JP5770845B2 - 抗う蝕性組成物の製造方法 - Google Patents
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Description
デキストラン産生菌のスクリーニングおよび培養:
沖縄県内の製糖工場の工程中からサトウキビの搾汁液(混合中)を採取し、ショ糖2%、ポリペプトン2.5%、酵母エキス5%、燐酸水素ニカリウム1.5%、食塩0.01%塩化カルシュウム0.05%、硫酸マグネシュウム0.01%、塩化マンガン0.01%の組成の寒天培地に塗布し、24時間30℃で培養する。形成したコロニーから1白金耳をとり、寒天を除いた同様の液体培地で、18時間30℃で静置培養する。文献(K.Funane,T.Matuo,H.Ono、T.Ishii,S.Gibu,T.Tokashiki and M.Kobayashi:Characterization of Glukans and Glucansucrases from Novel Leuconoctoc strains (Inclucing sp. S−51).J.A.Glycosi.、50,379−382(2003.)に記載の方法にしたがって、培養液のグルカンスクラーセ活性を測定し、活性の高い菌株をスクリーニングし、デキストラン生産するロイコノストック属微生物を得た。
高サイクロデキストラン産生能バチルス属微生物の取得:
バチルス・エスピーT−3040株(FERM BP−4132)について、公知文献(川端ら、「ニトロソグアニジン変異及びストレプトマイシン耐性変異による環状イソマルトオリゴ糖合成酵素(CITase)生産菌Bachillus circulansの育種」、食品・臨床栄養、1、43−48,2006)に記載の方法に従って変異処理を行い、T−3040株の110倍のサイクロデキストラン合成酵素(CITase)生産量を有するバチルス属微生物を得た。
NF膜処理の検討:
精製糖7kgをポリペプトン0.2%、酵母エキス0.2%、燐酸水素ニカリウム1.5%、食塩0.01%、塩化カルシウム0.05%、硫酸マグネシウム0.01%、塩化マンガン0.01%を含有する培地に添加し濃度14%となるように調整した。この培地に参考例1で得たロイコノストック属微生物培養液を4.5ml添加し、約18時間静置培養しデキストラン含有培地を得た。
一方、α化したデンプン2%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、食塩0.5%を含有する培地40mlをpH8.0に調整し、これに参考例2で得られたバチルス属微生物を植菌し、振とう培養機を用い125rpm、30分、30℃で均一混合した。次いで得られた混合液10mlを140mlづつ同様に調整した培地に植菌し、振とう培養機を用い、125rpm,30℃で30時間培養した。得られた培養液560mlを、90Lの培養装置を用い60Lの、同様に調整した培地に植菌し、110rpm、30℃で72時間培養した。得られた培養液を0.2μmのMFろ過膜処理して菌体を除去し、次いで分子分画5000のUFろ過膜処理を行なってサイクロデキストラン合成酵素を含有する濃縮液を得た。
この濃縮液を終濃度0.05unitの力価になるようにデキストラン含有培地に添加し、40℃で2時間反応させた。尚、サイクロデキストラン合成酵素1unitは、前記文献(川端ら、「ニトロソグアニジン変異及びストレプトマイシン耐性変異による環状イソマルトオリゴ糖合成酵素(CITase)生産菌Bachillus circulansの育種」、食品・臨床栄養、1、43−48、2006)において規定される酵素量を意味する。
圧力 1.0MPa
液温 40℃
原液量 600ml
原液濃縮倍率 10倍
最終濃縮液量 約60ml
最終透過液量 約640ml
抗う蝕性組成物の製造(1):
精製糖7kgをポリペプトン0.2%、酵母エキス0.2%、燐酸水素ニカリウム1.5%、食塩0.01%、塩化カルシウム0.05%、硫酸マグネシウム0.01%、塩化マンガン0.01%を含有する培地に添加し濃度14%となるように調整した。この培地に参考例1で得たロイコノストック属微生物培養液を4.5ml添加し、約18時間静置培養しデキストラン含有培地を得た。
一方、α化したデンプン2%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、食塩0.5%を含有する培地40mlをPH8.0に調整し、これに参考例2で得られたバチルス属微生物を植菌し、振とう培養機を用い125rpm、30分、30℃で均一混合した。次いで得られた混合液10mlを140mlづつ同様に調整した培地に植菌し、振とう培養機を用い、125rpm,30℃で30時間培養した。得られた培養液560mlを、90Lの培養装置を用い60Lの、同様に調整した培地に植菌し、110rpm、30℃で72時間培養した。得られた培養液を0.2μmのMFろ過膜処理して菌体を除去し、次いで分子分画5000のUFろ過膜処理を行なってサイクロデキストラン合成酵素を含有する濃縮液を得た。
HPLCによる分離:
精製糖2.1kgをポリペプトン0.2%、酵母エキス0.2%、燐酸水素ニカリウム1.5%、食塩0.05%、塩化カルシウム0.05%、硫酸マグネシウム0.01%、塩化マンガン0.01%を含有する培地に添加して濃度14%となるように調整した(全量15L)。この培地に参考例1のロイコノストック属微生物培養液を1.5ml添加し、約18時間静置培養した。同様の操作を2回繰返してデキストラン含有培地を得た。一方、1.4kgの精製糖を溶解させたポリペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、食塩0.5%を含有する60Lの培地に参考例2で得たバチルス属微生物を1,440ml添加して、容量90Lの培養装置にて30℃で約72時間培養した。この培養液を、0.2μmのMFろ過処理で菌体を除去し、分子分画5,000のUFろ過処理によりサイクロデキストラン合成酵素を含有する濃縮液を得た。
この濃縮液60Lとデキストラン含有培地15Lとを混合して40℃、2時間酵素反応を行い、反応後の液を0.2μmのMFろ過膜処理で菌体を除去し、分子分画5,000のUFろ過膜処理して酵素を分離回収した。透過液をアルファ・ラバル製セントリサーム濃縮機でBrix20まで濃縮し、オルガノ製CR1310合成樹脂のクロマト分離装置にアプライし、イオン交換水で溶出して、サイクロデキストランピークのフラクション40〜62Lの部分の22Lを凍結乾燥して、450.1gの粉末の組成物を得た(水分5.0%)。
この時の精製糖(3.5kg)からの組成物の収率は12.86%であった。得られた組成物について、実施例1と同様にして、サイクロデキストラン、イソマルトオリゴ糖、単糖類の含有量を分析した。その結果を表3に示す。
酵母による処理:
精製糖7kgをポリペプトン0.2%、酵母エキス0.2%、燐酸水素ニカリウム1.5%、食塩0.01%、塩化カルシウム0.05%、硫酸マグネシウム0.01%、塩化マンガン0.01%を含有する培地に添加し濃度14%となるように調整した。この培地に参考例1で得たロイコノストック属微生物培養液を4.5ml添加し、約18時間静置培養しデキストラン含有培地を得た。
一方、α化したデンプン2%、ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.1%、食塩0.5%を含有する培地40mlをpH8.0に調整し、これに参考例2で得られたバチルス属微生物を植菌し、振とう培養機を用い125rpm、30分、30℃で均一混合した。次いで得られた混合液10mlを140mlづつ同様に調整した培地に植菌し、振とう培養機を用い、125rpm、30℃で30時間培養した。得られた培養液560mlを、90Lの培養装置を用い60Lの、同様に調整した培地に植菌し、110rpm、30℃で72時間培養した。得られた培養液に0.01%のα−アミラーゼ及び0.01%の酵母を加えて一晩反応させ0.2μmのMFろ過膜処理して菌体を除去し、次いで分子分画5000のUFろ過膜処理を行なってサイクロデキストラン合成酵素を含有する濃縮液を得た。
この濃縮液を終濃度0.05unitの力価になるようにデキストラン含有培地に添加し、40℃で2時間反応させた。尚、サイクロデキストラン合成酵素1unitは、前記文献(川端ら、「ニトロソグアニジン変異及びストレプトマイシン耐性変異による環状イソマルトオリゴ糖合成酵素(CITase)生産菌Bachillus circulansの育種」、食品・臨床栄養、1、43−48、2006)において規定される酵素量を意味する。反応後の培地を分子分画量5000のUFろ過膜で処理してサイクロデキストラン合成酵素を分離回収し、透過液を分子量300ダルトンのNF膜でろ過を行なって水及びミネラル類を除去した。次いで、NFろ過膜による濃縮液に、パン用酵母(日仏商事株式会社製)を0.012%添加して30℃で48時間微好気性条件下で反応させた。その後0.2μmのMFろ過膜により酵母菌体を除去してから、WA−30(三菱化学社製)のイオン交換樹脂により酸を除去し、更に分子量300ダルトンのNFろ過膜により、水等を除去濃縮してからスプレードライして粉末の組成物2934g(水分5.1%)を得た。この時の精製糖(7Kg)からの抗う蝕性組成物の収率は、41.91%であった。得られた抗う蝕性組成物について、実施例1と同様にして、サイクロデキストラン、イソマルトオリゴ糖、単糖類の含有量を分析した。その結果を表3に示す。
非水溶性グルカン合成阻害試験:
下記方法により実施例1で得られた組成物(CImix)の非水溶性グルカン合成阻止活性を調べた。なお、糖アルコール類(キシリトール、マルチトール、エリスリトール、パラチノース)及びサイクロデキストラン精製品(サイクロイソマルトヘプタオース(CI−7)、サイクロイソマルトオクタオース(CI−8)、サイクロイソマルトノナオース(CI−9)についても同様に試験を行った。
(試験方法)
S.sobrinus6715株(ATCC33478)を4mlのBHI(Bacto Heart Infusion)液体培地で37℃で16時間静置培養した培養菌液を前培養液とした。スクロースを1%含むHI(Bacto Heart Infusion Broth)液体培地4mlに1%(40μL)の前培養液を植菌し、各濃度の被験物質を添加して45°の傾斜をつけた試験管内で37℃で16時間静置培養した。CImixの各濃度におけるWIG量は、S.sobrinus6715株(ATCC33478)を2LのBHI(Bacto Heart Infusion)液体培地で37℃で16時間静置培養した培養菌液を遠心分離し、その上澄み液に390g/Lの硫酸アンモニウムを加えてできた沈殿をpH6.0 p−buffer 20mlに溶解する液を粗酵素液とした。スクロースを1%含むHI(Bacto Heart Infusion Broth)液体培地2mlに50μLの粗酵素液を加え、各濃度のCImixを添加して45°の傾斜をつけた試験管内で37℃で6時間静置培養した。培養後、培養液を試験管壁への付着力の強さによりnon−adherent画分、loose−adherent画分、firm−adherent画分に下記方法で分画し、それぞれの菌体量とWIG(非水溶性グルカン)量、およびWSG(水溶性グルカン)量を定量した。菌体量は540nmにおける吸光度を測定し、またWGS量、WIG量はフェノール硫酸法により測定した。
培養後、試験管をゆっくり3回転した後、非付着物を培養液と共に別の試験管に移した。これをnon−adherent画分とした。残った試験管にPBSを4ml加え、ゆっくり3回転し洗浄した。このときの洗浄液もnon−adherent画分に加えた。残った試験管にPBSを4ml加え、10秒間ミキサーで攪拌した。このとき剥離したものをPBSとともに別の試験管に移した。これをloose−adherent画分とし、試験管に強く付着した画分をfirm−adherent画分とした。non−adherent画分を遠心し、上清と沈殿物に分けた。このときの上清よりWSGを調整し、沈殿物より菌体とWIGを調整した。non−adherent画分の遠心上清に同量のエタノールを加え2時間から1晩4℃で処理した後遠心し、沈殿物をWSGとした。WSGは50%エタノールで2回洗浄した。WSGに0.5N NaOH 1mlを加えて溶解し、溶液をWSGとした。non−adherent画分の沈殿物をPBS 4mlで洗ったあとに遠心し、沈殿物に0.5N NaOH 1mlを加え攪拌後、遠心し、上清と沈殿物に分けた。このときの上清をnon−adherent WIGとし、沈殿物にPBS 1mlを加え攪拌したものをnon−adherent菌体混濁液とした。loose−adherent画分は遠心後、沈殿物に0.5N NaOH 1mlを加え攪拌、遠心し、上清と沈殿物に分けた。このときの上清をloose−adherent WIGとし、沈殿物にPBS 1mlを加え攪拌したものをloose−adherent菌体混濁液とした。firm−adherent画分には、0.5N NaOH 1mlを加え攪拌、遠心し、上清と沈殿物に分けた。このときの上清をfirm−adherent WIGとし、沈殿物にPBS 1mlを加え攪拌したものをfirm−adherent菌体混濁液とした。
酸発酵性試験(1):
S.sobrinus6715株(ATCC33478)を4mlのBHI液体培地で37℃で16時間静置培養した培養菌液を前培養液とした。
スクロース1%を含むHI液体培地4mlに1%(40μL)の前培養液を植菌し、実施例1、比較例1〜2の組成物を1%添加して、試験管内で37℃で16時間静置培養し、その時のpHの変化を1時間毎に測定した。pHの測定は、試験管に微小電極を挿入し、培養を行いながらpHを継続的に測定した。測定に使用する微小電極にはTOA DKK TYPE GS−5015Cを、記録にはTOA DKKインテリジェントコーダーユリウス IHR−9061を使用した。16時間後のpHが5.7以上を「抗う蝕性」、5.7より低いと「う蝕性」と評価した。結果を表4に示す。
酸発酵性試験(2):
S.sobrinus(S.s)6715株(ATCC33478)またはS.mutans(S.m)MT8148株を4mlのBHI液体培地で37℃で16時間静置培養した培養菌液を前培養液とした。
スクロース1%を含むHI液体培地4mlに1%(40μL)の前培養液を植菌し、実施例1で得られた組成物を1%添加して、試験管内で37℃で16時間静置培養し、その時のpHの変化を1時間毎に測定した(1%混合)。pHの測定は、試験管に微小電極を挿入し、培養を行いながらpHを継続的に測定した。測定に使用する微小電極にはTOA DKK TYPE GS−5015Cを、記録にはTOA DKKインテリジェントコーダーユリウスIHR−9061を使用した。
同様にして、スクロース1%のみ(1%Suc.)、実施例1の組成物1%のみ(1%CImix)添加した場合のpHの変化を測定した。結果を図3に示す。
抗う蝕性液状甘味料の調製および抗う蝕性判定試験:
(1)抗う蝕性液状甘味料の調製
実施例1で得られた抗う蝕性組成物(CI類純度28.6%、IG類1.20%、単糖類1.80%)1.5gを、スクロース21gを水9gに溶解した砂糖シロップ(70Bx)30mlに加え、さらにホップ抽出物Betastab10A(Betatec社製:β−Acids(9〜11%)、α−Acids (<3%)、Waxes(<2%)、Water(81〜91%))30μmlを加えて、抗う蝕性液状甘味料を調製した。
(1)により得られた抗う蝕性液状甘味料について、S.mutans JCM 5705株を用いた以外は試験例1と同じ試験方法により、菌体量と非水溶性グルカン量を測定し、非水溶性グルカン合成阻害活性を評価した。また上記砂糖シロップのみ、砂糖シロップに実施例1の抗う蝕性液状甘味料を添加したものまたは砂糖シロップにホップ抽出物を添加したものについても同様にして試験した(表5)。結果を表6(菌体量)、7(非水溶性グルカン量)および図4(菌体量)、図5(非水溶性グルカン量)に示す。
(1)により得られた抗う蝕性液状甘味料にBetastab1000ppmを加えスクロース、CI、Betastabの合計量30gが2%になるように水で希釈した後、10,000rpm、15min、4℃で遠心し、上清をNo.5Cのろ紙でろ過してフィルターで滅菌してサンプルを調製した。S.sobrinus(S.s)6715株(ATCC33478)またはS.mutans(S.m)JCM 5705株を4mlのBHI液体培地で37℃で16時間静置培養した培養菌液を前培養液とした。
下記表8のように調製した培地4mlに40μLの前培養液を植菌し、調製したサンプルを1%添加して、試験管内で37℃で16時間静置培養し、その時のpHの変化を1時間毎に測定した。pHの測定は、試験管に微小電極を挿入し、培養を行いながらpHを継続的に測定した。測定に使用する微小電極にはTOA DKK TYPE GS−5015Cを、記録にはTOA DKKインテリジェントコーダーユリウスIHR−9061を使用し、16時間後のpHを測定した。コントロールとして砂糖シロップを用いた。またS.mutans JCM 5705株については、さらに砂糖シロップに実施例1の抗う蝕性液状甘味料を添加したもの、または砂糖シロップにホップ抽出物を添加したものについても同様にして試験した。S.mutans JCM 5705株の結果を表9、図6に示す。S.sobrinusの結果を表10に示す。
Claims (8)
- サイクロデキストラン合成酵素をデキストラン含有培地に作用させてサイクロデキストラン含有溶液を得て、得られたサイクロデキストラン含有溶液を分子分画400〜800ダルトンのナノフィルトレーション膜(NF膜)処理することによって得られる抗う蝕性組成物及び超臨界炭酸ガス抽出法により抽出したβ酸含有ホップ抽出物を含有する抗う蝕剤。
- 請求項1記載の抗う蝕剤およびショ糖を含有する甘味料。
- 甘味料中の抗う蝕剤の含有量が3〜10質量%である請求項2記載の甘味料。
- 甘味料中の超臨界炭酸ガス抽出法により抽出したβ酸含有ホップ抽出物の含有量が0.01〜0.05質量%である請求項2又は3に記載の甘味料。
- 甘味料中のショ糖の含有量が1〜75質量%である請求項2〜4のいずれかの項記載の甘味料。
- 請求項2〜5のいずれかの項記載の甘味料を含有する飲食品。
- 請求項1記載の抗う蝕剤を含有する飲食品。
- 請求項1記載の抗う蝕剤を含有する口腔用剤。
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