JP5757499B2 - アミロイド形成阻害剤の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、アミロイド形成阻害剤の製造方法に関する。高齢社会化が進む中で、アルツハイマー病や透析アミロイドーシス等のアミロイド線維の沈着によって引き起こされる疾病が社会問題化している。アミロイド線維は、変性したタンパク質分子が規則的に会合することによって形成される超分子複合体であり、かかるアミロイド線維の形成を阻害するものの出現が強く望まれている。本発明は、アミロイド線維の形成を阻害するアミロイド形成阻害剤の製造方法に関する。
従来、前記のようなアミロイド線維の形成を阻害するものとして、ポリフェノール類が知られており、かかるポリフェノール類の製造方法として、ウコン粉末に超臨界状態の二酸化炭素を２〜３時間接触させ、クルクミンを分離する方法（例えば、特許文献１参照）、ウコンのｃＤＮＡから選抜した４種類の遺伝子によってコードされるタンパク質であるＤＣＳ、ＣＵＲＳ１、ＣＵＲＳ２、ＣＵＲＳ３を単離し、これらのタンパク質を組み合わせてクルクミノイドを得る方法（例えば、特許文献２参照）、赤ワインからアルコールを除去したものを濃縮して吸収樹脂カラムに吸着させ、水性アルコールで溶離し、更にアルコールを除去した後、加熱により濃縮した抽出成分濃縮液を高速液体クロマトグラフフィーにて分離してポリフェノール類を得る方法（例えば、特許文献３参照）等が提案されている。
しかし、特許文献１の従来法には、高温・高圧の超臨界状態のガスを使用するため、相応の設備と熟練を要し、それでもなお作業の危険性が高いという問題があり、また特許文献２や３の従来法には、方法それ自体が複雑であって製造効率が悪いだけでなく、化学試薬や微生物による汚染のおそれもあるという問題がある。
本発明が解決しようとする課題は、安全に且つ効率的に量産したセサミン分解物を有効成分として用いるアミロイド形成阻害剤の製造方法を提供する処にある。
本発明者らは、前記の課題を解決するべく研究した結果、ゴマ種子由来のセサミンを特定の亜臨界状態の水で加水分解したセサミン分解物を有効成分として用いる方法が正しく好適であることを見出した。
すなわち本発明は、下記の第１工程及び第２工程を経て得られるセサミン分解物を有効成分として用いることを特徴とするアミロイド形成阻害剤の製造方法に係る。
第１工程：ゴマ種子由来のセサミンと水とを混合し、その混合物を耐圧容器内に密閉して、耐圧容器内の混合物の到達温度が２００〜３５０℃となるように加熱し、同温度で０〜１２０分間保持する工程。
第２工程：耐圧容器内に生成した加水分解物を冷却し、耐圧容器から溶剤を用いてセサミン分解物を取り出す工程。
第１工程：ゴマ種子由来のセサミンと水とを混合し、その混合物を耐圧容器内に密閉して、耐圧容器内の混合物の到達温度が２００〜３５０℃となるように加熱し、同温度で０〜１２０分間保持する工程。
第２工程：耐圧容器内に生成した加水分解物を冷却し、耐圧容器から溶剤を用いてセサミン分解物を取り出す工程。
本発明に係るアミロイド形成阻害剤の製造方法（以下、本発明の製造方法という）では、ゴマ種子由来のセサミンを亜臨界状態の水で加水分解する。かかるゴマ種子としては、生ゴマ種子、煎りゴマ種子、練りゴマ種子、切りゴマ種子、脱脂ゴマ種子等の各種のゴマ種子が挙げられるが、なかでも生ゴマ種子、煎りゴマ種子及び脱脂ゴマ種子が好ましい。
本発明の製造方法に供するゴマ種子由来のセサミンそれ自体は、公知の方法、例えば特開平１０−７６７６号公報に記載の方法により得ることができる。この方法によれば、ゴマ種子由来のセサミンは、ゴマ油の精製工程で発生する脱臭スカムから抽出等で精製することにより得ることができる。
第１工程では、先ずゴマ種子由来のセサミン（以下、セサミンという）と水とを混合して混合物とする。水の量はセサミンを加水分解するのに必要な科学量論的量以上であれば充分であるが、セサミン１質量部に対し、通常は水を１〜２０００質量部の割合で混合し、好ましくは水を２０〜１７００質量部の割合で混合する。またこの段階での混合物の温度は１０〜８０℃とするのが好ましい。かかる混合物を耐圧容器内に密閉して、耐圧容器内の混合物の到達温度が２００〜３５０℃、好ましくは２４０〜３３０℃、より好ましくは２６０〜３２０℃となるように加熱し、同温度で０〜１２０分間保持して、混合物中のセサミンを加水分解する。耐圧容器内の雰囲気ガスは空気でもよいが、予め窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガスで置換し、場合によっては予圧しておいてもよい。
第１工程では、耐圧容器内の混合物中のセサミンの加水分解を更に進めるため、到達温度２００〜３５０℃に加熱したものを同温度で０〜１２０分間、好ましくは０〜１０分間、より好ましくは３〜５分間保持する。かかる第１工程において、到達温度への加熱及び同温度での保持は、通常は１〜１３０分間、好ましくは１〜１０分間、より好ましくは３〜５分間とする。
第２工程では、耐圧容器内に生成した加水分解物を冷却し、耐圧容器から溶剤を用いて取り出す。かくしてセサミン分解物を得ることができる。
耐圧容器内には反応処理物に相当する加水分解物が生成し、通常この加水分解物は水に溶解し難い部分が混合した状態のものとなっているので、かかる加水分解物を溶剤により溶解し、セサミン分解物を得ることができる。ここで溶剤としては水溶性溶剤が好ましく、なかでもエタノールが好ましい。
亜臨界状態にする水としては、上水、蒸留水、イオン交換水及び超純水等を用いることができる。また耐圧容器としては、使用温度と使用圧力に耐えられるものはいずれでも使用可能であるが、なかでもステンレス製の耐圧容器が好ましい。反応方式は連続式でもバッチ式でもいずれも可能である。到達温度に加熱する方法及び到達温度を保持する方法は特に限定されないが、到達温度に加熱したオイルバス中に耐圧容器の一部又は全部を浸漬して行なうのが好ましい。
本発明の製造方法では、かくして得られるセサミン分解物を有効成分として用いる。前記の第１工程及び第２工程を経て得られるセサミン分解物は、詳しくは後述するように、優れたアミロイド形成阻害活性を示し、なかでもβ−アミロイドペプチドからアミロイドが形成されるのを阻害する活性を示し、アミロイドの形成から引き起こされる疾病等、特にアルツハイマー病に対して有用である。
以上説明した本発明には、ゴマ種子由来のセサミンから安全に且つ効率的に量産したセサミン分解物をアミロイド形成阻害剤の有効成分として用いることができるという効果がある。
以下、本発明の構成及び効果をより具体的にするため、実施例及び比較例を挙げるが、本発明がこれらの実施例に限定されるというものではない。尚、以下の実施例及び比較例において、部は質量部を、また％は質量％を意味する。
試験区分１（セサミン分解物の製造）
実施例１
セサミン５０ｍｇを内容積が４．２ｍＬのステンレス製耐熱容器に入れ、脱気した超純水１．６１２ｇを加えて混合物とした。混合物の温度は２５℃であった。蓋を閉じて密封した耐圧容器を２００℃のオイルバス内に静かに沈め、６０分間加熱及び保持した後、直ちに冷水に沈めて冷却した。蓋を開いて加水分解物を少量のエタノールに溶解して取り出し、セサミン分解物のエタノール溶液を得た。
実施例１
セサミン５０ｍｇを内容積が４．２ｍＬのステンレス製耐熱容器に入れ、脱気した超純水１．６１２ｇを加えて混合物とした。混合物の温度は２５℃であった。蓋を閉じて密封した耐圧容器を２００℃のオイルバス内に静かに沈め、６０分間加熱及び保持した後、直ちに冷水に沈めて冷却した。蓋を開いて加水分解物を少量のエタノールに溶解して取り出し、セサミン分解物のエタノール溶液を得た。
実施例２〜２７及び比較例１〜２
実施例１と同様にして、但し表１に示した条件下で、実施例２〜２７及び比較例１〜２のセサミン分解物を得た。
実施例１と同様にして、但し表１に示した条件下で、実施例２〜２７及び比較例１〜２のセサミン分解物を得た。
試験区分２（アミロイド形成阻害活性の測定：Ａβ溶液の調製法）
４２アミノ酸からなるβ−アミロイドペプチドとしてペプチド研究所社（ＰＥＰＴＩＤＥ ＩＮＳＴＩＴＵＲＥ，ＩＮＣ．）製のＡβ（１−４２）を０．１％アンモニア水に濃度が２５０μＭ（１．１ｍｇ／ｍｌ）となるように溶解した後、４℃の温度下において１３０００ｒｐｍの回転数で２時間遠心分離した。上澄液を分取し、分取した上澄液をＡβ溶液として用いた。このＡβ溶液はアミロイド形成試験に使用するまでは−８０℃下で保存した。
４２アミノ酸からなるβ−アミロイドペプチドとしてペプチド研究所社（ＰＥＰＴＩＤＥ ＩＮＳＴＩＴＵＲＥ，ＩＮＣ．）製のＡβ（１−４２）を０．１％アンモニア水に濃度が２５０μＭ（１．１ｍｇ／ｍｌ）となるように溶解した後、４℃の温度下において１３０００ｒｐｍの回転数で２時間遠心分離した。上澄液を分取し、分取した上澄液をＡβ溶液として用いた。このＡβ溶液はアミロイド形成試験に使用するまでは−８０℃下で保存した。
試験区分３（アミロイド形成阻害活性の測定：チオフラビン−Ｔ蛍光分析）
前記のＡβ溶液に、Ａβの終濃度が２５μＭとなるよう、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μＬ、１Ｍ塩化ナトリウム溶液を１０μＬ、試験区分１で得たセサミン分解物のエタノール溶液及び純水を加え、全量を１００μＬとしたものを反応液として実験に用いた。この反応液をＰＣＲチューブに３０μＬずつ加え、ＤＮＡサーマルサイクラーに入れて３７℃で２４時間インキュベーションした。終濃度でチオフラビン−Ｔを５μＭ及びグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）を５０ｍＭとなるよう調製したチオフラビン−Ｔ溶液１．６ｍＬに前記の反応液を８μＬ加え、蛍光光度計でその蛍光強度を測定して、以下の数１からアミロイド形成阻害活性を求めた。尚、励起波長は４４６ｎｍ及び測定波長は４９０ｎｍとし、またスリット幅はともに１０ｎｍとした。
前記のＡβ溶液に、Ａβの終濃度が２５μＭとなるよう、５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を１０μＬ、１Ｍ塩化ナトリウム溶液を１０μＬ、試験区分１で得たセサミン分解物のエタノール溶液及び純水を加え、全量を１００μＬとしたものを反応液として実験に用いた。この反応液をＰＣＲチューブに３０μＬずつ加え、ＤＮＡサーマルサイクラーに入れて３７℃で２４時間インキュベーションした。終濃度でチオフラビン−Ｔを５μＭ及びグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）を５０ｍＭとなるよう調製したチオフラビン−Ｔ溶液１．６ｍＬに前記の反応液を８μＬ加え、蛍光光度計でその蛍光強度を測定して、以下の数１からアミロイド形成阻害活性を求めた。尚、励起波長は４４６ｎｍ及び測定波長は４９０ｎｍとし、またスリット幅はともに１０ｎｍとした。
数１において、
蛍光強度（Ａβ）：測定試料中にＡβが存在し、セサミン分解物が存在しない系の蛍光強度
蛍光強度（ブランク）：測定試料中にＡβもセサミン分解物も存在しない系の蛍光強度
蛍光強度（サンプル）：測定試料中にＡβとセサミン分解物の両方が存在する系の蛍光強度
蛍光強度（Ａβ）：測定試料中にＡβが存在し、セサミン分解物が存在しない系の蛍光強度
蛍光強度（ブランク）：測定試料中にＡβもセサミン分解物も存在しない系の蛍光強度
蛍光強度（サンプル）：測定試料中にＡβとセサミン分解物の両方が存在する系の蛍光強度
試験区分４（アミロイド形成阻害活性の測定：阻害セサミン分解物濃度（ＩＣ５０））
試験区分３の測定において、セサミン分解物の濃度を変えた数サンプルの水溶液を用意し、これらについてアミロイド形成阻害活性（％）を求め、各アミロイド形成阻害活性を結ぶ線からアミロイド形成阻害活性が５０％のときのセサミン分解物の濃度を算出し、阻害セサミン分解物濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表１にまとめて示した。尚、ＩＣ５０はその数値が低いほどアミロイド形成阻害活性の高いことを示している。
試験区分３の測定において、セサミン分解物の濃度を変えた数サンプルの水溶液を用意し、これらについてアミロイド形成阻害活性（％）を求め、各アミロイド形成阻害活性を結ぶ線からアミロイド形成阻害活性が５０％のときのセサミン分解物の濃度を算出し、阻害セサミン分解物濃度（ＩＣ５０）を求めた。結果を表１にまとめて示した。尚、ＩＣ５０はその数値が低いほどアミロイド形成阻害活性の高いことを示している。
表１において、
到達温度：オイルバスの温度
加熱及び保持時間：耐圧容器をオイルバス内に静めた時間
セサミンの量：耐圧容器に入れたセサミンの量
比較例１及び２：いずれの濃度においてもアミロイド形成阻害活性（％）が低く、５０％の濃度が非常に大きくなったため、ＩＣ５０を算出できなかった。
到達温度：オイルバスの温度
加熱及び保持時間：耐圧容器をオイルバス内に静めた時間
セサミンの量：耐圧容器に入れたセサミンの量
比較例１及び２：いずれの濃度においてもアミロイド形成阻害活性（％）が低く、５０％の濃度が非常に大きくなったため、ＩＣ５０を算出できなかった。
表１の結果からも明らかなように、本発明の製造方法によって得られるセサミン分解物は、優れたアミロイド形成阻害活性を有する。
Claims (7)
- 下記の第１工程及び第２工程を経て得られるセサミン分解物を有効成分として用いることを特徴とするアミロイド形成阻害剤の製造方法。
第１工程：ゴマ種子由来のセサミンと水とを混合し、その混合物を耐圧容器内に密閉して、耐圧容器内の混合物の到達温度が２００〜３５０℃となるように加熱し、同温度で０〜１２０分間保持する工程。
第２工程：耐圧容器内に生成した加水分解物を冷却し、耐圧容器から溶剤を用いてセサミン分解物を取り出す工程。 - 第１工程において、セサミン１質量部に対して水を１〜２０００質量部の割合で混合する請求項１記載のアミロイド形成阻害剤の製造方法。
- 第１工程において、耐圧容器内の混合物の到達温度が２４０〜３３０℃となるように加熱する請求項１又は２記載のアミロイド形成阻害剤の製造方法。
- 第１工程において、耐圧容器内の混合物の到達温度が２６０〜３２０℃となるように加熱する請求項１又は２記載のアミロイド形成阻害剤の製造方法。
- 第１工程の加熱及び保持を１〜１０分間行なう請求項１〜４のいずれか一つの項記載のアミロイド形成阻害剤の製造方法。
- 第１工程の加熱及び保持を３〜５分間行なう請求項１〜４のいずれか一つの項記載のアミロイド形成阻害剤の製造方法。
- アミロイド形成阻害剤が、β−アミロイドペプチドからアミロイドが形成されるのを阻害するものである請求項１〜６のいずれか一つの項記載のアミロイド形成阻害剤の製造方法。
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