JP5685647B2 - 酸化鉄ナノカプセル、その製造方法およびそれを含む磁気共鳴画像診断造影剤 - Google Patents
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Description
本発明は、水分散性に極めて優れ、生体に安全であり、ＭＲＩ造影能に優れた酸化鉄ナノカプセル、その製造方法およびそれを用いた造影剤に関する。
ナノ物質は、その大きさが１ｎｍ〜１００ｎｍである物質であり、球形、板形、チューブなどの様々な形態で合成することができる。従来のバルク物質とは異なるナノ物質の独特の性質を利用して、電子、情報、環境、エネルギー、医薬などの色々な分野と結び付けて活発な応用技術の開発が行われている。
特に、ナノ物質のうち磁性を有した磁性ナノ粒子は、生体物質の分離、磁気共鳴画像診断造影剤、バイオセンサー、薬物／遺伝子伝達、磁性高温治療などの幅広い応用範囲にわたってその研究が進行しており、磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）造影剤のうち酸化鉄ナノ粒子を基にした肝臓造影剤であるResovist(Bayer Schering社)は現在臨床に用いられており、リンパ節造影剤であるCombidex（ＡＭＡＧ社）は臨床試験段階にあると知られている。
しかし、このような市販の造影剤に用いられる磁性ナノ粒子である酸化鉄ナノ粒子は、水溶液において金属塩を用いて共沈法によって合成した。したがって、大きさの調節が難しく、単分散度が良くない。また、常温で合成されるため、ナノ粒子の結晶性が低いという短所がある。
また他の酸化鉄ナノ粒子の製造方法として、熱分解法を用いた合成が挙げられる。熱分解法は、有機溶媒、金属前駆体および粒子の安定性を向上させる有機性表面安定剤などを混合して、溶媒の沸点までに加熱して熟成(aging)させる方法を利用するため、反応温度の調節が容易であり、沸点が相違する溶媒を用いると、様々な大きさのナノ粒子を合成することができる。このように合成されたナノ粒子は、水溶液において合成されたナノ粒子に比べて単分散度と結晶性に優れるため、応用分野において優れた物性を示す。
しかし、熱分解法は、ナノ粒子を有機溶媒において合成するため、合成された酸化鉄ナノ粒子の表面は有機物質で囲まれており、これは、ナノ−バイオ分野などに応用しようとする時に好適ではない。
したがって、生体内で安定し、且つ、水分散性が容易な物質でさらにナノ粒子表面の改質が必要である。ナノ粒子表面の改質方法には様々なものがある。代表的なものとして、ナノ粒子表面の有機物質を親水性物質で代替する配位子交換方法と、有機物質はそのままにしておき、親水性物質で表面を囲むカプセル化方法とがあり、カプセル化方法には、一つの粒子をカプセル化する方法と幾つかの粒子をカプセル化する方法とがある。
カプセル化工程の場合、親水性と疎水性の物質をいずれも有する両親媒性物質を用いると、両親媒性化合物の疎水性領域がナノ粒子の表面と結合し、両親媒性化合物の親水性領域がカプセルナノ粒子の最外郭に分布するようになって、水不溶性のナノ粒子を水溶性溶媒に安定的に分散させることができるので、生体利用率を極大化することができる。
本発明は、水溶性溶媒に対する分散性に極めて優れ、生体安定性に非常に優れ、且つ、優れたＭＲＩ造影性能を有する酸化鉄ナノカプセルおよびその製造方法を提供することにある。
以下、添付図面を参照して本発明の製造方法を詳細に説明する。次に紹介する図面は、当業者に本発明の思想が十分に伝えられるようにするために例として提供されるものである。したがって、本発明は、以下にて提示する図面に限定されず、他の形態で具体化されることもでき、以下にて提示する図面は、本発明の思想を明確にするために誇張して図示されることもある。また、明細書の全体にわたって同一の参照番号は同一の構成要素を示す。
この時、用いられる技術用語および科学用語において、他の定義がなければ、本発明が属する技術分野で通常の知識を有した者が通常に理解している意味を有し、下記の説明および添付図面において本発明の要旨を不明瞭にする可能性のある公知機能および構成に関する説明は省略する。
本発明による酸化鉄ナノカプセルの製造方法は、鉄錯体を熱分解して、疎水性配位子が結合された酸化鉄ナノ粒子を製造し、これをカルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲート(carboxymethyldextran-dodecylamine conjugate)またはデキストラン−リノール酸コンジュゲート（dextran-linoleic acid conjugate）のカプセル物質に封入して酸化鉄ナノカプセルを製造するという特徴がある。
詳細には、本発明による酸化鉄ナノカプセルの製造方法は、ａ）下記の化学式１のカルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲート(carboxymethyldextran-dodecylamine conjugate)または下記の化学式２のデキストラン−リノール酸コンジュゲート（dextran-linoleic acid conjugate）であるカプセル物質を製造するステップと、ｂ）鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含む疎水性有機酸基が配位子として結合している鉄錯体を熱分解して、疎水性配位子が結合された酸化鉄ナノ粒子を製造するステップと、ｃ）前記カプセル物質を緩衝溶液に溶解してカプセル物質水溶液を製造し、前記酸化鉄ナノ粒子を非極性有機溶媒に分散させてナノ粒子分散液を製造するステップと、ｄ）前記カプセル物質水溶液に前記ナノ粒子分散液を滴下し攪拌して、複数個の酸化鉄ナノ粒子がカプセル物質に封入された酸化鉄ナノカプセル分散液を製造するステップ、およびｅ）揮発を利用して、前記ｄ）ステップの酸化鉄ナノカプセル分散液に含まれた非極性有機溶媒を除去して、酸化鉄ナノカプセル水分散液を製造するステップ、を含んで行われる。
（化学式１）
（化学式２）
（前記化学式１中、前記ＲはＨまたはＣＨ２ＣＯＯＨであり、前記ｎは１〜５０００の整数であり、前記化学式２中、前記ｘは１〜１０００の整数であり、前記ｙは１〜１０００の整数である。）
前記化学式１のカルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲート(conjugate)または前記化学式２のデキストラン−リノール酸コンジュゲートであるカプセル物質は水溶媒相においてミセルを形成し、これにより、熱分解法によって合成されて疎水性配位子が結合された酸化鉄ナノ粒子を均一な大きさにカプセル化することができるという特徴があり、カプセル化した酸化鉄ナノ粒子は水溶性溶媒に対して極めて優れた分散性を有するという特徴がある。
さらには、前記鉄を中心にＣ４〜Ｃ２５を含む疎水性有機酸基が配位子として結合された鉄錯体を熱分解して製造された酸化鉄ナノ粒子は、熱分解温度および時間に応じてその大きさを数〜数十ナノメートルに精密に制御することができ、非常に均一な大きさを有する酸化鉄ナノ粒子であるという特徴がある。
さらには、デキストランは、ブドウ糖から構成された水溶性多糖類であって、Ｄ−グルコースの一つであり、ロイコノストックに属する乳酸菌によってスクロースを分解してＤ−グルコースを重合させる。ＦＤＡ承認を受けた物質であって、血漿増量剤として用いられ、特に常用造影剤であるFeridex（ＡＭＡＧ社）の酸化鉄ナノ粒子コーティング物質として用いられてきており、カルボキシメチルデキストランは、デキストランにカルボキシ基が結合しているデキストラン誘導体であり、カルボキシメチルデキストラン１ｇ当たり１．１〜１．５ｍｍｏｌのカルボキシ基が結合していると知られている。酸化鉄ナノ粒子を基にした常用造影剤であるResovistの酸化鉄ナノ粒子コーティング物質として用いられ、現在、臨床試験段階にあるリンパ節造影剤であるcombidexの酸化鉄ナノ粒子コーティング物質として用いられてきた。これにより、水溶媒相において分散が非常に優れ、且つ、生体に非常に安定した酸化鉄ナノ粒子が製造され、カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲート(conjugate)または前記化学式２のデキストラン−リノール酸コンジュゲートでカプセル化することにより、極めて均一な大きさの酸化鉄ナノカプセルが製造され、注入時の毛細血管の塞がりまたはターゲット組織以外の組織への吸収／拡散が防止されるという特徴がある。
詳細には、カプセル物質がカルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートである本発明による第１様態において、前記カプセル物質は、カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲート(conjugate)であり、前記ａ）ステップは、ａ１−１）カルボキシメチルデキストラン溶液とドデシルアミン溶液を混合して第１混合溶液を製造するステップと、ａ１−２）第１混合溶液にＥＤＣ(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)およびＮＨＳ(n-hydroxysuccinicimide)を添加して第２混合溶液を製造するステップ、およびａ１−３）第２混合溶液を透析および凍結乾燥するステップ、を含んで製造される。
前記カルボキシメチルデキストランの重量平均分子量は５００〜１，０００，０００Ｄａであり、好ましくは１０，０００〜１００，０００Ｄａである。
前記カルボキシメチルデキストラン溶液は、カルボキシメチルデキストラン：水が１（カルボキシメチルデキストラン）：３〜５（水）の重量比で混合されたカルボキシメチルデキストラン水溶液に、前記カルボキシメチルデキストラン水溶液の水の重量を基準に１０〜１５倍（重量）のＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)が添加されて製造されることが好ましく、前記ドデシルアミン溶液は、ドデシルアミン：クロロホルム：ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide)が１：８〜１２：２５〜３５の重量比で混合されて製造されることが好ましい。
前記ａ１−１）ステップにおいて、二つの溶液の混合時、ドデシルアミン：カルボキシメチルデキストランが１：１〜１０の重量比になるように、前記カルボキシメチルデキストラン溶液と前記ドデシルアミン溶液が混合されることが好ましい。前記カルボキシメチルデキストラン溶液と前記ドデシルアミン溶液の混合条件によって製造されるカルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートが有する親水性と疎水性の程度を制御することができる。
その次、ａ１−２）ステップにおいて、ドデシルアミン：ＥＤＣ：ＮＨＳが１：０．３〜０．７：０．１〜０．４になるように、前記ＥＤＣおよびＮＨＳが添加されることが好ましい。
詳細には、カプセル物質がデキストラン−リノール酸コンジュゲートである本発明による第２様態において、前記カプセル物質は、ａ２−１）デキストラン溶液とリノール酸溶液を混合して第１混合溶液を製造するステップと、ａ２−２）ＤＣＣ(n,n’-dicyclohexylcarbodiimide)およびＤＭＡＰ(dimethylaminopyridine)を第１混合溶液に添加して第２混合溶液を製造するステップ、およびａ２−３）第２混合溶液を透析および凍結乾燥するステップ、を含んで製造される。
前記デキストランの重量平均分子量は１００〜１００，０００Ｄａであり、５，０００〜１０，０００Ｄａであることが好ましい。
前記デキストラン溶液は、デキストラン：ＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)が１：５０〜８０の重量比で混合されて製造されることが好ましく、前記リノール酸溶液は、リノール酸：ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide)が１：８〜１４の重量比で混合されて製造されることが好ましい。
前記ａ２−１）ステップの混合時、デキストラン：リノール酸が１：２〜５の重量比になるように、前記デキストラン溶液と前記リノール酸溶液が混合されることが好ましい。前記デキストラン溶液と前記リノール酸溶液の混合条件によって製造されるデキストラン−リノール酸コンジュゲートが有する親水性と疎水性の程度を制御することができる。
その次、ａ２−２）ステップにおいて、デキストラン：ＤＣＣ：ＤＭＡＰが１：１．５〜２：０．３〜０．８になるように、前記ＤＣＣおよびＤＭＡＰが添加されることが好ましい。この時、前記ＤＣＣおよびＤＭＡＰは、各々、ＤＭＳＯに溶解された状態で添加されることが好ましい。
本発明による酸化鉄ナノカプセルの製造方法（第１様態および第２様態を含む）において、前記ｃ）ステップの緩衝溶液はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；phosphate buffered saline）であり、前記非極性有機溶媒はクロロホルムであるという特徴がある。
前記カプセル水溶液は、カプセル物質：緩衝溶液が１：５０〜５００の重量比で混合されて製造されることが好ましく、前記ナノ粒子分散液は、酸化鉄ナノ粒子：非極性有機溶媒が１：１０〜１００の重量比で混合されて製造されることが好ましい。
単一のカプセルに封入される酸化鉄ナノ粒子の量、カプセルの平均大きさおよびカプセルの分布、封入される酸化鉄ナノ粒子の凝集度は、酸化鉄ナノ粒子の大きさと前記ｄ）ステップの詳細遂行条件によって制御される。
造影剤に好適な磁性特性を有し、ＭＲＩ造影性能を極大化するために、前記酸化鉄ナノ粒子の平均大きさ（直径）は、３ｎｍ〜２０ｎｍであることが好ましい。上述したように、前記酸化鉄ナノ粒子は、鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含む疎水性有機酸基が配位子として結合している鉄錯体を熱分解して製造された疎水性配位子が結合された酸化鉄ナノ粒子であるという特徴がある。前記鉄錯体はオレイン酸鉄錯体(iron oleate complex)を含み、前記疎水性配位子が結合された酸化鉄ナノ粒子はオレエートが結合された酸化鉄ナノ粒子を含む。
詳細には、前記酸化鉄ナノ粒子は、上述した鉄錯体とオレイン酸を含む脂肪酸を３００〜３５０℃で２０〜９０分間反応させて製造することが好ましい。より詳細な酸化鉄ナノ粒子の製造方法はＰＣＴ／ＫＲ２００５／００４００９を参考にする。
カプセル別酸化鉄ナノ粒子の封入量偏差を減少し、酸化鉄ナノ粒子が効果的に封入されるために、前記ｄ）ステップにおいて、前記カプセル物質：酸化鉄ナノ粒子が１：０．０５〜０．２５の重量比になるように、酸化鉄ナノ粒子分散液が前記カプセル物質水溶液に滴下されることが好ましい。
カプセルの平均大きさを１００〜５００ｎｍに制御し、極めて均一な大きさのカプセルを製造するために、前記ｄ）ステップの滴下は、０．１〜３ｍｌ／分の速度で行われることが好ましく、前記ｄ）ステップの攪拌は、２００００〜３００００ｒｐｍで行われることが好ましい。この時、前記酸化鉄ナノ粒子分散液が前記カプセル物質水溶液に滴下されると同時に前記攪拌が行われることが好ましい。
上述した本発明の製造方法により、カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートまたはデキストラン−リノール酸コンジュゲートであるカプセル物質に、５ｎｍ〜２０ｎｍの平均大きさを有し、疎水性配位子が結合された酸化鉄ナノ粒子の複数個が封入された酸化鉄ナノカプセルが製造され、１００ｎｍ〜５００ｎｍの平均大きさを有し、非常に均一であり、且つ、水溶媒相において分散特性が極めて優れた酸化鉄ナノカプセルが製造される。
前記酸化鉄ナノカプセルを含有するＭＲＩ造影剤は肝臓造影剤として特に好適であり、前記酸化鉄ナノカプセルは、優れた肝組織選択性を有し、造影能に非常に優れるという特徴がある。
本発明による酸化鉄ナノカプセルの製造方法は、複数個の酸化鉄ナノ粒子が単一のカプセルに封入されることにより、前記酸化鉄ナノ粒子間のかたまり効果によって非常に優れた磁気共鳴画像の造影能を有するという特徴があり、製造される酸化鉄ナノカプセルの大きさが非常に均一であるため、造影しようとする組織（特に肝組織）以外の組織へ吸収および分布されることを防止することができ、水溶性溶液に対して極めて優れた分散性を有し、且つ、生体に安定的であるという効果がある。
以下、本発明を下記の実施例および比較例に基づいてより詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
［製造例１］１０ｎｍ酸化鉄ナノ粒子の合成
塩化鉄（ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４０ｍｍｏｌ）１０．８ｇとオレイン酸ナトリウム（１２０ｍｍｏｌ）３６．５ｇをエタノール８０ｍｌ、蒸留水６０ｍｌ、ヘキサン１４０ｍｌを含む混合溶媒に溶解させ、５７℃にその混合物を加熱し、同一の温度に１時間維持させた。
この過程の間、水相(aqueous phase)において初期の緋色が澄むようになり、初期の透明な有機相(organic phase)が赤色を帯びるようになり、これは、オレイン酸鉄錯体が成功的に合成されたことを示す。
前記反応が完了した時、オレイン酸鉄錯体を含む上部有機層(organic layer)が分離し、その後、前記ヘキサンは蒸発し、その結果、粘性を有した液体形態となった。
製造されたオレイン酸鉄錯体３６ｇをオクタデセン２００ｇとオレイン酸５．７ｇの混合物に添加した。前記結果から生成された混合物を真空下で室温から２．５℃／ｍｉｎの昇温速度で７０℃にまで加熱した後、同一の温度に１時間維持させることにより、反応物以外の残余溶媒と水分を除去した。
その後、窒素雰囲気下で２．５℃／ｍｉｎの速度で３２０℃にまで加熱した後、同一の温度に３０分間維持しながら熟成させ、この過程を経る間に激烈に反応が起こり、初期の赤色の溶液が黒褐色になり、これは、オレイン酸鉄錯体が完全に分解され、酸化鉄ナノ粒子が生成されたことを示す。
反応が終了した後、自然冷却過程を経て自動点火温度以下（１５０℃）になった時、空気を注入して酸化をさせた。前記結果から生成されたナノ粒子を含む溶液は室温にまで冷却し、体積比１：５のヘキサンとアセトン混合溶液を母液の体積の３倍に該当する量を加えて黒色の沈殿物が生成され、その後、遠心分離（ｒｐｍ＝２，０００）によって分離した。前記結果から生成された上層液を捨てた。
ヘキサンとアセトン混合溶液を加え、遠心分離する洗浄過程を少なくとも２回以上繰り返し行い、前記残余物に含まれたヘキサンおよびアセトンは乾燥によって除去し、ヘキサン中に容易に再分散するオレエートが結合された酸化鉄ナノ粒子を形成した。
図１は、製造された酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ(Transmission Electron Microscope)イメージであり、ＴＥＭ観察の結果、平均直径が１０ｎｍであるオレエートが結合された酸化鉄ナノ粒子が製造されることを確認し、粒子の形態が球形であり、粒子大きさが非常に均一な酸化鉄ナノ粒子が製造されることを確認した。
［製造例２］１１ｎｍ酸化鉄ナノ粒子の合成
前記合成過程中、熟成時間が１時間であることを除いては、製造例１に記載されたものと同一の反応条件を使って酸化鉄ナノ粒子を合成した。
図２は、製造された酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ(Transmission Electron Microscope)イメージであり、オレエートが結合され、平均直径が１１ｎｍである球形の酸化鉄ナノ粒子が製造されることを確認し、粒子大きさが非常に均一な酸化鉄ナノ粒子が製造されることを確認した。
［製造例３］１５ｎｍ酸化鉄ナノ粒子の合成
前記合成過程中、オクタデセンの代わりに１−エイコセンを用い、３３０℃で１時間熟成させたことを除いては、製造例１に記載されたものと同一の反応条件を使って酸化鉄ナノ粒子を合成した。
図３は、製造された酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ(Transmission Electron Microscope)イメージであり、オレエートが結合され、平均直径が１５ｎｍである球形の酸化鉄ナノ粒子が製造されることを確認し、粒子大きさが非常に均一な酸化鉄ナノ粒子が製造されることを確認した。
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートの合成
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートを合成するために、カルボキシメチルデキストラン（重量平均分子量１４，０００Ｄａ）５ｇを蒸留水２０ｍｌに完全に溶かした後、ＤＭＳＯ(dimethylsulfoxide)２５０ｍｌと混合してカルボキシメチルデキストラン溶液を製造した。ドデシルアミン１．４ｇ（７．５ｍｍｏｌ）とＣＨＣｌ３ １０ｍｌとＤＭＳＯ ４０ｍｌを混合してドデシルアミン溶液を製造した。
製造されたカルボキシメチルデキストラン溶液にドデシルアミン溶液を滴下する方法（滴下速度１ｍｌ／ｍｉｎ）によって二つの溶液を混合した後、混合溶液にＥＤＣ(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)０．７ｇをＤＭＳＯ ３０ｍｌに溶かしたＥＤＣ溶液とＮＨＳ(n-hydroxysuccinicimide)０．３５ｇをＤＭＳＯ １０ｍｌに溶かしたＮＨＳ溶液を注入した。
その次、常温で２４時間攪拌した後、フィルターペーパーを用いてフィルタリングした後、過量のエタノールを添加すると、白色の沈殿物が発生し、遠心分離（ｒｐｍ＝３，０００）を利用して沈殿物を分離した。
この沈殿物を蒸留水に分散させた後、３日間蒸留水において透析(dialysis)した後に凍結乾燥し、白色の固体状態のカルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートを得ることができた。
図４は、カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミン両親媒性高分子複合体のＦＴ−ＩＲ分析の結果である。１６５６ｃｍ−１と１５９３ｃｍ−１において新しいピーク(peak)が現れ、これは、各々、アミド(amide)結合においてＣ＝Ｏ stretching(amide I)とＮ−Ｈ deformation(amide II)を意味する。また、Ｃ−Ｈ stretchingピークが２９３３ｃｍ−１と２８７５ｃｍ−１において確認された。前記結果に基づき、カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートが成功的に合成されたことが分かった。
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートを用いた酸化鉄ナノ粒子のカプセル化
実施例１で製造されたカルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲート５５ｍｇとＰＢＳ ２５ｍｌを混合し、１０分間超音波処理して、カプセル水溶液を製造し、製造例１で製造された平均粒径が１０ｎｍである酸化鉄ナノ粒子１１ｍｇを０．５ｍｌのクロロホルムに分散させた後、１０分間超音波処理して、ナノ粒子分散液を製造した。
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲート溶液（カプセル物質水溶液）にナノ粒子分散液を１ｍｌ／ｍｉｎの速度で滴下する方法によって落としながら、ホモジナイザー（ｒｐｍ＝２６，０００）を利用して１０分間混合して、ナノカプセル粒子を形成した。ナノカプセル粒子が形成された溶液は、真空溶媒蒸発装置を利用して溶液中に含まれたクロロホルムを除去した。
図５は、前記過程を通じて製造されたカルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートカプセル物質にオレエートが結合された酸化鉄ナノ粒子が封入された酸化鉄カプセルのネガティブ染色(negative staining)後のＴＥＭ写真である。ＴＥＭ観察を通じて酸化鉄ナノ粒子がカプセル化したことを確認することができ、複数個の酸化鉄ナノ粒子が単一のナノカプセルで封入されたことを確認することができた。動的光散乱(dynamic light scattering(DLS、Melvern社のZetasizer))においてカプセルの大きさを測定した結果、平均粒径(Z-average)は１５０ｎｍであった。
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートを用いた酸化鉄ナノ粒子のカプセル化
製造例２で製造された平均粒径が１１ｎｍである酸化鉄ナノ粒子を用いたことを除いては、実施例２に記載されたものと同一の方法によってカプセル粒子を製造した。図６は、製造されたカプセルのＴＥＭ写真であり、製造された酸化鉄ナノカプセルの平均粒径は各々１４４ｎｍであった。
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートを用いた酸化鉄ナノ粒子のカプセル化
製造例３で製造された平均粒径が１５ｎｍである酸化鉄ナノ粒子を用いたことを除いては、実施例２に記載されたものと同一の方法によってカプセル粒子を製造した。図７は、製造されたカプセルのＴＥＭ写真であり、製造された酸化鉄ナノカプセルの平均粒径は１８８ｎｍであった。
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンカプセル物質に酸化鉄ナノ粒子が封入された酸化鉄カプセルの体外磁気共鳴弛緩性能の測定
実施例２、３、４で製造されたナノカプセルを各々ＰＢＳに分散させ、濃度が０．３６μｇ／ｍｌ、０．１９μｇ／ｍｌ、０．１２μｇ／ｍｌである溶液を製造した後、ＰＢＳを用いて希釈して各々の試料別に濃度が異なる５個の溶液を製造し、４．７Ｔ磁気共鳴画像診断機(Biospec 47/40、Bruker Biospin MRI GmbH)を利用して体外磁気共鳴弛緩性能を測定した。Ｔ２弛緩時間の測定はＭＳＭＥ(Multi Slice Multi Echo sequence)パルス列を利用し、具体的なパラメータは表１の通りである。
図８は、１０ｎｍ酸化鉄ナノ粒子を用いたカプセルのR2 relaxivityの測定結果のグラフであり、R2 relaxivity値は２９８ｍＭ−１ｓ−１であることが分かった。図９は、１１ｎｍ酸化鉄ナノ粒子を用いたカプセルのR2 relaxivityの測定結果のグラフであり、R2 relaxivity値は３１６ｍＭ−１ｓ−１であることが分かった。図１０は、１５ｎｍ酸化鉄ナノ粒子を用いたカプセルのR2 relaxivityの測定結果のグラフであり、R2 relaxivity値は３４０ｍＭ−１ｓ−１であることが分かった。
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンカプセル物質に酸化鉄ナノ粒子が封入された酸化鉄カプセルの体内磁気共鳴弛緩性能の測定
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミン両親媒性高分子カプセルに封入された酸化鉄ナノ粒子の磁気共鳴画像診断肝臓造影剤の性能を測定するために、４．７Ｔ磁気共鳴画像診断機(Biospec 47/40、Bruker Biospin MRI GmbH)においてＢＧＡ１２gradient coilを利用して、体内(in vivo)Ｔ２弛緩性能を測定した。
実験に使ったマウスは５週齢の雄Ｂａｌｂ／ｃ ｍｏｕｓｅであり、マウスの体重は約２０〜２５ｇであった。マウスを麻酔した後、ＭＲＩ機器に水平に入れてCoronal planeを観察し、同一の面の肝組織を調査するために全体実験時間の間呼吸麻酔して、マウスの動きが殆どない状態を維持した。
酸化鉄カプセルの鉄濃度をＩＣＰ−ＡＥＳを通じて分析した後、前記溶液２００μｌをマウスの尾静脈(tail vein)を通じて一度に注入し、最終溶液の濃度はマウスの重さを考慮して１ｍｇ Ｆｅ／ｋｇになるように実験した。Ｔ２弛緩時間の測定はＲＡＲＥ(Rapid Acquisition with Refocused Echoes)パルス列を利用し、具体的なパラメータは表２の通りである。
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンカプセル物質に酸化鉄ナノ粒子が封入された酸化鉄カプセルのＴ２減衰効果を定量的に評価するために、肝組織の一断面を選定して、肝部分の全体をＲＯＩ(Region of Interests)に選定し、信号強さ(Signal Intensity、SI)を分析した。獲得した信号強さの信頼度を最大化するために、アガロース(Agarose)１ｗｔ％溶液を２００μｌチューブに入れて冷却し、固形化した後、マウスの腹腔周辺に固定して対照群として利用した。
図１１は、実施例２で製造された酸化鉄カプセルを造影剤として用いた場合の体内磁気共鳴画像を示し、造影剤注入前と造影剤注入後の画像を比較した時、マウスの肝臓の色が黒く変わったことを確認することができ、これにより、カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミン両親媒性高分子カプセル物質に酸化鉄ナノ粒子が封入された酸化鉄カプセルが肝臓造影剤として用いられ得るということが分かった。
図１２は、実施例２で製造された酸化鉄カプセルを造影剤として用いた場合の肝臓の体内磁気共鳴画像の測定から得たイメージのシグナル値を数値化してrelaxivityを示すグラフである。ΔＲ２値は４７〜６０％であるものとして測定された。
［比較例１］カルボキシメチルデキストランを用いた酸化鉄ナノ粒子のカプセル化
平均粒径が１０ｎｍである酸化鉄ナノ粒子１２０ｍｇをヘキサン２０ｍｌに分散させた後、反応器に入れて攪拌した。カルボキシメチルデキストラン２０ｍｇを蒸留水２０ｍｌに溶かし、酸化鉄ナノ粒子溶液に滴下方法によって落とした後、５０℃で１時間攪拌すると、ヘキサン層にあった酸化鉄ナノ粒子がカルボキシメチルデキストランによって親水化して水層に移り、ヘキサン層は澄むようになり、水層は酸化鉄ナノ粒子の色である茶色を示した。蒸留水とエタノールを添加し、遠心分離機を利用して沈殿を形成した後、ＴＥＭを通じてカプセル化粒子の生成有無を観察した。
図１３は、前記の方法により製造されたカルボキシメチルデキストラン−酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。カプセル化されず、酸化鉄ナノ粒子が大きい塊を成してかたまっている形態である。
前記結果から、両親媒性分子を用いず、親水性物質であるカルボキシメチルデキストランを単独で用いると、カプセルナノ粒子を形成できないことが分かった。
［比較例２］界面活性剤を用いて親水化後カルボキシメチルデキストランで酸化鉄ナノ粒子のカプセル化
ＳＤＳ(Sodium Dodecyl Sulfate)３ｇを蒸留水１８ｍｌに溶かした後、クロロホルム３ｍｌに酸化鉄ナノ粒子０．０３ｇを分散させた溶液と混合した。真空溶媒蒸発装置を利用してクロロホルムを蒸発させ、界面活性剤でコーティングされた酸化鉄ナノ粒子が分散された溶液を得ることができた。カルボキシメチルデキストラン０．０１ｇを蒸留水５ｍｌに溶かした後、前記溶液に滴下した。５０℃で１時間攪拌した後、蒸留水とエタノールを添加し、遠心分離機を利用して沈殿を形成した。高分子部分をよく観察するために、ネガティブ染色(negative staining)をした後、ＴＥＭを通じて粒子の形状を観察した。
図１４は、前記の結果から製造したカルボキシメチルデキストラン−酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。白く表われる部分がカルボキシメチルデキストランであり、酸化鉄ナノ粒子がカプセル化したことが分かった。しかし、両親媒性分子を用いず、界面活性剤を用いて親水化した後にカプセル化をする場合、粒子大きさの調節が容易でなく、分散安定性が悪いという問題点があった。
デキストラン−リノール酸両親媒性コンジュゲートの合成
デキストラン−リノール酸コンジュゲートを合成するために、デキストラン０．８ｇ（重量平均分子量１０，０００）をＤＭＳＯ ５０ｍｌに完全に溶かしてデキストラン溶液を製造し、リノール酸２．２１２ｍｌ（７．０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ ２０ｍｌに溶かしてリノール酸溶液を製造した。製造されたデキストラン溶液にリノール酸溶液を滴下（滴下速度１ｍｌ／ｍｉｎ）して二つの溶液を混合した後、ＤＣＣ(n,n’-dicyclohexylcarbodiimide)１．１２ｍｌ（７．０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ(dimethylaminopyridine)０．４４ｇ（３．５ｍｍｏｌ）を各々ＤＭＳＯ ２０ｍｌに溶かした溶液を添加し混合して、２５℃で２４時間反応させた。
フィルターペーパーを用いてフィルタリングした後、副産物であるＤＣＵ(Dicyclohexylurea)濾過後、濾過された溶液に１対２の比率で混合したメタノールとアセトニトリルを過量添加すると、淡い黄色の沈殿物が発生した。この溶液をフィルタリングした後、フィルターペーパーに残った沈殿物をメタノールとアセトニトリル１対２の混合溶液で３回洗浄して乾燥させた。乾燥した白色の固体物質を蒸留水に溶かした後、透析(dialysis)および凍結乾燥を経て、固体状態のデキストラン−リノール酸コンジュゲートを得ることができた。
図１５は、デキストラン−リノール酸コンジュゲートのＦＴ−ＩＲ分析の結果である。１７４５ｃｍ−１においてエステル基のピークを確認することができ、これにより、デキストラン−リノール酸コンジュゲートが成功的に合成されたことが分かった。
デキストラン−リノール酸コンジュゲートを用いた酸化鉄ナノ粒子のカプセル化
実施例７で製造されたデキストラン−リノール酸コンジュゲート２２０ｍｇとＰＢＳ ２５ｍｌを混合し、１０分間超音波処理して、カプセル水溶液を製造した。製造例１で製造された平均粒径が１０ｎｍである酸化鉄ナノ粒子２２ｍｇを０．５ｍｌのクロロホルムに分散させた後、１０分間超音波処理して、ナノ粒子分散液を製造した。デキストラン−リノール酸コンジュゲート溶液（カプセル物質水溶液）にナノ粒子分散液を１ｍｌ／ｍｉｎの速度で滴下する方法によって落としながら、ホモジナイザー（ｒｐｍ＝２６，０００）を利用して１０分間混合して、カプセル粒子を形成した。
図１６は、前記過程を通じて製造されたデキストラン−リノール酸コンジュゲートカプセル物質に複数個の酸化鉄ナノ粒子が凝集した状態で封入されたカプセル粒子のネガティブ染色(negative staining)後に観察したＴＥＭ写真である。ＴＥＭ観察を通じて酸化鉄ナノ粒子がカプセル化したことを確認することができ、動的光散乱法（ＤＬＳ；dynamic light scattering）において粒子大きさを測定した結果、酸化鉄ナノカプセルの平均粒径は１５５ｎｍであった。
デキストラン−リノール酸カプセル物質に酸化鉄ナノ粒子が封入された酸化鉄ナノカプセルの体内磁気共鳴弛緩性能の測定
複数個の酸化鉄ナノ粒子がデキストラン−リノール酸コンジュゲートカプセルに封入された酸化鉄ナノカプセルの磁気共鳴画像診断肝臓造影剤の性能を測定するために、４．７Ｔ磁気共鳴画像診断機(Biospec 47/40、Bruker Biospin MRI GmbH)においてBGA12gradient coilを利用して、実施例６と同一の方法によって体内(in vivo)Ｔ２弛緩性能を測定した。
図１７は、造影剤注入前と造影剤注入後の映像を比較した時、マウスの肝臓の色が黒く変わったことを確認することができ、これにより、デキストラン−リノール酸コンジュゲート物質で封入された酸化鉄ナノ粒子が肝臓造影剤として用いられ得ることが分かった。
図１８は、肝臓の体内磁気共鳴画像の測定から得たイメージのsignal値を数値化して弛緩性能を示すグラフである。ΔＲ２値は３５〜４５％であるものとして測定された。
［比較例３］デキストランを用いた酸化鉄ナノ粒子のカプセル化
分子量が１０，０００であるデキストランを用いたことを除いては、比較例１に記載されたものと同一の方法によって実験した。
図１９は、前記方法により製造されたデキストラン−酸化鉄ナノ粒子のＴＥＭ写真である。カプセル化されず、酸化鉄ナノ粒子が大きい塊を成してかたまっている形態であることが分かり、前記の結果から、両親媒性分子を用いず、親水性物質であるデキストランを単独で用いると、カプセルナノ粒子を形成できないことが分かった。
以上のように、本発明では、特定の事項と限定された実施例および図面によって説明したが、これは、本発明のより全般的な理解を助けるために提供されるものに過ぎず、本発明は、前記実施例に限定されず、本発明が属する分野で通常の知識を有した者であれば、このような記載から様々な修正および変形が可能である。
したがって、本発明の思想は、説明された実施例に限定して定められてはならず、後述する特許請求の範囲だけでなく、該特許請求の範囲と均等であるか等価的な変形がある全てのものは本発明の思想の範囲に属するものであろう。
Claims (20)
- 鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含む疎水性有機酸基が配位子として結合している鉄錯体を熱分解して、疎水性配位子が結合された酸化鉄ナノ粒子を製造するステップ、および
カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートまたはデキストラン−リノール酸コンジュゲートのカプセル物質に前記疎水性配位子が結合された酸化鉄ナノ粒子を封入して酸化鉄ナノカプセルを製造するステップ、
を含むことを特徴とする酸化鉄ナノカプセルの製造方法。 - ａ）下記の化学式１のカルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートまたは下記の化学式２のデキストラン−リノール酸コンジュゲートであるカプセル物質を製造するステップと、
ｂ）鉄を中心原子とし、Ｃ４〜Ｃ２５を含む疎水性有機酸基が配位子として結合している鉄錯体を熱分解して、疎水性配位子が結合された酸化鉄ナノ粒子を製造するステップと、
ｃ）前記カプセル物質を緩衝溶液に溶解してカプセル物質水溶液を製造し、前記酸化鉄ナノ粒子を非極性有機溶媒に分散させてナノ粒子分散液を製造するステップと、
ｄ）前記カプセル物質水溶液に前記ナノ粒子分散液を滴下し攪拌して、複数個の酸化鉄ナノ粒子がカプセル物質に封入された酸化鉄ナノカプセル分散液を製造するステップ、および
ｅ）揮発を利用して、前記ｄ）ステップの酸化鉄ナノカプセル分散液に含まれた非極性有機溶媒を除去して、酸化鉄ナノカプセル水分散液を製造するステップ、
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
（化学式１）
（化学式２）
（前記化学式１中、前記ＲはＨまたはＣＨ２ＣＯＯＨであり、前記ｎは１〜５０００の整数であり、前記化学式２中、前記ｘは１〜１０００の整数であり、前記ｙは１〜１０００の整数である。） - カプセル物質は、カルボキシメチルデキストラン−ドデシルアミンコンジュゲートであり、ａ）ステップは、下記のステップを含んで行われることを特徴とする、請求項２に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
ａ１−１）カルボキシメチルデキストラン溶液とドデシルアミン溶液を混合して、第１混合溶液を製造するステップと、
ａ１−２）前記第１混合溶液に、ＥＤＣ(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)およびＮＨＳ(n-hydroxysuccinicimide)を添加して、第２混合溶液を製造するステップ、および
ａ１−３）前記第２混合溶液を透析および凍結乾燥するステップ。 - カルボキシメチルデキストランの重量平均分子量は、５００〜１，０００，０００Ｄａであることを特徴とする、請求項３に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- カルボキシメチルデキストラン溶液は、カルボキシメチルデキストラン：水が１：３〜５の重量比で混合されたカルボキシメチルデキストラン水溶液に、前記カルボキシメチルデキストラン水溶液の水の重量を基準に１０〜１５倍のＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)が添加されて製造されることを特徴とする、請求項３または４に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- ドデシルアミン溶液は、ドデシルアミン：クロロホルム：ＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)が１：８〜１２：２５〜３５の重量比で混合されることを特徴とする、請求項３〜５の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- ドデシルアミン：カルボキシメチルデキストランが１：１〜１０の重量比になるように、カルボキシメチルデキストラン溶液とドデシルアミン溶液が混合されることを特徴とする、請求項３〜６の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- ドデシルアミン：ＥＤＣ：ＮＨＳが１：０．３〜０．７：０．１〜０．４になるように、前記ＥＤＣおよびＮＨＳが添加されることを特徴とする、請求項３〜７の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- カプセル物質は、デキストラン−リノール酸コンジュゲートであり、ａ）ステップは、下記のステップを含んで行われることを特徴とする、請求項２に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
ａ２−１）デキストラン溶液とリノール酸溶液を混合して、第１混合溶液を製造するステップと、
ａ２−２）前記第１混合溶液に、ＤＣＣ(n,n’-dicyclohexylcarbodiimide）およびＤＭＡＰ(dimethylaminopyridine)を添加して、第２混合溶液を製造するステップ、および
ａ２−３）前記第２混合溶液を透析および凍結乾燥するステップ。 - デキストランの重量平均分子量は、１００〜１５０，０００Ｄａであることを特徴とする、請求項９に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- デキストラン溶液は、デキストラン：ＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)が１：５０〜８０の重量比で混合された溶液であり、リノール酸溶液は、リノール酸：ＤＭＳＯ(dimethyl sulfoxide)が１：８〜１４の重量比で混合された溶液であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- デキストラン：リノール酸が１：２〜５の重量比になるように、デキストラン溶液とリノール酸溶液が混合されることを特徴とする、請求項９〜１１の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- デキストラン：ＤＣＣ：ＤＭＡＰが１：１．５〜２：０．３〜０．８の重量比になるように、前記ＤＣＣおよびＤＭＡＰが添加されることを特徴とする、請求項９〜１２の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- ｃ）ステップの緩衝溶液はリン酸緩衝生理食塩水であり、非極性有機溶媒はクロロホルムであることを特徴とする、請求項２〜１３の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- ｄ）ステップにおいて、カプセル物質：酸化鉄ナノ粒子が１：０．０５〜０．２５の重量比となる酸化鉄分散液がカプセル物質水溶液に滴下されることを特徴とする、請求項２〜１４の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- ｄ）ステップの滴下は、０．１〜３ｍｌ／ｍｉｎ速度で行われることを特徴とする、請求項２〜１５の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- カプセル物質水溶液は、カプセル物質：緩衝溶液が１：５０〜５００の重量比で混合された溶液であり、ナノ粒子分散液は、酸化鉄ナノ粒子：非極性有機溶媒が１：１０〜１００の重量比で混合された溶液であることを特徴とする、請求項２〜１６の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- ｄ）ステップの攪拌は、２００００〜３００００ｒｐｍであることを特徴とする、請求項２〜１７の何れかに記載の酸化鉄ナノカプセルの製造方法。
- 請求項１〜１８から選択された何れか一項の製造方法により製造された酸化鉄ナノカプセル。
- 請求項１〜１８から選択された何れか一項の製造方法により製造された酸化鉄ナノカプセルを含有するＭＲＩ肝臓造影剤。
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