明者らのペプチド戦略(ｐＴＭ-ＮＲＰ１)を用いることによるＮＲＰ１の阻害が、細胞移動及び播種をどれだけ妨げるかを調べるために使用された。

Ｃ６細胞(ＡＴＣＣＣＣＬ-１０７)を、ＰＫＨ２６(Ｓｉｇｍａ)を用いて染色した。注入前に培養培地(５０００ｕ／ｍｌペニシリン、５ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２００ｍＭ・Ｌ-グルタミン、及び１０％ウシ胎児血清から構成される)中で、氷上で少なくとも２時間、細胞をペプチド(ｐＴＭ-ＮＲＰ１１０^-8Ｍ又は変異ｐＴＭ-ＮＲＰ１１０^-8Ｍ)とインキュベートした。１０⁶個の細胞の注射を、以下の座標：ブレグマに対して前後＋１.６ｍｍ；Ｌ、＋２ｍｍ；皮質表面に対してＨ、＋５ｍｍ(antero-posterior, +1.6mm relative to Bregma; L, +2mm; H, +5mm relative to the cortical surface)に従って定位フレームを用いて行った。

全ての注射を左線条体で行った。

８日の生存期間の後に、動物(４匹のラットからなる３群)を、ペントバルビタールの腹腔内注射により屠殺し、次に１００ｍｌのＰＢＳで前もって洗浄し、続いて５００ｍｌの２％ホルムアルデヒドで経心臓かん流を行った。脳を４℃で２時間、後固定（post-fixed)し、そして矢状断面(７０μｍ)をビブラトームで調製した。

１群の切片を、顕微鏡観察用にＰＢＳ-グリセロール(ｖ／ｖ)にマウントし、そして別の群をＣＤ３４の免疫染色用に処理した。切片を最初に５％ウシ通常血清を含むＰＢＳ中で１５分間室温でインキュベートして、非特異的結合部位をブロッキングした。２回目のインキュベートを１時間室温で行いそして次にマウス抗ＣＤ３４(１：２００)を用いて４℃で一晩行った。切片を５分間ＰＢＳ中で６回洗浄し、そして次にＡｌｅｘａ４８８に結合されたヤギ抗マウス抗体(１：５００；INTERCHIM)と３時間室温でインキュベートした。切片を５分間で６回ＰＢＳで洗浄し、そして最終的にＰＢＳ-グリセロール(ｖ／ｖ)にマウントし、顕微鏡分析を行った。

図１１は、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭ-ＮＲＰ１^mutペプチドを伴うか又は伴わずにＣ６細胞を脳注射した後のマウス脳切片を示す。腫瘍、皮質、線状体、脳梁(ｃｃ)、海馬(Ｈｐ)及び側脳室が、顕微鏡写真に写っている。

図１２は、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭＮＲＰ１^mutを伴って又は伴わずにＣ６細胞を脳に注射した後において、ＣＤ３４を免疫染色した後のマウス脳切片を示す。

対照条件において、腫瘍が線状体において発達し、そして脳梁及び皮質板に到達したということが結果により示される(図１１、ｎ＝４)。驚くべきことに、細胞を注射前に、ｐＴＭ-ＮＲＰ１で処理した場合に、発明者らは、８日目において腫瘍サイズのかなりの低下を観察した(ｎ＝４)。予期される様に、変異ｐＴＭ-ＮＲＰ１で処理されたＣ６細胞は、処理されていない細胞で観察された腫瘍と同様の腫瘍を誘導した(ｎ＝４)。こうして、ｐＴＭ-ＮＲｐ１の添加は、Ｃ６神経膠腫の発達を阻害する。

ｐＴＭ-ＮＲＰ１の存在下における腫瘍サイズの低下は、ＣＤ３４、つまり血管新生のマーカー、への免疫反応性のかなりの低減を伴った(図１２）。これにより、ｐＴＭ-ＮＲＰ１が、ＶＥＧＦシグナルをブロッキングすることにより抗腫瘍効果を発揮することが示唆された。

９) ｐＴＭ-ＮＲＰ１が、ｉｎｖｉｔｒｏにおいてＶＥＧＦシグナル伝達を拮抗作用できる
ＮＲＰ１は、ＶＥＧＦの受容体である(NEUFELDら、Adv. Exp. Med. Biol., vol.515, p: 81-90, 2002)。その結果、本発明者は、ｐＴＭ-ＮＲＰ１がＣ６細胞においてＶＥＧＦシグナル伝達を拮抗作用できるということを確かめた。この目的を達成するために、前に記載されたように調製されたＣ６腫瘍細胞凝集体(BAGNARDら、1998；及びNASARREら、Neoplasia、Vol.7, p180-189, 2005)を３Ｄマトリックス(凝固血漿)中で増殖させ、そしてＶＥＧＦ１６５で処理した。

代表的な腫瘍細胞が、ＶＥＧＦ１６５(５０ｎｇ／ｍｌ)、ｐＴＭ-ＮＲＰ１又はｐＴＭＮＲＰ１^mut(１０^-8Ｍ)の添加を伴って又は伴わずに凝集することを図１３が示す。

５０ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦ１６５の添加が、Ｃ６細胞の凝集体からの移動及び移動鎖(migration chains)の形成を誘導した(図１３)。驚くべきことに、ｐＴＭ-ＮＲＰ１の添加は、ＶＥＧＦ１６５依存性Ｃ６細胞移動を抑制した。変異型ｐＴＭ-ＮＲＰ１の添加は、ＶＥＧＦ１６５-誘導性Ｃ６細胞移動を妨げることができなかった。これらの結果により、ｐＴＭ-ＮＲＰ１が、Ｃ６細胞におけるＶＥＧＦ１６５シグナル伝達を遮断することができるということが示唆される。

最後に、これらの結果により、ｐＴＭ-ＮＲＰ１が、腫瘍形成の点でＮＲＰ１シグナル伝達を阻害するために使用できるということが示唆される。これはＶＥＧＦ依存性メカニズムを通した腫瘍細胞の移動及び生存におけるＮＲＰ１の役割に関する。ｐＴＭ-ＮＲＰ１を用いてＮＲＰ１を遮断することが、その生存、増殖、及び／又は播種がＮＲＰ１依存性のシグナル伝達カスケードを必要とする全ての腫瘍に対して、治療成果を有するということが本発明者らにより提案される。

Claims

クラスＩＩＩセマフォリン／ニューロピリン複合体のペプチドアンタゴニストであって、以下の：
配列番号２：ILITIIAMSSLGVLLGATCAGLLLYのアミノ酸配列を有するヒトニューロピリン-２、
配列番号３：LLTLPAIVGIGGGGGLLLLVIVAVLIAのアミノ酸配列を有するヒトプレキシンＡ１、
配列番号９：IIPIVAGVVAGIVLIGLALLLIWのアミノ酸配列を有するヒトインテグリンβ１
からなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインからなり、ここで当該膜貫通ドメインが異種配列と融合されている、前記ペプチドアンタゴニスト。
請求項１に記載のペプチドアンタゴニストをコードする核酸。
請求項２に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
請求項１に記載のペプチドアンタゴニスト、請求項２に記載の核酸、又は請求項３に記載の核酸ベクター、及び医薬として許容されるビヒクルを含む医薬組成物。
前記組成物が、１０^-12Ｍを超える濃度でペプチドアンタゴニストを含むことを特徴とする、請求項４に記載の医薬組成物。
前記組成物が、１０^-1１Ｍを超える濃度でペプチドアンタゴニストを含むことを特徴とする、請求項５に記載の医薬組成物。
クラスＩＩＩセマフォリン/ニューロピリン複合体シグナル伝達経路に関連する疾患を患う対象の予防又は治療において使用することを意図された、請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
クラスＩＩＩセマフォリン/ニューロピリン複合体シグナル伝達経路に関連する疾患が、神経変性疾患、癌、及び異常血管新生に関連する全ての疾患を含む群から選ばれることを特徴とする、請求項７に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、１０^-12Ｍを超える濃度の当該ペプチドアンタゴニストの放出を許容する、請求項４〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
前記医薬組成物が、１０^-11Ｍを超える濃度の当該ペプチドアンタゴニストの放出を許容する、請求項９に記載の医薬組成物。