JP5700336B2 - 糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子、およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、糖鎖を固定化した蛍光性ナノ粒子とその製造方法に関する。

近年、ナノ粒子は、ライフサイエンス、医療診断、バイオテクノロジーなどの様々な分野への応用が行われている。例えば、抗体などを固定化したナノ粒子は、抗原抗体反応による免疫染色や、抗原の検出、分離／精製などに有用である。また、薬剤や遺伝子を固定化したナノ粒子は、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）のキャリアとして有用である。また、標識したナノ粒子は、分析用マーカー、トレーサーなどの分析用試薬として有用である。

蛍光性ナノ粒子は、蛍光体成分として有機材料または無機材料を用いて調製される。有機材料は、容易に光退色するので長時間の蛍光イメージングには適さない。一方、無機材料は、有機材料に比べて光退色しにくいので長時間の蛍光イメージングが可能となる。

無機材料を用いる蛍光性ナノ粒子の製造法は、これまでに様々な方法が開発されている。一般的には、カドミウムイオンと硫黄やセレン、テルルなどのカルコゲンとを界面活性剤存在下で加熱し、ナノ結晶を形成／成長させることによって調製する（非特許文献１）。この方法では、反応時間によって粒径分布の狭い均一な蛍光性ナノ粒子を調製することができるが、ナノ粒子表面が界面活性剤で覆われており疎水性を示す。疎水性のため、水溶性の溶媒に不溶であるため、ライフサイエンス、医療診断、バイオテクノロジーなどの様々な分野への応用が難しい。

疎水性の蛍光性ナノ粒子から親水性の蛍光性ナノ粒子に転換させるために、方法として、デキストランやポリアクリル酸などの親水性ポリマーによる被覆、シランカップリング剤によるシリカ表面処理による親水化（非特許文献２）、リポソーム被覆（非特許文献３、４）などが知られているが、親水性の蛍光性ナノ粒子に不可欠な糖鎖を導入するためには多段階を要する。また導入できたとしても糖鎖本来の機能発現に必要な糖鎖の高密度化は困難である。

上記の方法に対して、近年、親水性の蛍光性ナノ粒子を水中で調製する方法が注目されている。テルル化カドミウムの調製法では（非特許文献５）、無機材料成分としてカドミウムイオンとテルル化水素ナトリウムを用いて、安定化剤として金属成分の配位子となる３−メルカプトプロピオン酸などのチオール基とカルボキシル基の二官能性を有する化合物を用いる。安定化剤に使用したチオール配位子は、容易に配位子交換することができるため、目的の分子構造を持つ蛍光性ナノ粒子に変換することができる。しかしながら、テルル化カドミウムの蛍光性ナノ粒子は、テルルが解離しやすく不安定である。また配位子交換によって導入したチオール配位子は、可逆的に固定化されているため、目的分子を長時間保持したナノ粒子の調製は難しい。さらに依然として、導入できたとしても糖鎖本来の機能発現に必要な糖鎖の高密度化は困難である。

テルル化カドミウムの蛍光性ナノ粒子の安定性を向上させるため、硫化カドミウムや硫化亜鉛などによる被覆する方法が開発されている（非特許文献６）。しかしながら、これらのナノ粒子に対して、糖鎖分子の固定化は困難である。

一方、糖鎖を固定化した蛍光性ナノ粒子（以下、適宜、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子、またはＳＦＮＰともいう。）として、硫化カドミウムのナノ粒子に糖鎖を固定化する方法が知られているが（特許文献１）、高い発光性能を有する蛍光性ナノ粒子の合成は達成されていない。

近年、毒性が高いＣｄを含まない蛍光性ナノ粒子の製造法の開発が進められている。Ｚｎ_1-x(ＡｇＩｎ)_xＳ（ＺＡＩＳ）（特許文献２）からなる蛍光性ナノ粒子はＣｄを含まないため注目されているが、その親水化は難しく、糖鎖分子の固定化にいたっては、これまでに達成されていない。

また、テルル化カドミウム、硫化カドミウム、ＺＡＩＳ等の親水化した蛍光性ナノ粒子に対して、リガンド交換反応による糖鎖の固定化を行うと、蛍光性ナノ粒子の発光性が著しく低下する問題点があった。

特表２００４−５１１５１１号公報（平成１６年４月１５日公表） 特開２０１０−３１１１５号公報（平成２２年２月１２日公開）

M. Bruchez Jr., et al., Science, 281, 2013 (1998) C. Earhart, et al., Langmuir, 24, 6215 (2008) F. Osaki, et al., J. Am. Chem. Soc., 126, 6520 (2004) X.-L. Sun, et al., ChemBioChem, 5, 1593 (2004) H. Zhang, et al, J. Phys. Chem. B, 107, 8 (2003) H. Peng, et al., J. Lumin, 127, 721 (2007)

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、ライフサイエンス、医療診断、バイオテクノロジーなどの様々な分野への利用に適した、粒径が均一でありかつ高い水分散性および発光性を有し、かつ容易に糖鎖を固定化することができる、安定的な糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造法を提供することを目的とする。

本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、還元剤処理した糖鎖リガンド複合体と、加熱処理した蛍光性ナノ粒子を混和することによって製造され、分散液として提供されることを特徴としている。本発明において、上記糖鎖リガンド複合体は水溶性であり、上記蛍光性ナノ粒子は親水化されている。得られた糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、水溶液中で分散する。すなわち、本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造方法は、加熱処理された蛍光性ナノ粒子と、還元剤処理された糖鎖リガンド複合体を混和する工程を包含することを特徴としている。

このような構成を採用することによって、表面が糖鎖リガンド複合体で修飾されており、平均粒径が１〜１０ｎｍの糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を得ることができる。

本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子において、上記糖鎖リガンド複合体は、炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えているリンカー化合物の一端に存在するアミノ基にて還元末端を有する糖鎖と結合し、該リンカー化合物の他端に存在する硫黄原子を含む炭化水素構造にて任意の金属と結合している。

上記炭化水素誘導鎖は、炭素及び水素からなる炭化水素鎖であり、一部の炭素や水素が他の原子や置換基に置き換わっていてもよい。すなわち、上記炭化水素誘導鎖とは、末端にアミノ基を有し、炭化水素鎖の主鎖構造である炭素−炭素結合（Ｃ−Ｃ結合）の一部が、炭素−窒素結合（Ｃ−Ｎ結合）、炭素−酸素結合（Ｃ−Ｏ結合）、アミド結合（ＣＯ−ＮＨ結合）に置き換わっていてもよいものを指す。

また、上記硫黄原子を含む炭化水素構造とは、炭素及び水素からなる炭化水素構造にて、一部の炭素が硫黄に置き換わっているものを意味する。また、この硫黄原子を含む炭化水素構造は、鎖状（直鎖、枝分かれ鎖の両方を含む）であっても、環状であってもよく、また、鎖状構造および環状構造の両方の構造を含んでいてもよい。

本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子において、上記硫黄原子を含む炭化水素構造は、Ｓ−Ｓ結合またはＳＨ基を含む炭化水素構造を備えているものであってもよい。つまり、上記硫黄原子を含む炭化水素構造中に、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）またはチオール基（ＳＨ基）が含まれていてもよい。

また、本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子において、上記アミノ基は芳香族アミノ基であることが好ましい。還元アミノ化反応の最適条件であるｐＨ３〜４においては、アミノ基がプロトン化されないことが必要である。そのため、芳香族との共役によってｐＨ３〜４でも非共有電子対が窒素原子上に存在する芳香族アミノ基が好ましい。

また、本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子において、糖鎖リガンド複合体の還元剤処理に用いる還元剤は水素化ホウ素ナトリウムであることが好ましい。

上記構成によれば、リンカー化合物内のＳ−Ｓ結合を還元して−ＳＨ基に変換し、任意の金属と、金属−硫黄（Ｓ）結合、例えばカドミウム−硫黄（Ｃｄ−Ｓ）結合により結合することができる。これにより、このＣｄ−Ｓ結合を介して、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を提供することができる。このことにより、容易に糖鎖を固定化することができる安定な糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造法の提供が可能となった。

還元剤処理した水溶性の糖鎖リガンド複合体を蛍光性ナノ粒子に添加することによって、蛍光性ナノ粒子を水溶液中で安定化することが可能となった。本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、粒径が均一であり、かつ高い水分散性を有する。

本発明の抗体固定化蛍光性ナノ粒子は、加熱処理された蛍光性ナノ粒子と、還元剤処理されたリガンド複合体を混和する工程を包含することを特徴としており、蛍光性ナノ粒子に固定化されたリガンド複合体に抗体を結合することによって製造される。本発明において、上記リガンド複合体は水溶性であり、上記蛍光性ナノ粒子は親水化されている。得られた抗体固定化蛍光性ナノ粒子は、水溶液中で分散する。

このような構成を採用することによって、表面が抗体リガンド複合体で修飾されており、平均粒径が５〜５０ｎｍの抗体固定化蛍光性ナノ粒子を得ることができる。

本発明に係る抗体固定化蛍光性ナノ粒子において、上記リガンド複合体は、炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えているリンカー化合物の一端にて抗体と直接的または間接的に結合し、該リンカー化合物の他端に存在する硫黄原子を含む炭化水素構造にて任意の金属（蛍光性ナノ粒子）と結合している。

上記炭化水素誘導鎖は、上述した糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子における炭化水素誘導鎖と同様の構造を有しているが、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造に用いられる炭化水素誘導鎖の一端に存在するアミノ基は他の反応基であってもよく、抗体を直接的または間接的に結合させ得る反応基であれば特に限定されず、糖鎖が結合していても結合していなくてもよい。すなわち、本発明の抗体固定化蛍光性ナノ粒子におけるリガンド複合体は、糖鎖が結合していても結合していなくてもよい。

また、上記硫黄原子を含む炭化水素構造は、上述した糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子における炭化水素構造と同一の構造であればよい。このような構造を有することによって、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を製造する際の利点が、抗体固定化蛍光性ナノ粒子の製造の際においてももたらされる。すなわち、本発明の抗体固定化蛍光性ナノ粒子の製造方法を用いれば、蛍光性ナノ粒子に抗体を容易に固定化することができ、かつ安定な抗体固定化蛍光性ナノ粒子の提供が可能となる。さらに、本発明を用いて製造された抗体固定化蛍光性ナノ粒子は、粒径が均一であり、かつ高い水分散性を有する。

以上のように、還元剤処理した糖鎖リガンド複合体と、加熱処理した親水性の蛍光性ナノ粒子とを混和するだけで、本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を調製することができる。このことは、容易に分解しやすい糖鎖であっても蛍光性ナノ粒子上に固定化できると同時に蛍光性ナノ粒子上に高い安定性を付与し得るという効果を奏する。また、本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を含む溶液に、上記糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の外側に位置する糖鎖を認識するタンパク質を添加するだけで、糖鎖とタンパク質とが相互作用した凝集物を生成し、溶液の蛍光も変化するので、糖鎖−タンパク質相互作用を、標識を用いることなく目視によって容易に測定することができるという、糖鎖−タンパク質相互作用の測定方法を提供し得るという効果を奏する。

糖鎖は、細胞内外に糖タンパク質や糖脂質の形で存在しており、細胞間認識やシグナル伝達をはじめとする様々な生体機能を担っている。細胞内外の糖鎖結合性分子を蛍光標識などによって可視化することができれば、糖鎖が関わる生体機能の解明に繋がる。細胞の糖鎖結合性を利用し、本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を用いて細胞の蛍光標識を行うことによって、蛍光性ナノ粒子が細胞に結合し、糖鎖による細胞の蛍光標識を可能にするという効果を奏する。同様の観測は、既知の蛍光を発する有機化合物を糖鎖に付与することによっても達成されるが、有機化合物の場合は、発光に伴って、有機化合物自体が光のエネルギーによって分解するため、蛍光が突然消失することが起こる。しかし、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の場合には、このような光による分解は起こらず、長時間の連続測定も可能である。

本発明の別の側面によれば、上記構成による本発明の蛍光性ナノ粒子を含む、相互作用検出剤、細胞標識剤、診断剤が提供される。

α−グルコース固定化蛍光性ナノ粒子のコロイド溶液の透過型電子顕微鏡画像を示す図である。 目視下における糖鎖−タンパク質相互作用解析を示す図である。 糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を用いたＦＡＣＳ解析を示す図である。 本発明の合成法または従来法によって得られた蛍光性ナノ粒子の半値幅（ａ）および蛍光波長（ｂ）を比較したグラフである。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによって本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子における糖鎖の固定化を示すチャート（ａ）、および本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像（ｂ）を示す図である。 本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子のタンパク質との相互作用を示すグラフである。 本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の結合特異性を示すグラフである。 本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子による細胞認識を示すグラフである。 本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子による細胞認識を示す蛍光顕微鏡画像である。 本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造に用いる蛍光性ナノ粒子の特性を示す図である。 本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造に用いる蛍光性ナノ粒子の特性を示す図である。 本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の特性を示す図である。 本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子による細胞認識を示す蛍光顕微鏡画像である。 本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子のタンパク質との相互作用および結合特異性を示す図である。 抗体を固定化した本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色の結果を示す図である。 抗体を固定化した本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の、ＵＶ−Ｖｉｓおよび蛍光強度を測定した結果を示す図である。 抗体を固定化した本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の、黄色ブドウ球菌との結合性を示す蛍光顕微鏡画像である。 ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによって本発明の抗体固定化蛍光性ナノ粒子におけるリンカー分子の固定化を示すチャートである。 本発明の抗体固定化蛍光性ナノ粒子の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の銀染色の結果を示す図である。 抗体固定化蛍光性ナノ粒子を用いたＦＡＣＳ解析を示す図である。

本発明の実施の形態について説明すれば以下のとおりであるが、本発明はこれに限定されるものではない。以下、本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造方法、糖鎖−タンパク質相互作用の測定方法、細胞の糖鎖結合性を利用して細胞を蛍光標識する方法、および抗体／糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造方法とそれを用いた細菌の検出方法について詳述する。

〔１．糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造法〕
本発明は、糖鎖を固定化した蛍光性ナノ粒子（すなわち、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子）を製造する方法を提供する。本発明の方法によって製造された蛍光性ナノ粒子は水溶液中で分散する特徴を有している。すなわち、本発明の方法は、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子のコロイド溶液を調製する方法でもある。

本明細書において、「糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子」とは、以下に詳述する糖鎖リガンド複合体と、任意の蛍光性ナノ粒子（蛍光性の金属ナノ粒子ともいう。）とを結合させてなるものである。なお、蛍光性ナノ粒子は後述するように製造してもよいし、市販のものを使用してもよい。

なお、本明細書において、「金属ナノ粒子」は、無機金属成分を含むナノ粒子であれば特に限定されず、本発明において好適に用いられる金属成分としては、Ｓｉ、Ｇｅ、Ｃｄ、Ｚｎ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｇａ、Ａｓ、Ｉｎ、Ｔｅ、Ｓなどが挙げられるがこれらに限定されない。

また、本明細書中において、「ナノ粒子」は水溶液中で分散してコロイド溶液を形成するものが意図される。よって、ナノ粒子の平均粒子径は、０．５〜４００ｎｍの範囲内であることが好ましく、０．５ｎｍ〜１００ｎｍの範囲内であることがより好ましく、１ｎｍ〜１０ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。平均粒子径は０．５ｎｍ未満であってもよいが、そのような粒子の製造は高コストであって実用的でなく、４００ｎｍを超えると、粒子の分散安定性が経時的に変化しやすいので好ましくない。

また、本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の構成要素である糖鎖リガンド複合体は、任意の蛍光性ナノ粒子と結合することのできるリンカー化合物と、分析対象となるタンパク質などと特異的に相互作用することができる糖鎖とから構成されている。そのため、上記糖鎖リガンド複合体は、タンパク質等の物質と疎水性に基づく非特異的な相互作用を形成しないことが必要とされる。好ましくは、上記糖鎖リガンド複合体は、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えたリンカー化合物および糖鎖からなり、上記リンカー化合物の主鎖は、その一端に糖鎖と結合したアミノ基を有し、その他端に硫黄原子を含む炭化水素構造を備えている。

本発明に利用されるリガンド複合体として好適なものは、ＷＯ２００５／０７７９６５に示されている化合物が挙げられる。具体的には、一般式（１）

（式中、ｐ，ｑはそれぞれ独立して０以上６以下の整数）にて表される構造を備え、上記Ｘとして、末端に芳香族アミノ基を有するとともに、主鎖に炭素−窒素結合を有していてもよい炭化水素誘導鎖を、１鎖又は２鎖又は３鎖含んでなる構造を備え、上記Ｙとして、硫黄原子又は硫黄原子を含む炭化水素構造を備え、上記Ｚとして、炭素−炭素結合又は炭素−酸素結合を持つ直鎖構造を備えているリンカー化合物と、還元末端を有する糖とが、上記芳香族アミノ基を介して結合している構造を有していることが好ましく、上記Ｘは、一般式（２）、または一般式（３）、または一般式（４）

（式中、ｍ^１〜ｍ^５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数、Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ）にて表される構造を備え、上記Ｒは糖鎖由来化合物であることがより好ましく、上記Ｚは、式（５）または式（６）

（式中、ｎ^１，ｎ^２はそれぞれ１以上６以下の整数）であってもよい。より好ましくは、本発明に利用可能なリガンド複合体は、一般式（７）、または、一般式（８）、または、一般式（９）、または、一般式（１０）、または、一般式（１１）

にて表される構造を有するリンカー化合物の芳香族アミノ基に、還元末端を有する糖が導入された構造を有するものが挙げられる。このようなリガンド複合体は、例えば、一般式（７）〜（１１）にて表される構造を有するリンカー化合物と、還元末端を有する糖とを用いて還元アミノ化反応を行うことによって製造することができ、

（式中、ｍ^１，ｍ^２，ｍ^３，ｍ^４，ｍ^５はそれぞれ独立して０以上６以下の整数、ｎ^１，ｎ^２はそれぞれ独立して１以上６以下の整数、ｑは０以上６以下の整数、Ｒは還元末端を有する糖、Ｒ’は水素（Ｈ）またはＲ）にて表される構造を有し得る。

また、本発明に利用可能なリガンド複合体は、上記一般式（７）、（８）、（９）または（１０）にて表されるリンカー化合物は、例えば、チオクト酸と、芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。また、上記一般式（１１）にて表されるリンカー化合物は、例えば、γ−メルカプト酪酸の２量体と、２分子の芳香族アミノ基末端が保護基によって保護されたアミン化合物との縮合反応を行い、上記芳香族アミノ基末端の保護基を脱保護することによって製造される。

上記チオクト酸は、

にて表される構造を備えており、上記アミン化合物は、保護基によって保護された芳香族アミノ基末端を有するものであれば特に限定されるものではない。

本発明の一実施形態において、上記一般式（９）にて表される構造においてｎ^１およびｑが０であるリンカー化合物

に、還元末端を有する糖が導入されたリガンド複合体が用いられる。このようなリガンド複合体の合成手順もまたＷＯ２００５／０７７９６５に開示されているが、例えば、リガンド複合体（化合物３０）の合成の手順を、式（３５）にしたがって簡単に説明すると以下のとおりである。

化合物２８（２．４７ｍｇ，８．２４μｍｏｌ）とシアル酸含有三糖（化合物２９、５．１１ｍｇ，７．５７μｍｏｌ）をジメチルアセトアミド／水（１：１，１．０ｍｌ）に溶解し、酢酸（１００μｌ）を加え、３７℃で１０時間放置した。反応液にシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１．５５ｍｇ，２４．７μｍｏｌ）を加え、３７℃でさらに７２時間放置した。反応液にアセトン３ｍｌを加え、未反応のシアノ化ホウ素ナトリウムをクエンチした後、濃縮した。得られた残渣は、Ｃｈｒｏｍａｔｏｒｅｘ ＯＤＳを用いたカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（カラム：ＤＡＩＳＯ ＳＰ−１２０−５−ＯＤＳ−ＢＰ）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を用いたクロマトグラフィーを順に行って精製した。

なお、化合物３０は白色の固体として得られ、収量は２．３１ｍｇ（３２％）であり、化合物３０の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（６００ＭＨｚ、Ｄ_２Ｏ）測定を行い、またＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行ったところ、ｍ／ｚ ９７７．５［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］であった。これらによって化合物３０の構造を確認することができた（分子質量は９５４．３４）。

以下の式（３６）〜（５１）にて表されるリガンド複合体を同様の手順で合成し、これらのリガンド複合体の^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定し、得られたチャートより、リガンド複合体の構造が確認されている。これらもまた、本実施形態において好適に用いられ得る。なお、後述する実施例にて示される、Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏおよびＧａｌβ１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏは、上記手順に従って合成されている。

このように本発明に利用可能なリンカー化合物は、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えており、主鎖の一末端にアミノ基を有している。さらに、上記リンカー化合物は、末端にアミノ基を有していることによって、糖鎖分子を簡便に導入することができる。なお、上記アミノ基は、修飾されているアミノ基（例えばアセチル基、メチル基やホルミル基等で修飾されたアミノ基）や、芳香族アミノ基であってもよいし、未修飾のアミノ基であってもよい。

糖鎖リガンド複合体には、硫黄原子（Ｓ）が含まれており、この硫黄原子（Ｓ）は、例えば、蛍光性ナノ粒子に含まれるカドミウム（Ｃｄ）と、金属−硫黄結合（Ｃｄ−Ｓ結合）を形成し、蛍光性ナノ粒子に結合することができる。

本発明に利用可能なリンカー化合物は、金属−硫黄結合（例えばＣｄ−Ｓ結合）を容易に形成することができるという点で、Ｓ−Ｓ結合またはＳＨ基が含まれている炭化水素構造を主鎖の他端に備えていることが好ましい。これによって、上記リンカー化合物は、蛍光性ナノ粒子上に糖鎖分子を集合化して配列することができる。ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）またはＳＨ基中の硫黄（Ｓ）は、例えば、蛍光性ナノ粒子上に存在するカドミウム（Ｃｄ）と、金属−硫黄結合（Ｃｄ−Ｓ結合）を形成し、金属との結合を強固にすることができる。

そして、上記糖鎖リガンド複合体には、上記リンカー化合物のアミノ基に、還元末端を有する糖鎖が導入されている。言い換えれば、上記糖鎖リガンド複合体は、上記リンカー化合物と、還元末端を有する糖鎖とが、アミノ基を介して結合している構造を有している。この糖鎖の導入は、例えば、上記リンカー化合物のアミノ基（−ＮＨ_２基）と糖鎖との還元アミノ化反応によって行うことができる。つまり、平衡によって生じる糖鎖中のアルデヒド基（−ＣＨＯ基）またはケトン基（−ＣＲＯ基、Ｒは炭化水素基）と、上記リンカー化合物が有するアミノ基とが反応する。そして、この反応によって形成されたシッフ塩基を引き続き還元することによって、アミノ基に容易に糖鎖を導入することができる。

なお、上記「還元末端を有する糖鎖」とは、アノマー炭素原子が置換を受けていない単糖、オリゴ糖鎖、多糖鎖である。つまり、上記還元末端を有する糖鎖とは、還元糖鎖である。上記還元末端を有する糖鎖としては、市販のものであっても天然のものであってもよく、あるいは、市販および天然の多糖鎖を分解して調製したものを用いることができる。

上記還元末端を有する糖鎖としてより具体的には、グルコース、ガラクトース、マンノース、マルトース、イソマルトース、ラクトース、パノース、セロビオース、メリビオース、マンノオリゴ糖鎖、キトオリゴ糖鎖、ラミナリオリゴ糖鎖、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルクロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などが挙げられるが、これに限定されることはない。

上記リガンド複合体に含まれるリンカー化合物は、金属に結合可能な硫黄原子と、オリゴ糖鎖等の糖鎖分子に結合可能なアミノ基とを有している。従って、例えばＣｄ−Ｓ結合などの金属−硫黄結合により上記リガンド複合体が蛍光性ナノ粒子上の金属に固定されるので、上記リンカー化合物を介して、本発明に係る蛍光性ナノ粒子に糖鎖分子を強固にかつ簡単に結合させることができるとともに、蛍光性ナノ粒子をコロイド状態で安定化することができる。また、上記リガンド複合体の固定化は、還元剤処理した上記リガンド複合体と蛍光性ナノ粒子を含む溶液を混和するだけで行うことができるので、非常に容易に糖鎖を固定化することができる。

また、上記リガンド複合体は、タンパク質との非特異的な相互作用の影響をほとんど無視することができる。それゆえ、上記リンカー化合物を有する上記リガンド複合体を用いることによって、上記糖鎖とタンパク質との相互作用を再現性よく評価することが可能になる。

上記のリガンド複合体は、リンカー化合物と糖鎖分子とを含んでなっているので、リンカー化合物内のＳ−Ｓ結合にて、金属−硫黄（Ｓ）結合、例えばカドミウム−硫黄（Ｃｄ−Ｓ）結合によって、任意の金属と結合することができる。これにより、このＣｄ−Ｓ結合を介して、蛍光性ナノ粒子上に糖鎖分子が固定化されてなる糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を提供することができる。上記任意の金属としては、上記リガンド複合体と結合可能なものであればよく、上記カドミウムの他、亜鉛、銅、銀、インジウム等の金属を用いることができるが、特にカドミウム、亜鉛を用いることが好ましい。

なお、上記リガンド複合体に導入されている糖鎖は、還元末端を有するものであれば単糖でもよいし、同一の単糖分子からなる単一オリゴ糖鎖または多糖鎖であってもよいし、種々の単糖分子やその誘導体からなる複合糖鎖・多糖鎖であってもよい。また、上記糖鎖は、いずれも、自然界から単離／精製して得られる種々の天然の糖鎖であってもよく、人工的に合成された糖鎖であってもよい。また、上記糖鎖は、多糖鎖を分解して得られたものであってもよい。

本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、加熱処理した親水性の蛍光性ナノ粒子を含む溶液と、還元剤処理した上記リガンド複合体との混和によって得ることができ、リガンド複合体のＳ−Ｓ結合の各Ｓ原子が、ナノ粒子上の金属と金属−硫黄結合によって結合する。具体的には、例えば、蛍光性ナノ粒子の溶液に、還元剤処理した上記リガンド複合体を含む溶液を添加することによって、上記リガンド複合体のＳ−Ｓ結合を、ナノ粒子上の金属−硫黄結合に変換して、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を得ることができる。

なお、親水性の蛍光性ナノ粒子の加熱処理の条件は、特に限定されるものではないが、チオール安定化剤の存在下にて、５０〜２００℃で行われることが好ましく、７０〜１８０℃がより好ましく、１００℃以上であることがさらに好ましい。チオール安定化剤としては、特に限定されないが、チオアセトアミド、３−メルカプトプロピオン酸（３−ＭＰＡ）、チオグリコール酸（ＴＧＡ）、４−メルカプトブタン酸、システイン、シスタミンなどのチオ化合物および塩類が挙げられる。

還元剤処理に用いられる還元剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムなどの塩類および陽イオン成分が異なる塩類等を挙げることができる。

蛍光性ナノ粒子およびリガンド複合体を含む溶液に用いる溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えば、水、メタノール、エタノール、プロパノール、これらの混合溶媒等を挙げることができる。また、上記混和によって得られた糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を遠心濾過し、低分子の塩などの成分を除くことによって、溶液状態で安定な糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を得ることができる。

糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を調製するために用いる金属ナノ粒子、上記リガンド複合体、還元剤の混合比は、特に限定されるものではないが、金属成分としてカドミウムが含まれる場合は、溶液中のカドミウム濃度が、最終濃度で０．１ｍＭ〜１ｍＭであることが好ましい。

上記リガンド複合体の濃度は、溶液中の最終濃度として０．１ｍＭ〜１０ｍＭであることが好ましい。

また、用いられる還元剤の濃度は、溶液中の最終濃度としてリガンド複合体濃度の１０倍モル濃度であることが好ましい。

このように、好ましい実施形態において、本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造方法は、加熱処理された蛍光性ナノ粒子と、還元剤処理された糖鎖リガンド複合体を混和する工程を包含し、上記蛍光性ナノ粒子は、第一および第二の金属成分からなる粒子コアが第一および第三の金属成分からなるシェル層によって被覆されており、上記糖鎖リガンド複合体は、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えたリンカー化合物および糖鎖からなり、上記リンカー化合物の主鎖は、その一端に糖鎖と結合したアミノ基を有しており、その他端に硫黄原子を含む炭化水素構造を備えており、還元剤処理された上記炭化水素構造が上記層に固定化されて、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の分散液が得られる。

本実施形態の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の構成要素である蛍光性ナノ粒子は、第一および第二の金属成分からなる粒子（コア）が第一および第三の金属成分からなる層（シェル）によって被覆されている「コア／シェル」構造を有していることが好ましい。蛍光性ナノ粒子が加熱処理されていることによって、シェル層の表面が均質化されて、上記糖鎖リガンド複合体を効率よく結合させることができ、その結果、蛍光性ナノ粒子上に高い安定性を付与し得る。

第一の金属成分は、Ｃｄ、Ｚｎ、Ａｇ、ＩｎおよびＳからなる群より選択されることが好ましく、第二の金属成分が、ＴｅおよびＳからなる群より選択されることが好ましい。また、第三の金属成分は、Ｃｄ、ＳおよびＺｎからなる群より選択されることが好ましく、後述するチオール安定化剤として提供されてもよい。本発明に使用可能な「コア／シェル」構造の蛍光性ナノ粒子としては、ＣｄＴｅ／ＣｄＳ、ＺＡＩＳ／ＺｎＳが挙げられるがこれらに限定されない。

１つの局面において、本実施形態の製造方法は、第一の金属成分を含む第一溶液と、第二の金属成分を含む第二溶液とを加熱条件下にて混合し、第一溶液と第二溶液との混合溶液を室温に冷却し、第一および第二の金属成分からなる粒子を混合溶液から精製することによって行われ、第一工程において混合された溶液が第三の金属成分をさらに含んでいることによって、第一および第二の金属成分からなる粒子が、第一および第三の金属成分からなる層によって被覆される。

別の局面において、本実施形態の製造方法は、第一の金属成分を含む第一溶液と、第二の金属成分を含む第二溶液とを加熱条件下にて混合し、第一溶液と第二溶液との混合溶液を室温に冷却し、第一および第二の金属成分からなる粒子を混合溶液から精製し、精製した粒子および第三の金属成分を含む水溶液を加熱処理することによって、第一および第二の金属成分からなる粒子が、第一および第三の金属成分からなる層によって被覆される。

粒子コアを精製した後に加熱処理を行うことによって、シェル層の表面の均質化がより一層改善されて、上記糖鎖リガンド複合体の結合が著しく向上する。この場合、精製の前に行われる加熱処理は、３０分間〜８時間にわたって行われることが好ましい。これにより、粒径が均一でありかつ高い水分散性を有する糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子が得られる。

なお、本明細書において、「室温」は通常の実験室内での温度であり、２０〜３０℃が好ましいが、加熱処理における反応を停止することができる温度であれば特に限定されず、いわゆる低温室（例えば４℃）であってもよい。

本実施形態において、第一溶液は、第一の金属成分の塩または錯塩が溶解した溶液であり、第二溶液は、第二の金属成分の塩または錯塩が溶解した溶液であっても、親水化された第二の金属成分が溶解した溶液であってもよい。

このような製造方法によって製造された糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、その表面上に抗体を容易に固定化し得るので、生体組織に対する特異性が向上した抗体固定化蛍光性ナノ粒子を容易に提供し得る。

本明細書において、「生体組織」は、生物体外に取り出された組織であっても、生物体内の組織であってもよく、臓器または器官であっても、これらに由来する単離された細胞であっても、培養細胞であってもよく、細胞を構成するタンパク質であってもよい。例えば、タンパク質−タンパク質の相互作用を検出するために用いられても、細胞を検出可能に標識するために用いられてもよく、生体内での物質動態を画像化するために用いられてもよい。

このように、本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子および抗体固定化蛍光性ナノ粒子を用いれば、生体組織の標識を容易に行うことができる。すなわち、本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を含む組成物は、生体組織を標識するための組成物であり得る。

〔２．糖鎖−タンパク質相互作用の測定方法〕
本発明に係る糖鎖−タンパク質相互作用の測定方法は、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を含む溶液と、上記糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の末端に位置する糖鎖を認識するタンパク質とを混和することによって、糖鎖とタンパク質とを相互作用させ、糖鎖−タンパク質複合体を生成させる工程を含むものである。

上記「糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を含む溶液」とは、本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子が液体に分散したコロイド溶液が意図される。糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を含んでいれば、他に塩などが含まれていてもよい。上記液体としては、例えば水や緩衝液等を用いることができる。

上記タンパク質としては、特に限定されるものではなく、上記糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の外側に位置する糖鎖を認識することができるものであればよい。例えば、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の末端に位置する糖鎖がグルコースの場合は、グルコースを認識することができるタンパク質であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンチルレクチン（ＬＣＡ）、ピーナッツレクチン（ＰＳＡ）等を用いることができる。

同様に、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の末端に位置する糖鎖がガラクトースである場合は、ガラクトースを認識するタンパク質であるヒママメレクチン（ＲＣＡ１２０）等を用いることができる。また、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の末端に位置する糖鎖がＮ−アセチルグルコサミンである場合は、Ｎ−アセチルグルコサミンを認識するタンパク質である小麦胚芽レクチン等を用いることができる。

糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を含む溶液と、上記糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の末端に位置する糖鎖を認識するタンパク質とを混和する方法は、特に限定されるものではなく、糖鎖とタンパク質とを近接させて相互作用が可能な状況を提供し得るものであればよい。例えば、マイクロプレートやエッペンドルフチューブなどにタンパク質の希釈系列を作製し、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を含む溶液を添加して放置することにより混和を行うことができる。

糖鎖とタンパク質との相互作用（糖鎖−タンパク質相互作用）としては、水素結合、イオン結合、静電気的相互作用、ファンデルワールス力等を挙げることができる。すなわち、上記糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の末端に位置する糖鎖をタンパク質が認識し、その結果、水素結合等の糖鎖−タンパク質相互作用が生じる。

なお、上記「認識」とは、タンパク質が分子内に有する糖鎖結合部位（糖鎖認識部位）によって糖鎖に結合することをいう。

上記「糖鎖−タンパク質複合体」とは、糖鎖とタンパク質とが相互作用して特異的に結合し、その結果生成される凝集物を意味する。本発明に係る糖鎖−タンパク質相互作用の測定方法は、糖鎖−タンパク質相互作用を凝集物の生成として目視で確認することができる。また、その際の溶液の蛍光色が変化する。糖鎖とタンパク質とが相互作用しない場合、またはタンパク質の糖鎖結合部位がタンパク質あたり１つしかない場合（単価タンパク質）には、凝集物は形成されない。

ここで、凝集反応を確認することによって物質間の相互作用を測定する方法としては、例えば抗原抗体反応を用いたラテックス凝集法等を挙げることができる（「バイオ診断薬の開発・評価と企業」、ＣＭＣテクニカルライブラリー１４６、シーエムシー出版、Ｐ９２−９７，Ｐ１０９−１１３）。上記ラテックス凝集法は、ラテックス表面に抗体を固定化させておき、９６穴のマイクロプレートを用いて試料抗原の希釈系列を作り、凝集を生じる最大希釈倍率を求め標準溶液と比較して測定するという方法である。結果は一定波長の光で吸光度として測定される。

コロイドについて凝集反応を確認することによって物質間の相互作用を測定する方法としては、上記蛍光性ナノ粒子の呈する赤褐色をもって結果を判断するという手法が考えられる。したがって、コロイドにおいても糖鎖とタンパク質とを相互作用させて凝集物を生成させ、当該凝集物の生成を確認することによって結果を判定することができる。本発明に係る方法は、従来の方法よりも非常に簡便であり、蛍光を使用することから感度の高い、有用な方法であるということができる。

また、本発明に係る方法を用いれば、未標識の状態で糖鎖−タンパク質相互作用を測定することができるので、標識を要する方法のような前処理を必要としない点で簡便である。さらに、標識効果が測定のばらつきに大きく影響するという問題も存在せず、再現性のよい測定を行うことができる。また、糖鎖−タンパク質相互作用を目視で確認することができるので、特別な装置も必要なく、非常に安価かつ容易に糖鎖−タンパク質相互作用を測定することができる。すなわち、本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、相互作用検出に利用可能であり、そのような用途に利用される組成物を構成し得る。

したがって、本発明に係る方法は、糖鎖やタンパク質の機能解析や、臨床的な検査および診断などに用いることが可能である。すなわち、本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、臨床的な検査に用いられる生体イメージング、近赤外増感などに利用可能であり、そのような用途に利用される組成物を構成し得る。

なお、本発明に係る糖鎖−タンパク質相互作用の測定方法は、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を含む溶液と、上記糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の末端に位置する糖鎖を認識するタンパク質とを混和することによって、糖鎖とタンパク質とを相互作用させ、糖鎖−タンパク質複合体を生成させる工程を含んでいればよい。したがって、例えば、上述したように、糖鎖−タンパク質複合体（凝集体）の生成を目視で確認するだけでもよいし、より詳細な測定を行う場合は、一定波長の紫外可視吸光スペクトルを測定する工程を含んでいてもよい。また、一定波長の光で励起した後に蛍光スペクトルを測定する工程を含んでいてもよい。

〔３．細胞の糖鎖結合性を利用して細胞を蛍光標識する方法〕
細胞は多量の糖鎖成分を含んでいる。細胞に存在するタンパク質は、細胞の内外に存在する糖鎖を認識し、細胞間の認識やシグナル伝達などの機能の調節を行っている。言い換えると、細胞の糖鎖結合性を利用し、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と細胞を結合させ、蛍光標識することができる。

蛍光標識した細胞は、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡等の機器を用いて解析する。すなわち、本発明の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子は、細胞標識、ウイルス標識、細胞イメージング、生体イメージング、近赤外増感などに利用可能であり、そのような用途に利用される組成物を構成し得る。

本発明の製造方法で細胞が特異的に認識する糖鎖を固定化した糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を製造したのち、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子と細胞含有溶液と混合させるだけで、細胞の表面のレセプターを介して結合し、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子による標識が行われる。

〔４．抗体固定化蛍光性ナノ粒子の製造法〕
本発明は、抗体を固定化した蛍光性ナノ粒子（すなわち、抗体固定化蛍光性ナノ粒子）を製造する方法を提供する。本発明の方法によって製造された蛍光性ナノ粒子は水溶液中で分散する特徴を有している。すなわち、本発明の方法は、抗体固定化蛍光性ナノ粒子のコロイド溶液を調製する方法でもある。

本発明の方法によって製造される抗体固定化蛍光性ナノ粒子の製造に用いられるリガンド複合体は、上述した一般式（１）にて表される構造を備える化合物であっても、例えば、下記式（Ｉ）または（ＩＩ）

（式中、ｎ^１，ｎ^２はそれぞれ独立して１以上６以下の整数、ｑは０以上６以下の整数）にて表される構造を備える化合物であってもよい。本発明の抗体固定化蛍光性ナノ粒子を製造する際に、上記式（Ｉ）および（ＩＩ）の構造を備える化合物をリガンド複合体として用いる場合もまた、上述した糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子を製造する方法に準じて行えばよいことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。

なお、本発明は以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲内で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

本発明について、実施例に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

〔実施例１：α−グルコース固定化蛍光性ナノ粒子の調製〕
非特許文献５および６に記載の方法を改変して、塩化カドミウムを含む水溶液に３−ＭＰＡを添加し、次いでＮａＨＴｅの溶液を加え、混合溶液を１時間還流した後にチオアセトアミドを加えることによって、金属ナノ粒子を含む溶液を調製した。

５ｍＭのカドミウムを含む金属ナノ粒子を含む溶液１ｍＬを分注し、マイクロコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ、１００００ＮＭＷＬ）を用いて遠心濾過（３５００ｒｐｍ、５分間）し、続いて、ナノ粒子を５００μＬの水に懸濁した。別途で、２５０μＬの、α−グルコースが結合した糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ；式（４６）にて表される化合物）の水溶液（１０ｍＭ）、および２５０μＬの、水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１００ｍＭ）を混合した。その後、この混合溶液５００μＬとナノ粒子５００μＬを遮光下にて混和および撹拌して糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の粗コロイド溶液を調製した。図１に、調製したナノ粒子の透過型電子顕微鏡画像を示す。

次に、上記粗コロイド溶液を再び遠心濾過によって精製し、α−グルコースが固定化した蛍光性ナノ粒子のコロイド溶液を得た。

〔実施例２：糖鎖−タンパク質相互作用の測定〕
ＣｏｎＡまたはＢＳＡのＰＢＳ溶液（各２ｍｇ／ｍＬ）を調製し、９６ウェルプレートに１レーンずつＣｏｎＡおよびＢＳＡの溶液を２倍段階希釈して５０μＬずつ添加した（図２、右側から１〜１１：左が高濃度で右が低濃度、最左：ブランク）。すべてのウェルに実施例１で調製したα−グルコースを固定化した蛍光性ナノ粒子のコロイド溶液を５０μＬ添加して混合した。約２時間放置した後、目視による相互作用の確認を行った。

図２の写真は、目視下での糖鎖−タンパク質相互作用の解析の結果を示す。結合性タンパク質が添加されているレーンにおいて特異的な凝集反応が見られた。

〔実施例３：糖鎖結合性を利用して細胞を蛍光標識する方法〕
５ｍＭのカドミウムを含む金属ナノ粒子を含む溶液１ｍＬを分注し、マイクロコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ、１００００ＮＭＷＬ）を用いて遠心濾過（３５００ｒｐｍ、５分間）し、続いて、ナノ粒子を５００μＬの水に懸濁した。別途で、２５０μＬの、β−ガラクトースが結合した糖鎖リガンド複合体（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ；式（３９）にて表される化合物）の水溶液（１０ｍＭ）、および２５０μＬの、水素化ホウ素ナトリウム水溶液（１００ｍＭ）を混合した。その後、この混合溶液５００μＬとナノ粒子５００μＬを遮光下にて混和および撹拌して糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の粗コロイド溶液を調製した。

次に、上記粗コロイド溶液を再び遠心濾過によって精製し、β−ガラクトース固定化した蛍光性ナノ粒子のコロイド溶液を得た。

引き続いて、調製した蛍光性ナノ粒子の細胞結合性をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を用いて解析した。細胞にはマウスのマクロファージ系の細胞であるＪ７７４を用いた。細胞数を１×１０^６個／ｍＬに調整した後、調製したナノ粒子を加え、１時間インキュベートした。その後、遠心分離、および細胞の洗浄を行い、細胞をホルマリンで固定化した。細胞を再び洗浄した後、ＦＡＣＳ解析を行った。

図３は解析結果のグラフを示す。横軸は蛍光強度、縦軸は細胞数を示す。また黒色線は細胞のみ（コントロール）を、黒色破線はα−グルコースを固定化した蛍光性ナノ粒子を加えたもの、灰色線はβ−ガラクトースを固定化した蛍光性ナノ粒子を加えたものをそれぞれ示す。細胞に対して蛍光性ナノ粒子が結合した場合、ピークはコントロールよりも右側にシフトする。測定の結果、α−グルコースまたはβ−ガラクトースを固定化した蛍光性ナノ粒子のどちらも、右側にピークがシフトしている。このことから、これらナノ粒子による細胞標識が可能であることが分かった。

〔実施例４：蛍光性ナノ粒子の調製１〕
非特許文献５および６に記載の方法は、いわゆるワンポットでの合成法であり、この方法に従えば、ＣｄＴｅをコアとしかつＣｄＳをシェルとする構造の蛍光性ナノ粒子（ＣｄＴｅ／ＣｄＳ）が得られ、この構造に基づいて安定性や蛍光強度が高くなることが報告されている。

しかし、このような方法では、得られた蛍光性ナノ粒子の蛍光スペクトル幅が広く、固定化する糖鎖に応じて蛍光波長（すなわち、蛍光の色）を変えることは困難であることがわかった。

本発明者らによる創意工夫の結果、上記問題点を解消した方法を完成するに至った。このような蛍光性ナノ粒子の調製方法は以下の通りであり、別々に調製した２種類の溶液を混合し、反応によって形成した粒子を一旦精製し、再度反応させる、ツーポットでの合成法である。
＜溶液１の調製＞：Ｔｅ（粉末、０．１２５ｍｍｏｌ（シグマ・アルドリッチより購入）および水素化ホウ素ナトリウム（０．０５００ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下にてアルゴンガスをバブリングした水（２ｍＬ）に溶解し９０分間撹拌してテルル化水素ナトリウム水溶液を調製した。
＜溶液２の調製＞：塩化カドミウム（０．０５００ｍｍｏｌ）とチオグリコール酸（ＴＧＡ；０．０２６５ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下にて、アルゴンガスをバブリングした水（１０ｍＬ）に溶解し、得られた溶液を水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）でｐＨを９に調整した後、アルゴンガスでさらにバブリングした。
＜ナノ粒子の調製＞：溶液２を１０５℃に加熱し、空気雰囲気下にて、激しく撹拌しながら溶液１を加えた。混合溶液を遮光下にて１時間撹拌した後に室温に戻して反応を停止させた。その後、混合溶液に２−プロパノール（蛍光性ナノ粒子溶液量に対して３倍量）を加え、遠心分離（９５００ｒｐｍ、５分間）を行った。上清を除去した後、沈殿を２−プロパノールに懸濁し、さらに遠心分離を行った後に、上清を除去した。この操作を再度行ってナノ粒子を洗浄した後、沈殿を水（１０ｍＬ）に溶解した。得られた溶液を４℃で１０時間保存した後、チオアセトアミド（０．２７μＬ）を加え、１０５℃で再加熱を行った。遮光下にて適度な時間にわたって加熱撹拌を行った後、室温に冷却して反応を停止させた。蛍光性ナノ粒子濃度は吸光度から見積り７μＭであることがわかった。

本発明における、ツーポットでの合成法で得られた蛍光性ナノ粒子と、従来法のワンポット得られた蛍光性ナノ粒子の半値幅を比較したグラフ（図４（ａ））、および蛍光波長（図４（ｂ））を示す。半値幅（半値全幅）とは最大蛍光強度の１／２の値を示す波長の幅である。示されるように、ワンポット合成法よりもツーポット合成法を用いる方が、蛍光性ナノ粒子の半値幅が狭い。また、チオール安定化剤として従来用いられる３−ＭＰＡよりもＴＧＡを用いる方が、蛍光性ナノ粒子の半値幅が狭いことがわかった。このように、表面配位子としてＴＧＡを用い、ＣｄＴｅコアへのＣｄＳシェルの付加にツーポット合成法を用いることによって、スペクトル幅が狭く、かつ多色同時蛍光発光が可能な蛍光性ナノ粒子を得られることがわかった。

〔実施例５：糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の調製１〕
上述したツーポット合成法によって得られた蛍光性ナノ粒子（ＣｄＴｅ／ＣｄＳ）を用いて、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＳＦＮＰ）を製造した。

α−グルコースが結合した糖鎖リガンド複合体（Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）（１２５μＬ、１０ｍＭ）と水素化ホウ素ナトリウム（１２５μＬ、１００ｍＭ）を混合し、２時間静置して、糖鎖リガンド複合体溶液（複合体の最終濃度２．５ｍＭ）を調製した。蛍光性ナノ粒子溶液（５００μＬ、７μＭ）を、マイクロコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ、１００００ＮＭＷＬ）を用いて遠心濾過（３５００ｒｐｍ、５分間）した後、濾過物を再度２５０μＬの水に懸濁した。この蛍光性ナノ粒子の懸濁液と上記糖鎖リガンド複合体溶液（２５０μＬ）を混合し、遮光下にて２４時間反応させた。過剰の糖鎖リガンド溶液を遠心濾過によって除去し、沈査をＰＢＳに分散させることによって水中での分散性が良好なＳＦＮＰ（αＧｌｃ−ＦＮＰ）を得た。

糖鎖の固定化について、上記αＧｌｃ−ＦＮＰを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによって糖鎖リガンド複合体の分子質量に相当するピークが測定されたことから確認した（図５（ａ））。また、透過型電子顕微鏡によって、αＧｌｃ−ＦＮＰの粒径を測定したところ、粒径が約５ｎｍであり、比較的均一度の高い粒子であることがわかった（図５（ｂ））。さらに、アントロン−硫酸法によって糖の定量を行った。換算すると、最終濃度２．５ｍＭの糖鎖リガンド複合体を蛍光性ナノ粒子と反応させた際に、ナノ粒子１つに約１３０個の糖鎖が固定化されていることがわかった。

〔実施例６：糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子のタンパク質との相互作用１〕
上述したように調製したＳＦＮＰ（２．５ｍＭ）と、糖鎖と特異的に結合するタンパク質との相互作用を調べた。５μＭのタンパク質溶液を、９６ウェルのマイクロプレートにそれぞれ１００μＬ加え、次いで各ウェルにα−グルコースを固定化したαＧｌｃ−ＦＮＰを１００μＬ加えた。プレートを遮光下にて１８時間放置した後、各ウェルにおける上清の蛍光スペクトルを測定した。タンパク質には、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ヒママメレクチン（ＲＣＡ１２０）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。α−グルコースと特異的に結合することが知られているＣｏｎＡを加えた時にのみ、蛍光強度の減少が観察された（図６）。ＵＶ−ＶＩＳよりも感度が高い蛍光において変化が観測されたことは、用いる糖鎖の量が微量であっても、タンパク質との特異的結合を測定することができることを示し、本発明の方法によって得られたＳＦＮＰが従来の方法によって得られる糖鎖固定化金ナノ粒子よりもかなり優れた性質を有していることがわかった。

〔実施例７：糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の結合特異性１〕
実施例４の手順に従ってβ−ガラクトースが結合した糖鎖リガンド複合体（Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ）調製し、これを用いて、実施例５の手順に従って水中での分散性が良好なＳＦＮＰ（βＧａｌ−ＦＮＰ）を得た。２種類のＳＦＮＰ（αＧｌｃ−ＦＮＰおよびβＧａｌ−ＦＮＰ）を用いて、タンパク質との選択的結合活性を調べた。

ＣｏｎＡと特異的に結合するα−グルコースを固定化したαＧｌｃ−ＦＮＰは、橙色の蛍光（Ｅｘ＝６２０ｎｍ）を示す（図７（ａ）中、Ｒ−αＧｌｃ−ＦＮＰと示す。）。と特異的に結合するβ−ガラクトースを固定化したβＧａｌ−ＦＮＰは、橙色の蛍光（Ｅｘ＝５３０ｎｍ）を示す（図７（ａ）中、Ｇ−βＧａｌ−ＦＮＰと示す。）。

これらのＦＳＮＰを１μＭに希釈し、各５０μＬずつを混合した。混合溶液を入れたチューブに５μＭのタンパク溶液（ＣｏｎＡ、ＲＣＡ１２０またはＢＳＡ）をそれぞれ１００μＬ加え、撹拌した後に一晩放置した。ＣｏｎＡを加えたチューブには、ＣｏｎＡとαＧｌｃ−ＦＮＰとの相互作用による橙色の蛍光を示す凝集体が生成し、上清は、ＣｏｎＡと相互作用しないβＧａｌ−ＦＮＰが残ることによって緑色になった（図７（ｂ））。一方、ＲＣＡ１２０を加えたチューブには、ＲＣＡ１２０とβＧａｌ−ＦＮＰとの相互作用による緑の蛍光を示す凝集体が生じ、上清は、ＲＣＡ１２０と相互作用しない結合しないα−グルコースを固定化したαＧｌｃ−ＦＮＰが残ることによって橙色になった（図７（ｂ））。なお、ＢＳＡを加えたチューブでは、凝集は生成せず、チューブ内の溶液は２つのＳＦＮＰの混合溶液の色であった（図７（ｂ））。このように、複数のタンパク質との相互作用を目視にて観察することができた。

〔実施例８：糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子による細胞認識１〕
ＳＦＮＰの細胞結合活性をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により解析した。ＳＦＮＰとして、αＧｌｃ−ＦＮＰおよびβＧａｌ−ＦＮＰを用い、コントロールとしてテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）を固定化したナノ粒子（ＴＥＧ−ＦＮＰ）を用いた。細胞には、肝癌由来の細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた。

細胞を１×１０^６個／ｍＬに希釈した後、ＳＦＮＰまたはＴＥＧ−ＦＮＰを加えて１２時間培養した。ＳＦＮＰまたはＴＥＧ−ＦＮＰを含む培地を除去した後、ＰＢＳで２回洗浄し、セルスクレイパーで細胞をプレートから剥がし、細胞を含むＰＢＳ溶液を調製した。この溶液を、ＦＡＣＳ解析に供した。

ＳＦＮＰでは、右側への大きなピークシフトが観察された（図８）。特に、βＧａｌ−ＦＮＰにおいてピークシフトは顕著であった。ＨｅｐＧ２細胞は、β−ガラクトース親和性があることが知られており、この結果は、ＨｅｐＧ２細胞のβ−ガラクトース親和性が明確に示されたことになる。また、αＧｌｃ−ＦＮＰにおいてもピークシフトが観察された。このことは、ＨｅｐＧ２細胞が、β−ガラクトースほどではないがα−グルコースに対しても高い親和性があることを示す。コントロールとして用いたＴＥＧ−ＦＮＰでは、右側へのピークシフトがほとんど見られなかった。これは、ＴＥＧ−ＦＮＰに糖鎖が結合していないことに起因するといえる。

さらに、プレートから剥がす前の細胞を蛍光顕微鏡（ＨＳオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００、ＢＩＯＲＥＶＯ， ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察した。コントロールとして用いたＴＥＧ−ＦＮＰでは、細胞にて蛍光がほとんど見られなかったが、αＧｌｃ−ＦＮＰおよびβＧａｌ−ＦＮＰでは、細胞にて蛍光が観察された（図９）。

〔実施例９：蛍光性ナノ粒子の調製２〕
αＧｌｃ−ＦＮＰおよびβＧａｌ−ＦＮＰは、蛍光性ナノ粒子（ＣｄＴｅ／ＣｄＳ）を用いて製造されたものであり、毒性のＣｄを含むものである。毒性を低減させることができれば、応用範囲をより広げることができる。そこで、特許文献２に記載の手順を改変して、Ｃｄよりも毒性が低いＺＡＩＳ（ＺｎＳ−ＡｇＩｎＳ_２）を合成し、ＺＡＩＳの親水化と糖鎖の固定化を行いＳＦＮＰを調製した。
＜溶液１’＞：Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバミド酸ナトリウム（２．５ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に溶解した。
＜溶液２’＞：ＡｇＮＯ_３（１１．２５ｍＭ）、Ｉｎ（ＮＯ_３）_３・３Ｈ_２Ｏ（１１．２５ｍＭ）、Ｚｎ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ（２．５ｍＭ）になるように水（５０ｍＬ）に溶解した。
＜ナノ粒子の調製＞：遮光下にて室温で撹拌した溶液１’に、溶液２’を穏やかに加えた。５分間攪拌した後に、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）を行った。沈殿に超純水を加えて再度遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を廃棄して沈殿を回収した。この操作を４回行った。次に、沈殿にメタノールを加えて遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を廃棄して沈殿を回収した。この操作を２回行い、得られた沈殿を減圧下にて乾燥させることによってＮ，Ｎ−ジエチルカルバミド酸錯体を得た。得られた錯体（５０ｍｇ）を試験管に移し、アルゴン置換した後に、オイルバスにて１８０℃で３０分間加熱攪拌した。放冷後に、アルゴン雰囲気下にて、オレイルアミン（３ｍＬ）を加え、オイルバスにて１０５℃で５分間加熱撹拌した。遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分間）した後、上清をメンブレン（０．４５μｍ、ＰＴＦＥ）で濾過し、得られた濾液にメタノール（３ｍＬ）を加え、沈殿を生じさせた。濾液全体の遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分間）を行った後に、上清を廃棄して沈殿を回収した。得られた沈殿にオレイルアミン（２ｍＬ）を加えて溶解させ、メンブレン濾過した後に、濾液にメタノール（２ｍＬ）を加えて再度沈殿を生じさせた。濾液全体の遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分間）を行った後に、上清を廃棄して沈殿を回収した。得られた沈殿に再度オレイルアミン２ｍＬを加え、アルゴン置換した後に、オイルバスにて１８０℃で３０分間加熱攪拌した。放冷後に、メタノール（２ｍＬ）を加えて沈殿を生じさせた。さらに、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分間）を行った後に、上清を廃棄して沈殿を回収した。得られた沈殿をクロロホルム（２ｍＬ）に再度溶解してＺＡＩＳ溶液を得た。

ＺＡＩＳの製造の際に、各試薬の濃度を図１０（ａ）のように変更することによって、組成比が異なりかつ蛍光スペクトルが異なるナノ粒子を製造することができた（図１０（ｂ）および（ｃ））。以下の実験には、組成比０．４の用いた例を説明する。

ＺＡＩＳのオレイルアミン溶液（２ｍＬ）に酢酸亜鉛無水和物（０．５６２μｍｏｌ）、チオアセトアミド（０．５６２μｍｏｌ）を加え、アルゴン置換した後に、遮光下にて、オイルバスにて１８０℃で３０分間加熱撹拌した。放冷後に、メタノールを加えて遠心分離（３５００ ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を廃棄して沈殿を回収した。得られた沈殿をクロロホルム（１ｍＬ）に溶解して、ＺＡＩＳをコアとしかつＺｎＳをシェルとする構造の蛍光性ナノ粒子（ＺＡＩＳ／ＺｎＳ）のクロロホルム溶液を得た。

ＺＡＩＳ／ＺｎＳのクロロホルム溶液（１ｍＬ）にクロロホルム（１ｍＬ）を加え、０℃に冷却し、攪拌下、３−ＭＰＡのエタノール溶液（０．２Ｍ、１ｍＬ）を加えた。続いて、水酸化カリウムのエタノール溶液（０．３Ｍ、１ｍＬ）を加え、遮光下にて１２時間攪拌した。遠心分離（３５００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を廃棄して沈殿を回収した。得られた沈殿を水（１ｍＬ）に溶解し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、５分間）を行い、得られた上清をメンブラン濾過（０．４５μｍ）を行って、３−ＭＰＡ被覆された親水性ＺＡＩＳ／ＺｎＳ（水溶液）を得た。

親水性ＺＡＩＳ／ＺｎＳに以下の処理を行って、より強い蛍光を発する親水化量子ドットを調製した。酢酸亜鉛無水和物（０．１１２４ｍｍｏｌ）を水（２ｍＬ）に溶解し、チオアセアミド（０．１１２４ｍｍｏｌ）、ＴＧＡまたは３−ＭＰＡ（０．２２４８ｍｍｏｌ）を加えた。水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ）を用いてｐＨを９に調整した後に、３−ＭＰＡ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳ水溶液（２ｍＬ）を加え、遮光下にて、オイルバスにて８０℃で加熱撹拌した。放冷後に、メタノールを加え、遠心分離（３５００ｒｐｍ、５分間）を行い、上清を廃棄して沈殿を回収した。得られた沈殿を水（１ｍＬ）に溶解し、メンブラン濾過（０．２２μｍ）を行い、不溶部分を除去して、親水化ＺＡＩＳ／ＺｎＳ水溶液を得た。チオール安定化剤としてＴＧＡを用いて製造したＺＡＩＳ／ＺｎＳの方が、３−ＭＰＡを用いて製造したものよりも強い蛍光を発した（図１１）。

〔実施例１０：糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の調製２〕
チオール安定化剤としてＴＧＡまたは３−ＭＰＡを用いて製造した蛍光性ナノ粒子（ＺＡＩＳ／ＺｎＳ）を用いて、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（ＳＦＮＰ）を製造した。

Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ（１２５μＬ、１０ｍＭ）と水素化ホウ素ナトリウム（１２５μＬ、１００ｍＭ）を混合し、２時間静置して、糖鎖リガンド複合体溶液（複合体の最終濃度２．５ｍＭ）を調製した。親水化したＺＡＩＳ／ＺｎＳ水溶液（５００μＬ、濃度７μＭ）を、マイクロコンを用いて遠心濾過（３５００ｒｐｍ、５分間）した後、濾過物を再度２５０μＬの水に懸濁した。この蛍光性ナノ粒子の懸濁液と上記糖鎖リガンド複合体溶液（２５０μＬ）を混合し、遮光下にて２４時間反応させた。過剰の糖鎖リガンド溶液を遠心濾過によって除去し、沈査をＰＢＳに分散させることによって水中での分散性が良好なＳＦＮＰ（αＧｌｃ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳ）を得た。

チオール安定化剤としてＴＧＡを用いて、還流を５時間行って得たＺＡＩＳ／ＺｎＳに固定化したαＧｌｃ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳの蛍光は、３−ＭＰＡを用いて製造したαＧｌｃ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳの蛍光よりも強く、しかも、室温で数週間安定であった（図１２（ａ）および（ｂ））。

〔実施例１１：糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子による細胞認識２〕
還流を５時間行って得たＺＡＩＳ／ＺｎＳに固定化したαＧｌｃ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳによる細胞結合活性を検討した。細胞には、肝癌由来の細胞であるＨｅｐＧ２細胞を用いた。比較対照として、ＣｄＴｅ／ＣｄＳに固定化したαＧｌｃ−ＦＮＰ（αＧｌｃ−ＣｄＴｅ／ＣｄＳ）を用いた。

細胞を１×１０^６個／ｍＬに希釈した後、αＧｌｃ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳまたはαＧｌｃ−ＣｄＴｅ／ＣｄＳを加えて１２時間培養した。αＧｌｃ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳまたはαＧｌｃ−ＣｄＴｅ／ＣｄＳを含む培地を除去した後、ＰＢＳで２回洗浄し、細胞を蛍光顕微鏡（ＨＳオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ−９０００、ＢＩＯＲＥＶＯ， ＫＥＹＥＮＣＥ）で観察した。αＧｌｃ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳおよびαＧｌｃ−ＣｄＴｅ／ＣｄＳのいずれを用いた場合も、細胞にて蛍光が観察されたが、αＧｌｃ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳを用いた場合は、細胞の形態が良好に維持されていた（図１３）。このことは、ＺＡＩＳの低毒性効果がＳＦＮＰにおいても維持されており、その効果が反映されたことを示す。

〔実施例１２：糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子のタンパク質との相互作用および結合特異性２〕
ＺＡＩＳ／ＺｎＳにＧａｌβ１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏを用いて、上記手順に従って水中での分散性が良好なＳＦＮＰ（βＧａｌ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳ）を得た。βＧａｌ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳを用いて、糖鎖と特異的に結合するタンパク質との相互作用を調べた。

５μＭのタンパク質溶液を、９６ウェルのマイクロプレートにそれぞれ１００μＬ加え、次いで各ウェルにβ−ガラクトースを固定化したβＧａｌ−ＦＮＰ（βＧａｌ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳ）を１００μＬ加えた。プレートを遮光下にて１８時間放置した後、各ウェルにおける上清の蛍光スペクトルを測定した。タンパク質には、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ヒママメレクチン（ＲＣＡ１２０）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いた。β−ガラクトースと特異的に結合することが知られているＲＣＡ１２０を加えた時にのみ、βＧａｌ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳの柿色の沈殿物が生じたことが目視で観測され（図１４（ａ））、蛍光強度の減少が観察された（図１４（ｂ））。ＲＣＡ１２０以外のタンパク質を加えた時には、凝集も蛍光強度の変化もなく、また糖鎖を固定化していないＴＥＧ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳおよびＴＧＡ−ＺＡＩＳ／ＺｎＳの場合にも、何ら変化が観測されなかった（図１４（ａ）、（ｃ）および（ｄ））。ＵＶ−ＶＩＳよりも感度が高い蛍光において変化が観測されたことは、用いる糖鎖の量が微量であっても、タンパク質との特異的結合を測定することができることを示し、本発明の方法によって得られたＳＦＮＰが従来の方法によって得られる糖鎖固定化金ナノ粒子よりもかなり優れた性質を有していることがわかった。

〔実施例１３：抗体を固定化した糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子〕
上述したように、抗体を固定化したナノ粒子は、抗原抗体反応による免疫染色や、抗原の検出、分離／精製に有用である。しかし、蛍光性ナノ粒子はサイズが小さく、抗体のサイズはナノ粒子と同程度に大きいので、抗体を固定化したナノ粒子では、抗体の疎水性ドメインの影響によって水中で分散性が良好であるというナノ粒子の効果が損なわれてしまう。本発明の方法によって得られたＳＦＮＰを用いて抗体を固定化すれば、糖が存在していることに起因して良好な分散性を維持することができる。

黄色ブドウ球菌（ＳＡ）の表面タンパク質であるＰｒｏｔｅｉｎ Ａに強く結合することが知られているヒトＩｇＧを固定化した蛍光性ナノ粒子を用いて、水中での分散性が良好な抗体／糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子（Ａｂ−ＳＦＮＰ）を作製した。また、このＡｂ−ＳＦＮＰを用いてＳＡを標識化し、共焦点レーザー顕微鏡下にてリアルタイムでの観察を行った。

Ｔｅ粉末（４０．０４ｍｇ）およびＮａＢＨ_４（４６．５４ｍｇ）をアルゴンガスで置換し、脱気水を２ｍＬ添加した後に１時間撹拌してＮａＨＴｅ溶液を調製した。５０ｍＬの脱気水にＣｄＣｌ_２（４５．８３ｍｇ）および３−ＭＰＡ（４３．６ｍＬ）を加え、１Ｍ ＮａＯＨでｐＨを９．０に調整し、脱気した後に溶液を１０５℃に加温し、さらに。ＮａＨＴｅ溶液を０．５ｍＬ加え、遮光下にて１時間還流してＣｄＴｅを生成させた。別途、０．４ｍＭチオアセトアミド水溶液を作製し、脱気した後にその１．５ｍＬを上記ＣｄＴｅ溶液に加え、遮光下にて、１０５℃で１８時間還流してＣｄＴｅ／ＣｄＳを調製した。Ａｍｉｃｏｎ １０，０００ＭＷＣＯを用いて、ＣｄＴｅ／ＣｄＳ溶液を限外濾過した（９５００ｒｐｍ×１０分間）。沈殿に超純水を加え、９５００ｒｐｍ×１０分間遠心分離して沈殿を洗浄した。この操作をさらに２回繰り返して、蛍光性ナノ粒子ＣｄＴｅ／ＣｄＳを回収した。得られた蛍光性ナノ粒子を４℃で保存した。

１０ｍＭ ＮａＢＨ_４ １２５μＬに、Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏまたはＧａｌβ１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏの混合液１２５μＬを加え、遮光下にて室温で１０分間撹拌し、さらに、ＣｄＴｅ／ＣｄＳの水溶液２５０μＬを加え、遮光下にて室温で２４時間撹拌した。Ａｍｉｃｏｎ １０，０００ＭＷＣＯを用いて、２５℃で限外濾過した（１４，０００×ｇにて５分間）。沈殿に超純水５００μＬを加え、２５℃での限外濾過（１４，０００×ｇにて５分間）によって沈殿を洗浄した。この操作をさらに２回繰り返して、ＳＦＮＰ（それぞれ、Ｇｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ−ＦＮＰ、およびＧａｌβ１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ−ＦＮＰ）を回収した。５００μＬになるように超純水を添加したＳＦＮＰを遮光下にて４℃で保存した。

得られたＳＦＮＰの懸濁液２００μＬに１０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ７．４）３００μＬを加え、撹拌した後に、０．２ｍｇ／ｍＬの濃度に調製したヒトＩｇＧ ５０μＬを加えた。混合溶液を撹拌した後に、さらに水溶性カルボジイミドＷＳＣＤ・ＨＣｌ（１０ｍｇ／ｍＬ）を３０μＬ加え、２時間撹拌した。撹拌後の溶液を、４℃で、５００００ｒｐｍ、３０分間超遠心分離した。上清を廃棄した後に、得られた沈殿にＰＢＳ（ｐＨ８）に溶解したエタノールアミン（５０ｍＭ）を５００μＬ加えた。混合溶液を、１０秒間の超音波処理の後に、遮光下にて１時間撹拌した。撹拌後の溶液を、４℃で、５００００ｒｐｍ、３０分間超遠心分離した。上清を廃棄した後に、得られた沈殿に５０ｍＭ ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．３）２００μＬを加え、混和した溶液を４℃で、５００００ｒｐｍ、３０分間超遠心分離することによって、沈殿を洗浄した。この操作をさらに２回繰り返した後に、０．２％スキンミルク、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ ２００μＬに沈殿物を溶解して、Ａｂ−ＳＦＮＰ溶液を得た。この溶液の保存を４℃で行った。

調製したＡｂ−ＳＦＮＰを２−メルカプトエタノールで還元し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を行った。その結果、２種類のＡｂ−ＳＦＮＰ（ヒトＩｇＧを固定化したＧｌｃα１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ−ＦＮＰおよびＧａｌβ１−４Ｇｌｃ−ｍｏｎｏ−ＦＮＰ）のいずれにおいても、ヒトＩｇＧのＨ鎖に相当するバンドが検出された（図１５）。このことは、ヒトＩｇＧがＳＦＮＰに固定化していることを示す。また、ＵＶ−Ｖｉｓ測定の結果、ヒトＩｇＧを固定化したことによって吸光度が全体的に下がるものの、スペクトルの形に変化はなかった（図１６）。ヒトＩｇＧの固定化前と比較して固定化後では、３５０ｎｍで励起したときの蛍光強度が約１／３に低減し、ピークトップが６１０ｎｍから６２５ｎｍへと長波長側へシフトした。なお、これらの結果について、固定化している糖鎖に起因する差異は認められなかった。

調製したＡｂ−ＳＦＮＰの菌体への結合特性を、２種類の黄色ブドウ球菌（ＳＡ）（野生型およびＰｒｏｔｅｉｎ Ａ欠損株）を用いて調べた。２種類の菌を一晩培養し、１００μＬ（１×１０^８ ｃｅｌｌ／ｍＬ）の培養液を遠心分離してＳＡを回収した。ヒトＩｇＧ固定化ＳＦＮＰを５％スキムミルク／ＰＢＳのブロッキング液で１０倍希釈し、その１００μＬを、回収したＳＡに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、菌体をＰＢＳで３回洗浄した後に、ＳＡの沈殿にＵＶ光を照射して生じた蛍光を観測した。

野生株では、Ａｂ−ＳＦＮＰによる濃いピンク色の蛍光が呈されたが、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ欠損株では蛍光が呈されず、抗体を固定化していないＳＦＮＰを用いた場合の結果と同じであった（図１７）。これらの結果は、Ａｂ−ＳＦＮＰのヒトＩｇＧがＰｒｏｔｅｉｎ Ａと結合したことを示している。

〔実施例１４：抗体を固定化した糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子２〕
一端をチオクト酸に、他端をカルボン酸にしたテトラエチレングリコール（ＴＥＧ）誘導体と、実施例４に記載したツーポット法で合成した蛍光性ナノ粒子ＱＤ（ＣｄＴｅ／ＣｄＳ）との付加を行い、さらに、上記ＴＥＧ誘導体のカルボン酸末端にＮα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リジン水和物を導入し、さらに、ニッケルを結合させた化合物を生成し、ニッケルに親和性を有するヒスチジンタグが付加されたＭ１３ファージ由来の一本鎖抗体ｓｃＦｖを、上記ニッケルを介して上記化合物に固定化した。このような、一本鎖抗体ｓｃＦｖ結合化合物を用いて、この一本鎖抗体ｓｃＦｖとの親和性が高い培養細胞Ｓ１Ｔ細胞への結合活性を調べた。具体的な手順を以下に示す。

テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）の一端にチオクト酸を付加し、他端をＯＨで修飾したＴＥＧ−ＯＨ

およびＣＯＯＨで修飾したＴＥＧ−ＣＯＯＨ

を調製した。これらを、両者の合計の最終濃度が２０ｍＭになるように、各混合比（ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ＝１０／０、９／１、８／２、７／３）にて混合した。得られた各溶液１２５μＬに１０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム １２５μＬを入れ、遮光下にて室温で１０分間攪拌した。撹拌後の各混合液にＣｄＴｅ／ＣｄＳ溶液 ２５０μＬを入れ、遮光下にて室温で２４時間攪拌した。その後、各サンプルを１０Ｋカット Ａｍｉｃｏｎ限外濾過チューブに入れて、１４０００×ｇにて１５℃で５分間遠心分離した。さらに、得られた濃縮画分に超純水４００μＬを入れて、１４０００×ｇにて１５℃で５分間遠心分離する工程を３回繰り返した。得られた濃縮画分を超純水で２５０μＬにフィルアップし、それぞれを、ＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ＝１０／０、ＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ＝９／１、ＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ＝８／２、ＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ＝７／３とした。

上記のように作製した４種類の蛍光性ナノ粒子（ＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ＝１０／０、ＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ＝９／１、ＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ＝８／２、ＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ＝７／３）各１００μＬを、それぞれ１０Ｋカット Ａｍｉｃｏｎ限外濾過チューブに入れて、４００μＬの２０ｍＭ 炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）を加え、１４０００×ｇにて１５℃で５分間遠心分離する工程を３回繰り返した。得られた各サンプル（５０μＬ）に５０μＬの２０ｍＭ 炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）を加えた。さらに、５０μＬの水溶性の塩酸カルボジイミド（ＥＤＣ−ＨＣｌ，最終濃度１６１ｍＭ）と５０μＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ，最終濃度２１．６ｍＭ）を混合し、遮光下にて室温で３０分間攪拌した。これをＡ液とした。

Ｎα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リジン水和物（ＮＴＡ）と塩化ニッケルを、それぞれの最終濃度が２０ｍＭおよび３８ｍＭになるように、２０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かし、室温下で１時間攪拌した。これをＢ液とした。

上記Ａ液およびＢ液を、等量ずつ（２００μＬ／サンプル）混合し、遮光下にて室温で２時間攪拌した後、各サンプルを１０Ｋカット Ａｍｉｃｏｎ限外濾過チューブに入れて１４０００×ｇにて１５℃で５分間遠心分離した。得られた濃縮画分に、４００μＬの２０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、１４０００×ｇにて１５℃で５分間遠心分離する工程を３回繰り返した。その後、４００μＬのＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水を加えて１４０００×ｇにて１５℃で５分間遠心分離を行い、得られた濃縮画分をＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ−ＮＴＡ−Ｎｉとした。ＴＥＧ−ＣＯＯＨ−ＮＴＡ−Ｎｉの構造は以下のとおりである。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる質量分析でＴＥＧ−ＣＯＯＨ−ＮＴＡ−Ｎｉに相当する分子質量が観測されたことから、ＴＥＧ−ＣＯＯＨ−ＮＴＡ−ＮｉがＱＤに固定化されていることを確認した（図１８）。

ＱＤ−ＴＥＧ−ＣＯＯＨ−ＮＴＡ−Ｎｉに固定化させる一本鎖抗体ｓｃＦｖを、以下のようにして作製した。文献（The Journal of Biochemistry. 2009; 145 (6): 799-810, Muraoka S et al.）に従い、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者由来のＳ１Ｔ細胞に特異的に結合するｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＡ３）を発現する大腸菌株からｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＡ３）タンパク質を抽出しかつ精製した。ｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＡ３）を発現する大腸菌ＨＢ２１５１株を、０．１ｍｇ／ｍＬアンピシリン、１ｍＭ イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドを含む２ＹＴ培地（１００ｍＬ）中で２４時間培養し、Ｓ１ＴＡ３の発現を誘導した。大腸菌を含む培地を３０００×ｇにて４℃で２０分間遠心分離し、得られた沈殿を２ｍＬのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液に溶かした。その後、超音波破砕を行い、１５０００×ｇにて４℃で５分間遠心分離して得た上清を、０．４５μｍミリポアフィルターに通し、粗タンパク抽出とした。得られた粗抽出物をニッケルカラムに通し、ヒスチジンタグの付いたｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＡ３）タンパク質を精製し、蛍光性ナノ粒子に固定化するｓｃＦｖサンプルとした。

ｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＡ３）の蛍光性ナノ粒子への固定化を、以下のようにして行った。ＱＤ−ＴＥＧ−ＯＨ／ＣＯＯＨ−ＮＴＡ−Ｎｉ 各２０μＬに、上述のようにして得られたＳ１ＴＡ３精製タンパク質溶液 １０μＬを混合し、遮光下にて４℃で２時間静置した。得られた抗体サンプルｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＡ３）を固定化した蛍光性ナノ粒子（ＱＤ−Ｓ１ＴＡ３）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびフローサイトメトリー解析に供した。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるｓｃＦｖ固定化ＱＤの確認を、以下のようにして行った。上述のようにして得られたＱＤ−Ｓ１ＴＡ３（５０μＬ）を、６００００ｒｐｍ，４℃で３０分間超遠心分離し、沈殿と上清画分ａ（ｓｕｐ １）に分けた。沈殿に２０ｍＭ 炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）を加えて容量を５０μＬとし、同様の操作を繰り返し、上清画分ｂ（ｓｕｐ ２）と沈殿画分（ｐｐｔ）を得た。上記操作で得られたサンプル画分各１０μＬと、２−メルカプトエタノールを含むサンプルローディングバッファー １０μＬとを混合し、１００℃で１０分間加熱した。得られたサンプルを１２．５％のポリアクリルアミドゲル上に乗せ、４０ｍＡで８０分間電気泳動した。電気泳動後のゲルを銀染色によって染色した。図１９にはそれぞれの画分の分析結果を示す。

ＱＤ−Ｓ１ＴＡ３ ＯＨ／ＣＯＯＨ＝１０／０では、ＴＥＧ−ＣＯＯＨ−ＮＴＡ−Ｎｉが存在しないため、ｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＡ３）タンパク質は固定化されない。そのため、ＱＤ−Ｓ１ＴＡ３ ＯＨ／ＣＯＯＨ＝１０／０ではｓｕｐ １，ｓｕｐ ２，ｐｐｔ全てにおいて、ｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＡ３）タンパク質の分子質量である２７ｋＤａの位置にはバンドは検出されないが、ＱＤ−Ｓ１ＴＡ３ ＯＨ／ＣＯＯＨ＝９／１、ＱＤ−Ｓ１ＴＡ３ ＯＨ／ＣＯＯＨ＝８／２、ＱＤ−Ｓ１ＴＡ３ ＯＨ／ＣＯＯＨ＝７／３では、いずれのｐｐｔにも２７ｋＤａの位置にバンドが検出された。このことにより、蛍光性ナノ粒子に、ＴＥＧ−ＣＯＯＨ−ＮＴＡ−Ｎｉを介して一本鎖抗体が固定化されていることが確認された。

ｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＡ３）タンパク質を固定化した蛍光性ナノ粒子の細胞への結合のフローサイトメトリーによる解析を以下のように行った。細胞には、ＡＴＬ由来のＳ１Ｔ細胞、及び非ＡＴＬの白血病細胞であるＭＯＬＴ４細胞を用いた。各細胞を１サンプルあたり１０^６個に調整後、１サンプルあたり１５μＬのＱＤ−Ｓ１ＴＡ３を加え、攪拌した後、遮光下にて４℃で１時間静置した。その後１ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水で１回洗浄し、２０００ｒｐｍ，４℃で５分間遠心分離した。細胞沈殿後に上清を破棄し、１ｍＬのＤｕｌｂｅｃｃｏリン酸緩衝化生理食塩水で細胞を攪拌し、フローサイトメトリーに用いるサンプルとした。

フローサイトメトリーにはベックマンコールター社製ＦＣ５００を使用し、解析にはＣＸＰ 解析ソフトウェアを使用した。ＱＤの蛍光励起にはアルゴンレーザー（４８８ｎｍ）を使用し、検出にはＦＬ３フィルタ（６２０ｎｍ）を用いた。図２０に結果を示すが、特にＱＤ−Ｓ１ＴＡ３ ＯＨ／ＣＯＯＨ＝８／２、ＱＤ−Ｓ１ＴＡ３ ＯＨ／ＣＯＯＨ＝９／１、ＱＤ−Ｓ１ＴＡ３ ＯＨ／ＣＯＯＨ＝７／３では、ＭＯＬＴ４細胞と比較して、Ｓ１Ｔ細胞に対して右側への大きなピークシフトが観察された。

本発明に係る糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子はリガンド複合体と蛍光性ナノ粒子とを結合させたものであるので、容易に糖鎖を固定することができる。そのため、本発明は糖鎖やタンパク質の機能解析や、細胞の標識等に用いることが可能であり、医薬品開発や生命現象の解明に寄与することが期待される。したがって、医薬、バイオ産業等において広く利用することが可能である。

Claims (12)

1. 蛍光性ナノ粒子を含む溶液と、還元剤処理された糖鎖リガンド複合体を混和する工程を包含し、
   上記蛍光性ナノ粒子は、
   ＣｄＴｅナノ粒子の水溶液をチオール安定化剤の存在下にて加熱処理し、加熱処理後の水溶液から精製された、ＣｄＴｅをコアとしかつＣｄＳをシェルとする構造のＣｄＴｅ／ＣｄＳ蛍光性ナノ粒子であるか、あるいは
   ＺｎＳ−ＡｇＩｎＳ _２ （ＺＡＩＳ）がＺｎＳからなる層によって被覆されているＺＡＩＳ／ＺｎＳナノ粒子の水溶液をチオール安定化剤の存在下にて加熱処理し、加熱処理後の水溶液から精製されたＺＡＩＳ／ＺｎＳ蛍光性ナノ粒子であり、
   上記糖鎖リガンド複合体は、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えたリンカー化合物および糖鎖からなり、
   上記リンカー化合物の主鎖は、その一端に糖鎖と結合したアミノ基を有し、その他端に硫黄原子を含む炭化水素構造を備えており、
   上記工程によって上記炭化水素構造が上記層に固定化されて、糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の分散液が得られることを特徴とする糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の製造方法。
2. 前記ＺＡＩＳ／ＺｎＳナノ粒子が、親水化されていることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
3. 前記精製が、室温下にて行われることを特徴とする請求項１または２に記載の製造方法。
4. 前記加熱処理が５０℃〜２００℃の範囲の温度にて行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 前記加熱処理が、３０分間〜８時間にわたって行われることを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
6. チオール安定化剤がチオグリコール酸（ＴＧＡ）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
7. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方法によって製造されたことを特徴とする糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子。
8. 請求項７に記載の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子の表面上に抗体が固定化されていることを特徴とする抗体固定化蛍光性ナノ粒子。
9. 蛍光性ナノ粒子を含む溶液と、還元剤処理されたリガンド複合体を混和する工程を包含し、
   上記蛍光性ナノ粒子は、
   ＣｄＴｅナノ粒子の水溶液をチオール安定化剤の存在下にて加熱処理し、加熱処理後の水溶液から精製された、ＣｄＴｅをコアとしかつＣｄＳをシェルとする構造のＣｄＴｅ／ＣｄＳ蛍光性ナノ粒子であるか、あるいは
   ＺｎＳ−ＡｇＩｎＳ _２ （ＺＡＩＳ）がＺｎＳからなる層によって被覆されているＺＡＩＳ／ＺｎＳナノ粒子の水溶液をチオール安定化剤の存在下にて加熱処理し、加熱処理後の水溶液から精製されたＺＡＩＳ／ＺｎＳ蛍光性ナノ粒子であり、
   上記リガンド複合体は、主鎖に炭化水素鎖または炭化水素誘導鎖を備えたリンカー化合物からなり、
   上記リンカー化合物の主鎖は、その一端に抗体を直接的または間接的に結合し得る反応基を有し、その他端に硫黄原子を含む炭化水素構造を備えており、
   上記工程によって上記炭化水素構造が上記層に固定化されて、抗体固定化蛍光性ナノ粒子の分散液が得られることを特徴とする抗体固定化蛍光性ナノ粒子の製造方法。
10. 請求項９に記載の製造方法によって製造されたことを特徴とする抗体固定化蛍光性ナノ粒子。
11. 請求項７に記載の糖鎖固定化蛍光性ナノ粒子あるいは請求項８または１０に記載の抗体固定化蛍光性ナノ粒子を含んでいることを特徴とする生体組織を標識するための組成物。
12. 相互作用検出剤、細胞標識剤、細胞イメージング剤、生体イメージング剤、ウイルス標識剤または近赤外増感剤であることを特徴とする請求項１１に記載の組成物。