CN103201211A - 氧化铁纳米胶囊、其制备方法和使用其的mri造影剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了氧化铁纳米胶囊，其具有极其优异的水分散性，在体内非常稳定，并且具有非常优异的MRI造影能力，还提供了制备其的方法和使用其的MRI造影剂。制备该氧化铁纳米胶囊的方法包括以下步骤：热分解铁络合物以制备疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子；然后通过羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料或右旋糖苷-亚油酸轭合物封装材料包封该疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子以形成氧化铁纳米胶囊。

Description

氧化铁纳米胶囊、其制备方法和使用其的MRI造影剂
技术领域
本发明涉及一种氧化铁纳米胶囊，其具有极其优异的水分散性，在体内稳定，并且具有优异的MRI造影能力，还涉及制备其的方法和使用其的MRI造影剂。
背景技术
纳米材料是粒径为1nm～100nm的材料。它们可以被合成为多种形状如球状、板状、管状等。因为纳米材料具有不同于传统大体积材料的特殊性能，因此在电子、信息、环境、能源、医药等不同领域中已经积极开发了使用这种特殊性能纳米材料的应用技术。
具体地，在纳米材料中，已经广泛研究了具有磁性能的磁性纳米粒子，用于生物材料提取、磁共振成像(MRI)造影剂、生物传感器、药物/基因导入和高温磁疗。在MRI造影剂中，一种基于氧化铁纳米粒子的MRI肝脏造影剂Resovist(由Bayer Schering公司生产)目前在临床实践中得以应用，以及一种MRI淋巴结造影剂Combidex(由AMAAG公司制备)已知处于临床测试中。
然而，氧化铁纳米粒子(其是用于市售MRI造影剂的磁性纳米粒子)是通过在水溶液中使用金属盐共沉淀来合成的。因此，用该方法合成的氧化铁纳米粒子的缺点在于难以调整它们的粒径，并且它们的单分散性较差。此外，因为这些氧化铁纳米粒子是在室温下合成的，因此其存在结晶度低的缺点。
此外，氧化铁纳米粒子还可以通过热分解来合成。热分解使用这样的方法：将有机表面稳定剂与有机溶剂和金属前体混合来提高粒子的稳定性，然后加热该混合物到有机溶剂的沸点来老化该混合物。所以，热分解的优点在于能够容易地控制反应温度以及当使用沸点互不相同的溶剂时，能够合成不同粒径的氧化铁纳米粒子。以此方法合成的氧化铁纳米粒子在应用领域中表现出优异的物理性能，因为与在水溶液中合成的氧化铁纳米粒子相比，它们具有优异的单分散性和结晶性。
然而，热分解的问题在于氧化铁纳米粒子是在有机溶剂中合成的，这样合成的氧化铁纳米粒子被有机物所包围，导致这些氧化铁纳米粒子不适于在纳米-生物应用中实际使用。
所以，需要使用在体内稳定的水可分散性材料对氧化铁纳米粒子进行表面处理。有各种纳米粒子的表面处理方法。通常有将包围纳米粒子的有机物转化成亲水性物质的配体交换方法和用亲水性物质覆盖纳米粒子的包封方法，所述纳米粒子被有机物质包围。该包封方法包括包封一个纳米粒子的方法和包封数个纳米粒子的方法。
在该包封方法中，当使用具有亲水性和疏水性的两性化合物时，该两性化合物的疏水性区域结合到纳米粒子表面，并且其亲水性区域分布在包封的纳米粒子的整个最外层壳上，这样不溶于水的纳米粒子能够稳定分散在水溶液中，由此使得纳米粒子在体内的使用率最大化。
发明概述
技术问题
本发明的一个目的是提供一种氧化铁纳米胶囊，其具有极其优异的水分散性，在体内非常稳定，并且具有非常优异的MRI造影能力，本发明还提供其制备方法。
技术方案
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供一种制备氧化铁纳米胶囊的方法，包括如下步骤：热分解铁络合物以制备疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子；和通过羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料或者右旋糖苷-亚油酸轭合物封装材料包封该疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子，以形成氧化铁纳米胶囊。
本发明的另一个方面提供一种通过所述方法制备的氧化铁纳米胶囊。
本发明的又一个方面提供一种磁共振成像(MRI)造影剂，其包含该氧化铁纳米胶囊。
有益效果
本发明制备氧化铁纳米胶囊的方法特征在于，多个氧化铁纳米粒子被单个纳米胶囊包封，这样这些铁纳米粒子彼此聚结，由此使得氧化铁纳米胶囊具有非常优异的磁共振成像(MRI)造影能力，并且该方法的优势在于，因为通过这种方法制备的氧化铁纳米胶囊具有均一粒径，因此可以防止这些氧化铁纳米胶囊被吸收和分布到除目标器官(特别是肝脏)以外的器官中，并且这些氧化铁纳米胶囊具有对水溶液极其优异的分散性且在体内是稳定的。
附图说明
通过下面结合附图给出的优选实施方案的说明，本发明上述的和其他的目标、特征和优点将变得显而易见，其中：
图1是制备例1所制备的氧化铁纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)照片；
图2是制备例2所制备的氧化铁纳米粒子的TEM照片；
图3是制备例3所制备的氧化铁纳米粒子的TEM照片；
图4显示实施例1所制备的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺两性聚合物复合材料的FT-IR分析结果；
图5是数个氧化铁纳米胶囊的TEM照片，每个油酸盐键合的氧化铁纳米粒子被实施例2所制备的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料所包封；
图6是实施例3所制备的氧化铁纳米胶囊的TEM照片；
图7是实施例4所制备的氧化铁纳米胶囊的TEM照片；
图8显示测量包封粒径为10nm的氧化铁纳米粒子的氧化铁纳米胶囊的R2弛豫率的结果；
图9显示测量包封粒径为11nm的氧化铁纳米粒子的氧化铁纳米胶囊的R2弛豫率的结果；
图10显示测量包封粒径为15nm的氧化铁纳米粒子的氧化铁纳米胶囊的R2弛豫率的结果；
图11显示使用本发明的氧化铁纳米胶囊的在体磁共振图像；
图12显示氧化铁纳米胶囊的弛豫率，其通过对使用本发明的氧化铁纳米胶囊的在体磁共振成像所测量的肝脏图像的信号值进行数字化来获得；
图13是对比例1所制备的羧甲基右旋糖苷-氧化铁纳米粒子的TEM照片；
图14是对比例2所制备的羧甲基右旋糖苷-氧化铁纳米粒子的TEM照片；
图15显示实施例7所制备的羧甲基右旋糖苷-亚油酸轭合物的FT-IR的分析结果；
图16是实施例8所制备的氧化铁纳米胶囊的TEM照片；
图17显示使用本发明的氧化铁纳米胶囊的在体磁共振图像；
图18显示氧化铁纳米胶囊的弛豫率，其通过对使用本发明的氧化铁纳米胶囊的在体磁共振成像所测量的肝脏图像的信号值进行数字化来获得；和
图19是对比例3所制备的右旋糖苷-氧化铁纳米粒子的TEM照片。
具体实施方式
下文中，将参考附图来详细地描述本发明优选的实施方案。
将下面的附图提供给本领域技术人员，作为实例来充分解释本发明的技术理念。所以，本发明可以改变成不同的形式，而不受下述附图的限制，并且这些附图可以放大以清楚地解释本发明的技术理念。此外，在整个附图中使用相同的附图标记来表示相同或相似的部件。
在这种情况中，本申请中所用的技术和科学术语是本领域技术人员通常所理解的含义，只要它们不被另行定义。此外，在本发明的说明书中，当对于背景技术的详细说明明确会使本发明的主旨不突出时，其说明将被省略。
制备本发明的氧化铁纳米胶囊的方法包括以下步骤：热分解铁络合物以制备疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子；和在羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料或者右旋糖苷-亚油酸轭合物封装材料中包封该疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子以形成氧化铁纳米胶囊。
具体的，制备本发明的氧化铁纳米胶囊的方法包括以下步骤：a)制备下述式1所示的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料或者下述式2所示的右旋糖苷-亚油酸轭合物封装材料；b)热分解铁络合物以制备疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子，在所述的铁络合物中疏水性C4-C25有机酸根作为配体键合到作为中心原子的铁上；c)将所述的封装材料溶解在缓冲剂溶液中以制备封装材料的水溶液，然后将氧化铁纳米粒子分散在有机非极性溶剂中来制备纳米粒子分散的溶液；将该纳米粒子分散的溶液滴入封装材料水溶液中，并且搅拌该封装材料水溶液和该纳米粒子分散的溶液的混合溶液，以制备氧化铁纳米胶囊分散的溶液，该溶液中分散有氧化铁纳米胶囊，每个胶囊包封了多个氧化铁纳米粒子；和e)通过挥发从该氧化铁纳米胶囊分散的溶液中除去有机非极性溶剂，以制备水分散的氧化铁纳米胶囊溶液。
[式1]
Figure BDA00002869080400061
其中R是H或者CH2COOH，且n是1-5000的整数。
[式2]
Figure BDA00002869080400062
其中x是1-1000的整数，且y是1-1000的整数。
上述式1所示的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料或者上述式2所示的右旋糖苷-亚油酸轭合物封装材料在水溶液中形成了胶团。所以，这种封装材料的特征在于，它能够包封经热分解合成的疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子以具有均匀的粒径，并且所包封的氧化铁纳米胶囊在水溶剂中具有极其优异的分散性。
此外，通过热分解铁络合物(在其中疏水性C4-C25有机酸根作为配体键合到作为中心原子的铁上)所制备的氧化铁纳米粒子的特征在于，可根据热分解的温度和时间将它们的粒径精确控制到几纳米到几十纳米的范围，并且它们具有非常均匀的粒径。
同时，右旋糖苷，其是一种含有葡萄糖(D-葡萄糖的一种)的水溶性多糖，用于通过使用属于明串珠菌属(Leuconostoc)的乳酸菌来分解蔗糖以聚合D-葡萄糖。右旋糖苷，其是FDA所批准的材料，被用作血浆扩容剂，并且具体地，其已经被用作包覆通常使用的MRI造影剂(Feridex，由AMAG公司生产)的氧化铁纳米粒子的材料。羧甲基右旋糖苷是一种右旋糖苷衍生物，其是键合有羧基的右旋糖苷。并且已知1.1～1.5mmol的羧基键合1g的羧甲基右旋糖苷。羧甲基右旋糖苷被用作包覆Resovist(其是一种通常使用的氧化铁纳米粒子基造影剂)的氧化铁纳米粒子的材料，并且已经被用作包覆Combidex(其是一种正处于临床测试中的淋巴腺造影剂)的氧化铁纳米粒子的材料。从而制备氧化铁纳米粒子，其在含水溶剂中具有非常优异的分散性且在体内非常稳定，并且将这些氧化铁纳米粒子用上述式1所示的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物或者上述式2所示的右旋糖苷-亚油酸轭合物包封，以制备具有极其均匀的粒径的氧化铁纳米胶囊，由此防止毛细血管被这些氧化铁纳米胶囊所阻塞或者防止这些氧化铁纳米胶囊被吸收和扩散到除目标组织以外的组织中。
具体地，在本发明第一实施方案的方法中，该封装材料是羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物，并且步骤a)包括以下步骤：a1-1)将羧甲基右旋糖苷溶液与十二烷基胺溶液混合以形成第一混合溶液；a1-2)将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)和正羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入该第一混合溶液中来形成第二混合溶液；和a1-3)透析、冻干该第二混合溶液。
该羧甲基右旋糖苷的平均分子量是500～1,000,000Da，优选10,000～100,000Da。
该羧甲基右旋糖苷溶液可以如下来制备：将二甲亚砜(DMSO)加入到羧甲基右旋糖苷水溶液中，在该羧甲基右旋糖苷水溶液中，羧甲基右旋糖苷与水以1(羧甲基右旋糖苷)：3～5(水)的重量比混合，并且二甲亚砜(DMSO)的加入量是羧甲基右旋糖苷水溶液中水的重量的10-15倍。该十二烷基胺溶液可以通过将十二烷基胺、氯仿和二甲亚砜(DMSO)以1：8～12：25～35的重量比混合来制备。
在步骤a1-1)中，羧甲基右旋糖苷溶液可以与十二烷基胺溶液混合，以使得十二烷基胺：羧甲基右旋糖苷的重量比是1：1～10。在这种情况中，能够控制通过将羧甲基右旋糖苷溶液与十二烷基胺溶液混合所制备的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物的亲水性和疏水性。
随后，在步骤a1-2)中，十二烷基胺、EDC和NHS可以以十二烷基胺：EDC：NHS重量比为1：0.3～0.7：0.1～0.4来加入。
具体地，在本发明第二实施方案的方法中，该封装材料是右旋糖苷-亚油酸轭合物，并且步骤a)包括以下步骤：a2-1)将右旋糖苷溶液和亚油酸溶液混合以形成第一混合溶液；a2-2)将n,n’-二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲氨基吡啶(DMAP)加入该第一混合溶液中以形成第二混合溶液；和a2-3)透析、冻干该第二混合溶液。
该右旋糖苷的平均分子量是100～100,000Da，优选5,000～10,000Da。
该右旋糖苷溶液可以通过将右旋糖苷和二甲亚砜(DMSO)以1：50～80的重量比混合来制备，并且该亚油酸溶液可以通过将亚油酸和二甲亚砜(DMSO)以1：8～14的重量比混合来制备。
在步骤a2-1)中，该右旋糖苷溶液可以与亚油酸溶液混合，以使得右旋糖苷：亚油酸的重量比是1：2～5。在这种情况中，能够控制通过将羧甲基右旋糖苷溶液与十二烷基胺溶液混合所制备的右旋糖苷-亚油酸轭合物的亲水性和疏水性。
随后，在步骤a2-2)中，可以加入右旋糖苷、DCC和DMAP，以使得右旋糖苷：DCC：DMAP重量比是1：1.5～2：0.3～0.8。在这种情况中，DCC和DMAP可以它们每个溶解在DMSO中来加入。
在制备本发明的氧化铁纳米胶囊的方法(包括第一和第二实施方案)中，在步骤c)中，该缓冲剂溶液可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)，该有机非极性溶剂可以是氯仿。
封装材料的水溶液可以通过将封装材料与缓冲剂溶液以1：50～500的重量比混合来制备，并且纳米粒子分散的溶液可以通过将氧化铁纳米粒子与有机非极性溶剂以1：10～100的重量比混合来制备。
被单个纳米胶囊所包封的氧化铁纳米粒子的数量、纳米胶囊的平均粒径、纳米胶囊的粒径分布和氧化铁纳米粒子的聚集度是通过氧化铁纳米粒子的粒径和步骤d)的条件来控制的。
为了表现出适于造影剂的磁性能和使得MIR造影能力最大化，氧化铁纳米粒子的平均粒径(直径)优选是3～20nm。如上所述，该氧化铁纳米粒子是通过热分解铁络合物所制备的疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子，在该铁络合物中疏水性C4-C25有机酸根作为配体键合到作为中心原子的铁上。该铁络合物包括油酸铁络合物，并且该疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子包括油酸盐键合的氧化铁纳米粒子。
具体地，该氧化铁纳米粒子可以通过将铁络合物与包括油酸的脂肪族酸在300～350℃反应20～90分钟来制备。参见PCT/KR2005/004009，将更详细地描述制备氧化铁纳米粒子的方法。
为了降低被纳米胶囊所包封的氧化铁纳米粒子的数量偏差和通过纳米胶囊有效的包封氧化铁纳米粒子，在步骤d)中，可以将封装材料：氧化铁纳米粒子重量比为1：0.05～0.25的氧化铁纳米粒子分散的溶液滴入封装材料水溶液中。
为了将纳米胶囊的平均粒径控制在100～500nm的范围和为了制备具有非常均匀粒径的纳米胶囊，在步骤d)中，氧化铁纳米粒子分散的溶液可以0.1～3mL/min的滴加速率滴入到封装材料的水溶液中。
在步骤d)中，封装材料的水溶液是以20,000～30,000rpm的转速搅拌的。在这种情况中，优选将氧化铁纳米粒子分散的溶液滴入封装材料水溶液中，同时进行搅拌。
根据上述的制备氧化铁纳米胶囊的方法，能够制备这样的氧化铁纳米胶囊，在其每个中，平均粒径为5～20nm的疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子被羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料或者右旋糖苷-亚油酸轭合物封装材料包封，可以制备平均粒径为100～500nm，并且在含水溶剂中具有极其优异分散性的氧化铁纳米胶囊。
含有该氧化铁纳米胶囊的MRI造影剂适于肝脏造影剂。这些氧化铁纳米胶囊具有优异的肝脏选择性和非常优异的造影能力。
发明实施例
下文中，将参考下面的实施例来更详细地描述本发明。但是，本发明的范围不限于此。
[制备例1]制备10nm的氧化铁纳米粒子
将10.8g的氯化铁(III)六水合物(FeCl3·6H2O，40mmol)和36.5g的油酸钠(120mmol)溶解在含有80mL乙醇、60mL蒸馏水和140mL己烷的混合溶剂中以形成混合溶液，然后将该混合溶液加热到57℃，并且在57℃保持1小时。
在该过程中，在水相中初始深红的混合溶液变清，并且在有机相中初始透明的混合溶液变得微红。从该事实可以确定成功地合成了油酸铁络合物。
在反应完成后，将含有油酸铁络合物的有机层从混合溶液中分离，然后挥发己烷。结果，该混合溶液变成粘性液体。
将36g所合成的油酸铁络合物加入到200g十八碳烯和5.7g油酸的混合物中。将所形成的混合物以2.5℃/min的加热速率在真空中从室温加热到70℃，然后在70℃保持1小时以除去残留的溶剂和水，不包括反应物。
其后，将所形成的混合物以2.5℃/min的加热速率在氮气氛下加热到320℃，然后在320℃保持30分钟进行老化。在该过程中，反应剧烈进行，并且初始的红色溶液变成黑褐色。从该事实可以确定油酸铁络合物完全分解，且产生了氧化铁纳米粒子。
在反应完成后，当所得溶液的温度通过自然冷却降低到自燃温度或者更低(150℃)时，将所形成的含有氧化铁纳米粒子的溶液通过注入空气来氧化。结果，所得溶液冷却到室温，并且通过将体积比为1：5的己烷和丙酮混合溶液加入到该所得溶液中，以使得混合溶液的量是所得溶液体积的三倍，从而产生黑色沉淀物，然后将所产生的沉淀物使用离心机(rpm=2000)进行分离。
将该加入己烷和丙酮混合溶液并且离心分离的清洗方法重复至少2次，并且通过干燥除去所形成的溶液中剩余的己烷和丙酮，以制备油酸盐键合的氧化铁纳米粒子，其易于再分散到己烷中。
图1是所制备的氧化铁纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)照片。从图1中确定制备了平均直径为10nm的油酸盐键合的氧化铁纳米粒子，以及制备了具有均匀粒度的球形氧化铁纳米粒子。
[制备例2]制备11nm的氧化铁纳米粒子
氧化铁纳米粒子是使用与制备例1相同的反应条件来制备的，除了在合成过程中老化时间是1小时之外。
图2是所制备的氧化铁纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)照片。从图2中确定制备了平均直径为11nm的油酸盐键合的氧化铁纳米粒子，以及制备了具有均匀粒度的球形氧化铁纳米粒子。
[制备例3]制备15nm的氧化铁纳米粒子
氧化铁纳米粒子是使用与制备例1相同的反应条件来制备的，除了使用1-二十碳烯代替十八碳烯，并且在合成方法中老化是在330℃进行1小时。
图3是所制备的氧化铁纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)照片。从图3中确定制备了平均直径为15nm的油酸盐键合的氧化铁纳米粒子，并且确定制备了具有均匀粒度的球形氧化铁纳米粒子。
[实施例1]合成羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物
为了合成羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物，将5g的羧甲基右旋糖苷(平均分子量：14,000Da)完全溶解在20mL蒸馏水中，然后与250mL的二甲亚砜(DMSO)混合以制备羧甲基右旋糖苷溶液。此外，将1.4g(7.5mmol)的十二烷基胺和10mL的氯仿(CHCl3)与40mL的二甲亚砜(DMSO)混合以制备十二烷基胺溶液。
通过将十二烷基胺溶液滴入羧甲基右旋糖苷溶液中来将两种溶液彼此混合，然后将EDC溶液(在其中0.7g的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺)完全溶解在30ml的DMSO中)和NHS溶液(在其中0.35g的NHS(正-羟基琥珀酰亚胺)完全溶解在10mL的DMSO中)注入到混合溶液中。
其后，将所形成的混合溶液在室温搅拌24小时，然后使用滤纸进行过滤，然后将过量的乙醇加入到该过滤的混合溶液中以产生白色沉淀物。将这种白色沉淀物使用离心机(rpm=3000)分离。
将这种沉淀物分散在蒸馏水中，透析3天，然后冻干获得白色固体的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物。
图4显示了羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺两性聚合物复合材料的FT-IR分析结果。如图4所示，新的峰出现在1656cm-1和1593cm-1。这些新峰意味着酰胺键的C=O拉伸(酰胺I)和N-H变形(酰胺II)。此外，C-H拉伸峰出现在2933cm-1和2875cm-1。基于这些结果，可确定成功地合成了羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物。
[实施例2]使用羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物包封氧化铁纳米粒子
将实施例1合成的55mg的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物与25ml的PBS进行混合，然后超声波处理10分钟以获得封装材料的水溶液。此外，将制备例1所制备的11mg的平均粒度10nm的氧化铁纳米粒子分散在0.5mL的氯仿中，然后超声波处理10分钟以获得氧化铁纳米粒子分散的溶液。
将该氧化铁纳米粒子分散的溶液以1mL/min的滴加速度滴入封装材料水溶液(羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物溶液)中，同时使用均化器(rpm=26,000)将这些溶液彼此混合10分钟以形成纳米胶囊粒子。随后，使用真空蒸发器从含有该纳米胶囊粒子的溶液中除去氯仿。
图5是氧化铁纳米胶囊的TEM照片，在其每个中，经负染后，油酸盐键合的氧化铁纳米粒子被所制备的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料包封。从图5中可以确定氧化铁纳米粒子被包封，且多个氧化铁纳米粒子被单个纳米胶囊所包封。该纳米胶囊的粒径是通过动态光散射(DLS，由Melvern公司生产)来测量的。结果确定氧化铁纳米胶囊的平均粒度是150nm。
[实施例3]使用羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物包封氧化铁纳米粒子
除了是使用制备例2所制备的平均粒度11nm的氧化铁纳米粒子之外，纳米胶囊粒子是以与实施例2相同的方式来制备的。图6是实施例3所制备的氧化铁纳米胶囊的TEM照片。所制备的氧化铁纳米胶囊的平均粒度是144nm。
[实施例4]使用羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物包封氧化铁纳米粒子
除了使用制备例3所制备的平均粒度15nm的氧化铁纳米粒子之外，纳米胶囊粒子是以与实施例2相同的方式来制备的。图7是实施例4所制备的氧化铁纳米胶囊的TEM照片。所制备的氧化铁纳米胶囊的平均粒度是188nm。
[实施例5]测量氧化铁纳米胶囊的活体外磁共振弛豫率
将实施例2、3和4所制备的纳米胶囊分别分散在PBS中以形成纳米胶囊浓度为0.36μg/mL的纳米胶囊溶液、纳米胶囊浓度为0.19μg/mL的纳米胶囊溶液和纳米胶囊浓度为0.12μg/mL的纳米胶囊溶液。然后，对于每个样品，制备了具有彼此不同的纳米胶囊浓度的五个纳米胶囊溶液，然后使用4.7T磁共振成像设备(Biospec47/40，Bruker Biospin MRI GmbH)测量这些纳米胶囊溶液的在体磁共振弛豫率。此外，使用MSME(Multi Slice Multi Echo序列)测量了其的T2弛豫时间，其详细参数如下表1中所示。
(表1)
分类 参数 备注
TR(重复时间) 10,000ms
TE(回声时间) 8～2,048ms 在8ms间隔256次
FOV 60×40mm
分辨率 0.234×0.156mm/象素
图8显示了测量包封有粒度10nm的氧化铁纳米粒子的氧化铁纳米胶囊的R2弛豫率结果。从图8中可看出，其R2弛豫率是298mM-1s-1。图9显示了测量包封有粒度11nm的氧化铁纳米粒子的氧化铁纳米胶囊的R2弛豫率结果。从图8中可看出，其R2弛豫率是316mM-1s-1。图10显示了测量包封有粒度15nm的氧化铁纳米粒子的氧化铁纳米胶囊的R2弛豫率结果。从图8中可看出，其R2弛豫率是340mM-1s-1。
[实施例6]测量氧化铁纳米胶囊的在体磁共振弛豫率
为了测量羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺两性聚合物纳米胶囊包封的氧化铁纳米粒子的磁共振成像肝脏造影剂的性能，使用BGA12梯度线圈的4.7T磁共振成像设备(Biospec47/40，Bruker Biospin MRIGmbH)测量了这种纳米胶囊的在体T2弛豫率。
用于测试的小鼠是重量为大约20～25g的雄性Balb/c小鼠。将该小鼠麻醉，然后水平放入MRI设备中，然后观察小鼠的冠状面(coronalplane)。此外，为了观察肝脏组织，将小鼠在整个测试周期中麻醉，并因此保持使得它不移动。
通过ICP-AES分析铁在氧化铁纳米胶囊中的浓度，然后将200μL的溶液通过尾部静脉注入到小鼠中，然后进行测试，在考虑到小鼠的重量下使得溶液的最终浓度是1mg Fe/kg。使用RARE(具有再聚焦回声的快速采集)测量了其T2弛豫时间，其详细参数如下表2中所示。
(表2)
分类 参数 备注
TR(重复时间) 3,500ms
TE(回声时间) 36ms 在8ms间隔256次
FOV 60×40mm
分辨率 0.234×0.156mm/象素
切片厚度 1mm
为了定量评价通过在羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料中包封氧化铁纳米粒子所形成的氧化铁纳米胶囊的T2衰减，选择肝脏组织的一个区域作为ROI(目标领域)，并且分析其信号强度(SI)。为了使得所获得的信号强度的可靠性最大，将1wt%的琼脂糖溶液加入到200μL管中，然后进行冷却来固化，然后将固化的琼脂糖固定到用作对照组的小鼠腹腔周围。
图11显示当将实施例2所制备的氧化铁纳米胶囊用作造影剂时的在体磁共振图像。将造影剂注入之前的图像与造影剂注入之后的图像进行比较，可以确定小鼠肝脏的颜色变成了黑色。结果，可以证实通过在羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺两性封装材料中包封氧化铁纳米粒子所形成的氧化铁纳米胶囊可以用作肝脏造影剂。
图12显示了氧化铁纳米胶囊的弛豫率，其是通过将实施例12的氧化铁纳米胶囊用作造影剂时，使用在体磁共振成像测量肝脏所获得的图像的信号值进行数字化来获得的。图12中显示ΔR2的值是47～60%。
[对比例1]使用羧甲基右旋糖苷包封氧化铁纳米粒子
将120mg的平均粒度为10nm的氧化铁纳米粒子分散在20mL的己烷中，放入反应器中，然后搅拌以获得氧化铁纳米粒子溶液。将20mg的羧甲基右旋糖苷溶解在20mL的蒸馏水中以获得羧甲基右旋糖苷溶液。当羧甲基右旋糖苷溶液滴入氧化铁纳米粒子溶液，然后将该混合溶液在50℃搅拌1小时后，该混合溶液的己烷层中存在的氧化铁纳米粒子经羧甲基右旋糖苷亲水化后移动到其水层，这样己烷层变透明且水层变成褐色，其是氧化铁纳米粒子的颜色。将蒸馏水和乙醇加入到该混合溶液中，然后使用离心机形成沉淀物，然后用透射电子显微镜(TEM)观察是否产生了纳米胶囊粒子。
图13是以此方式制备的羧甲基右旋糖苷-氧化铁纳米粒子的TEM照片。如图13所示，该羧甲基右旋糖苷-氧化铁纳米粒子发生聚结，而没有被包封。
从这个结果，可以推断当仅仅使用羧甲基右旋糖苷(其是一种亲水性材料)而不使用两性材料时，不会形成纳米胶囊粒子。
[对比例2]使用羧甲基右旋糖苷包封经表面活性剂亲水化的氧化铁纳米粒子
将3g的SDS(十二烷基硫酸钠)溶解在18mL的蒸馏水中，然后将该SDS溶液与溶解了0.03g的氧化铁纳米粒子的3mL氯仿溶液混合。随后，使用真空蒸发器从该混合溶液中蒸发氯仿以获得表面活性剂包覆的氧化铁纳米粒子分散的溶液。将0.01g的羧甲基右旋糖苷溶解在5mL蒸馏水中，然后滴入该表面活性剂包覆的氧化铁纳米粒子分散的溶液中。将所形成的混合溶液在50℃搅拌1小时，然后将蒸馏水和乙醇加入到该溶液中，然后使用离心机形成沉淀物。为了准确观察聚合物，通过TEM观察粒子形状。
图14是以此方式所制备的羧甲基右旋糖苷-氧化铁纳米粒子的TEM照片。从图14中可以确定氧化铁纳米粒子被包封，因为图14的白色部分代表羧甲基右旋糖苷。然而，当使用表面活性剂而非两性分子将氧化铁纳米粒子亲水化后包封时，存在着难以控制粒子粒径的问题，并且粒子的分散稳定性变差。
[实施例7]合成右旋糖苷-亚油酸两性轭合物
为了合成右旋糖苷-亚油酸轭合物，通过将0.8g的右旋糖苷(平均分子量：10000)完全溶解在50mL的DMSO中来制备右旋糖苷溶液，通过将2.212mL(7.0mmol)完全溶解在20mL的DMSO中以制备亚油酸溶液。通过将亚油酸溶液滴入右旋糖苷溶液中将这两种溶液彼此混合，然后向该混合溶液中加入其中1.12mL(7.0mmol)的DCC(n,n’-二环己基碳二亚胺)溶解在20mL的DMSO中的溶液和0.44g(3.5mmol)的DMAP(二甲氨基吡啶)溶解在20mL的DMSO中的溶液。将所形成的混合溶液在25℃反应24小时。
其后，将所形成的混合溶液使用滤纸进行过滤，然后将过量的以1：2的比例混合的甲醇和乙腈混合溶液加入到该过滤的混合溶液中，以产生浅黄色沉淀物。将这种浅黄色沉淀物用以1：2的比例混合的甲醇和乙腈的混合溶液洗涤，然后干燥3次获得白色固体物质。将这种白色固体物质溶解在蒸馏水中，透析，冻干以获得固体右旋糖苷-亚油酸轭合物。
图15显示了固体右旋糖苷-亚油酸轭合物的FT-IR分析结果。可以看到酯基峰出现在1745cm-1。基于这个结果，可以确定成功地合成了右旋糖苷-亚油酸轭合物。
[实施例8]使用右旋糖苷-亚油酸轭合物包封氧化铁纳米粒子
将220mg实施例7所合成的右旋糖苷-亚油酸轭合物和25mlPBS进行混合，然后超声处理10分钟以获得封装材料的水溶液。此外，将22mg的制备例1所制备的平均粒度为10nm的氧化铁纳米粒子分散在0.5mL的氯仿中，然后超声处理10分钟以获得氧化铁纳米粒子分散的溶液。将该氧化铁纳米粒子分散的溶液以1mL/min的滴加速率滴入封装材料水溶液(右旋糖苷-亚油酸轭合物溶液)中，同时使用均化器(rpm=26,000)将这些溶液彼此混合10分钟以形成纳米胶囊粒子。
图16是氧化铁纳米胶囊的TEM照片，在其每个中，多个氧化铁纳米粒子在负染后聚结的状态下被制得的右旋糖苷-亚油酸轭合物封装材料所包封。从图16中可以确定氧化铁纳米粒子被包封。纳米胶囊的粒径是通过动态光散射(DLS)来测量的。结果，可以确定氧化铁纳米胶囊的平均粒度是155nm。
[实施例9]测量氧化铁纳米胶囊的在体磁共振弛豫率
为了测量通过右旋糖苷-亚油酸轭合物纳米胶囊包封的氧化铁纳米粒子的磁共振成像肝脏造影剂的性能，以与实施例6相同的方式，使用BGA12梯度线圈的4.7T磁共振成像设备(Biospec47/40，BrukerBiospin MRI GmbH)测量了该纳米胶囊的在体T2弛豫率。
图17表示使用氧化铁纳米胶囊的在体磁共振图像。将造影剂注入之前的图像与造影剂注入之后的图像进行比较，可以确定小鼠肝脏的颜色变成了黑色。结果，可以证实通过在右旋糖苷-亚油酸轭合物纳米胶囊中包封氧化铁纳米粒子所形成的氧化铁纳米胶囊可以用作肝脏造影剂。
图18显示了氧化铁纳米胶囊的弛豫率，其是通过对使用在体磁共振成像所测量的肝脏获得的图像的信号值进行数字化来获得的。图18显示ΔR2值是35～45%。
[对比例3]使用右旋糖苷包封氧化铁纳米粒子
除了使用分子量10,000的右旋糖苷之外，该测试以与对比例1相同的方式来进行。
图19是以此方式制备的右旋糖苷-氧化铁纳米粒子的TEM照片。如图19所示，该右旋糖苷-氧化铁纳米粒子发生聚结而没有被包封。从这个结果，可以推断当仅仅使用右旋糖苷(其是一种亲水性材料)而不使用两性材料时，不会形成纳米胶囊粒子。
如上所述，虽然出于说明的目的公开了本发明优选的实施方案，但是本领域技术人员会理解不同的改变、增加和替代是可能的，而不脱离所附权利要求所公开的本发明的范围和主旨。
所以，本发明简单的改变、增加和替代属于本发明的范围，并且本发明具体的范围将明确定义在所附权利要求中。

Claims (20)

1.一种制备氧化铁纳米胶囊的方法，其包括以下步骤：
热分解铁络合物以制备疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子；和
通过羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料或者右旋糖苷-亚油酸轭合物封装材料包封该疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子以形成氧化铁纳米胶囊。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤：
a)制备下述式1所表示的羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物封装材料或者下述式2所表示的右旋糖苷-亚油酸轭合物封装材料；
b)热分解铁络合物以制备疏水性配体键合的氧化铁纳米粒子，在所述铁络合物中疏水性C4-C25有机酸根作为配体键合到作为中心原子的铁上；
c)将所述的封装材料溶解在缓冲剂溶液中以制备封装材料的水溶液，并且将氧化铁纳米粒子分散在有机非极性溶剂中以制备纳米粒子分散的溶液；
d)将该纳米粒子分散的溶液滴入封装材料水溶液中，并且搅拌该封装材料水溶液和该纳米粒子分散的溶液的混合溶液以制备氧化铁纳米胶囊分散的溶液，在该溶液中分散有氧化铁纳米胶囊，每个胶囊包封了多个氧化铁纳米粒子；和
e)通过挥发从该氧化铁纳米胶囊分散的溶液中除去有机非极性溶剂以制备水分散的氧化铁纳米胶囊溶液，
[式1]
Figure FDA00002869080300021
其中R是H或者CH2COOH，且n是1-5000的整数，
[式2]
Figure FDA00002869080300022
其中x是1-1000的整数，且y是1-1000的整数。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述封装材料是羧甲基右旋糖苷-十二烷基胺轭合物，且步骤a)包括以下步骤：
a1-1)将羧甲基右旋糖苷溶液与十二烷基胺溶液混合以形成第一混合溶液；
a1-2)将1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)和正羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入所述第一混合溶液中以形成第二混合溶液；和
a1-3)透析、冻干所述第二混合溶液。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述封装材料是右旋糖苷-亚油酸轭合物，且步骤a)包括以下步骤：
a2-1)将右旋糖苷溶液和亚油酸溶液混合以形成第一混合溶液；
a2-2)将n,n’-二环己基碳二亚胺(DCC)和二甲氨基吡啶(DMAP)加入所述第一混合溶液中以形成第二混合溶液；和
a2-3)透析、冻干所述第二混合溶液。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述羧甲基右旋糖苷的平均分子量是500-1,000,000Da。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述羧甲基右旋糖苷溶液是将二甲亚砜(DMSO)加入到羧甲基右旋糖苷水溶液中制备的，在该羧甲基右旋糖苷水溶液中羧甲基右旋糖苷与水以1：3～5的重量比混合，且二甲亚砜(DMSO)的加入量以重量计是羧甲基右旋糖苷水溶液中水的10-15倍。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述十二烷基胺溶液包含重量混合比为1：8～12：25～35的十二烷基胺、氯仿和二甲亚砜(DMSO)。
8.根据权利要求7所述的方法，其中将羧甲基右旋糖苷溶液与十二烷基胺溶液混合，以使得十二烷基胺：羧甲基右旋糖苷的重量比是1：1～10。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所加入的十二烷基胺、EDC和NHS重量比是十二烷基胺：EDC：NHS为1：0.3～0.7：0.1～0.4。
10.根据权利要求所述4的方法，其中该右旋糖苷的平均分子量是100-150,000Da。
11.根据权利要求4所述的方法，其中所述右旋糖苷溶液是这样的溶液，在其中右旋糖苷与二甲亚砜(DMSO)混合的重量比是1：50～80，且所述亚油酸溶液是这样的溶液，在其中亚油酸与二甲亚砜(DMSO)混合的重量比是1：8～14。
12.根据权利要求11所述的方法，其中将右旋糖苷溶液与亚油酸溶液混合，以使得右旋糖苷：亚油酸的重量比为1：2～5。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所加入的右旋糖苷、DCC和DMAP重量比是右旋糖苷：DCC：DMAP为1：1.5～2：0.3～0.8。
14.根据权利要求2的方法，其中在步骤c)中，缓冲剂溶液是磷酸盐缓冲的盐水(PBS)，且所述有机非极性溶剂是氯仿。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在步骤d)中，将封装材料：氧化铁纳米粒子重量比为1：0.05的氧化铁纳米粒子分散的溶液滴入到封装材料的水溶液中。
16.根据权利要求15所述的方法，其中在步骤d)中，将氧化铁纳米粒子分散的溶液以0.1～3mL/min的滴加速率滴入到封装材料的水溶液中。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述封装材料的水溶液是这样的溶液，在其中封装材料与缓冲剂溶液以1：50～500的重量比混合，且该纳米粒子分散的溶液是这样的溶液，在其中氧化铁纳米粒子与有机非极性溶剂以1：10～100的重量比混合。
18.根据权利要求16所述的方法，其中在步骤d)中，将封装材料的水溶液以20000～30000rpm的转速搅拌。
19.一种氧化铁纳米胶囊，其是通过权利要求1-18中任一项所述的方法来制备的。
20.一种磁共振成像(MRI)造影剂，其包含通过权利要求1-18中任一项所述的方法来制备的氧化铁纳米胶囊。
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