JP5709582B2 - ラマン振動の強度分布情報と質量分布情報とを位置合わせする方法 - Google Patents

Description

本発明は、ラマン振動の強度分布情報と質量分布情報を精度よく位置合わせする方法である。

近年、ガンなどの疾病を迅速かつ高精度に診断する技術が求められている。その中で、生体組織もしくは細胞に含まれている複数の成分を把握し、疾病の悪性度との相関を明らかにする技術が求められている。複数の成分を網羅的に把握する技術として、ラマン分光法と、質量分析法が挙げられる。一般的なラマン分光法である自発ラマン法では、レーザ光を試料に照射した際に発生するラマン散乱光と、入射光の振動数の差を計測することで、試料成分に特有の信号を得ることができる。一方、質量分析法では、一次ビームを試料に照射した際に発生する２次イオンの質量電荷比（質量／電荷数）を計測することで、試料成分に特有の信号を得ることができる。

これらの方法について、成分の同定能と計測時間という観点から比較すると、質量分析法では成分の同定する能力が高いことが長所であるが、広範囲の領域の分析には時間がかかることが短所である。一方で、ラマン分光法では広範囲の領域を高速で計測することができる点が長所であるが、同定能が低いことが短所である。一方、これまでに光学顕微鏡により得られた二次元画像と質量分析法により得られた二次元画像を、位置合わせ用マーカ（以下、マーカと記す）を利用して重ね合わせる方法が提案されている（特許文献１）。特許文献１では、マーカと病理組織はそれぞれ同一の基板上に設けている。

特開２０１０−８５２１９号広報

本発明者はラマン分光法による広範囲の分析を行った後に、特定の領域に対して質量分析法による同定を行うことで、網羅的な分析を迅速かつ正確に行う方法を考案するに至った。しかしながら、この方法を実施するためには、ラマン分光によって得られる情報と質量分析法によって得られる情報とを精度よく位置合わせする必要がある。

試料として病理組織を用いる場合には、一般的に数マイクロメートルの有限の厚さを有している。そのため特許文献１には、マーカについて平面形状と記載しているだけで厚さについて記載されていないが、マーカは病理組織よりも厚さが小さいと想定される。この方法をラマン画像と質量画像の重ね合わせに適用した場合、病理組織とマーカの表面の高さが各々異なるので、病理組織とマーカの両方に対して同時に焦点を合わせて画像を取得することができず、病理組織に焦点を合わせた場合にマーカの形状がぼけてしまう。その結果、精密な位置合わせが困難になることが判明した。また、特許文献１には、試料である病理組織の表面の一部分に物質を設ける方法が記載されているが、この方法では、物質が存在している個所からの信号を得ることができないため、試料表面全体をすべて計測対象とすることができないという課題があった。

本発明は、ラマン分光法によって得られるラマン振動の強度分布情報と質量分布法によって得られる質量分布情報とを位置合わせする方法において、高さが試料表面と同じか試料表面よりも高い三次元形状のマーカを用いるものであり、三次元形状のマーカが、円錐形、四角錐、三角錐、多角錐又は半球体であることを特徴とする。本発明は、ラマン分光法によって得られるラマン振動の強度分布情報と質量分布法によって得られる質量分布情報とを位置合わせする方法において、高さが試料表面と同じか試料表面よりも高い三次元形状のマーカを用いるものであり、前記三次元形状のマーカは、前記マーカを前記基板表面に対して平行な平面で切断した断面積が、前記基板表面からの距離が大きくなるにつれて小さくなる形状であることを特徴とする。本発明は、試料の質量分析によって得られた質量分布情報とラマン分析によって得られた情報を、マーカの情報に基づいて位置合わせすることを特徴とする。

本発明のラマン振動の強度分布情報と質量分布情報の位置合わせをする方法によれば、高さが試料表面と同じが試料表面よりも高いマーカを試料の周囲に設けることによって、試料表面の信号とマーカの信号の取得を同じ高さで行うことができる。その結果、試料表面の全ての面からラマン振動の強度分布情報および質量分布情報を取得することができるようになると同時に、生体試料表面と位置合わせ用マーカの高さが異なることに起因した、位置合わせしたときのずれの発生という課題を解決できる。これにより、ラマン振動の強度分布情報と質量情報の位置合わせを精度よく行うことができる。

本発明の概要を示す図 本発明の実施形態を説明する図 本発明の実施形態を説明する図 本発明の第一の実施形態を説明する図 本発明の第二の実施形態を説明する図 本発明の第三の実施形態を説明する図

以下、本発明について図面を用いて説明する。

本発明は、ラマン分光法によって得られるラマン振動の強度分布情報と質量分布法によって得られる質量分布情報とを位置合わせする方法において、高さが試料表面と同じか又は試料表面よりも高い三次元形状のマーカを用いることを特徴とする。また、本発明は、試料の質量分析によって得られた質量分布情報とラマン分析によって得られたラマン振動の強度分布情報を、マーカの情報に基づいて位置合わせする付けことを特徴とする
本発明において、ラマン振動の強度分布情報とは、ラマン分光法を利用して取得される試料表面の成分の分布を示す情報である。また、質量分布情報とは、質量分析法を利用して取得される試料表面の成分の分布を示す情報である。

本発明の概要について、図１を用いて説明する。

本発明では、第１工程として、基板上に、試料と、試料の外周部に、高さが試料表面と同じか又は高い三次元形状のマーカを設けて測定用試料を作製する。次に、第２工程として、ラマン分光法で測定用試料のラマン振動の強度分布情報を得る。第３工程として、質量分析法で測定用試料の質量分析情報を得る。第４工程として、ラマン振動の強度分布情報におけるマーカの情報と、質量分布情報におけるマーカの情報に基づいてラマン振動の強度分布情報と質量分布情報の位置合わせをする。第２工程と第３工程は入れ替えても良いが、ラマン分光法は非破壊分析法であるので、第２工程を先に行うことが好ましい。

本発明の質量分布情報とラマン振動の強度分布情報の位置合わせをする方法は、以下の方法を含む。具体的には、質量分布情報としての質量分布画像とラマン振動の強度分布情報としてのラマン画像を重ね合わせて表示できるようにすること、対応するラマン画像と質量分布画像を左右又は上下に並べて表示できるようにすること、対応するラマン画像と質量分布画像を交互に表示できるようにすること、を含む。また、図２に示すように、測定用試料について、ラマン振動の強度分布情報及び質量分布情報を測定する。そして、ラマン振動の強度分布情報をマーカ情報に基づいて変換して、質量分布情報をマーカ情報に基づいて変換して、二つの情報を位置合わせして合成すること、及び任意で合成した情報を表示すること、を含む。さらに、特定の位置のラマン画像に対応する質量分布画像を表示できるようにすることを含む。さらに、同じ位置に関するラマン情報Ｉ_Ｒ（ｘ、ｙ、ｚ）又はＩ_Ｒ（ｘ，ｙ）と、質量分布情報ｉ_Ｍ（ｘ，ｙ，ｚ）又はｉ_Ｍ（ｘ，ｙ，ｚ）を抽出すること、同じ領域に関するラマン情報と質量分布情報を抽出すること、を含む。

本発明のマーカは、高さが試料表面と同じか試料表面よりも高い三次元形状を有する。本発明のマーカと試料からなる測定試料の作製について、図３を用いて説明する。図３（ａ）と図３（ｂ）は、基板上に固定化された試料とマーカを示す。図３（ａ）は基板上の試料とマーカを横方向（Ｙ方向）から見た図を示しており、１は試料、２、３はマーカ、４は基板を示す。ここで横方向とは、試料とマーカが設置されている基板表面に対して平行となる方向のことである。試料とマーカを基板上に配置する際には、マーカの最も高い部位が試料の表面よりも高くなるようにマーカを配置する。マーカ２、３の高さは、試料の高さと同じかマーカの方が高い。また、マーカは、すべて同じ大きさや高さである必要はない。マーカ２、３の形状は、マーカを基板表面に対して平行な平面で切断した断面積が、基板表面からの距離が大きくなるにつれて小さくなる形状であることが好ましい。図３（ｂ）は基板の上方向から見た場合の形態を示しており、５は試料、６，７はマーカ、８は基板を示す。ここで上方向とは、試料とマーカが設置されている基板表面に対して垂直の方向のことである。マーカ６、７を設ける位置は、試料５の外周部分である。基板上に試料５とマーカ６、７を設ける順序は任意である。ここで試料５は、生体試料を用いることができる。生体試料としては、例えば、細胞、組織、器官が用いられるが、これらに限定されるものではなく生体由来の成分を含む材料である。

マーカ６、７の材料は、ラマン分光および質量分析法の両方において信号が得られる材料を用いる。このような材料としては、例えば、水素が重水素に置換された化合物、ハロゲン化合物、カルコゲン化合物、金属化合物を構成する元素が同位体元素で置換された化合物、アミノ基、カルボニル基、アミド基、アルキル基を含む化合物を用いることができる。アミノ基、カルボニル基、アミド基、アルキル基を含む化合物として、アミノ基、カルボニル基、アミド基、アルキル基を有する脂質、ポリペプチドを用いることができる。

また、基板上にマーカを配置する方法としては、マーカ材料の噴霧法、滴下法、蒸着法、塗布法、マーカと基板の化学的相互作用を利用した自己組織化法のうちいずれか、もしくは複数の方法の組み合わせを用いることができる。さらに、上記方法に加えて、フォトリソグラフィ法、エッチング法、インプリント法のうちいずれか、もしくは複数の方法の組み合わせを用いることで、マーカの形状をより均一に形成することができる。

次に、基板上に固定化された試料とマーカからなる測定用試料のラマン振動の強度分布情報を得る工程について説明する。ラマン顕微鏡では、ラマン分光における光学系の焦点位置の座標に対するラマン信号の強度を画像化することにより、試料表面の成分の分布に対応したラマン画像を得ることができる。一般に、ラマン顕微鏡では、光学系の焦点を生体試料表面に合わせた条件でレーザ光を走査し、試料とマーカの両方のラマン分光を行う。このラマン分光により、試料表面と、試料の表面と同じ高さであるマーカ部分の両方からの信号を含むラマン画像を得ることができる。

ラマン分光法は、自発ラマンを計測する方法に加えて、非線形光学効果を利用したラマン分光法も利用することができる。本発明のラマン分光法は、非線形光学効果を利用したラマン分光である誘導ラマン散乱法、コヒーレント反ストークスラマン散乱法であることが好ましい。これらの分光法では、ラマン画像を高速かつ高感度で取得することができるようになり、分析の精度と作業速度を向上できる。

非線形光学効果を利用したラマン分光について説明する。自発ラマンではラマン散乱光の強度は、散乱光の全体の強度のうち１０の−６乗から１０の−９乗程度と非常に弱く、計測時間が長くなることが課題であった。一方、非線形光学効果によるラマン分光である、コヒーレントアンチストークスラマン散乱法（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ ａｎｔｉ ｓｔｏｋｅｓ ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ、以下「ＣＡＲＳ」と記載する。）や、誘導ラマン散乱法（Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、以下「ＳＲＳ」と記載する。）では、高速・高感度での計測が可能になる。ＣＡＲＳやＳＲＳは、二種類の周波数をもつレーザ光源を試料に照射する。それぞれの周波数をω１、ω２とする（ω１＞ω２）。ＣＡＲＳでは二種類のレーザの振動数の差（ω１−ω２）が、分析対象の分子の振動数と一致する時に、（２ω１−ω２）の振動数を持つ光が生じる。この光の強度を検出することにより物資の組成や化学的な状態を分析する。ＳＲＳでは二種類のレーザの振動数の差（ω１−ω２）が分析対象の分子の振動数と一致する時に、高エネルギーのレーザから低エネルギーのレーザへとエネルギー遷移が生じる。その結果、高エネルギーレーザの強度が減少し、低エネルギーレーザの強度が増加する。この強度変化を計測することにより、物資の組成や化学的な状態を分析する。ＣＡＲＳやＳＲＳは、二種類のレーザ光が同一の点に集光された箇所においてのみ強いラマン散乱が生じるため、自発ラマン法と比較すると３桁程度の感度の向上が可能であると考えられている。また、集光点のサイズが微小であるので、高い空間分解能でラマン分光を行うことができるという特徴を有している。

図３（ｃ）にラマン分光によって得られる測定用試料のラマン画像の模式図を示す。試料から特定の成分に由来するラマン信号が発生する（領域９）とともに、試料の表面と同じ高さのマーカ部位からもラマン信号が発生する（領域１０、１１）。説明のために試料５の外周の形状を、図中の点線で囲まれた領域で示しているが、実際のラマン画像においては存在しない。ここで、試料からのラマン信号とマーカからのラマン信号は同一の成分に由来することが好ましい。しかし、試料の特定の成分のラマン画像と、マーカの特定の成分のラマン画像を各々取得し、重ね合わせを行うことでラマン画像を得ても良い。ラマン分光を質量分析より先に行う場合には、ラマン画像において特定の成分が分布している領域９、１０、１１の面積、数などを基に、質量分析法をする領域１２を設定することができる。

本発明で用いる質量分析法について説明する。質量分析法は試料のイオン化方法の違いから、種々の質量分析法が知られている。本発明では、以下の質量分析法を用いることが好ましい。これらの質量分析法を用いた場合、分解能が高く、分析の精度と作業効率を向上できる。
・飛行時間型二次イオン質量分析法（Ｔｉｍｅ ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下「ＴＯＦ−ＳＩＭＳ」と記載する。）
・マトリックス支援レーザ脱離イオン化法（Ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、以下「ＭＡＬＤＩ」と記載する。）
・脱離エレクトロスプレーイオン化法（Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ、以下「ＤＥＳＩ」と記載する。）

それぞれの方法において、試料表面のイオン化を発生させるために一次ビームが用いられる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳでは集束イオンビームが、ＭＡＬＤＩでは収束レーザ光が、ＤＥＳＩでは帯電した液滴群が一次ビームとして用いられる。一次ビームを試料の表面に照射することで試料表面から二次的に発生したイオンは、質量分析装置に導入され、質量電荷比が計測される。これらの方法を生体試料に適用した場合、タンパク質・脂質といった分子由来のイオンの質量電荷比を計測することができるため、生体試料を精密に同定することができる。さらに、一次ビームの照射位置を走査し、照射位置と質量分析法から得られる信号の強度を対応付ける事によって、試料の質量分布を画像化することが可能になる。一般に、質量イメージング法では、一次ビームの焦点を試料表面に合わせた条件で、一次ビームの照射位置を走査し、質量分析を行う。本発明では、試料表面と、試料の表面と同じ高さであるマーカの一部分の両方からの質量信号を含む質量分布情報を得ることができる。図３（ｄ）に質量分析法によって得られる質量分布画像の模式図を示す。領域１６は、ラマン画像の領域１２に対応する。図３（ｄ）において、試料表面から特定の成分に由来する質量信号が発生する領域１３（黒色の塗りつぶし領域）が得られるとともに、試料の表面と同じ高さであるマーカの一部分からも質量信号が発生する領域１４、１５（黒枠部分）が得られる。説明のためにラマン画像で信号が得られた領域９の外周の形状を、図中の点線で囲まれた領域で示しているが、実際の質量画像においては存在しない。ここで、試料からの質量信号とマーカからの信号は同一の成分に由来することが好ましいが、試料の特定の成分の質量画像とマーカの特定の成分の質量画像を各々取得し、重ね合わせを行うことで質量画像を得ても良い。

最後に、ラマン画像と質量画像の各々において、マーカ位置を特定した後に、ラマン画像と質量画像のマーカ位置が一致するように、各々の画像を重ね合わせる。

このように三次元形状を有するマーカを生体試料の近傍に設けることにより、ラマン画像および質量画像において生体試料表面からの信号とマーカからの信号を得ることができる。さらに、ラマン画像と質量画像のマーカ位置を一致させることで、正確に画像の位置合わせを行うことができる。

上記では、ラマン画像と質量分布画像の重ね合わせについて述べたが、マーカを用いてラマン振動の強度分布情報と質量分布情報の位置を一致させるという同じ原理により、次のような方法にも適用できる。例えば、質量分布画像とラマン振動の強度分布情報画像を重ね合わせること、対応するラマン画像と質量分布画像を左右又は上下に並べること、対応するラマン画像と質量分布画像を交互に表示すること、特定の位置のラマン振動の強度分布情報に対応する質量分布情報を表示させること、等である。また、本発明は、ラマン振動の強度分布情報と質量分布情報をマーカ情報に基づいて変換して合成すること、特定の位置のラマン画像に対応する質量分布画像を表示できるようにすること、にも適用できる。さらに、本発明は、同じ位置に関するラマン情報Ｉ_Ｒ（ｘ、ｙ、ｚ）又はＩ_Ｒ（ｘ，ｙ）と、質量分布情報ｉ_Ｍ（ｘ，ｙ，ｚ）又はｉ_Ｍ（ｘ，ｙ，ｚ）を抽出すること、同じ領域に関するラマン情報と質量分布情報を抽出すること、にも適用できる。

以下、本発明を実施形態に基づいて詳細に説明する。

（実施形態１）
実施形態１では、位置合わせ用のマーカの形状と、その位置合わせの方法を示す。基板上に異なる形状のマーカを設け、ラマン画像と質量画像を取得した模式図を図４に示す。マーカの材料には、重水素置換されたパルミチン酸が混合された樹脂を用いる。図４（ａ）はマーカを横から見た形状を示す。マーカの形状は、四角錐型１７、半球型１８、三角錐型１９、円錐の変形型２０の場合を示すが、これらの形状とは異なる三次元形状においても、同様の結果が得られることが推測される。試料は図示されていないが、マーカが設けられている基板上に存在しており、破線２１は試料表面と等しい高さを示す。図４（ｂ）はマーカを上からみた形状を示す。マーカはそれぞれ、四角錐型２２、半球型２３、三角錐型２４、円錐の変形型２５である。矢印２６はラマン分光における基板に対するレーザ光の入射方向を示し、矢印２７は質量分析における基板に対する一次ビームの入射方向を示す。矢印２８は、基板表面に対して垂直方向から見た場合の、質量分析におけるマーカに対する一次ビームの入射方向を示す。

試料表面の高さにレーザ光の焦点が集光された条件で、マーカのラマン画像の模式図を図４（ｃ）に示す。四角錐型、半球型、三角錐型、円錐の変形型の各々のマーカに対して２９、３０、３１、３２の信号を得る。破線２１の高さに焦点が合うようにレーザ光を調整すると、焦点位置に相当するマーカからラマン信号が強く発生する。したがって、この条件でのマーカのラマン画像は、基板面に対して平行かつレーザ光の焦点高さと等しい平面でマーカを切断すると仮定したときの、断面の外周部と類似のパターンを示す。

実施形態１ではＣＡＲＳによるラマン分光を行ったが、他のラマン分光法を用いても良い。また、実施例１では、ラマン散乱の検出には、基板に対して垂直方向から入射したレーザ光の方向に対して１８０度の方向に反射した光を利用したが、入射したレーザ光が試料を透過した光や、特定の角度に散乱した光を検出しても良い。

次に、マーカの質量画像の模式図を図４（ｄ）に示す。四角錐型、半球型、三角錐型、円錐の変形型の各々のマーカに対して３３、３４、３５、３６の信号を得た。試料表面の高さに一次ビームを集光すると、焦点位置に相当するマーカからイオン信号が強く発生した。質量分析法では、基板に対して特定の傾斜角で一次ビームを照射し、試料表面から発生したイオンを質量分析装置に導入する方法が一般的である。その場合、マーカを構成する面のうち、一次ビームが照射されない面が発生する。したがって、マーカの質量画像は、マーカを構成する面のうち一次ビームに照射されている面を、基板に対して平行かつ一次ビームの焦点高さと等しい平面で切断すると仮定したときの、断面の外周部と類似のパターンを示す。実施例１では、ＴＯＦ−ＳＩＭＳを用いた質量分析を行ったが、他の質量分析法を用いても良い。

マーカのラマン画像と質量画像を比較すると、ラマン画像の一部分が質量画像と相似形のパターンであることが分かる。ラマン画像中のマーカに由来するパターンと、質量画像中のマーカに由来するパターンの類似性を検出し、類似性の高い部分を重ね合わせることにより、ラマン画像と質量画像の重ね合わせを行う。なお、類似性の検出法として、パターンサーチ法、正規化相関法、エッジ検出法なども用いることができる。

（実施形態２）
実施形態２では、ラマン分光におけるレーザ光の入射角度、レーザ光の収束角度及びマーカの形状が、ラマン信号に及ぼす効果を示す。また、質量分析における一次ビームの照射角度、一次ビームの集束角度及びマーカの形状が、質量信号に及ぼす効果を示す。

ラマン分光におけるレーザ光は、有限の集束角をもって焦点位置に集光される。マーカからの信号を効率よく取得するためには、マーカの形状がレーザ光を遮蔽せず、レーザ光のすべてがマーカを構成する面に照射されることが好ましい。マーカの形状とレーザ光の収束角の関係について、マーカが円錐形、四角錐、三角錐、多角錐の場合について図５（ａ）を用いて説明する。

基板表面に垂直かつ、レーザ光の照射方向ベクトルとマーカの頂点Ａを含む平面で切断された場合に、マーカの断面は三角形となり、断面を三角形ＡＢＣとする。また、基板の断面のうち、基板表面は線分ＤＥとする。レーザ光３９はマーカ表面の線分ＡＣ上の点Ｃ′に集光されているとする。線分ＤＥと平行な線分のうち、点Ｃ′を通過する線分をＤ′Ｅ′とする。ここで点Ｃ′の基板表面からの高さは、ラマン分光を行う試料表面の高さと一致している。

マーカの断面で、試料表面の高さにおいてマーカと基板がなす角、すなわちマーカ３７を構成する線分ＡＣと線分Ｄ′Ｅ′との間でなす角∠ＡＣ′Ｄ′をθ１とする。レーザ光３９の集束角をθ２とする。試料表面の高さにおいてレーザ光の基板に対する照射角、すなわち、レーザ光の線分Ｄ′Ｅ′に対する照射角（レーザ光が集光用レンズで集光される前のレーザ光の照射方向ベクトルＦＧと、基板の断面の線分ＤＥと平行な線分のうち、点Ｃ′を通過する線分Ｄ′Ｅ′とのなす角∠ＦＣ′Ｅ′）をθ３とする。この場合、基板表面と平行な平面のうち、下記式（１）を満たす条件であれば、マーカの形状がレーザ光を遮蔽せず、ラマン分光でマーカからの信号を効率よく取得でき、ラマン画像のＳ／Ｎ（信号／ノイズ）比が向上する。

なお、レーザ光は平行な光ビームが集光用レンズを通過した後に、集光用レンズの焦点距離で集光される。

一般的にラマン分光を行う際のθ３は基板表面に対して垂直方向（θ３＝９０°）であるが、これ以外の場合においては、マーカを構成する複数の面のうち、レーザ光が照射されない面やレーザ光の一部が集光されない面が発生する。例えば、図５（ａ）のレーザ光の照射条件で、線分ＡＢに対してレーザ光を集光させたようとした場合、線分ＡＣでレーザ光の一部分もしくは大部分が遮蔽されてしまうために、線分ＡＢに集光されるレーザ光の強度は大きく減少してしまう。この場合、マーカのラマン画像は、マーカを構成する面のうちレーザ光が照射されている線分ＡＣからの信号強度が最も強くなるので、得られるラマン振動の強度分布情報は、レーザ光が線分ＡＣを含む面を基板に対して平行かつレーザ光の焦点高さと等しい平面で切断したときの断面のパターンとなり、これをラマン振動の強度分布情報と質量分布情報を関連させる際の、ラマン振動の強度分布情報として利用することができる。

また、質量分析法における一次ビームも同様に、有限の集束角をもって焦点位置に集光される。マーカからの信号を効率よく取得するためには、マーカの形状が一次ビームを遮蔽せず、マーカ表面に照射される一次ビームの量を多くすることが求められる。マーカの形状と１次ビームの収束角の関係について、マーカが円錐形、四角錐、三角錐、多角錐の場合について図５（ｂ）を用いて説明する。

一次ビーム４０が照射される、基板表面に垂直かつ、一次ビームの方向ベクトルとマーカの頂点を含む平面で切断された場合に、マーカの断面は三角形となり、これを三角形ＨＩＪとする。また、基板の断面のうち、基板表面の線分をＫＬとする。一次ビーム４０はマーカ表面の線分ＨＪ上の点Ｊ′に集光されているとする。線分ＫＬと平行な線分のうち、点Ｊ′を通過する線分をＫ′Ｌ′とする。ここで点Ｊ′の基板表面からの高さは、ラマン分光を行う試料表面の基板表面からの高さと一致している。

マーカの断面で、試料表面の高さにおいてマーカと基板のなす角、すなわち、マーカ４１を構成する線分ＨＪと線分Ｋ′Ｌ′との間でなす角∠ＨＪ′Ｋ′をθ４とする。一次ビームの集束角をθ５とする。試料表面の高さにおいて一次ビームの基板に対する照射角（一次ビームがレンズで集光される前の一次ビームの照射方向ベクトルＭＮと基板の断面の線分ＫＬと平行な線分のうち、点Ｊ′を通過する線分Ｋ′Ｌ′とのなす角∠ＭＪ′Ｌ′）をθ６とする。下記式（２）を満たす条件であれば、質量分析法でマーカからの信号を効率よく取得でき、質量画像のＳ／Ｎ（信号／ノイズ）比が向上する。

一般的に質量分析法を行う際には、マーカを構成する複数の面のうち、１次ビームが照射されない面が発生する。例えば、図５（ｂ）の１次ビームの照射条件で、線分ＨＩに対して一次ビームを集光させようとした場合、線分ＨＪが一次ビームの一部分もしくは大部分を遮蔽するために、線分ＨＩに集光される一次ビームの強度は大きく減少してしまう。この場合、マーカの質量画像は、マーカを構成する面のうち１次ビームが照射されている線分ＨＪを含む面を、基板に対して平行かつレーザ光の焦点高さと等しい平面で切断したときの、断面のパターンとなる。このパターンをラマン振動の強度分布情報と質量分布情報を関連させる際の、質量情報として利用することができる。

このように、マーカの形状とレーザ光の収束角を上記条件に調整することで、マーカの表面からの信号の強度を高め、ラマン画像と質量画像の重ね合わせが精度良くできる。同様に、ラマン振動の強度分布情報と質量分布情報を精度良く位置合わせをして関連させることができる。

さらに、マーカの形状とレーザ光および一次ビームの収束角の関係について、マーカが半球体の場合について図５（ｃ）を用いて説明する。レーザ光および一次ビームのそれぞれにおいて、同一の結果が得られるため、レーザ光の場合のみ説明する。基板表面に垂直かつレーザ光の方向ベクトルと半球体の最も高い点を含む平面で切断されたマーカの断面を図４（ｃ）に示す。基板の断面のうち、基板表面を線分ＱＲとする。レーザ光４３はマーカ表面の弧ＯＰ上の点Ｓに集光されているとする。線分ＱＲと平行な線分のうち、点Ｓを通過する線分をＱ′Ｒ′とする。ここで点Ｓの基板表面からの高さは、ラマン分光を行う試料表面の高さと一致している。

マーカの断面で、レーザ光の集光点Ｓにおける円の接線の線分ＹＴと、線分Ｑ′Ｒ′でなす角のうち∠ＹＳＱ′をθ７、レーザ光の集束角をθ８、レーザ光の基板に対する照射角（レーザ光がレンズで集光される前のレーザの照射方向ベクトルＵＶと、基板の断面の線分ＱＲと平行な線分のうち、点Ｓを通過する線分Ｑ′Ｒ′とのなす角のうち∠ＵＳＲ′）をθ９とする。下記式（３）を満たす条件であれば、半球を構成する面のうちマーカの形状がレーザ光を遮蔽せず、ラマン分光でマーカからの信号を効率よく取得できる面が存在し、ラマン画像のＳ／Ｎ（信号／ノイズ）比が向上する。

一方で、レーザ光を半球体に照射する際には、マーカを構成する面のうちレーザ光が照射されない面が発生する。図５（ｃ）の場合、弧ＯＰ上の点Ｗにレーザ光を集光させようとした場合、弧ＷＸでレーザ光４６の一部分もしくは大部分が遮蔽されてしまうために、集光されるレーザ光の強度は減少してしまう。

マーカのラマン画像は、レーザ光が遮蔽された状態でレーザ光がマーカを構成する面に照射された場合よりも、レーザ光が遮光されない状態でレーザ光がマーカを構成する面に照射された場合の方が、信号強度が強くなる。ラマン分光によって得られるラマン画像は、照射されているレーザ光の強度が高い面を基板に対して平行かつレーザ光の焦点高さと等しい平面で切断したときの、断面のパターンとなる。これをラマン振動の強度分布情報と質量分布情報を関連させる際の、ラマン振動の強度分布情報として利用することができる。

（実施形態３）
実施形態３では、生体試料とマーカの位置関係について検討した結果について説明する。図６（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は基板上の試料とマーカを基板の上方向から見た図を示す。図６（ａ）に、基板４９上に試料４７を配置し、その外周部分に大きさの異なる四角錐のマーカ４８が複数配置する場合を示す。図６（ｂ）に、基板５２上に試料５０が配置し、基板全体に同じ大きさの四角錐のマーカ５１を複数配置する場合を示す。図６（ｃ）に、基板５５上に試料５３を配置し、その外周部分に変形した楕円のマーカ５４が複数配置する。図６（ｄ）では、基板５８上に試料５６を配置し、その外周部分にマーカ５７を配置する場合を示す。マーカ５７の高さは試料よりも高く、基板に対して傾斜した面が含まれている。これらのいずれの場合においても、ラマン分光法および質量分析法の両方において、試料にレーザ光および一次ビームの焦点があった状態で、試料表面とマーカの両方からの信号を得ることができ、ラマン画像と質量画像を精度良く重ねることができる。これらの中で、図６（ｂ）や図６（ｄ）の場合には、マーカからの信号が均一となり、重ね合わせが容易になり、質量分布情報とラマン震度の強度分布情報を精度良く関連させることができるので好ましい。

１ 試料
２，３ 重ね合わせ用マーカ
４ 基板
５ 試料
６，７ 重ね合わせ用マーカ
８ 基板
１０，１１ 重ね合わせ用マーカからのラマン信号が得られている領域
１４，１５ 重ね合わせ用マーカからの質量信号が得られている領域

Claims (5)

1. ラマン分光法によって得られるラマン振動の強度分布情報と質量分析法によって得られる質量分布情報とを位置合わせする方法であって、
   基板上に、試料と、該試料の外周部に、高さが試料表面と同じか試料表面よりも高い三次元形状のマーカと、を配置した測定用試料を作製する工程と、
   ラマン分光法で前記測定試料のラマン振動の強度分布情報を得る工程と、
   質量分析法で前記測定用試料の質量分布情報を得る工程と、
   前記質量分布情報における前記マーカの情報と、前記ラマン振動の強度分布情報における前記マーカの情報に基づいて前記質量分布情報と前記ラマン振動の強度分布情報を位置合わせする工程と、
   を有し、前記三次元形状のマーカが、円錐形、四角錐、三角錐、多角錐又は半球体であることを特徴とする位置合わせをする方法。
2. ラマン分光法によって得られるラマン振動の強度分布情報と質量分析法によって得られる質量分布情報とを位置合わせする方法であって、
   基板上に、試料と、該試料の外周部に、高さが試料表面と同じか試料表面よりも高い三次元形状のマーカと、を配置した測定用試料を作製する工程と、
   ラマン分光法で前記測定試料のラマン振動の強度分布情報を得る工程と、
   質量分析法で前記測定用試料の質量分布情報を得る工程と、
   前記質量分布情報における前記マーカの情報と、前記ラマン振動の強度分布情報における前記マーカの情報に基づいて前記質量分布情報と前記ラマン振動の強度分布情報を位置合わせする工程と、
   を有し、前記三次元形状のマーカは、前記マーカを前記基板表面に対して平行な平面で切断した断面積が、前記基板表面からの距離が大きくなるにつれて小さくなる形状であることを特徴とする位置合わせをする方法。
3. 前記ラマン振動の強度分布情報がラマン振動の強度分布画像であり、
   前記質量分布情報が質量分布画像であり、
   前記位置合わせをする方法が、前記ラマン振動の強度分布画像と前記質量分布情報との重ね合わせることであることを特徴とする請求項１または２に記載の位置合わせをする方法。
4. 前記基板表面に垂直かつ、前記マーカの頂点を含み前記ラマン分光法のレーザ光の照射方向ベクトルを含む平面で前記マーカを切断したとき、
   前記マーカの断面において、前記試料表面の高さにおいて前記マーカと前記基板がなす角をθ１、前記レーザ光の集束角をθ２、前記試料の高さにおいて前記レーザ光の前記基板に対する照射角をθ３とした場合に、下記式（１）を満たすことを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の位置合わせをする方法。
   

   
5. 前記基板表面に垂直かつ、前記マーカの頂点を含み前記質量分析法の一次ビームの方向ベクトルを含む平面で前記マーカを切断したとき、
   前記マーカの断面において、前記試料表面の高さにおいて前記マーカと前記基板がなす角をθ４、前記一次ビームの集束角をθ５、前記試料表面の高さにおいて前記一次ビームの基板に対する照射角をθ６とした場合に、下記式（２）を満たすことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の位置合わせをする方法。
   

   

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