JP5702092B2 - チョウザメ由来の新規な株化細胞 - Google Patents

Description

本発明は、チョウザメのウィルス感染症の診断などへの利用が期待されるチョウザメ由来の新規な株化細胞に関する。

近年、水産養殖技術は、養殖可能な魚類の広汎化や供給安定性の向上などの点において目覚しい発展を続けているが、その反面において、細菌やウィルスなどの感染症による養殖魚の斃死も問題となっている。特に、ウィルス感染症は、大量斃死を伴うことが多いにもかかわらず有効な対策がないのが実情である。従って、ウィルス感染症に対しては、いかに早期に診断を行うかということが重要となる。
ウィルス感染症の診断を行うためには、ウィルスが感染する魚類の当該ウィルスに感受性を有する株化細胞が必要不可欠である。魚類由来の株化細胞は、ニジマス卵巣由来の線維芽性株化細胞であるＲＴＧ−２細胞が樹立されて以来、数多くの株化細胞が報告されている。しかしながら、その多くはサケ科魚類やコイ科魚類などの限られた魚類から分離培養して樹立された線維芽性のものであり、また、上皮性のものは少ない。従って、種々の魚類において、そのウィルス感染症の診断やウィルス自体の分離などが必ずしも円滑に行えているとはいえないのが現状である。
ところで、チョウザメ（ｓｔｕｒｇｅｏｎ）は、およそ３億年前から生存していた古代種であるが、その卵はキャビアとして珍重されているほか、その肉も食用として利用価値が高いことから、今後の養殖対象魚類として期待されている。このような状況下においては、チョウザメのウィルス感染症の診断を行うための株化細胞の樹立が必要となる。
本発明者らは、これらの事情のもとにこれまで精力的に研究を行い、その結果として、チョウザメの種類の１つであるベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞から２種類の株化細胞、ＳＴＩＰ−１細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２１）およびＳＴＩＰ−３細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−８４２２）の樹立に成功し、特許文献１において報告している。しかしながら、さらなる新規な株化細胞の探索と樹立は、チョウザメの養殖技術の確立のために大変意義深いことである。

特許第４０６５１５０号公報

そこで本発明は、チョウザメのウィルス感染症の診断などへの利用が期待されるチョウザメ由来の新規な株化細胞を提供することを目的とする。

本発明者らは上記の点に鑑みてさらに研究を重ねた結果、ベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞から新たな株化細胞としてＳＴＩＰ−２細胞の樹立に成功したが、このＳＴＩＰ−２細胞は、先に樹立したＳＴＩＰ−１細胞およびＳＴＩＰ−３細胞と異なる性質として、全く意外なことにヒアルロン酸産生能を有することを知見した。

本発明は、請求項１記載の通り、チョウザメの種類の１つであるベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞由来の株化細胞であって、培養することで細胞が集密的な状態になってからもさらに培養することで培養上清にヒアルロン酸を分泌するＳＴＩＰ−２細胞である。

本発明によれば、チョウザメのウィルス感染症の診断などへの利用に加え、ヒアルロン酸の産生細胞としての利用が期待されるチョウザメ由来の新規な株化細胞を提供することができる。

ＳＴＩＰ−２細胞の顕微鏡写真である。 各温度におけるＳＴＩＰ−２細胞の増殖曲線である。 ＳＴＩＰ−２細胞の増殖に対するＦＢＳの影響を示すグラフである。 ＳＴＩＰ−２細胞の染色体数を示すグラフである。 ＳＴＩＰ−２細胞の培養上清に含まれる高い粘度を有する透明の物質がヒアルロン酸であることを示す分子マトリックス電気泳動法（ＳＭＭＥ）による分析結果である。

本発明のＳＴＩＰ−２細胞の由来となるチョウザメは、Ｈｕｓｏ属に属するベルーガ（Ｈ．Ｈｕｓｏ）の雌とＡｃｉｐｅｎｓｅｒ属に属するステールリヤチ（Ａ．ｒｕｔｈｅｎｕｓ）の雄から作出された品種改良種であるベステル（Ｂｅｓｔｅｒ）である。ベステルは交雑種であるため、ベステル由来の株化細胞は、各種のウィルスに対する感受性に関してＨｕｓｏ属チョウザメの細胞とＡｃｉｐｅｎｓｅｒ属チョウザメの細胞の双方の特性を兼ね備えていることが期待される。

本発明のＳＴＩＰ−２細胞は、眼球由来の株化細胞である。一般に、魚類細胞を分離培養する場合、腎臓や卵巣を由来とする細胞を用いるが、これらの組織から上皮細胞のみを選択して分離培養するためには多大な時間と労力を必要とする。しかしながら、眼球由来の細胞を用いることにより、上皮細胞由来の株化細胞の樹立が容易となる。

本発明のＳＴＩＰ−２細胞は、眼球の組織の中で、外界と非接触の状態で存在する虹彩色素の上皮細胞から樹立されたものである。腎臓や卵巣を由来とする細胞は微生物汚染の可能性が否定できないが、虹彩色素上皮細胞は元来、微生物汚染の可能性がないので、無菌的に細胞を取出せば、その後の作業を無菌的に行うことで株化細胞の微生物汚染を確実に防ぐことができる。

本発明のＳＴＩＰ−２細胞の樹立方法は、例えば特許文献１に記載の方法に従って、初代培養細胞を継代培養することで行えばよい。培地は、魚類細胞の培養に通常用いられるＬ１５培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）を加えたようなものでよい。

本発明のＳＴＩＰ−２細胞は、特許文献１において報告したＳＴＩＰ−１細胞およびＳＴＩＰ−３細胞と同様に、ベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞から樹立した株化細胞であり、チョウザメのウィルス感染症の診断などへの利用が期待される。加えて、ＳＴＩＰ−２細胞は、ＳＴＩＰ−１細胞およびＳＴＩＰ−３細胞と異なる性質としてヒアルロン酸産生能を有するので、ヒアルロン酸の産生細胞としての利用が期待される。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

実施例１：ＳＴＩＰ−２細胞の樹立
（１）ベステル眼球からの虹彩色素上皮細胞の分離
体長約１５ｃｍのベステル３０尾から眼球を摘出して７０％エタノール中で殺菌処理した後、殺菌処理した眼球をペニシリンとストレプトマイシンを添加したＰＢＳ（−）中でよく洗浄した。その後、眼球から角膜とレンズを取り除いて虹彩を切り出した。こうして得られた虹彩を０．０５％ＥＤＴＡで約４０分間処理し、虹彩色素上皮細胞と、虹彩のストローマや強膜などの結合組織との分離を容易にした後、これらの結合組織を取り除き、分離したシート状の虹彩色素上皮細胞を０．１２５％トリプシンで酵素処理してシングルセル状態の細胞（初代細胞）を得た。

（２）初代培養
上記のようにして得られた初代細胞を、直径３．５ｃｍプラスチックディシュ（培養皿）に加えた、Ｌｅｉｂｏｖｉｔ’ｓ Ｌ１５培地（Ｇｉｂｃｏ社製）に１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製の牛胎児血清）とペニシリン（１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）とストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した培地を用い、２０℃のＣＯ_２インキュベータ内（但し大気雰囲気）で培養した。初代細胞の中から増殖性の優れた細胞を選択し、継代培養を繰り返した。

（３）継代培養
培養皿が細胞で集密的（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な状態になったら、０．０５％ＥＤＴＡと０．１２５％トリプシンを含有する溶液で細胞を培養皿から剥離し遠心分離により細胞を回収し、別の培養皿に移し、上記の初代培養の培養条件で培養を継続した。これを繰り返すことによって、長期間培養可能な株化細胞としてＳＴＩＰ−２細胞を得た。このＳＴＩＰ−２細胞は、継代培養の際、コラーゲンなどの細胞外基質を培養皿底面にコーティングするといったような添加をしなくても培養皿に着定した。なお、このＳＴＩＰ−２細胞は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに２０１０年８月９日に寄託されている（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２７４）。この特許出願の時点において、ＳＴＩＰ−２細胞の継代培養回数は３００回を超えている。

実施例２：ＳＴＩＰ−２細胞の性質
（１）細胞の形態
ＳＴＩＰ−２細胞は典型的な敷石状の上皮性の細胞である（図１参照：培養開始後１６日目の顕微鏡写真。スケールバーは５０μｍ）。

（２）細胞の温度特性
図２に示したように、ＳＴＩＰ−２細胞は１５℃〜２５℃で良好な増殖性を示したが、２５℃を超えるとその増殖性は阻害された。２０℃での培養開始後１９日目における細胞の倍化時間（指数関数的に細胞が増殖する時間）は約８０時間であり、培養皿への細胞の定着効率（培養皿に定着した細胞数を細胞皿に添加した全細胞数で割った値を百分率で表したもの）は約８８％であった。

（３）細胞増殖に対するＦＢＳの影響
図３に示したように、ＳＴＩＰ−２細胞を増殖せしめるために必要なＬ１５培地に添加されるＦＢＳの濃度は４％で足りた（ＦＢＳ濃度以外は上記の初代培養の培養条件と同じ）。よって、ＳＴＩＰ−２細胞を増殖せしめるために必要なＦＢＳは少量であることから、ＳＴＩＰ−２細胞の大量培養は経済的に有利であることがわかった。

（４）細胞の染色体数
ＳＴＩＰ−２細胞の染色体数を、継代培養２００回以上の細胞について、培養６日目の対数増殖期の細胞にコルヒチン処理を行う常法にて調べた。具体的には、細胞に最終濃度が０．２０μｇ／ｍｌになるようにコルヒチンを加え、１８時間培養した後に培地を取り除いてから細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した。次に、０．０５％ＥＤＴＡと０．１２５％トリプシンを含有する溶液で細胞を培養皿から剥離し遠心分離により細胞を回収した。こうして回収した細胞に０．０７５ＭのＫＣｌを添加して室温にて２０分間静置して低張処理を行った。低張処理した細胞懸濁液はカルノア液を用いて２０分間氷中で固定した後、フレームドライ法によって染色体標本とした。これをギムザ染色し、顕微鏡（倍率１０００倍）で染色体を計数した。その結果、ＳＴＩＰ−２細胞の染色体数は１９６．５±１．７本でモードは１９９本であった。この染色体数はベステルの染色体数である１１７本の約１．７倍であり、株化細胞の特徴を示すものであった（図４参照）。染色体の核型分析によれば、マイクロクロモゾームが最も多く、全体の約５３％を占めていた。

（５）細胞のヒアルロン酸産生能
上記の初代培養の培養条件と同じ培養条件でＳＴＩＰ−２細胞の培養を行い、培養皿が細胞で集密的な状態になってからもさらに培養を行うと、培養上清に高い粘度を有する透明の物質の蓄積が観察された。この現象は、先に樹立したＳＴＩＰ−１細胞およびＳＴＩＰ−３細胞では見られない、ＳＴＩＰ−２細胞に特異的なものであった。そこでこの物質の分析を以下の方法で行った。
ＳＴＩＰ−２細胞を培養皿が細胞で集密的な状態になってからさらに３〜４日培養した後の培養上清１ｍｌをスポイトで吸い取り、３ｍｌのエタノールを添加して４℃で２時間静置した後、１００００ｘｇで５分間遠心分離し、得られた沈殿を回収した。この沈殿を１ｍｌの２Ｍ尿素／０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）に溶解し、１００μｇのトリプシンを添加して３７℃で一晩反応させ、タンパク質の分解処理を行った後、分子量が１００ｋＤａ未満の画分をカットオフするフィルターで分子量が１００ｋＤａ以上の画分を５０μｌまで濃縮した。得られた濃縮液を還元アルキル化処理した後、分子マトリックス電気泳動法（ＳＭＭＥ：必要であればＹ．Ｍａｔｓｕｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２００９，８１（１０），ｐｐ３８１６−３８２３を参照のこと）を用いて分析した。結果を図５に示す（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ染色による）。図５左の電気泳動写真から、ＳＴＩＰ−２細胞の培養上清には培地には含まれない分子量が１００ｋＤａ以上の物質が含まれていることがわかった。そこで１０μｌの上記の濃縮液に１μｌの０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を添加し、さらに、ヒアルロニダーゼの１ｍｇ／ｍｌ水溶液（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ ｈｙａｌｕｒｏｌｙｔｉｃｕｓ由来）を１μｌ添加し、６０℃で一晩反応させた後、反応液を分子マトリックス電気泳動法を用いて分析したところ、図５右の電気泳動写真から明らかなように、ヒアルロニダーゼ処理を行う前に存在したスポット（Ｃｏｎｔｒｏｌ）がヒアルロニダーゼ処理によって消失した。以上の結果から、ＳＴＩＰ−２細胞の培養上清に含まれる高い粘度を有する透明の物質は、１００ｋＤａ以上の分子量を有するヒアルロン酸であること、ＳＴＩＰ−２細胞はヒアルロン酸産生能を有し、培養上清にヒアルロン酸を分泌することがわかった。

本発明は、チョウザメのウィルス感染症の診断などへの利用に加え、ヒアルロン酸の産生細胞としての利用が期待されるチョウザメ由来の新規な株化細胞を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims (1)

1. チョウザメの種類の１つであるベステルの眼球の虹彩色素上皮細胞由来の株化細胞であって、培養することで細胞が集密的な状態になってからもさらに培養することで培養上清にヒアルロン酸を分泌するＳＴＩＰ−２細胞（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２７４）。