JP5683962B2 - アミノトランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼの核酸およびポリペプチドおよび使用方法 - Google Patents

アミノトランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼの核酸およびポリペプチドおよび使用方法 Download PDF

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Description

（出典明示による組み込み）
配列表は、ＰＣＴ ＡＩ§８０１（ａ）のもと本出願の出願と同時に提出されている。07_0245WO01seq.txtと同一である添付の配列表は、出典明示により本明細書の一部とされる。
付属物Ｉは、ＰＣＴ ＡＩ§８０１（ａ）のもと本出願の出願と同時に提出されている。07_0245WO01app.txtと同一である添付の付属物は、配列表に関連する表であり、出典明示により本明細書の一部とされる。
（関連出願の相互参照）
本出願は、出典明示によりその全部が本明細書の一部とされる２００８年１月３日に出願された米国特許出願第６１／０１８，８１４号に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）のもとで優先権の利益を主張する。
（技術の分野）
本発明は、核酸およびポリペプチドに関し、より詳細にはアミノトランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼをコードする核酸およびポリペプチドに関し、ならびに該アミノトランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼを使用する方法に関する。
（背景）
アミノトランスフェラーゼ酵素は、アミノ酸とアルファ-ケト酸との間のアミノ基転位反応を触媒する。アルファ-アミノトランスフェラーゼは、アミノ酸からアミノ基を除去する反応を触媒し、アルファ-ケト酸を形成し、そしてアミノ基を反応物のα−ケト酸に転移させ、ケト酸をアミノ酸に転換する。従って、アミノトランスフェラーゼはアミノ酸の産生に有用である。
脱水酵素などのオキシドレダクターゼ酵素は、１個またはそれを超えるプロトンや電子対を受容体に転移させる（例えば電子を還元体から酸化体に転移させる）ことにより基質を酸化させる反応を触媒する。従って、オキシドレダクターゼは、アミノ酸の酸化的脱アミノを触媒してケト酸にする又はケト酸の還元的アミノを触媒してアミノ酸にする際に有用である。
米国出願第６１／０１８，８１４号
（要約）
この開示は、相当数の様々なアミノトランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼポリペプチド、ならびにそのようなアミノトランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼポリペプチドをコードする核酸を提供する。この開示は、そのようなアミノトランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼの核酸およびポリペプチドを使用する方法もまた提供する。
１つの態様において、本発明は、トリプトファンをインドール−３−ピルベートに（あるいは、インドール−３−ピルベートをトリプトファンに）転換する方法を提供する。該方法は、トリプトファン（またはインドール−３−ピルベート）を、ａ）アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ）またはオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 535, 537, 539, 541, 543, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 559, 561, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 651, 653, 655, 657, 659, 661, 663, 665, 667, 669, 671, 673, 675, 677, 679, 681, 683, 685, 687, 689, 691, 693, 695, 697, 699, 701, 703, 705, 707, 709, 711, 713, 715, 716, 719, 721, 723, 725, 727, 729, 731, 733, 735, 737, 739, 741, 743, 745, 747, 749, 751, 753, 755, 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144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 220 G240N, 220 T241N, 表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 870 T242N, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974, 976, 1069, 1070, 1071, 1072および1073からなる群より選択される１つまたはそれを超えるポリペプチド；ｅ）ＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有するｄ）のバリアント；あるいは、ｆ）ＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有するｄ）またはｅ）の断片、と合することを含む。
他の態様において、本発明は、ＭＰをモナチン（monatin）に（あるいは、モナチンをＭＰに）転換する方法を提供する。該方法は、通常、ＭＰ（またはモナチン）を、a）アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ）またはオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 535, 537, 539, 541, 543, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 559, 561, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 651, 653, 655, 657, 659, 661, 663, 665, 667, 669, 671, 673, 675, 677, 679, 681, 683, 685, 687, 689, 691, 693, 695, 697, 699, 701, 703, 705, 707, 709, 711, 713, 715, 716, 719, 721, 723, 725, 727, 729, 731, 733, 735, 737, 739, 741, 743, 745, 747, 749, 751, 753, 755, 757, 759, 761, 763, 765, 767, 769, 771, 773, 775, 777, 779, 781, 783, 785, 787, 789, 791, 793, 795, 797, 799, 801, 803, 805, 807, 809, 811, 813, 815, 817, 819, 821, 823, 825, 827, 829, 831, 833, 835, 837, 839, 841, 843, 845, 847, 849, 851, 853, 855, 857, 859, 861, 863, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 961, 963, 965, 967, 969, 971, 973および975からなる群より選択される１つまたはそれを超える核酸分子；ｂ）ＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするａ）のバリアント；ｃ）ＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするａ）またはｂ）の断片；ｄ）ＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有する、配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 220 G240N, 220 T241N,表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 870 T242N, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974, 976, 1069, 1070, 1071, 1072および1073からなる群より選択される１つまたはそれを超えるポリペプチド；ｅ）ＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有するｄ）のバリアント；あるいは、ｆ）ＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有するｄ）またはｅ）の断片、と合することを含む。
１つの実施形態において、１つまたはそれを超える核酸分子は、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 969, 971, 973および975からなる群より選択される。他の実施形態において、１つまたはそれを超えるポリペプチドは、配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 220 G240N, 220 T241N,表４３および表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 866, 868, 870, 870 T242N, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 970, 972, 974および976からなる群より選択される。
特定の実施形態において、核酸分子は、配列番号：９４５、８９１、８９３、２１９、１７５、１０６３、１０６５および１０６７からなる群より選択される配列を有する。特定の実施形態において、ポリペプチドは配列番号：９４６、８９２、８９４、２２０、１７６、１０６４、１０６６および１０６８からなる群より選択される配列を有する。特定の実施形態において、ポリペプチドは配列番号：１０６９または１０７０で示されるコンセンサス配列に相当する配列を有する。特定の実施形態において、ポリペプチドは配列番号：１０７１、１０７２および１０７３で示されるコンセンサス配列に相当する配列を有する。
いくつかの実施形態において、バリアントは、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 969, 971, 973および975と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％）の配列同一性を有する核酸分子である。
いくつかの実施形態において、バリアントは、配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 220 G240N, 220 T241N, 表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 866, 868, 870, 870 T242N, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 970, 972, 974および976と、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％）の配列同一性を有するポリペプチドである。
１つの実施形態において、バリアントは配列番号：２２０と少なくとも６５％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％）の配列同一性を有するポリペプチドである。他の実施形態において、バリアントは配列番号：８７０と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％）の配列同一性を有するポリペプチドである。さらなる他の実施形態において、バリアントは配列番号：８９４と少なくとも６５％（例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％）の配列同一性を有するポリペプチドである。
特定の実施形態において、バリアントは変異体である。代表的な変異体は、限定するものではないが、ＤＡＴ４９７８の残基２４３に対応する残基での突然変異（例えば、配列番号：８７０でのＴ２４２Ｎ、配列番号：２２０ではＧ２４０Ｎまたは配列番号：２２０でのＴ２４１Ｎ）を有する変異体を含む。１つの実施形態において、バリアントは、コドンが最適化された核酸分子である。特定の実施形態において、バリアントポリペプチドはキメラポリペプチドである。
特定の実施形態において、核酸分子は発現ベクター中に含まれており、例えば過剰発現されることがあってよい。特定の実施形態において、アミノトランスフェラーゼまたはオキシドレダクターゼポリペプチドは、固体担体上に固定される。特定の実施形態において、トリプトファンまたはＭＰは、置換されたトリプトファンまたは置換されたＭＰである。代表的なトリプトファンは、６−クロロ−Ｄ−トリプトファンである。
他の態様において、本発明はトリプトファンをインドール−３−ピルベート（あるいは、インドール−３−ピルベートをトリプトファン）に転換する方法を提供する。該方法は、典型的には、トリプトファン（またはインドール−３−ピルベート）を、ａ）Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＤＡＴ）活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 969, 971, 973および975からなる群より選択される１つまたはそれを超える核酸分子；ｂ）ＤＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするａ）のバリアント；ｃ）ＤＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするa）またはｂ）の断片；ｄ）ＤＡＴ活性を有する配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 220 G240N, 220 T241N, 表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 866, 868, 870, 870 T242N, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 970, 972, 974, 976, 1069, 1070, 1071, 1072および1073からなる群より選択される１つまたはそれを超えるポリペプチド；ｅ）ＤＡＴ活性を有するｄ）のバリアント；あるいは、ｆ）ＤＡＴ活性を有するｄ）またはｅ）の断片、と合することを含む。
さらなる他の態様において、本発明はＭＰをモナチン（あるいは、モナチンをＭＰ）に転換する方法を提供する。該方法は、一般に、ＭＰ（またはモナチン）を、ａ）ＤＡＴ活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 969, 971, 973および975からなる群より選択される１つまたはそれを超える核酸分子；ｂ）ＤＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするａ）のバリアント；ｃ）ＤＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするａ）またはｂ）の断片；ｄ）ＤＡＴ活性を有する、配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 220 G240N, 220 T241N, 表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 866, 868, 870, 870 T242N, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 970, 972, 974, 976, 1069, 1070, 1071, 1072および1073からなる群より選択される１つまたはそれを超えるポリペプチド；ｅ）ＤＡＴ活性を有するｄ）のバリアント；あるいは、ｆ）ＤＡＴ活性を有するｄ）またはｅ）の断片、と合することを含む。
特定の実施形態において、核酸分子またはポリペプチドは、配列番号：９４５、８９１、８９３、２１９、１７５、１０６３、１０６５および１０６７からなる群より選択される配列を有する。特定の実施形態において、ポリペプチドは配列番号：１０６９、１０７０、１０７１、１０７２または１０７３で示されるコンセンサス配列に相当する配列を有する。いくつかの実施形態において、トリプトファンまたはＭＰは、置換されたトリプトファンまたは置換されたＭＰである。代表的な置換されたトリプトファンは６−クロロ−Ｄ−トリプトファンである。
さらなる他の態様において、本発明は、モナチンを作製する方法を提供する。一般に、該方法は、トリプトファンを、モナチンが産生される条件下でＣ３炭素源およびａ）Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＤＡＴ）活性を有するポリペプチドをコードする、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 969, 971, 973および975からなる群より選択される１つまたはそれを超える核酸分子；ＤＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするａ）のバリアント；ｃ）ＤＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするａ）またはｂ）の断片；ｄ）ＤＡＴ活性を有する、配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 220 G240N, 220 T241N,表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 866, 868, 870, 870 T242N, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 970, 972, 974, 976, 1069, 1070, 1071, 1072および1073からなる群より選択される１つまたはそれを超えるポリペプチド；ｅ）ＤＡＴ活性を有するｄ）のバリアント；あるいは、ｆ）ＤＡＴ活性を有するｄ）またはｅ）の断片、と接触させることを含む。
いくつかの実施形態において、核酸分子は、配列番号：９４５、８９１、８９３、２１９、１７５、１０６３、１０６５および１０６７からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、Ｃ３炭素源は、ピルベート、オキザロアセテートおよびセリンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、本方法は、シンターゼ／リアーゼ（ＥＣ４．１．２．−または４．１．３．−）ポリペプチドを加えること又は含めることをさらに含む。代表的なシンターゼ／リアーゼ（ＥＣ４．１．２．−または４．１．３．−）ポリペプチドは、アルドラーゼ、例えばＫＨＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）またはＨＭＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）を含む。
上記方法のいくつかの実施形態において、産生されるモナチンはＲ，Ｒモナチンである。いくつかの実施形態において、産生されるモナチンはＳ，Ｒモナチンである。特定の実施形態において、トリプトファンは、置換されたトリプトファン、例えば６−クロロ−Ｄ−トリプトファンである。
特に定義しない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者により共通して理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と類似の若しくは均等な方法および材料を本発明の実地においてまたは本発明を試験する際に用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。加えて、材料、方法および実施例は単なる例示であって、限定を意味するものではない。本明細書中で言及する刊行物、特許出願、特許および他の参考文献はすべて、出典明示によりその全体を本明細書の一部とする。不一致がある場合には、定義を含む本願明細書により調整されよう。
本発明の１つまたはそれを超える実施形態の詳細を、添付の図面および以下の記載中で説明する。本発明の別の特徴、目的および利点は、図面および詳細な説明から、さらに、特許請求の範囲から明らかとなろう。
図１は、配列番号：８９４、１０６６、１０６４および１０６８のアライメントである。 図２は、配列番号：８７０、９１０およびいくつかのバシラス属（Bacillus）の配列のアライメントである。配列番号：８７０の新規な部分に対するコンセンサス配列ＡおよびＢ（それぞれ、配列番号：１０６９および１０７０）は、このアライメントから作り出された。 図３は、配列番号：９４６、８９４、８９２、２２０、１７６、１０６４、１０６６および１０６８のアライメントである。コンセンサス配列Ｃ、ＤおよびＥ（それぞれ、配列番号：１０７１、１０７２および１０７３）は、このアライメントから作り出された。 図４は、以下で詳細に記載するように、番号付けされた残基がＴＭＣＡＳＭ進化（evolution）について選択された複数の部位を示す３ＤＡＡ−Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼのモデルである。 さまざまな図面において類似の参照符号は、同様のエレメントを示す。
（詳しい説明）
本明細書で開示するものは、アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ）活性（例えばアミノ基転移酵素活性）を有するポリペプチドをコードする相当数の異なる核酸分子である。具体的に開示されるものは、多くのＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＤＡＴ）である。ＤＡＴは、アミノ基転移反応（例えば、Ｄ−アラニン＋２−オキソグルタレート ＜＝＞ ピルベート＋Ｄ−グルタメート）を触媒する。さらに、オキシドレダクターゼ活性（例えばデヒドロゲナーゼ活性）を有するポリペプチドをコードする相当数の異なる核酸分子を提供する。オキシドレダクターゼ、例えばデヒドロゲナーゼは酸化還元反応（例えば、Ｄ−アミノ酸＋Ｈ２Ｏ＋アクセプタ ＜＝＞ ２−オキソ酸＋ＮＨ３＋還元型アクセプタ）を触媒する。本明細書中で開示する核酸またはポリペプチドは、トリプトファンをインドール−３−ピルベートおよび／または２−ヒドロキシ２−（インドール−３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（「モナチン前駆体」または「ＭＰ」）をモナチンに転換するのに用いることができる。
単離した核酸分子および精製されたポリペプチド
本発明は、部分的に、アミノトランスフェラーゼ（ＡＴ）活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の同定に基づいており、必要に応じて、本明細書中では「ＡＴ」核酸分子またはポリペプチドとも称する。本発明はまた、部分的にオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の同定に基づいており、必要に応じて、本明細書中では「オキシドレダクターゼ」核酸分子またはポリペプチドとも称する。
本明細書に記載の特定の核酸分子は、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 535, 537, 539, 541, 543, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 559, 561, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 651, 653, 655, 657, 659, 661, 663, 665, 667, 669, 671, 673, 675, 677, 679, 681, 683, 685, 687, 689, 691, 693, 695, 697, 699, 701, 703, 705, 707, 709, 711, 713, 715, 716, 719, 721, 723, 725, 727, 729, 731, 733, 735, 737, 739, 741, 743, 745, 747, 749, 751, 753, 755, 757, 759, 761, 763, 765, 767, 769, 771, 773, 775, 777, 779, 781, 783, 785, 787, 789, 791, 793, 795, 797, 799, 801, 803, 805, 807, 809, 811, 813, 815, 817, 819, 821, 823, 825, 827, 829, 831, 833, 835, 837, 839, 841, 843, 845, 847, 849, 851, 853, 855, 857, 859, 861, 863, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 961, 963, 965, 967, 969, 971, 973および975で示される配列を含む。本明細書中で用いられるように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、ヌクレオチドアナログを用いて生成されたＤＮＡアナログまたはＲＮＡアナログを含みうる。本発明の核酸分子は、その意図される使用に応じて、一本鎖または二本鎖であってよい。
本発明の核酸分子は、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 535, 537, 539, 541, 543, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 559, 561, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 651, 653, 655, 657, 659, 661, 663, 665, 667, 669, 671, 673, 675, 677, 679, 681, 683, 685, 687, 689, 691, 693, 695, 697, 699, 701, 703, 705, 707, 709, 711, 713, 715, 716, 719, 721, 723, 725, 727, 729, 731, 733, 735, 737, 739, 741, 743, 745, 747, 749, 751, 753, 755, 757, 759, 761, 763, 765, 767, 769, 771, 773, 775, 777, 779, 781, 783, 785, 787, 789, 791, 793, 795, 797, 799, 801, 803, 805, 807, 809, 811, 813, 815, 817, 819, 821, 823, 825, 827, 829, 831, 833, 835, 837, 839, 841, 843, 845, 847, 849, 851, 853, 855, 857, 859, 861, 863, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 961, 963, 965, 967, 969, 971, 973および975、ならびに機能的なＡＴ活性またはオキシドレダクターゼ活性を有する配列のいずれかと、少なくとも７５％の配列同一性（例えば８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性）を有する分子を含む。
配列同一性のパーセントを計算するにあたって、２つの配列を整列させ、その２つの配列の間の核酸またはアミノ酸残基の完全な一致の数を決定する。その完全に一致した数を、整列させた領域の長さ（すなわち、整列させたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で割り、１００を乗じることで配列同一性のパーセント値とする。整列させた領域の長さは、一方または両方の配列の一部であり、最大で最も短い配列の全長のサイズまででありうることは正しく理解されるであろう。ある単一の配列を異なる別の配列と整列させることもでき、それ故、整列させた各配列によって異なる配列同一性のパーセント値を有しうることは正しく理解されるであろう。この同一性のパーセント値は通常四捨五入され最も近い整数となっていることに注意すべきである。例えば、７８．１％、７８．２％、７８．３％および７８．４％は７８％に切り捨てられ、一方で７８．５％、７８．６％、７８．７％、７８．８％および７８．９％は７９％に切り上げられる。また、整列させた領域の長さは常に整数であることにも注意すべきである。
配列同一性のパーセントを決定するための２つまたはそれを超える配列のアライメントは、ワールドワイドウェブ上のncbi.nlm.nih.govで入手できるＢＬＡＳＴ（basic local alignment search tool）プログラムに組み込まれているもののような、Altschulら、(1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402)により記載されたアルゴリズムを用いて実施される。ＢＬＡＳＴ検索を実施して、Altschulら、のアルゴリズムを用いて本明細書に記載の整列させたＡＴ核酸分子と他のいずれかの配列またはその部分との間の配列同一性のパーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列間の同一性を整列させて比較するために用いられるプログラムであるのに対して、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列間の同一性を整列させて比較するために用いられるプログラムである。本発明の配列と他の配列との間の同一性のパーセントを計算するためにＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、個々のプログラムの初期設定パラメータが用いられる。
本発明の核酸分子、例えば、約１０ヌクレオチド長から約５０ヌクレオチド長の間の核酸分子を用いて、標準的な増幅条件下で、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子を増幅することができる。ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸の増幅は、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子の有無を決定することを目的としてもよいし、あるいはＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子を得る（例えば、クローニングする）ことを目的としてもよい。本明細書中で用いられるように、標準的な増幅条件は、増幅反応混合物の基本的な成分、ならびに鋳型の核酸を変性させること、その鋳型核酸にオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせること、およびポリメラーゼによるプライマー伸長により増幅産物を得ることからなる複数のサイクルを含む繰り返し条件を意味する（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号；第４，６８３，２０２号；第４，８００，１５９号；および第４，９６５，１８８号を参照のこと）。増幅反応混合物の基本的な成分は、通常、例えば４種のデオキシヌクレオシド三リン酸塩（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、またはそのアナログ）、オリゴヌクレオチドプライマー、鋳型核酸、およびポリメラーゼ酵素をそれぞれ含む。鋳型核酸は典型的には少なくとも約９０℃の温度で変性され、プライマーによる伸長は典型的には少なくとも約７２℃の温度で行われる。加えて、初期のＰＣＲ法の変法（アンカーＰＣＲ、ＲＡＣＥ ＰＣＲ、またはライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ））が開発され、当分野で既知である。例えば、Landegranら、1988, Science, 241:1077-1080;およびNakazawaら、1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:360-364を参照のこと。
アニーリング温度を用いて、増幅の特異性を調節することができる。プライマーが鋳型核酸にアニールする温度は、各プライマーのＴｍよりも低くなければならないが、プライマーが鋳型核酸に非特異的にアニーリングすることを避けるのに十分高くなければならない。Ｔｍは、ＤＮＡ二本鎖の半分を一本鎖に分離させる温度であり、Sambrookら、の１１．４６節（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York）の１１．４６節において提供される公式を用いてオリゴヌクレオチドプライマーに対して予測することができる。非特異的な増幅産物は、正確な増幅産物について期待されるサイズではないゲル上のバンドとして検出される。
本発明の核酸分子は、例えば、約１０ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長（最大で数千ヌクレオチド長）の核酸分子を用いて、標準的なハイブリダイゼーション条件下で、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子とハイブリダイズさせることができる。ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子に対するハイブリダイゼーションは、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子を検出することまたは得ることを目的としてもよい。本明細書で用いられるように核酸分子間の標準的なハイブリダイゼーション条件は、Sambrookら（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；７．３７節−７．５７節、９．４７節−９．５７節、１１．７節−１１．８節および１１．４５節−１１．５７節）において詳細に論じられている。約１００ヌクレオチドよりも短いオリゴヌクレオチドプローブについて、Sambrookらは第１１．４５節〜第１１．４６節で適切なサザンブロット条件を開示する。１００ヌクレオチド長未満の配列と第二の配列との間のＴｍは、第１１．４６節で提供される公式を用いて計算することができる。Sambrookらは、約１００ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドプローブを用いるサザンブロットについてのプレハイブリダイゼーション条件およびハイブリダイゼーション条件をさらに開示する（第９．４７節〜第９．５２節を参照のこと）。１００ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドを用いたハイブリダイゼーションは、一般にＴｍより１５℃〜２５℃低く実施される。１００ヌクレオチド長を超える配列と第二の配列との間のＴｍは、Sambrookらの第９．５０節〜第９．５１節で提供される公式を用いて計算することができる。加えて、Sambrookらは、第９．５４節で示す条件を、約１００ヌクレオチドを超えるオリゴヌクレオチドを用いて探索したサザンブロットを洗浄するために推奨する。
核酸を含むメンブレンをプレハイブリダイズする条件およびハイブリダイズする条件、ならびに核酸を含むメンブレンを洗浄して過剰なプローブおよび非特異的に結合したプローブを除去する条件は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに重要な役割を果たし得る。例えば、ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーな条件下で実行され得る。そのような条件は、例えばSambrookら、第１１．４５節〜第１１．４６節に記載されている。特定のレベルのストリンジェンシーを達成するために用いられる条件は、ハイブリダイズされる核酸の性質に応じて変化しうる。例えば、核酸のハイブリダイズする領域の長さ、相補性の程度、ヌクレオチド配列の組成（例えば、Ｇ／Ｃ対Ａ／Ｔヌクレオチド含有量）および核酸の種類（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ）が、ハイブリダイゼーション条件を選択する際に考慮されてよい。例えば、洗浄条件は、洗浄溶液中の塩濃度を下げることによっておよび／または洗浄を実施する際の温度を上げることによって、よりストリンジェントにさせることができる。
ハイブリダイゼーションの量は、ホスフォ・イメージャー（PhosphorImager）またはデンシトメーター（Densitometer；Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）を用いて、メンブレン上で直接定量化することもできるし、またはオートラジオグラフから定量化することができる。当業者であれば、ハイブリダイゼーションの量を解釈することに、例えば、ラベル化したオリゴヌクレオチドプローブの比放射能、標的核酸上でプローブが結合する部位の数およびオートラジオグラフまたは他の検出媒体の露光の量が影響を及ぼしうることは理解する。いずれかのハイブリダイゼーション条件、洗浄条件および検出条件を用いてプローブ核酸分子の固定化された標的核酸に対するハイブリダイゼーションを試験することができるが、同一のハイブリダイゼーション条件、洗浄条件および検出条件下で、プローブの標的核酸に対するハイブリダイゼーションを試験することがより重要であることは容易に認められよう。好ましくは、標的核酸は同じメンブレン上にある。当業者であれば、適当な陽性対照および陰性対照を、増幅反応またはハイブリダイゼーション反応のすべてのセットを用いて実施し、汚染および／またはオリゴヌクレオチドプリマーまたはプローブによる非特異的なアニーリングを避けるべきであることは、正しく理解するであろう。
オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、１つまたはそれを超えるＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸と特異的にアニールまたはハイブリダイズする。増幅に関して、オリゴヌクレオチドプライマーセットは、鋳型核酸の逆鎖と通常アニールし、ポリメラーゼがその領域を超えて効果的に重合化させることができるように、そしてその増幅産物が例えば電気泳動を用いて容易に検出することができるように、お互いに適当な距離を置かなければならない。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブは、オリゴヌクレオチドを設計する際に手助けとなるコンピュータープログラム、例えばオリゴ（OLIGO；Molecular Biology Insights Inc., Cascade, CO)を用いて設計することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドプライマーは、１０〜３０または４０または５０ヌクレオチド長（例えば１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０ヌクレオチド長）であるが、適当な条件が用いられる場合にはより長くてもよいし、より短くてもよい。
Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（ＤＡＴ）核酸分子を増幅するために用いたオリゴヌクレオチドプライマーペアの非制限的な例示を、表２〜８（配列番号：９７８〜１０６２および１０７４〜１０８３）、表４６（配列番号：１０８４〜１１０３）および表５４（配列番号：１１０４〜１１２５）に示す。配列番号：９７８〜１０６２および１０７４〜１０８３）で示される配列は、ＡＴ核酸分子を増幅するために用いることができるオリゴヌクレオチドプライマーの非制限的な例である。本発明に関連するオリゴヌクレオチドは、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子の制限酵素消化により得ることができるし、あるいは、標準的な化学合成および他の既知の技術により調製することができる。
本明細書で用いられるように「単離された」核酸分子は、単離された核酸分子に通常付随する他の核酸分子から分離されている核酸分子である。このように、「単離された」核酸分子は、限定するものではないが、その単離された核酸が得られる生物のゲノムにおいて天然ではその核酸の一端または両端に存在する配列を含まない核酸分子（例えばＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）を含む。そのような単離された核酸分子は、操作の利便性のために又は融合核酸分子を生成するためにベクター（例えば、クローニングベクター、または発現ベクター）中に通常導入される。加えて、単離された核酸分子は、改変核酸分子、例えば組み換えまたは合成核酸分子を含みうる。核酸ライブラリー（例えばｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー）内、または制限消化されたゲノムＤＮＡを含むゲル（例えばアガロースまたはポリアクリルアミド）部分内において何百乃至何百万もの他の核酸分子の中に存在する核酸分子は、単離された核酸とはみなさない。
ＡＴ活性またはオキシドレダクターゼ活性を有する本明細書に記載の単離された核酸分子は、当分野で慣用の技術であって、本明細書中の実施例に記載の多くの技術を用いることにより得ることができる。例えば、本発明の範囲内にある単離された核酸は、限定するものではないが、組み換え核酸技術、ポリメラーゼ連鎖反応（例えばＰＣＲ、例えば直接的な増幅または部位特異的変異導入）および／または核酸ハイブリダイゼーション技術（例えばサザンブロッティング）を含むいずれかの方法を用いて得ることができる。一般的なＰＣＲ技術は、例えばPCR Primer: A Laboratory Manual, DieffenbachおよびDveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995に記載されている。組み換え核酸技術は、例えば制限酵素消化およびライゲーションを含み、それらは本明細書に記載のようにＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子を単離するために用いることができる。本発明の単離された核酸はまた、単独の核酸分子または一連のオリゴヌクレオチドのいずれかとして化学的に合成することができる。
核酸操作についての技術、例えば、サブクローニング、ラベル化プローブ（例えばクレノー（Klenow）ポリメラーゼを用いたランダム−プライマーラベル化、ニックトランスレーション、増幅）、配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅および類似の方法は、科学文献および特許文献に広く記載されており、例えば、Sambrookら、Eds., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory；Current Protocols in Molecular Biology, 1997, Ausubel, Ed. John WileyおよびSons, Inc., New York；Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, Ed. Elsevier, N.Y. (1993)を参照のこと。
精製されたＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチド、同様にＡＴ活性またはオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチド断片は、本発明の範囲内にある。ＡＴポリペプチドは、アミノ基とケト酸との間の反応を触媒するポリペプチドを示す。具体的には、ＤＡＴによるアミノ基転移反応は、アルファ−ケト酸はそのままにしてアミノ酸からアミノ基を除去し、そのアミノ基を反応物であるアルファ−ケト酸に転移させ、それによってそのアルファ−ケト酸をアミノ酸に転換することを含む。ＡＴポリペプチドの予測されるアミノ酸配列は、配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 表４３または表５２で示される１つまたはそれを越える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 970, 972, 974および976で示される。
オキシドレダクターゼポリペプチドは、酸化還元反応を触媒するポリペプチドを示し、オキシドレダクターゼポリペプチドの予測されるアミノ酸配列は、配列番号：252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 962, 964, 966および968で示される。
本明細書中で用いられる用語「精製された」ポリペプチドは、天然状態でそのポリペプチドに付随する細胞成分から分離されたポリペプチドを示す。典型的には、ポリペプチドは、天然状態で付随するタンパク質および天然に存在する分子から少なくとも部分的に取り出されている場合、「精製された」と考えられる。ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドの豊富化の程度または純度は、いずれかの適当な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析を用いて分析することができる。
本発明はまた、配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974および976とは配列が異なるＡＴおよびオキシドレダクターゼポリペプチドを提供する。
例えば、当業者であれば、変更を、ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチド（例えば、配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220,表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974および976）中に、あるいはＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子（例えば、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 535, 537, 539, 541, 543, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 559, 561, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 651, 653, 655, 657, 659, 661, 663, 665, 667, 669, 671, 673, 675, 677, 679, 681, 683, 685, 687, 689, 691, 693, 695, 697, 699, 701, 703, 705, 707, 709, 711, 713, 715, 716, 719, 721, 723, 725, 727, 729, 731, 733, 735, 737, 739, 741, 743, 745, 747, 749, 751, 753, 755, 757, 759, 761, 763, 765, 767, 769, 771, 773, 775, 777, 779, 781, 783, 785, 787, 789, 791, 793, 795, 797, 799, 801, 803, 805, 807, 809, 811, 813, 815, 817, 819, 821, 823, 825, 827, 829, 831, 833, 835, 837, 839, 841, 843, 845, 847, 849, 851, 853, 855, 857, 859, 861, 863, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 961, 963, 965, 967, 969, 971, 973および975）に導入し、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列に変更をもたらし得ることは正しく理解できるであろう。
配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974および976とは配列が異なるが、アミノトランスフェラーゼ活性およびオキシドレダクターゼ活性をそれぞれ保持するＡＴおよびオキシドレダクターゼポリペプチドは、当分野で慣用されるスクリーニング方法により容易に同定することができる。
例えば、コードされるＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドにおける１つまたはそれを超えるアミノ酸残基における保存的アミノ酸置換および／または非保存的アミノ酸置換をもたらすこととなる変更を、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸コード配列に導入することができる。核酸配列における変更は、そのようなポリペプチドをコードする核酸の部位特異的変異導入、ＰＣＲによる変異導入などの標準的な技術、または指向進化（directed evolution）により作り出すことができる。加えて、ポリペプチド配列における変更は、ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドの全部または一部に沿って、例えば対応する核酸の飽和突然変異誘発により無作為に導入することができる。別法では、変更は、そのような変更を有する核酸分子またはポリペプチドを化学的に合成することによって、核酸分子またはポリペプチド配列に導入することができる。
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基と置き換わることである。アミノ酸残基間の類似性は、当分野で理解されている。例えば、Dayhoffら(1978, in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(Suppl. 3):345-352)は、アミノ酸の類似性の尺度として用いることができるアミノ酸置換の頻度の表を提供する。保存的置換の例としては、例えば、脂肪族アミノ酸を別の脂肪族アミノ酸で置き換えること；セリンをスレオニンで置き換えることまたはその逆；酸性残基を別の酸性残基で置き換えること；アミド基を有する残基を別のアミド基を有する残基置換で置き換えること；塩基性残基を別の塩基性残基と交換すること；または芳香族残基を別の芳香族残基で置き換えること、を含む。非保存的置換は、あるアミノ酸残基が類似しない側鎖を有するアミノ酸残基と置き換わることである。
核酸における変更は、１つまたはそれを超える突然変異誘発物質を用いて導入することができる。突然変異誘発物質は、限定するものではないが、紫外線、ガンマ照射または化学突然変異誘発物質（例えば、マイトマイシン、亜硝酸、光活性化ソラレン、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはギ酸）を含む。他の突然変異誘発物は、ヌクレオチド前駆体の類似体、例えばニトロソグアニジン、５−ブロムウラシル、２−アミノプリンまたはアクリジンである。インターカレーター、例えばプロフラビン、アクリフラビン、キナクリンおよびその他の類似物が用いられてもよい。
変化は、例えばエラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド−特異的変異導入、アセンブリＰＣＲ、セクシャル（sexual）ＰＣＲ変異導入、インビボ突然変異誘発、カセット変異導入、リクルーシブ・アンサンブル変異導入（recursive ensemble mutagenesis）、エクスポネンシャル・アンサンブル突然変異誘発（exponential ensemble mutagenesis）、遺伝子リアセンブリ（gene reassembly）（例えば、GeneReassembly、米国特許第６，５３７，７７６号を参照のこと）、遺伝子部位飽和変異導入（Gene Site Saturation Mutagenesis、ＧＳＳＭ）、合成ライゲーションリアセンブリ（synthetic ligation reassembly、ＳＬＲ）またはそれらの組み合わせなどの方法によって、ＡＴまたはオキシドレダクターゼの核酸および／またはポリペプチドに導入することができる。変更はまた、組み換え、再帰的配列組み換え（recursive sequence recombination）、ホスホチオエート・モディファイによるＤＮＡ変異導入（phosphothioate-modified DNA mutagenesis）、ウラシルを含ませた鋳型での変異導入（uracil-containing template mutagenesis）、ギャップド・デュプレックス変異導入（gapped duplex mutagenesis）、ポイントミスマッチ修復による突然変異誘発（point mismatch repair mutagenesis）、修復機能を欠く宿主株での突然変異誘発（repair-deficient host strain mutagenesis）、化学突然変異誘発（chemical mutagenesis）、放射線突然変異誘発（radiogenic mutagenesis）、欠失突然変異誘発、制限−選択突然変異誘発（restriction-selection mutagenesis）、制限−精製突然変異誘発、人工的遺伝子合成（artificial gene synthesis）、アンサンブル突然変異誘発（ensemble mutagenesis）、キメラ核酸マルチマー・クリエーション（chimeric nucleic acid multimer creation）またはそれらのいずれかの組み合わせなどの方法によって、ポリペプチド中に導入することもできる。
ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸は、所望するように最適化されたコドンであってよい。例えば、好ましくないまたはあまり好ましくないコドンを特定し、置き換えられるコドンと同じアミノ酸をコードする好ましいコドンまたは中立的に用いられるコドンに置き換えることができる。好ましいコドンは、宿主細胞において遺伝子のコード配列に繰り返し現れるコドンであり、好ましくないまたはあまり好ましくないコドンは、宿主細胞において遺伝子のコード配列であまり出現せず、その核酸をモディファイすることにより宿主細胞においてその発現が増加することとなるコドンである。ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸を、いずれかの宿主細胞（例えば、本明細書に記載のいずれかの宿主細胞）の特定のコドン使用頻度に対して最適化することもできる。コドン最適化の代表的な説明のために、例えば米国特許第５，７９５，７３７号を参照のこと。コドンの最適化に加えて、核酸を指向進化にかけてもよい。例えば米国特許第６，３６１，９７４号を参照のこと。
他の変更もまた、この開示内容の範囲内にある。例えば、１個、２個、３個、４個またはそれを超えるアミノ酸が、アミノトランスフェラーゼまたはオキシドレダクターゼポリペプチドのカルボキシ末端および／またはアミノ末端から、その生物学的活性を著しく変化させることなく取り除かれてもよい。加えて、１個またはそれを超えるアミノ酸を変更して、ポリペプチドのｐIを増大または低下させることができる。いくつかの実施形態において、残基はグルタミン酸塩に変更されてもよい。また、キメラのアミノトランスフェラーゼまたはオキシドレダクターゼポリペプチドが提供される。例えば、キメラＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドは、別の結合または触媒ドメイン部分を含んでいてもよい。異なるポリペプチドから別のドメインを組み換える方法および特定の用途または基質に対する最もよい組み合わせを見つけ出すためにその結果得られるキメラ体をスクリーニングする方法は、当分野において慣例である。
本明細書中で例示された配列における１つ特定の変更は、ＡＴＣＣ受入番号４９７８のＤＡＴ（ＤＡＴ４９７８）の２４３番目の残基に対応する残基を含む。一例として、配列番号：８７０のＤＡＴポリペプチド配列をＤＡＴ４９７８に合わせて整列させ、ＤＡＴ４９７８の２４３番目の部位と対応する配列番号：８７０の残基を特定し（２４２番目の残基）、ＴｈｒからＡｓｎに変更した（配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎ）。別の例として、配列番号：２２０のＤＡＴポリペプチド配列をＤＡＴ４９７８に合わせて整列させ、ＤＡＴ４９７８の２４３番目の部位と対応する配列番号：２２０の残基を特定し（２４０番目の残基か２４１番目の残基のいずれか）、ＧｌｙからＡｓｎへまたはＴｈｒからＡｓｎにそれぞれ変更した（配列番号：２２０ Ｇ２４０Ｎおよび配列番号：２２０ Ｔ２４１Ｎ）。当業者であれば、本明細書中で開示するいずれかのＤＡＴにおいてＤＡＴ４９７８の２４３番目の残基に対応する残基を容易に特定することができ、ポリペプチド配列のその特定の残基に変更を容易に導入することができる。多くのさらなるＤＡＴ変異体を作製し、表４３および表５２に列挙する。
配列番号：８９４は新規のＤＡＴであり、公開されたデータベース内で最もそれに近い配列でも配列番号：８９４ポリペプチドと、わずか６０％の配列同一性しか示さないことは注目に値する。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号：８９４と少なくとも例えば６５％の配列同一性（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性）を有し、かつ機能的なＤＡＴ活性を有する配列を含む。加えて、配列番号：８７０もまた新規なＤＡＴであり、バシルス（Bacillus）のＤＡＴポリペプチドと７６％の配列同一性を有し、そしてＢ．スフェリカス（sphaericus）のＤＡＴポリペプチドと６９％の配列同一性を有する。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号：８７０と少なくとも８０％の配列同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性）を有し、かつＤＡＴ活性を有する配列を含む。さらに、配列番号：２２０は、Ｃ．ベイジェリンキ（beijerinckii）由来のＤＡＴポリペプチドと６２％の配列同一性を有する新規のＤＡＴである。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号：２２０と少なくとも６５％の配列同一性（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性）を有する配列を含む。
一例として、配列番号：８７０および９１０を公開されたＤＡＴに合わせて整列させ、コンセンサス配列を決定した。バシルス（Bacillus）の様なＤＡＴポリペプチド・グループの残りのものからそれを独特なものとする配列番号：８７０の様なＤＡＴポリペプチドのコンセンサス配列を、配列番号：１０６９（コンセンサス配列Ａ）に示す。他の例として、配列番号：１７６、２２０、８９２、８９４および９４６を整列させ、コンセンサス配列を決定した。このＤＡＴグループのコンセンサス配列を、配列番号：１０７１（コンセンサス配列Ｃ）に示す。配列番号：１０７０（コンセンサス配列Ｂ）は、配列番号：１０６９（コンセンサス配列Ａ）と比べて僅かだが更に保存的なコンセンサス配列を提示し、一方で配列番号：１０７２（コンセンサス配列Ｄ）および配列番号：１０７３（コンセンサス配列Ｅ）は、配列番号：１０７１（コンセンサス配列Ｃ）と比べて僅かだが更に保存的なコンセンサス配列に相当する。本明細書中で開示されるコンセンサス配列Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥに相当するコンセンサス配列を有するポリペプチドは、ＤＡＴ活性を示しうることが期待される。
アミノトランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼの核酸またはポリペプチドの断片は、全長のアミノトランスフェラーゼおよびオキシドレダクターゼの核酸ならびにポリペプチドの一部を示す。本明細書中で用いられる「機能的断片」は、それぞれの酵素活性を保持するアミノトランスフェラーゼまたはオキシドレダクターゼポリペプチドの断片である。「機能的断片」はまた、それぞれの酵素活性を保持するポリペプチドをコードするアミノトランスフェラーゼまたはオキシドレダクターゼ核酸の断片を示す。例えば、機能的断片は、アミノ基転移酵素または酸化還元反応を触媒させるためにインビトロまたはインビボでの反応にそれぞれ用いることができる。
ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドは、既知の方法、例えばＤＥＡＥイオン交換、ゲル濾過およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって、天然の供給源（例えば生体試料）から得ること（例えば、精製すること）ができる。天然の供給源は、限定するものではないが、微生物、例えば細菌および酵母を含む。精製されたＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドはまた、例えばＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸（例えば、配列番号：1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 443, 445, 447, 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 469, 471, 473, 475, 477, 479, 481, 483, 485, 487, 489, 491, 493, 495, 497, 499, 501, 503, 505, 507, 509, 511, 513, 515, 517, 519, 521, 523, 525, 527, 529, 531, 533, 535, 537, 539, 541, 543, 545, 547, 549, 551, 553, 555, 557, 559, 561, 563, 565, 567, 569, 571, 573, 575, 577, 579, 581, 583, 585, 587 589, 591, 593, 595, 597, 599, 601, 603, 605, 607, 609, 611, 613, 615, 617, 619, 621, 623, 625, 627, 629, 631, 633, 635, 637, 639, 641, 643, 645, 647, 649, 651, 653, 655, 657, 659, 661, 663, 665, 667, 669, 671, 673, 675, 677, 679, 681, 683, 685, 687, 689, 691, 693, 695, 697, 699, 701, 703, 705, 707, 709, 711, 713, 715, 716, 719, 721, 723, 725, 727, 729, 731, 733, 735, 737, 739, 741, 743, 745, 747, 749, 751, 753, 755, 757, 759, 761, 763, 765, 767, 769, 771, 773, 775, 777, 779, 781, 783, 785, 787, 789, 791, 793, 795, 797, 799, 801, 803, 805, 807, 809, 811, 813, 815, 817, 819, 821, 823, 825, 827, 829, 831, 833, 835, 837, 839, 841, 843, 845, 847, 849, 851, 853, 855, 857, 859, 861, 863, 865, 867, 869, 871, 873, 875, 877, 879, 881, 883, 885, 887, 889, 891, 893, 895, 897, 899, 901, 903, 905, 907, 909, 911, 913, 915, 917, 919, 921, 923, 925, 927, 929, 931, 933, 935, 937, 939, 941, 943, 945, 947, 949, 951, 953, 955, 957, 959, 961, 963, 965, 967, 969, 971, 973および975）をクローニングして発現させ、その結果として生じるポリペプチドを、例えば既知の発現系のいずれか、限定するものではないが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs, Beverly, MA）またはｐＲＩＴ５（Pharmacia, Piscataway, NJ）を用いて精製することによって、得ることができる。加えて、精製されたＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドは、例えば固相合成技術（例えばRoberge, 1995, Science, 269:202; Merrifield, 1997, Methods Enzymol., 289:3-13を参照のこと）を用いた化学合成により、得ることができる。
精製されたＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドまたはその断片は、１つまたはそれを超えるＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を生成するための免疫原として用いることができる。そのような抗体は、当分野で慣用される標準技術を用いて作り出すことができる。全長のＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチド、あるいはＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドの抗原断片を、免疫原として用いることもできる。ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドの抗原断片は、通常、ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチド（例えば、配列番号：2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 表４３または表５２で示される１つまたはそれを超える突然変異を有する配列番号：220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 408, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 442, 444, 446, 448, 450, 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482, 484, 486, 488, 490, 492, 494, 496, 498, 500, 502, 504, 506, 508, 510, 512, 514, 516, 518, 520, 522, 524, 526, 528, 530, 532, 534, 536, 538, 540, 542, 544, 546, 548, 550, 552, 554, 556, 558, 560, 562, 564, 566, 568, 570, 572, 574, 576, 578, 580, 582, 584, 586, 588, 590, 592, 594, 596, 598, 600, 602, 604, 606, 608, 610, 612, 614, 616, 618, 620, 622, 624, 626, 628, 630, 632, 634, 636, 638, 640, 642, 644, 646, 648, 650, 652, 654, 656, 658, 660, 662, 664, 666, 668, 670, 672, 674, 676, 678, 680, 682, 684, 686, 688, 690, 692, 694, 696, 698, 700, 702, 704, 706, 708, 710, 712, 714, 716, 718, 720, 722, 724, 726, 728, 730, 732, 734, 736, 738, 740, 742, 744, 746, 748, 750, 752, 754, 756, 758, 760, 762, 764, 766, 768, 770, 772, 774, 776, 778, 780, 782, 784, 786, 788, 790, 792, 794, 796, 798, 800, 802, 804, 806, 808, 810, 812, 814, 816, 818, 820, 822, 824, 826, 828, 830, 832, 834, 836, 838, 840, 842, 844, 846, 848, 850, 852, 854, 856, 858, 860, 862, 864, 866, 868, 870, 872, 874, 876, 878, 880, 882, 884, 886, 888, 890, 892, 894, 896, 898, 900, 902, 904, 906, 908, 910, 912, 914, 916, 918, 920, 922, 924, 926, 928, 930, 932, 934, 936, 938, 940, 942, 944, 946, 948, 950, 952, 954, 956, 958, 960, 962, 964, 966, 968, 970, 972, 974および976で示される配列を有するもの）の少なくとも８個（例えば、１０個、１５個、２０個または３０個）のアミノ酸残基を含み、かつ、その抗原断片に対して産生された抗体（例えば、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体；キメラ抗体またはヒト化抗体）が１つまたはそれを超えるＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドに対して特異的な結合親和性を有するようなＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドのエピトープを包含する。
ポリペプチドは、限定するものではないが、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、分光法、Ｘ線撮影（タンパク質放射能標識）、電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散性（hyperdiffusion）クロマトグラフィー、さまざまな免疫学的方法、例えば免疫沈降、免疫拡散、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ゲル電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、抗体による染色、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）、熱分解質量分析、フーリエ変換赤外分光法、ラマン分光分析、ＧＣ−ＭＳおよびＬＣ−エレクトロスプレーおよびキャップ−ＬＣ−タンデム型エレクトロスプレー質量分析法、その他の類似物を含む当分野で既知の方法のいずれかにより検出および精製することができる。新規な生物活性はまた、米国特許第６，０５７，１０３号に記載の方法またはその変法を用いてスクリーニングすることができる。さらに、１つまたはそれを超える、あるいはすべての細胞のポリペプチドを、プロテインアレイを用いて測定することができる。
ＤＡＴまたはオキシドレダクターゼの核酸およびポリペプチドを使用する方法
ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチド、またはそのようなＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドをコードするＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸はそれぞれ、トリプトファンのインドール−３−ピルベートへの転換および／またはＭＰのモナチンへの転換（あるいはその逆の反応）を容易にするために用いることができる。本明細書に記載の反応は、特に示さない限り、いずれかの特定の方法に限定されるものではないことに留意されたい。本明細書中で開示される反応は、例えばインビボ、インビトロ、またはその組み合わせにおいて行うことができる。
ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子を含む構築物が提供される。発現ベクターを含み、ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドを発現するのに適した構築物は、商業的に入手可能であり、および／または当分野で慣用の組み換えＤＮＡ技術による方法により容易に作製することができる。代表的な構築物またはベクターは、限定するものではないが、レプリコン（例えばＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）、自律型の自己複製性の環状または直鎖状のＤＮＡまたはＲＮＡ、ウィルスベクター（例えばアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターまたはアデノ関連ウィルスベクター）、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、フォスミド（fosmid）、バクテリオファージまたは人工染色体を含む。クローニング用の媒体は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、Ｐ１バクテリオファージ由来のベクター（ＰＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）または哺乳動物人工染色体（ＭＡＣ）を含む人工染色体を含みうる。例示的なベクターは、限定するものではないが、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、ＧＥＭ１（Promega Biotec, Madison, WI, USA）ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Qiagen）、ｐＤ１０、ｐｓｉＸ１７４ ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Stratagene）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmacia）、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７を含む。代表的なプラスミド、ウイルスおよびその類似物の記載については、米国特許第５，２１７，８７９号もまた参照のこと。
ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸分子を含むベクターまたは構築物は、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸に作動可能に連結される発現に必要なエレメントを含んでいてよい。発現に必要なエレメントは、核酸コード配列の発現を指向させるおよび調節する核酸配列を含む。発現に必要なエレメントの１つの例には、プロモーター配列がある。プロモーター配列は、コード配列の転写を誘導することができる配列である。プロモーター配列は、例えばＡＴまたはオキシドレダクターゼプロモーター配列、または非ＡＴまたは非オキシドレダクターゼプロモーター配列であってよい。非ＡＴおよび非オキシドレダクターゼプロモーターは、例えば、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ラムダＰＬおよびｔｒｐなどの細菌プロモーター、ならびにＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ＳＶ４０初期およびＳＶ４０後期、レトロウイルス由来のＬＴＲおよびマウス・メタロチオネインＩなどの真核生物プロモーターを含む。プロモーターはまた、例えば構成的なもの、誘導性のもの、および／または組織特異的なものであってよい。代表的な構成的プロモーターにはＣａＭＶ３５Ｓがあり；代表的な誘導性プロモーターには、例えばアラビノース、テトラサイクリン誘導性およびサリチル酸応答性のプロモーターが挙げられる。
発現に必要な付加的なエレメントには、イントロン、エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）、応答エレメント、または核酸の発現をモジュレートする誘導性エレメントが含まれる。発現に必要なエレメントは、リーダー配列またはシグナル配列を含みうる。例えば、リーダー配列を含むＤＡＴポリペプチドである配列番号：１５６を参照のこと。発現に必要なエレメントはまた、例えば翻訳開始のためのリボソーム結合部位、スプライス供与部位および受容部位、ならびに転写ターミネーターを含みうる。発現に必要なエレメントは、細菌、酵母、昆虫、哺乳動物またはウイルス起源であってよく、ベクターまたは構築物は、異なる起源のエレメントの組み合わせを含んでいてもよい。発現に必要なエレメントは、例えばGoeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA.に記載されている。
本明細書中で記載されるベクターまたは構築物は、選択可能なマーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子または真核細胞にネオマイシン耐性を与える遺伝子;大腸菌にテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を与える遺伝子;およびS.セレビシエ（serevisiae）のためのＴＲＰ１をコードする遺伝子）をコードする配列、ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドの精製の際に用いることができる配列（例えば６×Ｈｉｓタグ）、およびベクターまたは構築物の複製に関与する１つまたはそれを超える配列（例えば複製起点）を含みうる。加えて、ベクターまたは構築物は、例えばベクターまたは構築物を組み込むための配列相同性を有する領域を１つまたは２つ含みうる。ゲノム組み込むためのベクターおよび構築物は、当分野で周知である。
本明細書中で用いられるように、「作動可能に連結される」は、プロモーターおよび／または他の調節エレメント（複数のエレメント）が、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸に対して、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸の発現を指向させるまたは調節するような様式でベクターまたは構築物中に配置されていることを意味する。一般に、転写される配列と作動可能に連結されるプロモーターおよび発現に必要な他のエレメントは、その転写される配列に対して物理的に隣接しており、すなわち、それらはシス作用性である。しかしながら、いくつかの転写調節配列、例えばエンハンサーは、それらがその発現を増強するコード配列と物理的に隣接している必要がないか、または近接して配置されている必要がない。
宿主細胞もまた提供する。宿主細胞は、一般に、本発明の核酸配列、例えばＡＴまたはオキシドレダクターゼをコードする配列、または本明細書に記載のベクターまたは構築物を含む。宿主細胞は、当業者にとっては馴染みのあるいずれかの宿主細胞、例えば細菌細胞、菌類の細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞を含む原核細胞または真核細胞であってよい。例示的な細菌細胞は、エシェリキア（Escherichia）属、バシラス（Bacillus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、サルモネラ（Salmonella）属、シュードモナス（Pseudomonas）属およびスタフィロコッカス（Staphylococcus）属の範囲内にあるいずれかの種を含み、例えば、大腸菌、Ｌ．ラクティス（lactis）、Ｂ．サブチリス（subtilis）、セレウス菌（B.cereus）、チフス菌（S.typhimurium）、Ｐ．フルオレセインス（fluorescens）を含む。例示的な菌類細胞は、アスペルギルス（Aspergillus）のいずれかの種を含み、例示的な酵母細胞は、ピキア（Pichia）、サッカロマイセス（Saccharomyses）、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces)またはシワニオマイセス（Schwanniomyces）のいずれかの種を含み、Ｐ．パストリス（pastoris）、Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）またはＳ．ポンベ（pombe）を含む。例示的な昆虫の細胞は、スポドプテラ（Spodoptera）またはショウジョウバエ（Drosophila）のいずれかの種を含み、ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９を含む。例示的な動物細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ボーズメラノーマ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系を含む。例えば、Gluzman, 1981, Cell, 23:175を参照のこと。適当な宿主の選択は、当業者の能力の範囲内にある。
核酸を多種多様な細胞に導入する技術は周知であり、技術文献および科学文献に記載されている。ベクターまたは構築物は、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃またはＴｉ媒介遺伝子移入を含む様々な技術のいずれかを用いて宿主細胞中に導入することができる。具体的な方法としては、リン酸カルシウム形質転換法、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔法（Davisら、1986, Basic Methods in Molecular Biology）が挙げられる。例示的な方法は、ＣａＰＯ４沈殿法、リポソーム融合、リポフェクション（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標））、電気穿孔法、ウイルス感染などを含む。ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸は、宿主細胞のゲノム内に安定して取り込まれてもよいし（例えば、レトロウイルス形質導入を用いて）、あるいは細胞質に一過性でまたは安定してのいずれかで存在してもよい（すなわち、標準的な調節配列、選択マーカーなどを利用した、従来のプラスミドの使用を通じて）。
宿主細胞の中身は、通常、遠心分離により収集し、物理的な方法または化学的な方法により破壊し、その結果得られた粗抽出物をさらなる精製のために保有する。タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶菌剤の使用を含むいずれかの都合のよい方法によって破壊することができる。そのような方法は、当業者には周知である。発現されるポリペプチドまたはその断片は、限定するものではないが、沈殿法（例えば硫安沈殿またはエタノール沈殿）、酸抽出、クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換または陽イオン交換、ホスホセルロース、疎水性相互作用、親和性、ヒドロキシアパタイトおよびレクチン）を含む方法により細胞培養液中から回収および精製することができる。要すれば、ハイパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終の精製工程に用いることができる。
無細胞翻訳系もまた、本発明のポリペプチドを産生するために用いることができる。無細胞翻訳系は、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを用いることができる。幾つかの態様において、ＤＮＡ構築物を直鎖にした後に、インビトロ転写反応を実施してもよい。次いで、転写されたｍＲＮＡを、適当な無細胞翻訳抽出物、例えばウサギ網状赤血球抽出物と一緒にインキュベートし、所望のポリペプチドまたはその断片を作製する。
ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチド、その断片またはバリアントは、多くの方法により活性を評価することができる。酵素ポリペプチドの活性を検出または測定する方法は、一般に、ポリペプチド、その断片またはバリアントを適当な基質と合すること、およびその基質の量が減少するかおよび／または産物または副産物の量が増加するかどうかを決定することを含む。本明細書中で開示されるＤＡＴの活性を評価するために用いられる基質は、典型的には、トリプトファンおよび／またはＲ−ＭＰであり、その産物はインドール−３−ピルベートおよび／またはＲ，Ｒ−モナチンであった。トリプトファンまたはＭＰ基質に加えて、本明細書中で開示されるポリペプチドはまた置換されたトリプトファンおよび／またはＭＰ基質、例えば限定ではなく、塩素化トリプトファンまたは５−ヒドロキシトリプトファンを利用しうる。加えて、ＭＰのモナチンへの転換の副産物（例えば、４−ヒドロキシ−４−メチルグルタミン酸（ＨＭＧ））をモニタまたは測定することができる。
ＡＴ活性を評価する方法は、例えば、Sugioら、1995, Biochemistry, 34:9661-9669；Roら、1996, FEBS Lett., 398:141-145；またはGutierrezら、2000, Eur. J. Biochem., 267, 7218-7223）に記載されている。加えて、脱水素酵素活性を評価する方法は、Leeら、2006, AEM, 72(2):1588-1594；およびMayer, 2002, J. Biomolecular Screening, 7(2):135-140に記載されている。加えて、候補ポリペプチドをＤＡＴ活性について評価する方法は、本明細書中の実施例の項のうちパートＡおよびパートＢに記載されている。あるポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかを決定することを目的として、実施例の項のパートＢに記載の方法が用いられる。
典型的には、ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドは、約０．０５〜２０ユニットの間の範囲（例えば、約０．０５、０．１０、０．２０、０．３０、０．４０、０．５０、０．６０、０．７０、０．８０、０．９０、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは１９．５、またはそれ以上のユニット）で活性を示す。本明細書中で用いられるように、ユニットは、酵素１ｍｇあたり１分間に放出される産物の１μモルに等しい。１つの実施形態において、ＡＴポリペプチドについての活性１ユニットは、酵素１ｍｇあたり１分間に産生されるアルファ−ケト酸またはケトン（それぞれアルファ−アミノ酸またはアミンから形成される）が１μモルである。別の実施形態に置いて、アミノトランスフェラーゼポリペプチドについての活性１ユニットは、酵素１ｍｇあたり１分間に産生されるアルファ−アミノ酸またはアミン（それぞれアルファ−ケト酸またはケトンから形成される）が１μモルである。
本明細書中で開示される１つまたはそれを超えるＡＴまたはオキシドレダクターゼの核酸またはポリペプチドを用いた、トリプトファンのインドール−３−ピルベートへの転換またはＭＰのモナチンへの転換は、インビトロまたはインビボ、溶液中または宿主細胞内で、連続してまたは並行して、実施することができる。１つまたはそれを超える反応がインビトロで行われる場合、その反応（複数の反応）に望ましい材料は、水性反応媒体または溶液中での混合によって合し、産生されるべき所望の産物（複数の産物）のために十分な時間維持することができる。別法としては、本明細書に記載の１つまたはそれを超える反応で用いられる１つまたはそれを超えるＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドを、固体担体に固定してもよい。固体担体の例としては、エポキシ、アルデヒド、キレート剤または第一級アミン基を含む物が挙げられる。好適な固体担体の具体的な例としては、限定するものではないが、ユーペルギット（Eupergit（登録商標））Ｃ（Rohm and Haas Company, Philadelphia, PA)樹脂ビーズおよびＳＥＰＡＢＥＡＤＳ（登録商標）ＥＣ−ＥＰ（Resindion）が挙げられる。
インビボでインドール−３−ピルベートをトリプトファンから作り出すためにまたはＭＰからモナチンを作り出すために、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸（例えば発現ベクター）を、本明細書に記載のいずれかの宿主細胞に導入することができる。宿主細胞に依存して、多くのまたは全ての補因子（例えば、金属イオン、補酵素、ピリドキサール−リン酸、またはホスホパテテイン（phosphopanthetheine））および／または生じる転換反応に必要な基質を、培地中に提供してもよい。インビトロまたはインビボでの反応を進行させた後に、その転換効率を基質の量が減少したかどうか、あるいは産物の量が増加したかどうかを決定することにより評価することができる。
いくつかの実施形態において、本明細書中で開示される１つまたはそれを超えるＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドは、当業者には既知の多くのストラテジーを用いて改良または最適化することができる。例えば、１つまたはそれを超える反応が行われるインビボまたはインビトロ条件、例えばｐＨまたは温度を調整して、ポリペプチドの活性を改善または最適化することができる。加えて、ポリペプチドの活性は、ＡＴまたはオキシドレダクターゼ核酸を別のベクターまたは構築物中に再クローニングすることによって、および／または別の宿主細胞を用いることによって改善または最適化することができる。例えば、遺伝子工学的に改変または選択され、トリプトファンの増大した取り込みまたは産生を示す宿主細胞を用いることができる（例えば、米国特許第５，７２８，５５５号を参照のこと）。さらに、ＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドを、ポリペプチドの正確な折り畳みを（例えば、シャペロンポリペプチドを用いることによって）、あるいは適切な翻訳後修飾、例えば限定するものではないが、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化（pegylation）、リン酸エステル化、プレニル化、セレノイル化（selenoylation）、硫酸化、ジスルフィド結合形成、および脱メチル、ならびにフラビン、ヘム部分、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体、脂質または脂質誘導体、および／またはホスファチジルイノシトールのような分子の共有結合を、確実に行わせるか又は補助することにより改善または最適化することができる。加えて、ポリペプチドの可溶性を、当分野で周知の多くの方法、例えば限定するものではないが、低温発現またはペリプラズムでの発現を用いることによって、増大させることができる。
基質としてトリプトファンおよび／またはＭＰを用いてＤＡＴ活性を示す多くのポリペプチドが、本明細書中で特定された。具体的には、配列番号：950, 946, 948, 892, 894, 866, 870, 870 T242N, 872, 874, 878, 880, 882, 884, 902, 910, 918, 176, 178, 154, 220, 156, 216, 238, 224, 230, 232, 214, CbDAT, CaDATおよびLsDATが、ＤＡＴ活性を示す。配列番号：946, 892, 894, 220, 176, 1064, 1066および1068が、実施例のパートＢに記載の条件下で非常に高い活性を示したことには、注目すべきである。配列番号：220および894は、ＭＰのモナチンへの転換の間に低レベルのＨＭＧ副産物を産生したことは注目に値する。
モナチン産生における、アミノトランスフェラーゼまたはオキシドレダクターゼの核酸またはポリペプチドの使用
本明細書に記載のＤＡＴポリペプチドの１つまたはそれを超えるものを、モナチンの産生に用いることができる。モナチンは、以下の化学式を有する高甘味度甘味料である：
Figure 0005683962
モナチンは、４個の潜在的な立体異性体配置をもたらす２個のキラル中心を含む。Ｒ，Ｒ立体配置（「Ｒ，Ｒ立体異性体」または「Ｒ，Ｒモナチン」）；Ｓ，Ｓ立体配置（「Ｓ，Ｓ立体異性体」または「Ｓ，Ｓモナチン」）；Ｒ，Ｓ立体配置（「Ｒ，Ｓ立体異性体」または「Ｒ，Ｓモナチン」）；およびＳ，Ｒ立体配置（「Ｓ，Ｒ立体異性体」または「Ｓ，Ｒモナチン」）。本明細書中で用いられるように、特に明記しない限り、用語「モナチン」は、モナチンの４種の立体異性体をすべて含む組成物、モナチン立体異性体のいずれかの組み合わせ（例えばＲ，ＲおよびＳ，Ｓ立体異性体のモナチンのみを含む組成物）を含む組成物、ならびに単一の異性型（またはその塩のいずれか）を示して用いられる。モナチンに関する様々な番号付け方式のために、モナチンは、多くの別の化学名でも知られている：２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−アミノグルタル酸；４−アミノ−２−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−ペンタン二酸；４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）グルタミン酸；および３−（１−アミノ−１，３−ジカルボキシ−３−ヒドロキシ−ブタ−４−イル）インドール。
モナチンの様々な立体異性体（例えばＲ，Ｒモナチン）を産生する方法は、例えば国際公開第０７／１３３１８３号および第０７／１０３３８９号に開示されている。本明細書中で開示される１つまたはそれを超えるＤＡＴポリペプチドは、トリプトファンの存在下で、モナチン組成物を作製するための当業者に既知の方法を用いることができる。国際公開第０７／１３３１８３号および第０７／１０３３８９号の両方で開示されるように、インドール−３−ピルベート（または、その誘導体；例えば国際公開第０７／１０３３８９号を参照のこと）の２−ヒドロキシ２−（インドール３イルメチル）−４−ケトグルタル酸（「モナチン前駆体」または「ＭＰ」）への転換が、モナチンの第一のキラル中心を指定する一方で、ＭＰのモナチンへの転換は第二のキラル中心を指定する。実施形態において、モナチンの産生に必要とされる１つまたはそれを超える転換は、結果として得られる組成物または調製物が所望のパーセンテージ（例えば、最小でおよび／または最大で）の１つまたはそれを超えるモナチン立体異性体（例えばＲ，Ｒモナチン）を含むように、１以上の酵素、例えば酵素混合物によって触媒される。別法では、モナチンは、そのような所望のパーセンテージの各モナチン立体異性体（複数の立体異性体）を含む組成物または調製物を産生するために組み合わされる、本発明の方法に従う２つの別個の製造過程によって作製された。
本明細書中で開示される１つまたはそれを超えるＡＴポリペプチドを利用して産生されるモナチンは、産生されたモナチンの総量あたり少なくとも約０．５％〜３０％のＲ，Ｒ−モナチンであってよい。他の実施形態において、本明細書中で開示される１つまたはそれを超えるポリペプチドまたは生合成経路を用いて産生されるモナチンは、産生されるモナチンの総量あたり、３０％を超えるＲ，Ｒ−モナチンである；例えば、Ｒ，Ｒ−モナチンは、産生されるモナチン総量の４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である。別には、さまざまな量の２つまたはそれを超えるモナチン調製物を合して、結果として、所望のパーセンテージのＲ，Ｒ−モナチンの調製物とすることができる。例えば、３０％Ｒ，Ｒ−モナチンのモナチン調製物を９０％Ｒ，Ｒ−モナチンのモナチン調製物と合してもよい；等量の３０％と９０％のＲ，Ｒ−モナチン調製物とを合わせた場合、結果として生じるモナチン調製物は６０％Ｒ，Ｒ−モナチンであろう。
本明細書中で開示される１つまたはそれを超えるＤＡＴポリペプチドを用いて産生されるモナチンは、例えば誘導体であってもよい。「モナチン誘導体は」は、以下の構造を有する：
Figure 0005683962
［式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅは、それぞれ独立して、水素原子、ヒドロキシル基、Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基またはハロゲン原子、例えばヨウ素原子、臭素原子、塩素原子またはフッ素原子から選択されるいずれかの置換基を表す。しかしながら、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、ＲｄおよびＲｅが全て同時に水素であることない。別には、ＲｂとＲｃ、および／またはＲｄとＲｅはそれぞれ、一緒になってＣ１−Ｃ４アルキレン基を形成しうる。「置換されたモナチン」は、例えばハロゲン化または塩素化されたモナチンまたはモナチン誘導体を示す。例えば、米国特許出願公開（Publication）第２００５／０１１８３１７号を参照のこと。
モナチン誘導体は、甘味料としても用いることができる。例えば、塩化Ｄ−トリプトファン、特に６−クロロ−Ｄ−トリプトファンは、Ｒ，Ｒモナチンと類似の構造を有しており、非栄養甘味料と確認された。同様に、ハロゲン化型のモナチンおよびヒドロキシ置換型のモナチンは、甘味があることが見出された。米国特許出願公開第２００５／０１１８３１７号を参照のこと。置換されたインドールは、文献中でＰＬＰ−酵素の適切な基質であることが示され、置換されたトリプトファンを産生した。例えば、Fukudaら、1971, Appl. Environ. Microbiol., 21:841-43を参照のこと。ハロゲンは、酵素の触媒機序またはエナンチオ特異性を立体的に妨げることはないようである。従って、ハロゲンおよびヒドロキシル基は、特にトリプトファンのインドールのベンゼン環の１位〜４位上の水素と、次のＤ−またはＬ−トリプトファン、インドール−３−ピルベート、ＭＰまたはモナチンへの転換を妨げることなく、置換可能であるであろう。
本明細書中で開示される１つまたはそれを超えるＤＡＴポリペプチドは、１つまたはそれを超えるさらなるポリペプチドの有無にかかわらず、モナチンの産生に用いられうる。ＤＡＴポリペプチド（または、そのようなＤＡＴポリペプチドをコードする核酸分子）は、トリプトファンの（アミノ受容体の存在下で）インドール−３−ピルビン酸への転換に、およびＭＰのモナチンへの転換に用いられ得る。これら２つの反応の間の中間の工程は、インドール−３−ピルビン酸のＭＰへの転換であり、Ｃ３炭素源、例えばピルベート、オキザロアセテートまたはセリンの存在を要求する。ＭＰからモナチンへの転換工程におけるＤＡＴポリペプチドの使用により、結果として第２のキラル中心でＲ立体配置を得る。配列番号：９４６、９５０、２２０および９４８が高い量のＲ，Ｒモナチンを産生したことは注目すべきことである。
インドール−３−ピルベート（またはインドール−３−ピルビン酸）のＭＰへの転換は酵素がない場合でも生じうるが（すなわちアルドール縮合）、ポリペプチドによって容易化させることができる。第一のキラル中心のキラリティーは、インドール−３−ピルベートをＭＰに転換する反応のエナンチオ特異性によって決定される。ＭＰの形成反応が酵素によって容易化させることができない場合や、キラル助剤がない場合には、Ｒ−ＭＰとＳ−ＭＰのラセミ混合物が典型的に形成される。インドール−３−ピルベートのＭＰへの転換を容易にする酵素には、例えば、シンターゼ／リアーゼ（ＥＣ４．１．３．−および４．１．２．−）、特にクラスＥＣ４．１．３．１６およびＥＣ４．１．３．１７のものが挙げられる。これらのクラスは、炭素−炭素シンターゼ／リアーゼ、例えば２つのカルボン酸基質の縮合を触媒するアルドラーゼを含む。酵素クラスＥＣ４．１．３．−は、求電子剤としてオキソ酸基質（例えばインドール−３−ピルベート）を利用して炭素−炭素結合を形成するシンターゼ／リアーゼであるが、一方で、ＥＣ４．１．２．−は、求電子剤としてアルデヒド基質（例えばベンズアルデヒド）を利用して炭素−炭素結合を形成するシンターゼ／リアーゼである。例えば、ＫＨＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）およびＨＭＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１７）は、インドール−３−ピルベートおよびピルベートをＭＰに転換すると知られている。本明細書中で、用語「ＨＭＧアルドラーゼ」は、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタレート・アルドラーゼ活性を有するいずれかのポリペプチドを示して用いられる。ＨＭＧアルドラーゼの適切な例としては、コマモナス・テストステローニ（Comamonas testosteroni）ＰｒｏＡおよびシノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）ＰｒｏＡ（ＮＣＢＩ受入番号ＣＡＣ４６３４４）が挙げられる。
モナチンを産生する経路中の１つまたはそれを超える転換反応をインビボで実施する場合、当業者であれば、微生物内でのＲ，Ｒモナチンを含むモナチンの産生を、様々な慣用の方法によって最適化することができる。そのような微生物は、本来のままで他の微生物よりも１つまたはそれを超える下記の特徴の点で良好なものであってよく、またはモディファイされて、典型的にはモナチンの改善された産生（そのような修飾の前の微生物と比べて）となる、１つまたはそれを超える下記の特徴を発揮するものであってよい。そのような特徴は、限定するものではないが、トリプトファン（例えばＤ−トリプトファン）を取り込む微生物の能力における増強；インドール−３−ピルベートを取り込む微生物の能力における増強；インドール−３−ピルベートを分泌する微生物の能力の低下；微生物におけるインドール−３−ピルベートの分解量の減少；および／または微生物に対するＤ−トリプトファンの毒性の低下が挙げられる。そのような特徴および１つまたはそれを超えるそのような特徴を示す微生物を得るための方策は、例えば国際公開第０７／１３３１８３号および第０７／１０３３８９号に記載されている。
モナチン、または本明細書中で開示される１つまたはそれを超えるＡＴまたはオキシドレダクターゼポリペプチドを用いて産生されるモナチン生合成経路に対するトリプトファンの中間体（インドール−３−ピルベートおよびＭＰを含む）は、反応物の成分から精製されてよい。１つの実施形態において、モナチンまたは中間体は、それが合成される酵素調製物から精製されるべき物質を単純に除去することによって精製することができる。他の実施形態において、モナチンまたは中間体は、結果として生じる「精製された」組成物または調製物が有機化合物の総重量あたり少なくとも約５−６０％のモナチンが存在するように、それが合成された調製物から精製される。別の実施形態において、モナチンまたは中間体は、有機化合物の総重量あたり少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の純度に精製されうる。本明細書中で開示される１つまたはそれを超えるポリペプチドまたは生合成経路を用いて産生されたモナチンは、当業者には既知のいずれかの方法（例えば、再結晶化の繰り返し）によって反応物の成分から精製されうる。
本発明によれば、当分野の範囲内にある慣用の分子生物学技術、微生物学技術、生化学技術および化学技術により実施され得る。そのような技術は、文献において完全に説明される。本発明は以下の実施例ではさらに記載されるが、それらは特許請求の範囲で記載される本発明の範囲を制限するものではない。
実施例
本明細書に記載のアミノトランスフェラーゼとオキシドレダクターゼは、選抜方策を用いて得られた。この選抜方策では、環境（environmental）ＤＮＡライブラリーを、Ｌ−トリプトファン栄養素要求性を示す細菌宿主株にて構築した。ライブラリークローンを、Ｄ−トリプトファンを含む（しかし、Ｌ−トリプトファンを欠く）培地に植菌した。生育できた僅かなクローンが、Ｄ−トリプトファンにおいて活性がある酵素をコードした不連続な環境ＤＮＡ断片のうちの１つで遺伝子を発現したクローンである。例えば、活性トリプトファンラセマーゼを発現し、Ｄ−トリプトファンをＬ−トリプトファンに転換することができたクローンが、同定された。加えて、Ｄ−トリプトファンを中間体に転換できるオキシドレダクターゼ（例えばアミノ酸オキシダーゼまたは脱水素酵素）を発現したクローンが同定され、次いで、その宿主細胞はＬ−トリプトファンに転換することができた。アミノ酸オキシダーゼおよび脱水素酵素のようなオキシドレダクターゼの場合、そのような中間体は、インドール−３−ピルベートである。
パートＡにおける実施例は、候補ＤＡＴおよびオキシドレダクターゼの核酸、およびそのコードされたポリペプチドの最初のキャラクタリゼーションのために用いた方法論を記載する。特定の核酸およびポリペプチドのさらなるキャラクタリゼーションは、パートＢで記載する。
パートＡ
実施例１−増殖およびアッセイ手順＃１
酵素調製
グリセロールストックを用いて、適当な抗生物質を含む５０ｍＬのＬＢ培地のフラスコに植菌した。種培養を、２３０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩生育させ、ＯＤ６００ｎｍを確認した。その種培養を用いて、４００ｍＬに植菌してのＯＤ６００ｎｍを０．０５とした。その培養物を、２３０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。
ＯＤ６００ｎｍが０．５〜０．８の間になったときに、培養物を１ｍＭのＩＰＴＧにより誘導して、３０℃で２３０ｒｐｍにて一晩インキュベートした。培養物を４０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により細胞をペレット化することで回収した。上清を棄て、ペレットを後の使用まで冷凍するか、あるいは２６Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅを補充した２０ｍＬの５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に再懸濁し、製造業者の指示につきマイクロ流動化装置（microfluidizer、Microfluidics Corporation, Newton, MA）を用いて溶解した。清澄した溶解液を集め、１１，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を透明な遠心管に集め、０．２μｍのフィルターに通じて濾過した。清澄した溶解液の一部試料５ｍＬをバイアルに移し、製造業者の指示につき凍結乾燥器（Virtis Company, Gardinier, NY）を用いて凍結乾燥させた。約１ｍＬの清澄した溶解液を、バイオラッド（Bio-Rad）プロテインアッセイ試薬（Bio-Rad, Hercules, CA）とＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いるタンパク質定量のために保持した。次に、各凍結乾燥試料中のタンパク質量を計算した。
活性アッセイ
活性アッセイのための酵素は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）中に調製した。ＤＡＴアッセイは、通常、約１ｍｇ／ｍＬの総タンパクを用いて実施した。
ＲＲ−モナチン基質を用いたＤＡＴアッセイ
２５ｍＭのＲＲ−モナチン、２５ｍＭのピルビン酸ナトリウム塩、０．０８ｍＭのＰＬＰ、９０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）および以上で（「酵素調製」の項で）記載したように調製された０．８ｍｇ／ｍＬのＤＡＴ（総タンパク）を合して、３０℃で３００ｒｐｍにてインキュベートした。さまざまな時点（一般に、０時間、２時間、４時間および２４時間）で、５０μＬの反応産物を１５０μＬの氷冷アセトニトリルに移し、試料を３０秒間激しく攪拌した。試料を、４℃で１０分間、１３，２００ｒｐｍにて遠心分離し、その上清を０．４５μｍフィルターに通じた。その濾液を、メタノールにて１０倍希釈し、試料を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析して形成されるＤ−アラニンをモニタした（下記の実施例の「Ｄ−アラニンまたはＲ，Ｒ−モナチンを検出するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法」の項で記載される）。
トリプトファン基質を用いたＤＡＴアッセイ
１０ｍＭのＤ−トリプトファン、２５ｍＭのピルビン酸ナトリウム塩、０．０８ｍＭのＰＬＰ、９０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）および以上で（「酵素調製」の項で）記載したように調製された０．８ｍｇ／ｍＬのＤＡＴ（総タンパク）を合して、３０℃で３００ｒｐｍにてインキュベートした。さまざまな時点（一般に、０時間、２時間、４時間および２４時間）で、５０μＬの反応産物を１５０μＬの氷冷アセトニトリルに移し、３０秒間激しく攪拌し、４℃で１０分間、１３，２００ｒｐｍにて遠心分離した。その上清を０．４５μｍフィルターに通じ、その濾液を、メタノールにて１０倍希釈した。試料を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析して形成されるＤ−アラニンをモニタした（下記の実施例の「Ｄ−アラニンまたはＲ，Ｒ−モナチンを検出するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法」の項で記載される）。
Ｄ−アラニンまたはＲ,Ｒ−モナチンを検出するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳスクリーニングは、９６穴プレートからの試料を、ＣＴＣＰａｌオートサンプラー（LEAP Technologies, Carrboro, NC）を用いてＬＣ−１０ＡＤｖｐポンプ（Shimadzu, Kyoto, Japan)にて供給される３０／７０Ｈ２Ｏ／Ａｃｎ（０．１％のギ酸）混合液中に１．０ｍＬ／分でゾルバックス・エクリプス（Zorbax Eclipse）ＸＤＢ−Ｃ８（２．１×５０ｍｍ）カラムを通じて注入およびＡＰＩ４０００ターボイオン−スプレイ三連四重極質量分析計（TurboIon-Spray triple-quad mass spectrometer）（Applied Biosystems, Foster City, CA）中に注入することによって行った。
イオンスプレーおよび多重反応モニタリング（Multiple Reaction Monitoring；ＭＲＭ）は、ポジティブイオンモードにて目的の分析物について実施した。アラニン：親／娘イオン：９０．１２／４４．２５モナチン：親／娘イオン：２９３．１１／１３０．１５。
実施例２−アッセイ手順＃１を用いたＤＡＴの活性
ベクターｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓは、ｐＳＥ４２０（Invitrogen, Carlsbad, CA）の派生物である。ｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓに関しては、ベクターをＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、Ｃ−Ｈｉｓを用いてライゲーションした。Ｃ−Ｈｉｓ：５’−ＣＣＡ ＴＧＧ ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＡＣＴ ＡＡＧ ＣＴＴ（配列番号：９７７）。このベクターのＨｉｓ−タグの発現は、宿主および終始コドンの選択に依存する。すなわち、ＴＡＧ終止コドンとｓｕｐＥ宿主とを用いた場合、このＨｉｓ−タグは発現され；ＴＡＧ終止コドンは用いるがｓｕｐＥ宿主を用いない場合、このＨｉｓ−タグは発現されない。特に明記しない限り、このＨｉｓ−タグはこれらの実験では発現しなかった。
以下のサブクローンを除いて、ＤＡＴサブクローンは、ｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓベクター／大腸菌ＨＭＳ１７４宿主（Novagen, San Diego, CA）であった：配列番号：９３０、９３２、９３６はｐＥＴ１０１Ｄ−Ｔｏｐｏベクター／ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）宿主（Invitrogen, Carlsbad, CA）であった；配列番号：９３４はｐＥＴ１０１Ｄ−Ｔｏｐｏベクター／ＢＬ２１コドンプラスＲＩＬ宿主（Stratagene, La Jolla, CA）であった；配列番号：９３８、９４２、９４４、９４６はｐＳＥ４２０ベクター／ＸＬ１Ｂｌｕｅ宿主（Stratagene, La Jolla, CA）であった；配列番号：９４０、９４８、９５０、９６２および９６６はｐＳＥ４２０−ｃ−Ｈｉｓベクター／ＸＬ１Ｂｌｕｅ宿主（Stratagene, La Jolla, CA）であった；ならびに配列番号：９２８はｐＱＥＴ１ベクター／Ｍ１５ｐＲＥＰ４宿主（米国特許第５，８１４，４７３号および第６，０７４，８６０号に記載のｐＱＥＴ１）（Qiagen; Valencia, CAからのＭ１５ｐＲＥＰ４）であった。
実施例１に記載の手順に従って、サブクローンを増殖させ、溶解させ、そして凍結乾燥させた。試料は、Ｒ，Ｒ−モナチンならびにＤ−トリプトファンに対する活性について試験した（実施例１に記載のように）。モナチンのＤＡＴ活性に関しては、ＤＡＴを、２５ｍＭのＲ，Ｒ−モナチン、２５ｍＭのピルビン酸ナトリウム塩および０．０８ｍＭのＰＬＰ（ｐＨ８）と一緒に３０℃でインキュベートした。Ｄ−トリプトファンＤＡＴアッセイに関しては、ＤＡＴを、１０ｍＭのＤ−トリプトファン、２５ｍＭのピルビン酸ナトリウム塩および０．０８ｍＭのＰＬＰ（ｐＨ８）と一緒に３０℃でインキュベートした。ＤＡＴはすべて、両方のアッセイで０．８ｍｇ／ｍＬの総タンパクでロードした。
表示の時点で、５０μＬの反応産物を、１５０μＬの氷冷アセトニトリルに加えた。試料を３０秒間激しく攪拌し、次いで上清をメタノールにて１０倍に希釈した。次に、試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析し（実施例１に記載のように）、形成されたＤ−アラニンをモニタした。以下の表は、両方の基質におけるＤ−アミノトランスフェラーゼ活性を示す。
表１：Ｒ，Ｒ−モナチンおよびＤ−トリプトファンに対するＤ−アミノトランスフェラーゼサブクローンの活性
Figure 0005683962
ＮＴ、試験していない；ＮＤ、用いた条件下では検出されず；＋、低い発現、＋＋、中程度の発現、＋＋＋、高い発現
表１：Ｒ，Ｒ−モナチンおよびＤ−トリプトファンに対するＤ−アミノトランスフェラーゼサブクローンの活性（続き）
Figure 0005683962
ＮＴ、試験していない；ＮＤ、検出されず；＋、低い発現、＋＋、中程度の発現、＋＋＋、高い発現
表１：Ｒ，Ｒ−モナチンおよびＤ−トリプトファンに対するＤ−アミノトランスフェラーゼサブクローンの活性（続き）
Figure 0005683962
ＮＴ、試験していない；ＮＤ、検出されず；＋、低い発現、＋＋、中程度の発現、＋＋＋、高い発現
以上で列記したサブクローンと配列標中にも存在するその天然配列との間には非常に保存的な差異が存在したことは注目すべきことである。例えば、非常にしばしば、大腸菌での発現がより効率的になるように、開始コドンまたは終始コドンがモディファイされた。野生型配列のクローニングはＤＡＴ活性に関して類似の結果を与えるであろうことが期待される。明確化を目的として、以下の表は、本明細書に記載されるクローンとサブクローンの数の間にある関係を示す。
Figure 0005683962
Figure 0005683962
Figure 0005683962
Figure 0005683962
パートＢ
実施例３−モナチン、ＭＰ、トリプトファン、アラニンおよびＨＭＧの検出
この実施例は、選抜されたＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＤＡＴ）酵素のさらなるキャラクタリゼーションに関連した分析方法論を記載する。
モナチンおよびトリプトファンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング（Multiple Reaction Monitoring、ＭＲＭ）分析
生化学反応に由来するモナチンおよびトリプトファンの混合物の分析は、クロマトグラフィーの間にシリーズで配置されたウォーターズ９９６フォトダイオード・アレイ（Photo-Diode Array、PDA）吸光度モニタを備えたウォーターズ２７９５液体クロマトグラフィーおよびマイクロマス（Micromass（登録商標））クアトロウルティマ（Quattro Ultima（登録商標））三連四重極質量分析器を含む、ウォーターズ／マイクロマス（Waters/Micromass（登録商標））液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）装置を用いて実施した。ＬＣ分離は、２．１ｍｍ×２５０ｍｍのＸｔｅｒｒａ ＭＳ Ｃ８逆相クロマトグラフィーカラムを用いて４０℃で行った。ＬＣ移動相は、Ａ）０．３％のギ酸と１０ｍＭのギ酸アンモニウムを含む水、およびＢ）０．３％のギ酸と１０ｍＭのギ酸アンモニウムを含むメタノールから構成された。
勾配溶出は、０分〜８．５分の５％Ｂ〜４５％Ｂの直線形式、８．５分〜９分の４５％Ｂ〜９０％Ｂの直線形式、９分〜１２．５分の９０％Ｂ〜９０％Ｂの定組成形式、１２．５分〜１３分の９０％Ｂ〜５％Ｂの直線形式であり、各試行の間には４分の再平衡化の期間を含んだ。流量は０．２７ｍＬ／分であり、ＰＤＡ吸光度は２１０ｎｍから４００ｎｍまでモニタした。ＥＳＩ−ＭＳのすべてのパラメータは、目的の検体のプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）の生成、および特有のフラグメントイオンの産生に基づいて最適化および選択した。以下の装置パラメータを、モナチンおよびトリプトファンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング（ＭＲＭ）分析のために用いた：キャピラリー：３．５ｋＶ；コーン（Cone）：４０Ｖ；ヘキス（Hex）１：２０Ｖ；アパーチャー（Aperture）：０Ｖ；ヘキス２：０Ｖ；ソース温度：１００℃；脱溶媒和温度：３５０℃；脱溶媒和ガス：５００Ｌ／時；コーンガス：５０Ｌ／時；低い質量分解能（Ｑ１）：１２．０；高い質量分解能（Ｑ１）：１２．０；イオンエネルギー：０．２；エントランス：−５Ｖ；衝突エネルギー：８；エグジット（Exit）：１Ｖ；低い質量分解能（Ｑ２）：１５；高い質量分解能（Ｑ２）：１５；イオンエネルギー（Ｑ２）：３．５；乗算器（Multiplier）：６５０。４つのモナチン特異的な親から娘へのＭＲＭ転移および１つのトリプトファン特異的な親から娘への転移が、インビトロおよびインビボ反応物中のモナチンおよびトリプトファンを特異的に検出するために用いられる。モニタされる転移は、２９３．０８から１５７．９４、２９３．０８から１６７．９４、２９３．０８から１３０．０１および２９３．０８から２５６．７７である。トリプトファンは、ＭＲＭ転移２０５．０から１４６．０を用いてモニタされる。モナチンおよびトリプトファンの内部標準定量化に関して、ｄ５−トリプトファンおよびｄ５−モナチンに対して各検体を４種の異なる比率で含む４個の較正標準を分析する。これらのデータを、線形最小二乗解析にかけ、モナチンおよびトリプトファンについての較正曲線を作成する。各試料に、固定量のｄ５−トリプトファンおよびｄ５−モナチン（ｄ５−モナチンは、国際公開第２００３／０９１３９６（Ａ２）号による方法に従ってｄ５−トリプトファンから合成した）を加え、応答比率（モナチン／ｄ５−モナチン；トリプトファン／ｄ５−トリプトファン）を上記の較正曲線と組み合わせて用い、混合物中での各検体の量を算出する。ｄ５−トリプトファンおよびｄ５−モナチンについてモニタされる親から娘への質量転移は、それぞれ、２１０．０から１５０．０、および２９８．１から１７２．０、および２９８．１から１６２．００である。
モナチンのキラルＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＭＲＭ）測定
生化学反応物中のモナチンの立体異性体分布の決定は、１−フルオロ−２−４−ジニトロフェニル−５−Ｌ−アラニンアミド（ＦＤＡＡ）により誘導化し、続いて逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭ測定によって達成した。
ＦＤＡＡによるモナチンの誘導化
５０μＬの試料または標準物および１０μＬの内部標準に、１００μＬのアセトン中１％のＦＤＡＡ溶液を加えた。１２μＬの１．０Ｍの重炭酸ナトリウムを加え、その混合物を随時攪拌しながら４０℃で１時間インキュベートした。試料を取り出し、冷却し、２０μＬの２．０Ｍ ＨＣｌを用いて中和した（より多くのＨＣｌが、緩衝性の生物学的混合物の中和を果たすために要求されうる）。脱気が完全に仕上がった後に、試料はＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析のための準備ができたこととなる。
モナチンの立体異性体分布の決定のためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング
分析は、以上の項に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ装置を用いて実施した。４種のモナチンの立体異性体をすべて分離することができるＬＣ分離（具体的には、ＦＤＡＡ−モナチン）は、フェノメネクス・ルナ（Phenomenex Luna（登録商標））２．０×２５０ｍｍ（３μｍ）Ｃ１８逆相クロマトグラフィーカラム上で４０℃にて実施した。そのＬＣ移動相は、Ａ）０．０５％（質量／容量）の酢酸アンモニウムを含む水、およびＢ）アセトニトリルで構成された。溶出は、０分〜２分の１３％Ｂの定組成、２分〜１５分の１３％Ｂ〜３０％Ｂの直線形式、１５分〜１６分の３０％Ｂ〜８０％Ｂの直線形式、１６分〜２１分の８０％Ｂの定組成、および２１分〜２２分の８０％Ｂ〜１３％Ｂの直線形式であり、試行の間には８分の再平衡化の期間を含んだ。流量は０．２３ｍＬ／分であり、ＰＤＡ吸光度は２００ｎｍから４００ｎｍまでモニタした。ＥＳＩ−ＭＳのすべてのパラメータは、ＦＤＡＡ−モナチンの脱プロトン化分子イオン（［Ｍ−Ｈ］−）の生成、および特有のフラグメントイオンの産生に基づいて最適化および選択した。
以下の装置パラメータを、ネガティブイオンＥＳＩ／ＭＳモードでのモナチンのＬＣ／ＭＳ分析のために用いた：キャピラリー：３．０ｋＶ；コーン：４０Ｖ；ヘキス１：１５Ｖ；アパーチャー：０．１Ｖ；ヘキス２：０．１Ｖ；ソース温度：１２０℃；脱溶媒和温度：３５０℃；脱溶媒和ガス：６６２Ｌ／時；コーンガス：４２Ｌ／時；低い質量分解能（Ｑ１）：１４．０；高い質量分解能（Ｑ１）：１５．０；イオンエネルギー：０．５；エントランス：０Ｖ；衝突エネルギー：２０；エグジット：０Ｖ；低い質量分解能（Ｑ２）：１５；高い質量分解能（Ｑ２）：１４；イオンエネルギー（Ｑ２）：２．０；乗算器：６５０。３つのＦＤＡＡ−モナチン特異的な親から娘への転移を、インビトロおよびインビボ反応物中のＦＤＡＡ−モナチンを特異的に検出するために用いた。モナチンについてモニタされた転移は、５４２．９７から２６７．９４、５４２．９７から４９９．０７、および５４２．９７から５２５．０４であった。モニタされたモナチンの内部標準誘導体質量転移は、５４８．２から５３０．２であった。ＦＤＡＡ−モナチン立体異性体の同定は、精製されたモナチン立体異性体と比較したクロマトグラフィーの保持時間、および質量分析スペクトルデータに基づいた。内部標準は、反応過程をモニタするために、およびＳ，Ｓ立体異性体の保持時間の確認のために用いた。
トリプトファン、モナチン、アラニンおよびＨＭＧを含む、アミノ酸の液体クロマトグラフィー−ポストカラム蛍光検出
トリプトファン、モナチンおよびアラニンのための手順
生化学反応物中のアミノ酸を検出するためのポストカラム蛍光検出を用いた液体クロマトグラフィーは、ウォーターズ２６９０ＬＣシステム、またはウォーターズ４７４走査型蛍光検出器およびウォーターズ・ポストカラム・リアクションモジュールを備えた同等物にて実施した（ＬＣ／ＯＰＡ法）。ＬＣ分離は、インターラクション−ソディウム・ローデッド（Interaction-Sodium loaded）イオン交換カラムにて６０℃で実施した。移動相Ａは、ピカリング（Pickering）Ｎａ３２８緩衝液（Pickering Laboratories, Inc.; Mountain View, CA）であった。移動相Ｂは、ピカリングＮａ７４０緩衝液であった。勾配溶出は、０分〜２０分の０％Ｂ〜１００％Ｂ、２０分〜３０分の１００％Ｂの定組成、および３０分〜３１分の１００％Ｂ〜０％Ｂの直線形式であり、試行の間に２０分の再平衡化の期間を含んだ。移動相の流量は０．５ｍＬ／分であった。ＯＰＡポストカラム誘導溶液の流速は、０．５ｍＬ／分であった。蛍光検出器の設定は、Ｅｘ３８８ｎｍおよびＥｍ４２５ｎｍであった。ノルロイシンを、分析の内部標準として用いた。アミノ酸の同定は、精製された標準物についてのクロマトグラフィーの保持時間のデータに基づいた。
ＨＭＧの手順
生化学反応由来の試料を、パッキング材料としてＣ１８を含む固相抽出（solid phase extraction、ＳＰＥ）カートリッジ、および溶出液としての０．６％酢酸により清澄化した。次いで、ＳＰＥからの回収した画分を、既知の体積にし、蛍光検出器を備えたＨＰＬＣポストカラムＯ−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）誘導化を用いて分析した。クロマトグラフィー分離は、ウォーターズ２６９５液体クロマトグラフィーシステムと直列での２個のフェノメネクス・アクア（Phenomenex Aqua）Ｃ１８カラム；５μｍ粒子の２．１ｍｍ×２５０ｍｍカラムおよび３μｍ粒子の２．１ｍｍ×１５０ｍｍカラムを用いることで可能となった。カラム温度は４０℃であり、カラム定流速は０．１８ｍL／分であった。移動相は、０．６％酢酸であった。ＯＰＡポストカラム誘導化および検出系は、ウォーターズ・リージェント・マネージャ（ＲＭＡ）、反応コイルチャンバー、この反応コイルチャンバーに対する温度調節モジュール、およびウォーターズ２８４７蛍光検出器から構成される。ＯＰＡ流量は０．１６ｍＬ／分に設定し、反応コイルチャンバーは８０℃に設定した。蛍光検出器は、３４８ｎｍの励起波長および４５０ｎｍの発光波長を備えていた。検出器感度を調節するたのパラメータ、例えばシグナル増強および減衰は実験の必要性に合わせて設定した。ＨＭＧの定量化は、グルタミン酸のモル応答に基づいた。
ＬＣ／ＭＳによるＭＰの検出
液体クロマトグラフィー分離は、ウォーターズ２６９０液体クロマトグラフィーシステムおよび２．１ｍｍ×５０ｍｍのアギレント・エクスリプス（Agilent Eclipse）ＸＤＢ−Ｃ１８ １．８μｍの逆相クロマトグラフィーカラムを用い、流速０．２５ｍL／分にて、以下の勾配条件を用いて行った：
Figure 0005683962
移動相Ａは１０ｍＭのギ酸アンモニウムを含む０．３％（ｖ／ｖ）ギ酸であり、移動相Ｂは５０：５０のメタノール／アセトニトリル中、０．３％ｗのギ酸／１０ｍＭのギ酸アンモニウムであった。カラム温度は４０℃であった。
ネガティブエレクトロスプレーイオン化モード（−ＥＳＩ）で作動させるマクロマス（Micromass）ＺＱ四重極質量分析器のパラメータは以下のように設定した：キャピラリー：２．２ｋＶ；コーン：３５Ｖ；抽出器（Extractor）：４Ｖ；ＲＦライン：１Ｖ；ソース温度：１２０℃；脱溶媒和温度：３８０℃；脱溶媒和ガス：６００Ｌ／時；コーンガス：オフ；低い質量分解能：１５．０；高い質量分解能：１５．０；イオンエネルギー：０．２；乗算器（Multiplier）：６５０。単一イオンモニタリング（sngle ion monitoring）ＭＳ実験は、ｍ／ｚ２９０．３、２１０．３、１８４．３および２０８．４について選択的に検出を可能にするように設定した。ｍ／ｚ２０８．４は、内部標準であるｄ５−トリプトファンの脱プロトン化分子［Ｍ−Ｈ］−イオンである。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによるＭＰの検出
ＬＣ分離は、ウォーターズＨＰＬＣ液体クロマトグラフィーシステムおよび２．１ｍｍ×５０ｍｍのアギレント・エクスリプス（Agilet Eclipse）ＸＤＢ−Ｃ１８ １．８μｍの逆相クロマトグラフィーカラムを用い、流速０．２５ｍＬ／分で、以下の勾配条件を用いて行った：
Figure 0005683962
移動相Ａは１０ｍＭのギ酸アンモニウムを含む０．３％（ｖ／ｖ）であり、移動相Ｂは５０：５０のメタノール／アセトニトリル中に１０ｍＭのギ酸アンモニウムを含む０．３％のギ酸であった。カラム温度は、４０℃であった。
ネガティブエレクトロスプレーイオン化モード（−ＥＳＩ）で作動させるＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多重反応モニタリング（ＭＲＭ）実験のためのウォーターズ・プレミア（Premier）ＸＥ三連四重極質量分析器のパラメータは以下のように設定した：キャピラリー：３．０ｋＶ；コーン：２５Ｖ；抽出器：３Ｖ；ＲＦライン：０Ｖ；ソース温度：１２０℃；脱溶媒和温度：３５０℃；脱溶媒和ガス：６５０Ｌ／時；コーンガス：４７Ｌ／時；低い質量分解能（Ｑ１）：１３．５；高い質量分解能（Ｑ１）：１３．５；イオンエネルギー（Ｑ１）：０．５Ｖ；エントランス：１Ｖ；衝突イオンエネルギー：１８Ｖ；エグジット１：１９；低い質量分解能（Ｑ２）：１５；高い質量分解能（Ｑ２）：１５；イオンエネルギー（Ｑ２）：２．０；乗算器：６５０。４種の親−娘ＭＲＭ転移をモニタし、モナチン前駆体（ＭＰ）およびｄ５−モナチン前駆体（ｄ５−ＭＰ）を選択的に検出した；ｄ５−ＭＰは内部標準（Ｉ．Ｓ．）として用いた。その４種のＭＲＭ転移は、２９０．１から１８４．１、２９０．１から２１０．１、２９０．１から２２８．１、および２９５．１から１８９．１であった。これらの転移のうちの２つ、ＭＰに関する２９０．１から１８４．１およびｄ５−ＭＰに関する２９５．１から１８９．１は、較正曲線を作成するためと定量の目的のために用いた。２９０．１から２１０．１への転移および２９０．１から２２８．１への転移はＭＰの定性的な二次的確認として用いた。
標準物用のおよびアッセイ用のモナチンおよびＭＰの製造
モナチンの製造
米国特許第５，１２８，４８２号に記載のようにＲ，ＲとＳ，Ｓモナチンのラセミ混合物を合成して製造した。Ｒ，ＲおよびＳ，Ｓモナチンは、誘導化と加水分解工程によって分割した。概説すると、モナチンラセミ混合物をエステル化し、その遊離アミノ基をカルバマゼピン（ＣＢＺ）によりブロックし、ラクトンを形成させ、そのＳ，Ｓラクトンを固定化したタンパク質分解酵素を用いて選択的に加水分解した。モナチンはまた、Bassoliら、Eur. J. Org. Chem., 8:1652-1658, (2005）に記載されるように分割することができる。
ＭＰ製造
Ｒ−ＭＰは、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液中のＡＴ−１０３広範囲（broad range）Ｄ−アミノトランスフェラーゼ（BioCatalytics, Pasadena, CA）を用い、アミノ受容体としてピルビン酸ナトリウムを用いて、Ｒ，Ｒモナチンのアミノ交換により製造した。Ｓ−ＭＰは、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液中のＡＴ−１０２Ｌ−アミノトランスフェラーゼ（BioCatalytics）を用い、アミノ受容体としてピルビン酸ナトリウムを用いて、Ｓ，Ｓモナチンのアミノ交換により製造した。反応は両方とも、３０℃で、ｐＨ約８．０−８．３にて約２０時間行った。化合物は両方とも、ＲｏｈｍおよびＨａａｓ（Philadelphia, PA）疎水性樹脂（ＸＡＤ（登録商標）１６００）を備えた製造規模のＨＰＬＣを用い、水に溶出して精製した。９０％を超える純度のモナチン前駆体を含む試料を集め、凍結乾燥させた。
実施例４−タンパク質調製方法
この実施例では、クローニング、発現、細胞抽出物の調製、タンパク質精製、および選抜したＤＡＴの二次的キャラクタリゼーションのためのタンパク質定量に用いられる方法論を記載する。
当業者であれば、サブクローニングした核酸（例えば、断片）または他の修飾を施した核酸（例えば、タグ付き）によりコードされるポリペプチドに活性があれば、その全長のまたは野生型の核酸にコードされる対応するポリペプチドに活性が存在することの予兆であると考えられることは理解されるであろう。
ＴｏｐｏプラスミドにクローニングするためのＤＡＴコード遺伝子の増幅
ＴｏｐｏクローニングのためのＰＣＲ反応（ストラタジーン（Stratagene）のＰｆｕＴｕｒｂｏまたはクローン化されたＰｆｕのいずれかを用いる）は以下のとおりであった：ポリメラーゼ酵素用の１×の推奨緩衝液、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー、および５０μｌの反応液あたり１μｌのポリメラーゼ（２．５ユニット）。この反応液は、反応液あたり約５ｎｇ〜約１００ｎｇの鋳型ＤＮＡを含んだ。９４℃で２分間のホットスタートをＰＣＲに用い、同様に９４℃の融解温度を用いた。アニーリング温度は、プライマーのＴｍに依存し、３０秒または６０秒のいずれかであった。伸長温度（７２℃）は少なくとも１ｋｂあたり２分間であった。反応産物は通常１×ＴＡＥ１％アガロースゲルにおいて分離され、適当なサイズのバンドを、１０μｌ〜５０μｌ溶出容量を用いたことを除いて製造業者により推奨するとおりにキアクイック・ゲルエクストラクション（QIAquick Gel Extraction）キットを用いて精製した。精製したＰＣＲ産物の１μｌ〜４μｌの容量を用いて、ｐＣＲＩＩ−ＴｏｐｏＢｌｕｎｔプラスミド（Invitrogen, Carlsbad, CA）に製造業者により推奨されるとおりにライゲーションした。
非タグ付き発現用ｐＥＴ３０ａへのＤＡＴのクローニング
配列番号：９４５、９４７、９４９、８９１、８９３、８６９、８７３、８７７、８８１、８８３および８９５（配列番号：９４６、９４８、９５０、８９２、８９４、８７０、８７４、８７８、８８２、８８４および８９６に記載の配列を有するポリペプチドをコードする）で示される配列を有するＤＡＴを、プラスミドまたはＰＣＲ産物からＰｆｕＴｕｒｂｏ（Stratagene, La Jolla, CA）および５’端にＮｄｅＩおよび３’端にＮｏｔＩまたはＢａｍＨＩのいずれかの制限酵素部位を付加したプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ断片を、製造業者により推奨されるようにしてｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏ（Invitrogen, Carlsbad, CA）中にクローニングした。その配列を、配列決定（Agencourt, Beverly, MA）により確認し、次いで正しい配列を有するインサートを適当な制限酵素を用いてそのベクターから切り出し、ｐＥＴ３０ａのＮｄｅＩおよびＮｏｔＩ（またはＢａｍＨＩ）制限部位にライゲーションした。具体的なプライマーについては表２を参照のこと。
配列番号：１５５の配列を有するＤＡＴ核酸（配列番号：１５６を有するポリペプチドをコードする）をＰｆｕＴｕｒｂｏ（Stratagene）および５’端と３’端にそれぞれＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を付加したプライマーを用いて増幅した。ＰＣＲ断片を、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いて消化し、ｐＥＴ３０ａのＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にライゲーションした。具体的なプライマーについては表２を参照のこと。配列番号：１５６の配列を有するポリペプチドが、０．９９１の確率で（Nielsen, 1997, Protein Engineering, 10:1-6に記載されるように、SignalPにより決定した）、以下のリーダー配列を含み得ることに注意すべきである：ＫＮＳＰＩＩＡＡＹＲＡＡＴＰＧＳＡＡＡ（配列番号：１０８４）。推定のリーダー配列を含むこのＤＡＴポリペプチドをコードする核酸をクローン化した。
表２． 増幅用のプライマー
Figure 0005683962
部位特異的変異導入
部位特異的変異導入は、クイックチェンジ複数部位特異的変異導入キット（QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit）（Stratagene, La Jolla, CA）を用い、製造業者の指示に従って実施した。配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎ変異体を作り出すために、実施例１０に記載のｐＥＴ３０ａの非タグ付き構築物を鋳型として用いた。配列番号：２２０ Ｇ２４０Ｎおよび配列番号：２２０ Ｔ２４１Ｎ変異体を作り出すために、実施例１０に記載のＣ末端にＨｉｓタグを有するｐＥＴ３０ａ構築物を鋳型として用いた。用いた変異導入プライマーを、以下の表３に列記する。所望の変異体はすべて、ＤＮＡ配列決定により確認した。
表３．プライマー配列
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非タグ付きタンパク質として発現させるためのｐＥＴ３０ａにおけるＤＡＴ ＰＣＲ産物のクローニング
配列番号：177, 179, 153, 165, 181, 217, 187, 189, 207, 219, 215, 195, 199, 197, 209, 201, 221, 235, 203, 237, 239, 223, 225, 227, 229, 231, 245, 213, 155, 169, 171, 167, 173および175で示される配列を有するＤＡＴ核酸（配列番号：178, 180, 154, 166, 182, 218, 188, 190, 208, 220, 216, 196, 200, 198, 210, 202, 222, 236, 204, 238, 240, 224, 226, 228, 230, 232, 246, 214, 156, 170, 172, 168, 174および176で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドをコードする）を、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩに適応する末端を有し、かつ切断効率を改善するための外来のヌクレオチドを有するＰＣＲ産物として得た。
ＤＡＴ ＰＣＲ産物は、５’端にＮｄｅＩ制限酵素部位および３’端にＮｏｔＩ部位を含んだ。まず、そのＰＣＲ断片をｐＣＲ４ ＴＯＰＯまたはｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）中にクローニングした。ＤＮＡ配列を配列決定により確認した後、ＤＡＴ遺伝子をＮｄｅＩおよびＮｏｔＩの消化によりＴＯＰＯプラスミドから切り出し、同じ制限酵素を用いて切断したｐＥＴ３０ａベクターにライゲーションした。ＮｄｅＩまたはＮｏｔＩのいずれかの部位を含むＤＡＴ遺伝子を、適応する制限酵素部位を有するプライマーを用いて内在的に増幅し、ｐＥＴ３０ａにクローン化した。例えば、配列番号：１５５を有するＤＡＴ核酸（配列番号：１５６の配列を有するポリペプチドをコードする）を、ｐＥＴ３０ａ中にクローニングするためにＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を用いた元のＰＣＲ産物から再び増幅した。
Ｃ−Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質として発現させるためのｐＥＴ３０ａにおけるＤＡＴのクローニング
ＤＡＴ４９７８およびＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎ（実施例６に記載される）、配列番号：８７０（プラスミドｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓから発現される）、および配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎ、配列番号：１７６および配列番号：２２０（ｐＥＴ３０から発現される非タグ付き形式）をコードする核酸を、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Stratagene）および終止コドンのすぐ上流にＸｈｏＩ部位を配置したプライマーを用いて再び増幅した。ＰＣＲ断片を、製造業者による推奨のとおりにｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏ（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングし、またｐＥＴ３０ａのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位に直接クローニングした。その配列は配列決定（Agencourt, Beverly, MA）により確認し、次いで正しい配列を有するインサートをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いてベクターから切り出し、そのインサートをｐＥＴ３０ａのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位にライゲーションした。具体的なプライマーおよびプラスミド名については表４を参照のこと。
表４．プライマー配列
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ＣｂＤＡＴおよびＣａＤＡＴのクローニング
クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）のＤ−アミノトランスフェラーゼを、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（Stratagene）、およびＣ．ベイジェリンキ・ゲノムＤＮＡ、５’端にＮｄｅＩおよび３’端にＮｏｔＩ制限部位を含むＰＣＲプライマーと共に用いてＰＣＲ増幅した。ゲノムＤＮＡを、ピュールジーン（Purrgene）ゲノムＤＮＡ精製キット（Gentra Systems, Minneapolis, MN）を製造業者の指示に従って用い、Ｃ．ベイジェリンキ（ＡＴＣＣ５１７４３）から抜き出した。
８２４ｂｐのＰＣＲ産物を、キアゲン（Qiagen）ゲルエクストラクションキット（Gel Extraction Kit）を用いてゲルから抜き出し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−Ｔｏｐｏ（Invitrogen）にＴＯＰＯクローニングした。配列を確認した後、その遺伝子をＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ切断したｐＥＴ２８ｂおよびｐＥＴ３０ａベクターにラピッド・ライゲーションキット（Rapid Ligation Kit；Roche）を用いてライゲーションした。Ｃ．アセトブチリカム（acetobutylicum）ＤＡＴを、ゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ８２４）およびストラタジーン・オプティプライム（Optiprime）ＰＣＲキットを５’端にＮｄｅＩおよび３’端にＮｏｔＩを含むＰＣＲプライマーと共に用いて、ＰＣＲにより増幅した。うまく得られたＰＣＲ反応物を、ｐＣＲ４ ＴＯＰＯベクター中にクローニングし、ＴＯＰＯクローンを配列決定した。陽性ＴＯＰＯクローンを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、そのＤＡＴ断片を、同じ制限酵素を用いて消化したｐＥＴ３０ａにライゲーションした。
表５．プライマー配列
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ＬｓＤＡＴのインビトロ合成
ラクトバチルス・サルバリウス（Lactobacillus salivarius）DATを、Stemmerら、1995, Gene, 164:49-53に基づいた改訂方法を用いてアセンブルした。概説すると、センス鎖とアンチセンス鎖の間に重なる２０塩基対を有する、４３個のオリゴヌクレオチド（主として４０マー）を、その遺伝子配列およびその相補ＤＮＡ配列に基づき、ＩＤＴに注文した。プライマーリストに関しては表６を参照のこと。そのプライマーを水中に２５０μMにまで希釈し、５μLの各プライマーをマイクロチューブ中で混合して一緒にした。ＰＣＲは以下のように行った：１００μＬの反応液あたり、１．５μＬのプライマープール、４μＬのｄＮＴＰ、１×ＸＬ ＰＣＲ緩衝液、１ｍＭの酢酸マグネシウム、２μＬのｒＴｔｈポリメラーゼ（Roche, Indianapolis, IN）、および０．２５μＬのＰｆｕポリメラーゼ（Stratagene, La Jolla, CA）を加えた。３分間のホットスタートを９４℃で行い、続いて９４℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、そして６８℃で１５秒間のサイクルを１５回行った。さらに１０サイクルを、（６８℃での）３０秒間の伸長時間を用いて行った。さらに１０サイクルを７５秒間の伸長時間を用いて行った。最後に、鎖伸長過程を、６８℃で７分間行った。
表６．ＬｓＤＡＴを合成するために用いたオリゴ
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プライマーＬ．ｓａｌ ＤＡＴ Ｒ ＮｏｔＩおよびＬ．ｓａｌ ＤＡＴ Ｆ ＮｄｅＩ（以下）を用いた第二の増幅は、結果的に正しい分子量のバンドをもたらした。この第二の増幅のプライマー配列については表７を参照のこと。
表７．プライマー配列
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第二のＰＣＲ反応は、２個のプライマーのみを加えることを除いて上記と同じように調製した。ＰＣＲの鋳型に関しては、最初のＰＣＲ反応液２．５μｌを用いた。３分間のホットスタートを９４℃で行い、続いて９４℃で３０秒間、４２℃で３０秒間、そして６８℃で１５秒間のサイクルを１０回行った。さらに１０サイクルを、高めたアニーリング温度４８℃で３０秒間、（６８℃での）３０秒間の伸長を行った。最後に、鎖伸長工程を、６８℃で７分間行った。
その断片を、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、ＴＯＰＯクローンを配列決定した。陽性のＴＯＰＯクローンを、ＮｄｅＩおよびＮｏｔＩを用いて切断し、ＤＡＴ断片を、同じ制限酵素を用いて消化したｐＥＴ３０ａベクターにライゲーションした。
酵素の調製
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ｐＥＴ由来のプラスミドからのＤＡＴ発現のための宿主株として用いた。大腸菌株ＴＯＰ１０は、他の全てのＤＡＴ構築物において使用した。所望の構築物の単一コロニーは、典型的には、適当な量の抗生物質を含むオーバーナイトエクスプレス（Overnight Express）ＩＩ培地（Novagen）に植菌した。３０℃で一晩の培養に続いて、ＯＤ６００が１０を超えた時に、細胞を遠心分離により回収した。別には、一晩培養物を適当な抗生物質を含むＬＢ培地に培養物を植菌するために利用した。培養物を３０℃で増殖させ、ＯＤ６００を０．５〜０．９にし、タンパク質発現は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて同じ温度で４時間誘導した。
５μＬ／ｍＬのプロテアーゼインヒビターカクテルＩＩ（Protease Inhibitor Cocktail II；EMD Bioscience/Calbiochemカタログ番号５３９１３２）、１μｌ／ｍｌのベンゾナーゼ・ヌクレアーゼ（Benzonase（登録商標）Nuclease；EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７０７４６）および０．０３３μｌ／ｍｌのｒ−リソザイム（Lysozyme（商標））溶液（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７１１１０）を含むバッグバスター（第一級アミン不含）抽出試薬（BugBuster（登録商標）（primary amine-free）Extraction Reagent；EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７０９２３）を細胞に、細胞ペレット１ｇあたり５ｍＬまたは一晩の培養物５０ｍＬあたり５ｍＬ加えることにより、細胞抽出物を調製した。細胞再懸濁液を室温で１５分間穏やかに攪拌しながらインキュベートした。１６，１００ｒｃｆで２０分間４℃での遠心分離に続いて、無細胞抽出液としてその上清を取り出した。
モナチン反応のために酵素調製物を用いる前に、洗剤および低分子量の化合物を、０．０５ｍＭのＰＬＰを含むリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）またはＥＰＰＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．２）用いて予め平衡化したＰＤ−１０カラム（GE Healthcare, Piscataway, NJ）に通じて細胞抽出液から取り除いた。タンパク質を、平衡緩衝液を用いて溶出した。典型的には、蛋白質濃度は、基準としてＢＳＡ（Pierce）を用いるバイオラッド・クマシー（Coomassie）プレートアッセイ（ブラッドフォードアッセイとしても知られている）を用いて決定した。場合により、ＢＣＡ（Pierce）マイクロタイタープレートアッセイを、タンパク質決定のために用いたことを、ここに注記する。無細胞抽出液中のＤ−アミノトランスフェラーゼの濃度を評価するために、１ｍｇ／ｍｌの試料をエクスペリオン（Experion）（Bio-Rad, Hercules, Ca）電気泳動システムにロードし、エクスペリオン・ソフトウェア（バージョン２．０．１３２．０）を用いて無細胞抽出液中の可溶性ＤＡＴタンパク質のパーセンテージを計算した。別法として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、可視評価を発現のパーセンテージを見積もるために行った。
Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質は、ＧＥヘルスケア（GE Healthcare）キレーティングセファロース・ファストフロウ樹脂かノバジェン（Novagen）ヒス−バインド（His-Bind）カラムのいずれかを用いて精製した。セファロース樹脂を用いた精製は、無細胞抽出液を、２００ｍＭの塩化ナトリウムおよび０．０５０ｍＭのＰＬＰを含むリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）を用いて予め平衡させたカラムにロードすることを含んだ。次いで、そのカラムを、３〜５カラム容量の平衡緩衝液、２５ｍＭのイミダゾールを含む３〜５カラム容量の平衡緩衝液、そして５０〜１００ｍＭのイミダゾールを含む３〜５カラム容量の平衡緩衝液を連続して用いて洗浄した。Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、５００ｍＭのイミダゾールを含む３〜５カラム容量の平衡緩衝液を用いてカラムから溶出した。溶出物を、アミコン（Amicon；Billerica, MA）セントリコン（Centricon）−７０を用いて濃縮した。濃縮したタンパク質溶液中のイミダゾールおよび塩化ナトリウムは、５０μＭのＰＬＰを含むリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．８）（ＤＡＴ４９７８およびＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎについて）またはＥＰＰＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ８．２）（配列番号：８７０および配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎ）を用いて予め平衡化したＰＤ１０脱塩カラムに通じて除去した。タンパク質濃度は、バイオラッド・プロテインアッセイ（Bio-Rad）および基準としてアルブミン（Pierce）を用いて決定した。精製した酵素の一部試料（０．５ｍｌ〜１ｍｌ）を使用するまで−８０℃で保存した。製造業者の指示に従った、ヒス−バインド（His-Bind）カラムを用いたＨｉｓタグ付きタンパク質の精製。カラムからの溶出液は、上記のようにＰＤ１０を用いて脱塩した。
実施例５ Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性についてのアッセイ手順＃２
モナチン産生アッセイ（標準）
以下の成分を合した：１００ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．２；２００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；１００ｍＭのＤ−トリプトファン；５０μＭのＰＬＰ；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０；実施例６記載の５０μｇ／ｍＬのアルドラーゼ（無細胞抽出液を用いた；アルドラーゼ濃度は、エクスペリオン・チップ（Experion chip）から読み取るパーセンテージに基づいた）および適当な量のＤＡＴ（典型的には０．１〜１ｍｇ／ｍＬ）。
ＰＬＰ保存溶液およびタンパク質溶液を除いて、全ての他の試薬は、無酸素脱イオン水を用いて作製し、嫌気チャンバー中で保存した。反応液は、恒常的に穏やかに混合しながら室温にて嫌気チャンバー中で調製した。時点を測るために、ギ酸を、反応混合物の一部試料に終濃度２％（ｖ／ｖ）となるように加えた。ベンチトップ型のマイクロチューブを用いて１６，１００ＲＣＦで５分間の遠心分離後に、その上清を０．２μｍのナイロン膜フィルターに通じて濾過した。次いで、試料を水を用いて２０倍〜１００倍に希釈して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析した。
Ｄ−トリプトファンアミノ基転移アッセイ
特定のＤ−アミノトランスフェラーゼのＤ−トリプトファンアミノ基転移活性を比較するために、以下のアッセイを実施した。このアッセイ混合物は、Ｄ−ＡＴを含む０．５ｍｇ／ｍＬの細胞抽出タンパク質；４０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ８．０；２０ｍＭのＤ−トリプトファン；１００ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび５０μＭのＰＬＰを含んだ。このアッセイ物を、３７℃で３０分間インキュベートし、次いで氷上に置いた。
反応進行度は、以下のアッセイを用いて形成されるインドール−３−ピルベートの量を測定することにより調べた：５μｌ、１０μｌおよび２０μｌの反応混合物に、２００μｌの以下の溶液を加えた：０．５ｍＭのヒ酸ナトリウム；０．５ｍＭのＥＤＴＡ；および５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ８．５）。インドール−３−ピルベート・エノール−ホウ酸複合体の３２５ｎｍでの吸光度を、同じ溶液中で調製されたインドール−３−ピルベートの標準曲線と比較した。
アラニン形成はまた、Ｄ−トリプトファンアミノ基転移反応の進行度を調べるために用いることができる。アラニンの濃度は、実施例３に記載されるように決定した。
Ｒ，Ｒモナチンアミノ基転移アッセイ
アッセイ条件（終量２ｍＬ）は、０．０１％のＴｗｅｅｎ；１００ｍＭのＥＰＰＳ ｐＨ８．２；１００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；約３ｍＭのＲ，Ｒモナチン；０．５ｍｇ／ｍＬのＤＡＴ；および５０μＭのＰＬＰを含んだ。反応の進行度は、実施例３に記載のプロトコルを用いて形成されるアラニンまたはＲ−ＭＰの検出によりモニタした。
実施例６−ＤＡＴおよびアルドラーゼを得るための方法
この方法は、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを用いたモナチン形成において用いられるアルドラーゼのクローニング、および比較を目的として用いた事前に単離したＤ−アミノトランスフェラーゼを記載する。
アルドラーゼ
Ｄ−トリプトファンからのモナチン産生アッセイにおいて用いたアルドラーゼを単離し、国際公開第２００７／１０３３８９号に記載されるようにｐＥＴベクターにサブクローニングした（配列番号：２７５の核酸によりコードされる配列番号：２７６のアルドラーゼとしての応用を参照されたい）。
ＤＡＴおよびＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎ
ＡＴＣＣ＃４９７８（ＤＡＴ４９７８）由来のＤ−アミノトランスフェラーゼを、米国特許出願公開第２００６／０２５２１３５号に記載のようにクローニングした。Ｔ２４３Ｎ変異体を、ｐＥＴ３０（非タグ付き）ＤＡＴ４９７８構築物を用いて作製した。
変異導入のためのプライマーは、ストラタジーン（Stratagene）マルチチェンジキット（Multi-Change kit）（La Jolla, CA）に列記された提案に従って設計した。プライマーの５’はリン酸化した。変異導入は、製造業者の指示に従ってストラタジーン・マルチチェンジキットを用いて行った。変異導入オリゴヌクレオチド配列を表８に示す。
表８．変異導入オリゴヌクレオチド配列
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大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞（Stratagene）を形質転換し、結果物の精製プラスミド調製物を配列決定して、正しく変異が組み込まれたことを確認した。次いで、ＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎを含むプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）発現宿主に形質転換した。
Ｂ．スフェルカスＤＡＴ
Ｂ．スフェリカス（sphaericus）（ＡＴＣＣ番号 １０２０８）のＤ−アミノトランスフェラーゼを、米国特許第２００６／０２５２１３５号に記載されるようにクローニングした。同文献に記載されたように、タンパク質を調製した。
実施例７−ＤＡＴの分析
配列番号：９２８、９３０、９３２、９３４、９３６、９３８、９４０、９４２、９４４、９４６、９４８および９５０で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドを、実施例２に記載されるベクター中のおよび適合する大腸菌発現宿主中の対応する核酸を発現させることにより産生した。当業者であれば、アセンブリＰＣＲ技術、例えば実施例４に記載される技術を用いて、これらのＤ−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を合成することができる。カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地の一晩培養物を、同じ培地１００ｍＬにて１００倍に希釈し、５００ｍＬのバッフル付フラスコにて増殖させた。この培養物を３０℃でＯＤ６００が０．５〜０．９になるまで増殖させ、タンパク質発現は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて同温度で４時間誘導した。総タンパク質のための試料を、回収前に素早く取得した。細胞は遠心分離により回収し、１０ｍＬのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８を用いて一度洗浄した。細胞は、細胞抽出物を調製するまで−８０℃で素早く凍結した。
細胞抽出物を調製し、溶出するためのおよびＰＤ１０カラムを平衡化するための緩衝液として１００ｍＭのリン酸カリウムを用いて、実施例４に記載のように脱塩した。総タンパク質およびＤＡＴ濃度は、記載のように決定した。
アミノ受容体としてピルベートを用いたＲ，Ｒモナチンのアミノ基転移は、１０ｍＭのＲ，Ｒモナチンを利用したことを除いて実施例５に記載のように実施した。アラニン、モナチンおよびモナチン前駆体レベルの初期分析は互いに一致しなかったが、結果は定性的に考えられる。配列番号：９４８の配列を有するＤＡＴポリペプチドは、モナチン前駆体形成を示すようであった。
活性のさらなる立体配置について、モナチン形成アッセイを、約０．２ｍｇ／ｍＬのＤＡＴ濃度を用いた方法に記載のとおりに行った。対照として、０．２ｍｇ／ｍＬ濃度の精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴを評価した。２時間および２１時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％となるよう加え、その試料を凍結した。次いで、試料を融解し、回転させ、濾過した。試料は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチンに関して、ならびに実施例３に記載のＬＣ／ＯＰＡポストカラム蛍光方法論を用いてトリプトファンおよびアラニンに関して分析した。配列番号：９４６および９５０の配列を有するＤＡＴポリペプチドは、試験した条件下でＲ，Ｒモナチンを形成できた。配列番号：９４８の配列を有するＤＡＴポリペプチドは、トリプトファンの消失およびアラニン形成の増加を示し、これは、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼとしてのその活性を実際に示すものである。配列番号：９４６の配列を有するＤＡＴポリペプチドは、総タンパク質量により決定されたところでは良好に発現されていたが、可溶性が高くなかった。このことは、幾つかの矛盾する結果を明らかにする。配列番号：９３０、９３２、９４０、９４２，および９４４で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析において目視可能なバンドを示さなかったが、それゆえに、別の条件下で発現された場合には活性であるかもしれない。結果については表９を参照のこと。
表９．ＤＡＴ活性
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ｎｄ＝試験した条件下では検出されず
ｐＥＴ３０ａにおけるＤＡＴポリペプチドの分析
配列番号：９４６、９４８および９５０の配列を有するＤＡＴポリペプチドを、実施例４に記載のようにｐＥＴ３０ａにサブクローニングした。ｐＥＴ３０ａ中にＤＡＴを含む大腸菌株ＢＬ２１ ＤＥ３の二重の培養物を、オーバーナイトエクスプレスＩＩ（溶液１〜６, Novagen）にて両方とも２５℃および３０℃で一晩増殖させた。対照として、インサートを含まないｐＥＴ３０ａプラスミドを含む株もまた増殖させた。細胞をＯＤ６００が５〜１０のときに回収した。細胞は、遠心分離により回収し、１０ｍＬの１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８を用いて一度洗浄し多。細胞は、さらに処理するまで−８０℃で凍結した。
細胞抽出物は、溶出するためのおよびＰＤ１０カラムを平衡化するための緩衝液としての１００ｍＭのリン酸カリウムを用いて、実施例４に記載のように調製した。総タンパク質およびＤＡＴタンパク質濃度は、記載したのように決定した。配列番号：９４６の配列を有するＤＡＴポリペプチドは、３０℃で総タンパク質画分において良好に発現したが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察したところ可溶化していなかった。配列番号：９４８および９５０の配列を有するＤＡＴポリペプチドは、比較的高温でも発現して、可溶化した。
モナチン形成アッセイは、配列番号：９４６のポリペプチドに対して０．１ｍｇ／ｍＬ（他のものは全て０．５ｍｇ／ｍＬ）のＤＡＴ濃度を用いたことを除いて実施例５に記載のように実施した。陽性対照として、精製された０．５ｍｇ／ｍＬ濃度のＢ．スフェリカスＤＡＴもまたアッセイした。２時間および２１時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％にて加え、その試料をさらに処理するまで凍結した。次いで、試料を融解させ、回転して濾過した。試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてモナチンについて、ならびに実施例３に記載のＬＣ／ＯＰＡポストカラム蛍光検出法を用いてトリプトファンおよびアラニンについて分析した。結果は表１０に示す。Ｄ−トリプトファン消費およびアラニン形成が、試験した全てのＤ−アミノトランスフェラーゼについて示され、このことは、それらがすべてのＤ−トリプトファンに対する活性を有していたことを示すものである。これらの条件下で、配列番号：９４６および９４８の配列を有するＤＡＴポリペプチドだけが、モナチン形成の活性を有するようであった。２種の宿主系の間での発現または安定性における差異が、ある場合では活性が見られたが別の場合では見られなかったことの理由なのかもしれない。
表１０
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ｎｄ、試験した条件下では検出されず
実施例８−ｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓにおけるＤＡＴ分析
配列番号：８８６、８８８、８９０、８９２および８９４ ＤＡＴで示される配列を有するＤＡＴポリペプチドは、大腸菌ＨＭＳ１７４中のｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓベクターから産生した。当業者であれば、アセンブリＰＣＲ技術、例えば実施例４に記載される技術を用いて、これらのＤ−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を合成することができる。様々なＤＡＴ構築物の一晩培養物を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地中で３０℃にて増殖させた。翌日、同培地５ｍＬに、その一晩培養物１Ｌを植菌した。培養物を３０℃でＯＤ６００ｎｍが約０．５に達するまで増殖させ、次いで、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。さらに培養物を４時間３０℃にてインキュベートし、次いで、３８００ｒｃｆにて１５分間遠心分離して回収した。その細胞を、５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ７．０を１．５ｍＬ用いて洗浄し、再び遠心分離した。その上清を破棄し、細胞ペレットの重量を測った。
細胞抽出物は、溶出のためのおよびカラム平衡化のための緩衝液として１００ｍＭのリン酸カリウムを用いて、方法に記載されたように調製した。全てのおよびＤＡＴ濃度は、ＢＣＡ（Pierce）を総タンパク質決定のためのブラッドフォードに代えて用いたことを除いて記載のとおりに決定した。２種の異なるベクターのみの培養物を、クローン化したＤＡＴと同じ大腸菌宿主において増やした。産生されたすべてのタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて目視可能なバンドを示したが、可溶化の程度は異なっていた。配列番号：８９２の配列を有するポリペプチドは、ほとんど可溶化しなかった。
各酵素のＤ−トリプトファンアミノ基転移活性を比較するために、実施例５記載のＤ−トリプトファンアミノ基転移アッセイおよびＲ，Ｒモナチンアミノ基転移アッセイを実施した。Ｄ−トリプロファンアミノトランスフェラーゼは、Ｄ−アミノトランスフェラーゼを含む終濃度０．５ｍｇ／ｍＬの細胞抽出物および対照として０．１ｍｇ／ｍＬの精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴを用いて、標的とした。細胞内抽出物中のＤＡＴの定量は、可溶性のポリペプチドが低レベルであったため困難であった。配列番号：８８８、８９２および８９４で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドは、３０分間の反応間、基質としてのＤ−トリプトファンに対して良好な活性を示した。配列番号：８８６および８９０で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドは、酵素を用いない対照を超える測定可能な活性を有したが、試験した条件下ではほとんど活性を示さなかった。
モナチンアミノ基転移実験を室温で行い、Ｂ．スフェリカス由来の精製された陽性対照を含む各ＤＡＴ０．５ｍｇ／ｍＬを標的とさせた０．５時間、１時間および２時間後に試料を取得した。次いで、Ｒ，Ｒモナチンアミノ基転移試料をモナチンおよびアラニンについて分析した。残存するモナチンの量はＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより定量した；アラニン形成は実施例３のポストカラム誘導化法を用いて測定した。試験した条件下では、配列番号：８９２および８９４で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドは活性であった。配列番号：８９４の配列を有するＤＡＴポリペプチドは、Ｒ，ＲモナチンからＲ−ＭＰへの最も高い転換活性を有するようだ。アラニン形成を試験した場合、その傾向は一致した。様々な時点でのアラニン産生数（ｍＭで）を表１１に示す。
表１１．Ｒ，Ｒモナチンアミノ基転移反応によるアラニン形成（ｍＭ）
Figure 0005683962
配列番号：８９１および８９３で示される配列を有するＤＡＴ核酸を、実施例４に記載のｐＥＴ３０ａにサブクローニングした。これらの構築物を、Ｔ７プロモーターからの発現のためのＤＥ３ライソジェン（lysogen）を運搬する様々な大腸菌宿主（Ｋ−１２株およびＢ株の大腸菌、およびｐＬｙｓＳプラスミドを運搬する大腸菌株を含む）に形質転換した。クローンを、実施例４に記載のように、０．５ｍＭのピリドキシンを添加するまたは添加しないオーバーナイトエクスプレスシステムＩＩにおいて発現させ、発現についてはＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはエクスペリオンにより分析した。これらの実験から、タンパク質は大部分が不溶性画分に発現されることが明らかとなった。ピリドキシンは、インキュベーション温度を３７℃から３０℃に低下させたように、低い程度で可溶化を改善する手助けをした。さらなる研究は、可溶性発現を最大にするように設計されたクローニング系で行った（実施例１６〜２２を参照のこと）
実施例９−ｐＥＴ３０ａ中のＣａＤＡＴ、ＣｂＤＡＴおよびＬｓＤＡＴの分析
配列番号：８９４で示されるアミノ酸配列を用いて、公開データベース中で利用可能な類似のタンパク質について探索した。配列番号：８９４と類似性を有する３個のＤＡＴが見つかった。それらは、ラクトバシルス・サルバリウス（Lactobacillus salivarus）（タンパク質レベルで４７％の同一性）、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）（タンパク質レベルで５７％の同一性）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）（タンパク質レベルで６０％の同一性）に由来した。遺伝子およびタンパク質配列、ならびにそれらの受入番号を、この実施例の最後に示す。図１は、配列番号：８９４に類似するこれらのタンパク質のうちのコンセンサス領域を示すアライメントである。あるものは、構造の類似性を示す高い程度のコンセンサス領域を見つけることができる。
これらの核酸は、ｐＥＴ３０ａ中にクローニングし、対応するポリペプチドを発現させ、本明細書に記載されるように活性について試験した。
ＣｂＤＡＴ
クロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＣｂＤＡＴ）を、ｐＥＴ３０ａ（非タグ付き）ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローン化し、オーバーナイトエクスプレスＩＩ（Novagen）を用いて発現させた。細胞は、６００ｎｍの光学密度が約９になったときに回収し、４０００ｒｃｆで１５分間遠心分離した。細胞を１００ｍＭのリン酸カリウムｐＨ７．８（冷却）を用いて一度洗浄し、再び回転させた。
細胞抽出物を、溶出のためのおよびカラムを平衡化するための緩衝液として１００ｍＭのＥＰＰＳ ｐＨ８．２を用いて、本明細書に記載されるように調製した。総タンパク質およびＤＡＴタンパク質濃度は、ＢＣＡ法（Pierce）をブラッドフォード（クマシー）アッセイに代えて用いたことを除いて記載されるように決定した。ＣｂＤＡＴは良好に発現したが、一部が可溶化するのみであった。
モナチン形成アッセイは、実施例５に記載のように行ったが、ＣｂＤＡＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）の活性はｐＨ７．４（緩衝液としてリン酸カリウムを用いた）でも研究した。対照として、精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴ（１ｍｇ／ｍＬ）をｐＨ８．２でアッセイした。１時間、２時間、４時間、８時間および２３時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％にて加えた。試料を分析するまで−８０℃で凍結した。次いで、試料を融解させ、回転させて濾過した。試料を実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチンについて分析した。結果を表１２に示す。産生されたモナチンの量は、ｐＨ８．２で実施したアッセイに関してよりも僅かに高かった。同様の実験を、Ｎ末端にＨｉｓタグを有するｐＥＴ２８から発現されたポリペプチドを用いて実施した。タグ付き型の活性は、非タグ付きのものよりも僅かに低いようであるが、依然として容易に検出可能であった。
表１２．時間に対する活性
Figure 0005683962
ＣａＤＡＴおよびＬｓＤＡＴ
ラクトバシルス・サルバリウス（Lactobacillus salivarus）由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＬｓＤＡＴ）およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）由来のＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＣａＤＡＴ）を、ｐＥＴ３０ａ（非タグ付き）ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングし、オーバーナイトエクスプレスＩＩ（Novagen）を用いて発現させた。培養物の６００ｎｍでの光学密度が約９に達したときに、４０００ｒｃｆで１５分間の遠心分離により細胞を回収した。
細胞抽出物は、溶出するためのおよびカラムを平衡化するための緩衝液として１００ｍＭのＥＰＰＳ ｐＨ８．２を用いて、本明細書に記載のように調製した。総タンパク質およびＤＡＴタンパク質濃度は、ＢＣＡ（Pierce）プロトコルを用いて決定した。両方の酵素は良好に発現され、可溶性であった。
アッセイは、室温で嫌気条件下にて実施した。対照として、精製されたＢ．スフェリカスＤ−アミノトランスフェラーゼをアッセイした。約０．５ｍｇ／ｍＬの各ＤＡＴを用いた。０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間および２２時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％にて加え、試料を凍結した。次いで、試料を融解し、回転させ、濾過した。試料を、実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチンについて分析した。結果を表１３に示す。
表１３
Figure 0005683962
配列番号：８９４で示される配列を有するＤＡＴのホモログは活性であった。上記の保存された配列を示すホモログはすべてモナチン形成アッセイにおいて活性であったため、それらの一次配列の同一性が４７％の低さであっても、本明細書に記載のコンセンサス配列を有するＤ−アミノトランスフェラーゼはいずれも活性を有するであろうことが期待される。本研究以前に、より詳しくキャラクタライズされたバシルスＤ−アミノトランスフェラーゼと低いホモロジーを有する、これらの独特のＤ−アミノトランスフェラーゼが、モナチンに関する活性を有するであろうこと、あるいは広域の特異的酵素であり得ることについての証拠は存在していなかった。
ＤＮＡ配列ＣａＤＡＴ（受入番号AE001437 AE007513-AE007868；バージョンAE001437.1 GI:25168256；ヌクレオチド914049.. 914891）
Figure 0005683962
タンパク質配列ＣａＤＡＴ（受入番号NP_347428；バージョンNP_347428.1 GI:15894079）
Figure 0005683962
ＤＮＡ配列ＣｂＤＡＴ（受入番号CP000721 AALO01000000 AALO01000001-AALO01000089 バージョンCP000721.1 GI：149901357；ヌクレオチド3213484.. 3212636）
Figure 0005683962
タンパク質配列ＣｂＤＡＴ（受入番号YP_001309869 バージョンYP_001309869.1 GI：150017615）
Figure 0005683962
ＤＮＡ配列ＬｓＤＡＴ（受入番号CP000233 バージョン CP000233.1 GI:90820184；ヌクレオチド1750082.. 1750927）
Figure 0005683962
タンパク質配列ＬｓＤＡＴ（受入番号YP_536555 バージョンYP_536555.1 GI:90962639）
Figure 0005683962
実施例１０−ＤＡＴの分析
ベクターｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓ中の配列番号：８６５、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５および８７７の配列を有するＤＡＴ核酸を含むＭＳ１７４大腸菌を得て、アンピシリンを含むＬＢ培地の寒天プレート上にストリークした。当業者であれば、アセンブリＰＣＲ技術、例えば実施例４に記載される技術を用いて、これらのＤ−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を合成することができる。単一コロニーを用いて、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む３ｍＬのＬＢ培地に植菌した。一晩培養物５００μｌを用いて、２５０ｍＬのバッフル付フラスコ中の同培地５０ｍＬに植菌した。細胞を３０℃でＯＤ６００ｎｍ 約０．５まで増殖させた。ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭにて加えた。細胞を３０℃で４時間誘導し、遠心分離により回収した。
細胞抽出物は、実施例４に記載のように調製した。総タンパク質およびＤＡＴ濃度は、実施例４に記載されように決定した。ＤＡＴはすべて、良好に発現したようで、その大部分が高い程度の可溶性を示した。
モナチン形成アッセイは、０．１ｍｇ／ｍＬのＤＡＴ濃度および１０μｇ／ｍＬ濃度のアルドラーゼを用いることを除いて、実施例５に記載のように実施した。対照として、０．１ｍｇ／ｍＬの精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴをアッセイした。６時間および２２時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％にて加え、その試料を凍結した。次いで試料を融解させ、回転させ、濾過した。試料を、実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチン濃度について分析した。試験した濃度下では、配列番号：８７０、８７４および８７８はすべて３工程のモナチン形成アッセイで高い発生を有していたようだ。配列番号：８６６、８７２および８７６で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドはまた、モナチン形成経路において活性を有していたが、試験した条件下では配列番号：８７０、８７４および８７８で示される配列を有するポリペプチドと同程度ではなかった。
表１４は、モナチン形成の結果（ｐｐｍにて）を示す。
表１４．モナチン形成アッセイ
Figure 0005683962
ｎｄ、試験した条件下では検出されず
ｐＥＴ３０ａ中の配列番号：８７０、８７４および８７８の配列を有するポリペプチドのさらなる分析
上記のＤＡＴをコードする核酸を含むｐＥＴ３０ａプラスミドを用いて形質転換した大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３の培養物を、３０℃で５０ｍＬのオーバーナイトエクスプレスＩＩ（溶液１〜６, Novagen）にて一晩増殖させた。陽性対照として、ｐＥＴ３０ａ中のＡＴＣＣ＃４９７８由来のＤＡＴを含む株もまた増殖させ、誘導した（実施例６で記載される）。細胞はＯＤ６００ｎｍが５〜１０で集め、遠心分離により回収し、さらに処理するまで−８０℃で凍結した。
細胞抽出物を、実施例４に記載のように調製した。総タンパク質およびＤＡＴ濃度は、実施例４に記載のように決定した。
モナチン形成アッセイは、配列番号：８７０についてはＤＡＴポリペプチド濃度０．５ｍｇ／ｍＬおよび配列番号：８７４および８７８についてはそれぞれ０．２７５ｍｇ／ｍＬの濃度を用いたことを除いて、実施例５に記載のように行った。対照として、ＤＡＴ４９７８および精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度でアッセイした。０．５時間、１時間、２時間、４時間、６．５時間、９時間、２４時間および２２時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％出加え、試料を凍結した。次いで、試料を融解させ、回転させ、濾過した。試料は、実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチンについて分析した。結果は、表１５に示す（形成されたモナチンのｐｐｍで）。
表１５
Figure 0005683962
３個のサブクローン（配列番号：８７０、８７４、および８７８の配列を有するポリペプチドをコードする）のＤＡＴはすべて、ｐＥＴシステムで良好に発現され、可溶性のタンパク質を産生した。配列番号：８７０で示される配列を有するポリペプチドは、可溶性画分に最も多い量の発現を与え、配列番号：８７４および８７８の配列を有するＤＡＴポリペプチドと比較して時間の経過に伴って低下する様子もなく高い活性を示した。
野生型および変異体ＤＡＴポリペプチド間の比較
配列番号：８７０の残基がＴからＮに変化した変異体ポリペプチド（配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎ）を、実施例４で記載するように構築し、発現させ、ＤＡＴ４９７８、ＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎ（実施例６記載の）、B.スフェリカスおよび野生型の配列番号：８７０と比較した。
配列番号：８７０、８７０ Ｔ２４２Ｎ、ＤＡＴ４９７８およびＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎの配列を有する野生型および変異体ポリペプチドをｐＥＴ３０ａベクターから発現させるＢＬ２１ ＤＥ３培養物を、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコにて５０ｍＬのオーバーナイトエクスプレス（Novagen）中で３０℃、２５０ｒｐｍにて増殖させた。６００ｎｍの光学密度が１０を超えたときに細胞を遠心分離により回収した。細胞抽出物は、実施例４に記載のように調製し、総タンパク質およびＤＡＴ濃度は実施例４に記載されるように決定した。試験したＤＡＴはすべて高発現であり、エクスペリオン・ソフトウェア（Experion software）を用いて決定したところ、すべて３０％近くの可溶性であった。配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎの配列を有するポリペプチドは最も高発現であり、総可溶性タンパク質は３６．３％であると予測された。
モナチン形成アッセイは、ＤＡＴポリペプチド濃度０．５ｍｇ／ｍＬで実施例５に記載のように行った。対照として、０．５ｍｇ／ｍＬの精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴをアッセイした。０．５時間、１時間、２時間、４時間、６．５時間、９時間、および２３．２５時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸をその試料に終濃度２％にて加え、その一部試料を凍結した。次いで、試料を融解させ、回転させ、濾過した。試料をモナチン、トリプトファン、アラニンおよび４−ヒドロキシ−４−メチルグルタミン酸（ＨＭＧ）について実施例３に記載のように分析した。
最後の時点で、付加的な一部試料を取り出し、実施例３に記載のＦＤＡＡ誘導化方法によりＲ，Ｒモナチン％を決定した。
モナチン形成数（ｐｐｍ）は、以下の表１６で示す。Ｒ，Ｒパーセントは、２３．２５時間の時点に関して右側の列で示す。
表１６
Figure 0005683962
配列番号：８７０のポリペプチドのＴ２４２Ｎ変異体の活性は、非常に高く、陽性対照よりも良好であり、ＤＡＴポリペプチドの野生型よりも高かった。この変異体により形成されたＲ，Ｒモナチンのパーセンテージもまた、他の標準酵素のいずれよりも高かった。形成されたＨＭＧ量（副産物）の分析は定性的であったが、９時間および２３．２５時間の時点では、類似のＨＭＧ量がＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎポリペプチドおよび配列番号：８７０のＴ２４２Ｎポリペプチドにより形成された。
配列番号：８７０で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドは、新規のタンパク質であり、既知の近縁のＤ−アミノトランスフェラーゼ（バシルスＹＭ−１ Ｄ−アミノトランスフェラーゼ）と７６％の配列同一性を、実施例６に記載されるＢ．スフェリカスＤＡＴと６９％のアミノ酸配列同一性を示す。図２は、この新規な酵素と公開された他のＤＡＴとのアライメントを示し、この酵素を独特なものとする残基を見つけることができ、その優れた活性の説明とすることができる。
配列番号：９１０で示される配列を有する高活性ＤＡＴポリペプチド（Ｂ．スフェリカスの型のＤＡＴにより類似する；実施例１２を参照のこと）もまたアライメントで示される。配列番号：８７０ポリペプチドの独自性の例として、図２のアライメントにおいて残基５４−５５番目（Ｂ．スフェリカスの番号付け）のアミノ酸残基周辺の領域において、バシルス−様のＤＡＴが高い程度の保存性を有するが、配列番号：８７０はＡＳよりもＥＣ残基を有することは明白である。他の例として、図２で示されるアライメントの１３５番目の残基周辺の高く保存された領域において、配列番号：８７０のポリペプチドは、主にバリン残基であるのに対してより疎水性の残基（Ｔ）を有している。配列番号：８７０酵素を表すが、以前から知られている広域で特異的なＤ−アミノトランスフェラーゼおよび強く関連するホモログを除外するコア配列を、コンセンサス配列ＡおよびＢとして示す。これらのコンセンサス配列のいずれかを含むポリペプチドはいずれもＤＡＴ活性を示し、モナチン形成経路の工程で活性であろうことが期待される。
コンセンサス配列Ａ
Figure 0005683962
コンセンサス配列Ｂ
Figure 0005683962
ＰＥＲＬ正規表現変換言語（regular expression convention language）と類似して、「＊」は２０種のタンパク質新生の（proteinogenic）アミノ酸からのアミノ酸残基の任意の数が存在してよく；［ ］は、この括弧内にあるアミノ酸のいずれか１個が存在してよく；「｛＃｝」は、括弧内に示された数字｛＃｝に適合する残基数である限り、２０種のタンパク質新生のアミノ酸のいずれが存在してもよいことを示す。
コンセンサス配列Ａ中の「＊」の使用に関して、いずれの「＊」位置でもアミノ酸の数は、例えば０個〜約２０個の残基まで（例えば、コンセンサス配列Ｂ（配列番号：１０７０）を参照こと）、または約２０個〜約１００個の残基まで変わり得るし、あるいはそのアミノ酸の数は、例えば１０００個またはそれを超える残基よりも多くても良い。限定するものではなく、「＊」位置での１個またはそれを超える挿入が、例えば、（限定するものではないが）キナーゼ結合ドメイン（例えば、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosu；受入番号２ＣＺＮ＿Ａ）またはＰ．バークホルデリア（burkholderia；受入番号ＹＰ＿３３１５３１）由来のもの）のようなドメイン、あるいはセルロース結合ドメイン（例えば、セルロモナス・フィミ（Cellulomonas fim；受入番号１ＥＸＨ＿Ａ）またはクロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium；受入番号１ＵＹ１＿Ａ）由来のもの）のようなドメインに相当してもい。幾つかの実施形態において（限定するものではない）、指定された位置の５個またはそれ未満の「＊」がそれぞれ、例えば、約２０個を超える残基（例えば、約１００個の残基を超える）の挿入を含む。他の実施形態において（限定するものではない）、指定された位置の５個またはそれを越える「＊」がそれぞれ、約１００個未満の残基（例えば、約２０個未満、例えば３個、５個、１０個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、７５個、８０個、９０個または９５個の残基）の挿入を含む。本明細書中で開示するコンセンサス配列に相当する配列を１個またはそれ以上を有するポリペプチドの活性、あるいは１個またはそれを超える「＊」位置で挿入された任意の数の残基を含むポリペプチドの活性は、本明細書に記載の方法を用いて評価することができる。
配列番号：１０６９で示されるコンセンサス配列を含む非制限的な例のポリペプチドは、配列番号：８７０で示される配列およびコンセンサス配列Ｂ（配列番号：１０７０）を有するポリペプチドを含む。
タグ付きおよび非タグ付き配列番号：８７０、８７０ Ｔ２４２Ｎ、ＤＡＴ４９７８およびＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎ間の比較
配列番号：８７０、８７０ Ｔ２４２Ｎ、ＤＡＴ４９７８およびＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎを有するポリペプチドを発現する大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３細胞を、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ中の５０ｍＬのオーバーナイトエクスプレス（Novagen）にて一晩、３０℃で２５０ｒｐｍにて増殖させた。６００ｎｍの光学密度が１０を超えたときに、細胞を遠心分離により回収した。細胞抽出物は、実施例４に記載のように調製した。総タンパク質およびＤＡＴ濃度は実施例４に記載のように決定した。
Ｃ末端タグ付きの配列番号：８７０、８７０ Ｔ２４２Ｎ、ＤＡＴ４９７８およびＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎポリペプチドを発現する大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３を、１０００ｍＬのバッフル付きフラスコ中の２００ｍＬのオーバーナイトエクスプレス（Novagen）にて一晩３０℃で２５０ｒｐｍにて増殖させた。２つの各々のクローンの培養物を増殖させた。６００ｎｍの光学密度が１０を超えたときに、細胞を、遠心分離により集めて回収した。細胞抽出物は、５０μｌのベンゾネース・ヌクレアーゼ（Benzonase Nuclease、Novagen）、０．７５μｌのｒ−リソザイム（r-Lysozyme）（Novagen）、および２５０μｌのプロテアーゼインヒビターカクテルＩＩ（Calbiochem）を含む５０ｍＬのバッグバスター・プリマリーアミンフリー（Bug Buster Primary Amine Free；Novagen）の添加により作製した。細胞を、穏やかに揺らしながら室温で１５分間インキュベートした。その抽出物を、４５，０００×ｇで１０分間遠心分離した。
Ｈｉｓタグ付きタンパク質を、ＧＥヘルスケア（Piscataway, NJ）のキレーティング・セファロース（Chelating Sepharose（商標））ファストフロウ樹脂を用いる方法の項に記載のように精製した。精製したタンパク質は、ＰＤ１０カラムを用いて脱塩し、１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．８（ＤＡＴ４９７８およびＤＡＴ４９７８ Ｔ２４３Ｎポリペプチドについて）に、または１００ｍＭのＥＰＰＳ ｐＨ８．２（配列番号：８７０および８７０ Ｔ２４２Ｎポリペプチド）にし、緩衝液は両方とも５０μＭのＰＬＰを含んだ。
Ｒ，Ｒモナチン形成アッセイは、ＤＡＴ濃度０．５ｍｇ／ｍＬを用いて、実施例５に記載のように実施した。一部試料を２．２５時間、４．５時間、９時間および２４時間で取り出し、ｐＨをギ酸により調整し、凍結した。実施例３記載のＦＤＡＡ誘導化方法を用いた立体異性体分布の決定のためにギ酸を添加することなく、余分の一部試料は最後の時点で取り出した。試料を融解させ、５分間遠の心分離にかけ、上清を０．２μｍのナイロン膜フィルターを用いて濾過した。試料を、実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法を用いたモナチン分析にかけた。結果は、形成されたモナチンをｐｐｍで表１７に示す。一番右の列は、実験の最後に形成されていたＲ，Ｒモナチンの％である。
表１７
Figure 0005683962
Ｃ末端タグ付きおよび非タグ付き酵素の全体的な活性および立体特異性は、非常に類似する。加えて、サブクローン化した核酸によりコードされるポリペプチドの活性の存在は、全長のまたは野生型の核酸によりコードされるその対応するポリペプチドに対する活性が存在することの予兆であることが期待される。
実施例１１−ＤＡＴ分析
配列番号：８８０、８８２および８８４の配列を有するポリペプチドをコードするｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓベクター中のＤＡＴ核酸を含む大腸菌ＨＭＳ１７４を、アンピシリンを含むＬＢ培地の寒天プレートにストリークした。当業者であれば、アセンブリＰＣＲ技術、例えば実施例４に記載される技術を用いて、これらのＤ−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を合成することができる。単一クローンを用いて、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含む３ｍＬのＬＢ培地に植菌した。５００μｌを用いて、２５０のバッフル付きフラスコ中の５０ｍＬの同培地に植菌した。ＯＤ６００ｎｍが約０．４になるまで３０℃で細胞を増殖させ、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭで加えた。細胞を３０℃で４時間増殖させ、遠心分離により回収した。
細胞抽出液は、実施例４に記載のように調製した。総タンパク質およびＤＡＴポリペプチド濃度は、実施例４に記載のように決定した。配列番号：８８２および８８４は良好に発現し、可溶性画分に高レベルで存在した。
Ｒ，Ｒモナチン形成アッセイは、約０．５ｍｇ／ｍＬの各ＤＡＴポリペプチド（０．３５ｍｇ／ｍＬの配列番号：８８０のポリペプチドを用いたことを除いて）実施例５に記載のように実施した。２時間、８時間、および２３時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％にて加え、その試料を凍結した。次いで、試料を融解し、回転させ、濾過した。試料は、実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチンについて分析した。結果は表１８に示す。
最後の時点で、余分の一部試料を取り出し（ｐＨ調整せず）、実施例３に記載のＦＤＡＡ誘導化方法論を用いて産生されるモナチンの立体異性体の分布を決定した。産生されたＲ，Ｒのパーセンテージを以下の表１８の右端の列に示し、そのバランスはＳ，Ｒモナチンが優性である。
表１８
Figure 0005683962
配列番号：８８２および８８４で示される配列を有するポリペプチドは、Ｄ−トリプトファンからのモナチン形成反応において良好な活性を示した。
産生されたモナチンの立体異性体は、これらのＤＡＴをＢ．スフェリカスの対照酵素と比較して用いた場合に、高かった。配列番号：８８２および８８４の配列を有するＤＡＴポリペプチドをコードするＤＡＴ核酸を、実施例４に記載のようにｐＥＴ３０ａにサブクローニングした。
ｐＥＴ３０ａベクターから発現される配列番号：８８２および８８４の配列を有するＤＡＴポリペプチドの分析
ｐＥＴ３０ａベクター中の配列番号：８８２および８８４の配列を有するＤＡＴポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３の培養物を、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ中の５０ｍＬのオーバーナイトエクスプレス（Novagen）にて一晩３０℃で２５０ｒｐｍにて増殖させた。６００ｎｍの光学密度が１０を超えたときに、細胞を遠心分離により集めた。
細胞抽出物は実施例４に記載されるように調製した。総タンパク質およびＤＡＴポリペプチド濃度は、記載のように決定した。総タンパク質および可溶性タンパク質試料は、４〜１５％グラジエントアクリルアミドゲルを用いて、エクスペリオン・システム（Experion system）により分析した。発現は、エクスペリオン・ソフトウェアにより約３０％であると予測された。目視できるバンドを、総タンパク質および可溶性タンパク質（無細胞抽出物）画分の両方で見られた。
モナチン形成アッセイは、０．５ｍｇ／ｍＬおよび２ｍｇ／ｍＬのＤＡＴポリペプチド濃度を用いて実施例５に記載のように実施した。精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴを対照として用いた。２時間、４．５時間、９時間、２４時間、３６時間および４８時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％にて加え、その試料を凍結した。次いで、試料を融解し、回転させ、濾過した。試料を、実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチンについて分析した。試料は、ＨＭＧレベルについて定量的に分析した。実施例３に記載のＦＤＡＡ誘導化方法論を用いた立体異性体分析のために、さらなる一部試料を取り出した（ｐＨ調整せず）。結果は、表１９および２０に示す。
表１９
Figure 0005683962
表２０．選択した時点で産生されたモナチンの立体純度（stereopurity）
Figure 0005683962
配列番号：８８２および８８４で示される配列を有するポリペプチドは、良好なモナチン形成活性および立体純度を示し、最初の時点の間では対照のＢ．スフェリカスよりも低いＨＭＧを産生するようであった。配列番号：８８２の配列を有するポリペプチドは、類似の初期のモナチン形成を示したが、この実験ではより低いモナチン力価でプラトーに達するようだ。
実施例１２−ｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓ中およびｐＥＴ３０ａ中のＤＡＴの分析
配列番号：８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９１０、および８９６の配列を有するＤＡＴポリペプチドをコードする読み取り枠を評価した。当業者であれば、アセンブリＰＣＲ技術、例えば実施例４に記載される技術を用いて、これらのＤ−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を合成することができる。
ｐＥＴ３０ａベクター中の配列番号：８９６で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３の培養物（実施例４に記載されるようにサブクローニングした）を、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ中の５０ｍＬのオーバーナイトエクスプレス（Novagen）にて一晩３０℃で２５０ｒｐｍにて増殖させた。６００ｎｍの光学密度が１０を超えたときに、細胞を遠心分離により回収した。
Ｔｏｐ１０（Invitrogen, Carlsbad, CA）大腸菌を、配列番号：８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、および９０９で示される配列を有するＤＡＴ核酸を含むｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓプラスミドを用いて形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地に撒いた。一晩培養物５００μｌを用いて、２５０のバッフル付きフラスコ中の５０ｍＬの同培地に植菌した。細胞を３０℃でＯＤ６００ｎｍが約０．４になるまで増殖させ、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭで加えた。細胞を３０℃で４時間増殖させ、遠心分離により回収した。
細胞抽出物は、実施例４に記載されるように調製した。可溶性タンパク質および見積もられるＤＡＴ濃度を実施例４に記載のように決定した。
Ｒ，Ｒモナチン形成アッセイは、ＤＡＴポリペプチド濃度０．５ｍｇ／ｍＬを用い、配列番号：８９６の配列を有する０．３ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを用い；配列番号：８９８の配列を有する０．０６ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを用い；配列番号：９００で示される配列を有する０．４ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを用い；配列番号：９０２の配列を有する０．１ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを用い；配列番号：９０４の配列を有する０．１２ｍｇ／ｍＬのポリペプチドを用いたことを除いて、実施例５に記載されようように実施した。陽性対照として、配列番号：８７０、８７０ Ｔ２４２Ｎおよび精製されたＢ．スフェリカスをＤＡＴポリペプチド濃度０．５ｍｇ／ｍＬにて試験した。２時間、６時間、および２４時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％にて加え、その試料を凍結した。次いで、試料を融解させ、回転させ、濾過した。試料は、実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチンについて分析した。さらなる一部試料を立体異性体分布分析のために取り出し、ギ酸を用いて処理しなかった。２４時間の時点についての結果を表２１に示す。配列番号：９０８の配列を有するＤＡＴポリペプチドをコードするＤＡＴ核酸分子は、サブクローニングしなかったので、アッセイできなかった。
表２１
Figure 0005683962
ｎｄ＝試験した条件下では検出されず
配列番号：９１０および９０２で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドは、モナチン形成反応について高レベルの活性を有し、Ｒ，Ｒモナチンの適正に高レベルで産生した。結果は、配列番号：８７０で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドは、試験した条件下で、配列番号：９１０で示される配列を有する野生型ポリペプチドの活性に相当する活性を示したが、配列番号：８７０ポリペプチドにおけるＴ２４２Ｎ変異体は、本酵素の活性および光学特異性において大きな改善をもたらす。
実施例１３−ＤＡＴ分析
配列番号：９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４および９２６ ＤＡＴをコードする核酸配列を含むプラスミド（ｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓ）を得た。当業者であれば、幾らかの遺伝子アセンブリプロトコル、例えば実施例４に記載のプロトコルを用いて遺伝子をクローニングすることができる。
大腸菌Ｔｏｐ１０（Invitrogen）細胞を、配列番号：９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４および９２６の配列を有するＤＡＴポリペプチドを含むｐＳＥ４２０−ｃＨｉｓにより形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地上に撒いた。一晩培養物５００μｌを用いて、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコを中、５０ｍＬの同培地に植菌した。培養物を３０℃でＯＤ６００ｎｍが約０．４になるまで生育させた。ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭで加えた。細胞を３０℃で４時間増殖させ、遠心分離により回収した。
細胞抽出物は、実施例４に記載されるように調製した。総可溶性タンパク質およびＤＡＴタンパク質濃度は、実施例４で記載されるように決定した。わずかに部分的に可溶性であった配列番号：９１６ポリペプチドを除いて、発現したほとんどのＤＡＴポリペプチドは、可溶性であった。
Ｒ，Ｒモナチン形成アッセイは、約０．２５ｍｇ／ｍＬに標的を定めたＤＡＴポリペプチドを用い；０．１ｍｇ／ｍＬの配列番号：９２２ポリペプチドを用いて、０．２ｍｇ／ｍＬの配列番号：９２６ポリペプチドを用いたことを除いて、実施例５に記載されるように実施した。陽性対照として、精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴを０．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で試験した。２時間、８時間および２４時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％にて加え、その試料を凍結した。次いで、試料を融解し、回転させ、濾過した。試料は、実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチンについて分析した。その結果を表２２に示す。
表２２
Figure 0005683962
ｎｄ＝アッセイした条件下では検出されず
配列番号：１６９、１７１、１６７、１７３および１７５で示される配列を有するＤＡＴ核酸（配列番号：１７０、１７２、１６８、１７４および１７６で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドをコードする）をＰＣＲ産物として得て、実施例４に記載のようにｐＥＴ３０ａにサブクローニングした。当業者であれば、いずれかの遺伝子アセンブリ法、実施例４に記載の方法を用いて遺伝子を再構築することができるであろう。
ｐＥＴ３０ａベクター中の配列番号：１６９、１７１、１６７、１７３および１７５の配列を有するＤＡＴ核酸を含む大腸菌ＢＬ２１ ＤＥ３細胞を、２５０ｍＬのバッフル付きフラスコ中の５０ｍＬのオーバーナイトエクスプレス（Novagen）にて一晩３０℃で２５０ｒｐｍにて増殖させた。６００ｎｍの光学密度が１０を超えたときに、細胞を遠心分離により集めた。
細胞抽出物は、実施例４に記載のように調製した。総可溶性タンパク質およびＤＡＴタンパク質濃度は、実施例４に記載のように決定した。配列番号：１７０の配列を有するポリペプチド（配列番号：１６９の配列を有するＤＡＴ核酸によりコードされる）可溶性ではないようであり、これは妨げられた活性アッセイを有し得る。
Ｒ，Ｒモナチン形成アッセイは、ＤＡＴポリペプチド濃度０．５ｍｇ／ｍＬを用い、０．２５ｍｇ／ｍＬの配列番号：１７０ポリペプチドを用いたことを除いて、実施例５に記載のように実施した。陽性対照として、精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴを０．５ｍｇ／ｍＬ濃度で試験した。２時間、８時間および２４時間後に、一部試料を取り出し、ギ酸を終濃度２％にて加え、その試料を凍結した。次いで、試料を融解させ、回転させ、濾過させて、実施例３に記載のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチンについて分析した。結果を表２３に示す。
表２３
Figure 0005683962
試料（ｐＨ調整せず）を分析し、実施例３に記載のＦＤＡＡ誘導化プロトコルを用いてＲ，Ｒ％を決定した。配列番号：１７６で示される配列を有するＤＡＴポリペプチドにより産生させるモナチンは、２４時間後のＢ．スフェリカスにより産生されるＲ，Ｒの９５．２％と比べて、同時点でＲ，Ｒ９９．６％であった。配列番号：１７６の配列を有するＤＡＴポリペプチドに由来する活性および立体純度は、両方とも極めて高く、対応する核酸を、さらなる定量的な研究のために実施例４に記載のようにＣ末端タグ付きタンパク質としてサブクローニングした。
配列番号：１７６のＣ−Ｈｉｓタグ付きタンパク質のキャラクタリゼーション
配列番号：１７５を有する核酸は、配列番号：１７６の配列を有するポリペプチドをコードし、Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有する融合タンパク質として発現させることができるように、終始コドンを除いたｐＥＴ３０ａ中にクローニングした。そのタンパク質を実施例４に記載のようにヒス−バインド（His-Bind）樹脂を用いて精製した。融合タンパク質をＰＤ−１０脱塩カラムから溶出した場合、黄色の沈殿物が溶液中に形成された。黄色の残渣がカラム上でも観察された。この黄色の色は通常、ＰＬＰ結合タンパク質の存在の指標となる。この脱塩工程でのＰＬＰ結合タンパク質の沈殿を避ける目的で、別の緩衝液（１００ｍＭのリン酸塩、および１００ｍＭのＥＰＰＳ、グリセロールを含むまたは含まない）で２つのｐＨ値（７．８および８．２）を利用した。試した緩衝液はいずれも、この沈殿を完全に避けることはできないようであった。
モナチンアッセイを、よく混合した不均一なタンパク質溶液および０．５ｍｇ／ｍＬのＤＡＴポリペプチドを用いて実施した。結果を表２４に示す。精製された配列番号：１７６ＤＡＴポリペプチド（Ｃ−タグ付き）は、Ｂ．スフェリカス由来の陽性対照ＤＡＴポリペプチドに相当する活性を示したが、しかしながら、その活性は、配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎまたは配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎの配列を有する変異体ポリペプチドにより示される活性よりは低いようであった。
表２４．モナチン産生（ｐｐｍ）
Figure 0005683962
実施例１４−ＤＡＴの評価
２９種のＤＡＴをコードする読み取り枠をＰＣＲとして得た。当業者であれば、アセンブリ技術、例えば実施例４に記載の技術を用いてＤＡＴをコードする遺伝子を合成することができることに留意されたい。ＤＡＴ核酸をｐＥＴ３０ａベクター中にサブクローニングし、実施例４に記載のように非タグ付きタンパク質として発現させた。脱塩した無細胞抽出物（実施例４に記載のように調製した）を、モナチン形成アッセイに用いた。以下のポリペプチドは別として（用いた量は小括弧内）、０．５ｍｇ／ｍＬのＤＡＴポリペプチド濃度をモナチンアッセイに用いた：配列番号：１５６ポリペプチド（０．４ｍｇ／ｍＬ）、配列番号：１８２ポリペプチド（０．４５ｍｇ／ｍＬ）、配列番号：２４０ポリペプチド（０．４７ｍｇ／ｍＬ）、および配列番号：２０４ポリペプチド（０．４２ｍｇ／ｍＬ）。
ＤＡＴポリペプチドのほとんどは、陽性対照の酵素と比較して、アッセイした条件下では、検出できない産生から低いモナチン産生までを示した。発現したＤＡＴポリペプチドのほとんどは、エクスペリオンにより決定されたように可溶性であったが、しかしながら、配列番号：２０４および２４０を有するポリペプチドは、非常に低レベルで発現し、そしてあまり可溶性ではなかったようだ。一方で、配列番号：２２０を有するポリペプチドは、エクスペリオン・ソフトウェアにより判断されるように、総可溶性タンパク質が６８％であると予想された。
モナチン産生の結果を表２５および２６に示す。２４時間で、配列番号：１５６および２１４を有するＤＡＴポリペプチドは、陽性対照の酵素、Ｂ．スフェリカス由来のＤＡＴと比較して、４０％〜５０％のモナチンを産生した。ほとんどの活性なＤＡＴポリペプチドは、配列番号：２２０ポリペプチドであった。反応後約４時間が始められ、モナチン濃度は最大に達した。配列番号：１５６の成熟タンパク質（予測されるリーダー配列を含まない）は、ＤＡＴポリペプチドの活性成分であり、従って、そのタンパク質はリーダー配列を含まずに組換え技術により産生することができる。
表２５．形成されたモナチン（ｐｐｍ）
Figure 0005683962
ｎｄ＝アッセイした条件下では検出されず
表２６．形成されたモナチン（ｐｐｍ）
Figure 0005683962
ｎｄ＝アッセイした条件下では検出されず
配列番号：２２０ポリペプチドの高い活性は、配列番号：２２０ポリペプチドを配列番号：８７０、８７０ Ｔ２４２ＮおよびＢ．スフェリカスＤＡＴポリペプチドと比較する別のモナチン形成アッセイにおいても確認された。ＤＡＴポリペプチド濃度０．１ｍｇ／ｍＬおよび０．５ｍｇを、アッセイした各ＤＡＴポリペプチドについて用いた。結果を表２７に示す。アッセイしたＤＡＴポリペプチドの高い程度での活性のために、モナチン試料は、１００倍希釈して（典型的には１０倍または２０倍希釈であるのに対し）、用いた指示の定量範囲内に入れた。
表２７．形成されたモナチン（ｐｐｍ）
Figure 0005683962
以上の実験において配列番号：２２０を有するＤＡＴポリペプチドにより形成されるＲ，Ｒのパーセンテージは、実施例３に記載のＦＤＡＡ誘導化方法論を用いて決定した。配列番号：２２０の配列を有するＤＡＴポリペプチドは、高い立体特異性があり、２４時間でのＢ．スフェリカスのＲ，Ｒ９２．９％と比較して、Ｒ，Ｒモナチン９９．３％を産生した。別のアッセイにおいて、配列番号：２２０ポリペプチドは、Ｒ，Ｒ−モナチン９９．８％を産生した。
配列番号：２２０の配列を有するＤＡＴポリペプチドは、実施例９で示すようにＣ．ベイジェリンキ（beijerinckii）ＤＡＴポリペプチドとタンパク質レベルで６２％の同一性がある新規のタンパク質である。配列番号：２２０ポリペプチドは、他の高い活性のＤＡＴポリペプチド（配列番号：８９２および８９４（実施例８）、９４６（実施例７）および１７６（実施例１３）で示される配列を有するＤＡＴポリペプチド）と８６％〜９０％の一次配列ホモロジーを有する。これらの高い活性および新規なＤＡＴポリペプチドは、この研究の前にキャラクタライズされてはおらず、これらの酵素は、Ｒ，Ｒモナチン産生反応に関して、公開されたバシルス−様のＤ−アミノトランスフェラーゼのいずれよりも、高い活性および高い立体特異性を示した。図３は、関連するＤ−アミノトランスフェラーゼのアライメントを示し、共通してそれらは下記するコンセンサス配列モチーフを示す。
コンセンサス配列Ｃ
Figure 0005683962
コンセンサス配列Ｄ
Figure 0005683962
コンセンサス配列Ｅ
Figure 0005683962
ＰＥＲＬ正規表現変換言語（perldoc.perl.org）と類似して、「＊」は２０種のタンパク質新生のアミノ酸からのアミノ酸残基の任意の数が存在してよく；［ ］は、この括弧内にあるアミノ酸のいずれか１個が存在してよく；「｛＃｝」は、括弧内に示された数字｛＃｝に適合する残基数である限り、２０種のタンパク質新生のアミノ酸のいずれが存在してもよいことを示す。
コンセンサス配列Ａ中の「＊」の使用に関して、いずれの「＊」位置でもアミノ酸の数は、例えば０個〜約２０個の残基まで（例えば、コンセンサス配列Ｄ（配列番号：１０７２）およびＥ（配列番号：１０７３）を参照こと）、または約２０個〜約１００個の残基まで変わり得るし、あるいはそのアミノ酸の数は、例えば１０００個またはそれを超える残基よりも多くてもよい。限定するものではなく、「＊」位置での１個またはそれを超える挿入が、例えば、（限定するものではないが）キナーゼ結合ドメイン（例えば、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosu；受入番号２ＣＺＮ＿Ａ）またはＰ．バークホルデリア（burkholderia；受入番号ＹＰ＿３３１５３１）由来のもの）のようなドメインあるいはセルロース結合ドメイン（例えば、セルロモナス・フィミ（Cellulomonas fim；受入番号１ＥＸＨ＿Ａ）またはクロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium；受入番号１ＵＹ１＿Ａ）由来のもの）のようなドメインに相当してもい。幾つかの実施形態において（限定するものではない）、指定された位置の５個またはそれ未満の「＊」がそれぞれ、例えば、約２０個を超える残基（例えば、約１００個の残基を超える）の挿入を含む。他の実施形態において（限定するものではない）、指定された位置の５個またはそれを越える「＊」がそれぞれ、約１００個未満の残基（例えば、約２０個未満、例えば３個、５個、１０個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、７５個、８０個、９０個または９５個の残基）の挿入を含む。本明細書中で開示するコンセンサス配列に相当する配列を１個またはそれ以上を有するポリペプチドの活性、あるいは１個またはそれを超える「＊」位置で挿入された任意の数の残基を含むポリペプチドの活性は、本明細書に記載の方法を用いて評価することができる。
配列番号：１０７１で示されるコンセンサス配列を含む非制限的な例のポリペプチドは、配列番号：２２０、８９２、８９４、１７６、および９４６を含み、コンセンサス配列Ｄ（配列番号：１０７２）およびＥ（配列番号：１０７３）を含む。いずれかのコンセンサス配列Ｃ、Ｄ、またはＥのいずれかを示すＤ−アミノトランスフェラーゼは、モナチン形成経路工程において活性であろうことが期待される。
配列番号：２２０の配列を有するｃ−Ｈｉｓタグ付きポリペプチドのキャラクタリゼーション
配列番号：２１９の配列を有するＤＡＴ核酸（配列番号：２２０のポリペプチドをコードする）は、それがＣ末端に６×Ｈｉｓ−タグを有する融合タンパク質として発現されるように（実施例４で記載されるように）、終始コドンを含まないｐＥＴ３０ａにクローニングした。この融合タンパク質を、実施例４に記載されるヒス−バインド（His-Bind）カラム（Novagen）を用いて精製した。ＰＤ−１０脱塩カラムからの溶出物は、黄色の沈殿を形成した。黄色の残渣がカラム上でも観察された。モナチンアッセイは、よく混合した不均一タンパク質溶液を用いて行った。用いられたＤＡＴポリペプチドの量は、左端の列にパーセンテージで示す。表記「ｗ／Ｔｒｐ」は、酵素を１０ｍＭのＤ−トリプトファンを共に一晩氷上でインキュベートしたことを示す。結果を表２８に示す。
表２８．形成されたモナチン（ｐｐｍ）
Figure 0005683962
０．１ｍｇ／ｍＬの配列番号：２２０ポリペプチドを含む反応は、０．５ｍｇ／ｍＬの配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎポリペプチドを含む反応と類似のモナチン形成の時間経過を示した。精製されたタンパク質を含む溶液中にＤ−トリプトファン（１０ｍＭ）を添加し、沈殿を除去した。配列番号：２２０をＤ−トリプトファン（１０ｍＭ）と共に一晩氷上でインキュベートした試料に関して、活性の消失が観察されたが、配列番号：８７０ Ｔ２４２ＮポリペプチドをＤ−トリプロファン（１０ｍＭ）を用いて処理した場合にはマイナスの効果は観察されなかった。ＨＭＧの存在もまた、ピーク領域を比較することによって、配列番号：２２０ポリペプチドにより触媒される反応に関して定量的に分析した。両方のＤＡＴポリペプチドを濃度０．５ｍｇ／ｍＬで利用した場合、配列番号：２２０ポリペプチドにより触媒されるこの反応は、配列番号：８７０ Ｔ２４２Ｎポリペプチドを含む反応と比較して、約４０％のＨＭＧを形成した。初期の時点では、２つの酵素間ではより大きな明確な差異を示す。
配列番号：２２０ポリペプチドの精製中のタンパク質沈殿を避ける試みにおいて、ＤＴＴ（５ｍＭ）をバッグバスター試薬を含むすべての緩衝液、ヒス−バインド（His-Bind）カラム用の緩衝液、およびＰＤ−１０カラム用の緩衝液においてインキュベートした。沈殿は、脱塩カラム後には観察されず、ＤＴＴを精製中に含ませた場合と、２ｍＭの濃度で精製されたタンパク質溶液中に加えた場合に配列番号：２２０ポリペプチドの活性にマイナスの効果は観察されなかった。モナチン形成アッセイに関するデータを表２９に示す。用いたＤＡＴポリペプチドの量は、左の列の小括弧内に示す。「添加ＤＴＴ」は、２ｍＭのＤＴＴを、精製後のタンパク質を再び可溶化させるために加えたことを示し、「精製ｗ／ＤＴＴ」は、５ｍＭのＤＴＴを、精製を通じて存在させたことを示す。
表２９．形成されたモナチン（ｐｐｍ）
Figure 0005683962
配列番号：２２０ポリペプチドの非常に望ましい特性は、それをさらなる変異導入または指向進化実験の卓越した候補ペプチドにする。
配列番号：２２０ポリペプチドの部位特異的変異導入
バシラスＤＡＴポリペプチドと関連するＤＡＴポリペプチドのループ領域は、この酵素の基質特性および立体特異性に重要であることが特定された（Roら、1996, FEBS Lett, 398:141-145；Sugioら、1995, Biochemistry 34:9661-9669；および欧州特許EP 1 580 268号）。１つの鍵となる重要なこの領域内の残基は、２４２番目の残基のＴ（ＡＴＣＣ＃４９７８由来のＤＡＴポリペプチドにおいては、この位置は２４３番目の残基Ｔに対応する）である。ＤＡＴ４９７８のＴ２４３Ｎ変異体が示すように、配列番号：８７０ポリペプチドのＴ２４２Ｎ変異体は、活性と立体特異性の両方に改善を示した（実施例１０を参照のこと）。配列番号：２２０ポリペプチドと配列番号：８７０ポリペプチドとの一次配列のアライメントは、わずか３５％のアミノ酸配列同一性と６５％のホモロジーを示した。配列番号：８７０のＴ２４２残基は、配列番号：２２０のＧ２４０残基に対応して整列し、次にＴ２４１残基が続く。両方のタンパク質（鋳型としてのバシルスＹＭ−１構造を有する）に関してアクセルリス（Accelrys）ＤＳモデラー（Modeler）ソフトウェアを用いても、配列番号：８７０ポリペプチドを配列番号：２２０ポリペプチドとそのループ領域で重ね合わせることは困難であった。従って、両方のアミノ酸を、部位特異的変異導入の標的として選択した。
配列番号：２２０ Ｇ２４０Ｎおよび配列番号：２２０ Ｔ２４１Ｎと称される変異体ポリペプチドを、実施例４に記載されるように対応する核酸（配列番号：２１９）の部位特異的変異導入により作り出した。２つの変異体ポリペプチドを、モナチン形成アッセイに用いた６×Ｈｉｓタグ付き融合タンパク質として発現させ、精製した。黄色沈殿物が、配列番号：２２０ポリペプチド変異体の両方について、脱塩工程で観察された。モナチン形成アッセイについての結果を表３０および３１に示す。用いたＤ−アミノトランスフェラーゼの量は、左列の小括弧内に示す。配列番号：２２０ポリペプチドの種々の調製物をこのアッセイで利用した。「ファーム」は、用いた配列番号：２２０ポリペプチドが実施例１５で記載されるように発酵槽中で産生されたことを示す。
表３０．産生されたモナチン（ｐｐｍ）
Figure 0005683962
表３１．形成されたモナチン（ｐｐｍ）
Figure 0005683962
非常に少量のモナチン（９５．７％のＲ，Ｒモナチン）が、配列番号：２２０ Ｇ２４０Ｎポリペプチド変異体により触媒された反応物中で形成された。変異体である配列番号：２２０ Ｔ２４１Ｎポリペプチドは、約５０％の活性を消失したが、立体特異性は依然として維持した（産生されたＲ，Ｒモナチン９９．７％）。これらの結果は、ホモロジーモデリングおよびアライメントと共に、２４２残基〜２４３残基周辺の領域において（潜在的にそれを越えて）、配列番号：２２０ポリペプチドの構造が、配列番号：８７０ポリペプチドの構造と、または文献中のバシルス−様のＤＡＴポリペプチドの構造と類似しないことを示唆する。Ｘ線結晶構造がないために、配列番号：２２０ポリペプチドおよび関連するＤＡＴポリペプチドの無作為変異導入、組み合わせアプローチおよび他の指向進化アプローチが、この酵素の活性をさらに改良する際に生産性が高いことが期待される。
実施例１５−発酵槽におけるＤＡＴの産生
細菌培養培地の成分は、ジフコ・フィッシャーサイエンティフィック（Difco, FisherScientific）かＶＷＲからのものであり；他の試薬は、分析グレードのものか、または商業的に利用可能で最も高いグレードのものであった。発酵は、ニューブラウンズウィック・サイエンティフィック（NewBrunswick Scientific）（Edison, NJ）ＢｉｏＦｌｏ３０００（登録商標）発酵槽において行った。遠心分離は、ＪＬＡ−１６．２５０またはＪＡ−２５．５０ローターを備えたベックマン（Beckman）（Fullerton, CA）アバンティ（Avanti（登録商標））Ｊ−２５Ｉ遠心分離機にて実施した。
Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する配列番号：２２０の配列を有するポリペプチドをコードするＤＡＴ核酸を、実施例１６に記載のｐＭｅｔ１ａベクター中にＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限部位を用いてクローニングした。抗生物質マーカー（ｂｌａ遺伝子）は、さらに、ＰｓｉＩ制限酵素消化を用いて除去し、そのベクターバンドをゲル精製し、そのベクターの末端をセルフライゲーションさせ、大腸菌宿主中に形質転換させ、そしてメチオニンを含まない選択培地プレートか最少培地プレートに撒いてもよい。典型的には、１５種のアミノ酸を含むナイトハルト（Neidhardt）培地を用いる。配列番号：２２０核酸配列をｐＭＥＴ１ａ中に挿入するためのクローニング部位は、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩであった（実施例１６を参照のこと）。
Ｃ末端Ｈｉｓ−精製タグを運搬する配列番号：２２０ ＤＡＴポリペプチドを２．５Ｌ規模の発酵槽中で、高細胞密度および高レベルでの所望のタンパク質の発現を達成する流加培養プロセスにて生産した。大腸菌株Ｂ８３４（ＤＥ３）：：配列番号：２２０ｃＨＩＳ ｐＭＥＴ１の増殖に関するプロトコルおよび結果は、以下のように記載される：新鮮な培地プレート（ナイトハルト（Neidhardt）＋１５種のアミノ酸、メチオニンなし）から出発して、細胞を、１５種のアミノ酸が補充された５ｍＬのナイトハルト培地にて、３０℃、２２５ｒｐｍにて６〜８時間増殖させた。培養物１ｍＬを、５ｇ／Lのグルコースが補充された生産培地（production medium）の一部試料２ １２５ｍｌにそれぞれ移した。フラスコを３０℃、２２５ｒｐｍで一晩（１６時間〜１８時間）増殖させた。発酵槽を、１Ｌあたり２．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４；８．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４；２．０ｇ／ＬのＮａＣｌ；１．０ｇ／Ｌのクエン酸Ｎａ３・２Ｈ２Ｏ；１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．０２５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ；０．０５ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．４ｍＬ／Ｌナイトハルト（Neidhardt）微量栄養素、および２．０ｇ／Ｌのグルコースを含む産生培地２．５リッターで満たした。発酵槽に、１０％ｖ／ｖの一晩培養物を植菌した。植菌の３時間後に６０％ｗ／ｖグルコース溶液を用いて、指数関数的なグルコース供給を始めた。この供給は、０．１５ｈ−１の指数関数的速度の微生物増殖を支えるために必要な速度で補充した。二酸化炭素評価速度（ＣＥＲ）を、１時間あたり１Ｌにつき１００ミリモルの値を調べ（植菌後約２１時間；１５〜１６ｇのＤＣＷ／Ｌの細胞バイオマスに相当する）、遺伝子発現を、２ｇ／Ｌのラクトースのボーラス添加（２０％溶液として供給される）により誘導した。この供給により、６０％ｗ／ｖのグルコースから５０％ｗ／ｖのグルコース＋１０％ｗ／ｖのラクトースに変化したが、供給速度は誘導時の速度に固定した。「５０％ｗ／ｖのグルコース＋１０％ｗ／ｖのラクトース」供給は、６時間維持した。発酵の終了時に、細胞を５０００〜７０００×ｇで１０分間遠心分離することにより回収し、−８０℃で湿細胞ペースト（wet cell paste）として凍結した。細胞ペースト（３１８グラム）は２．８Ｌの細胞ブロスから収集した。
配列番号：２２０ポリペプチドを含む無細胞抽出物を調製するために、５０ｇの湿細胞ペーストを、５０μＭのピリドキサル・リン酸（ＰＬＰ）を含む５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）の１５０ｍＬに懸濁し、次いで、その懸濁液の温度を１５℃未満に維持しながら、マイクロフルイディック（Microfluidics）ホモジナイザー（Microfluidics, Newton, MA）（１８，０００ｐｓｉにて３回）を用いて砕いた。細胞残屑を遠心分離（２０，０００×ｇ、３０分間）により除去した。２ｍＭのＤＴＴを清澄した細胞抽出物に加えた。
精製された配列番号：２２０を調製するために、清澄した細胞抽出物の一部試料２×２５ｍＬを、０．０５ｍＭのＰＬＰおよび２００ｍＭの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのＥＰＰＳ（ｐＨ８．４）により予め平衡化した４５ｍＬのキレーティング・セファロース（Chelating Sepharose（商標））ファストフロウ樹脂（ニッケル（ＩＩ）型）カラムにそれぞれロードした。試料をロードした後、カラムを、３〜５容量の平衡緩衝液、３〜５容量の２５ｍＭのイミダゾールを含む平衡緩衝液、３〜５容量の１００ｍＭのイミダゾールを含む平衡緩衝液、そして３〜５容量の５００ｍＭイミダゾールを含む平衡緩衝液を連続して用いて洗浄／溶出を行った。５００ｍＭのイミダゾール溶出物を、アミコン（Amicon；Billerica, MA）セントリコン（Centricon）−７０遠心濾過器具（ＭＷＣＯ１０ｋＤａ）を用いて１０×に濃縮した。イミダゾールおよび塩化ナトリウムは、０．０５ｍMのＰＬＰを含む５０ｍMのＥＰＰＳ（ｐＨ８．４）を用いて予め平衡化した使い捨てのＧＥヘルスケアＰＤ１０脱塩カラムに通じて除去した。脱塩した溶液のタンパク質濃度は、ピアース（Pierce）ＢＣＡアッセイキット（Rockford, IL）を用いて決定した。各画分の純度および無細胞抽出画分での低レベルの発現は、４％〜１５％のグラジエントゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定した。〜９０％純度の約４５０ｍｇのタンパク質を、５０ｍＬの清澄した細胞抽出物から回収した。２ｍＭのＤＴＴを１０ｍＬの精製されたタンパク質に加えた。精製されたタンパク質を一部試料（０．５〜５ｍＬ）に分注し、−８０℃で保存した。
ベンチ規模の反応（２５０ｍＬ）を０．７Ｌのシックスフォルス攪拌型発酵槽（Sixfors agitated fermenter）（Infors AG, Bottmingen, Switzerland）にて窒素ヘッドスペース下で行った。反応混合物は、１０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭのＰＬＰ、２００ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１００ｍＭのＤ−トリプトファンを含んだ。この反応混合物を適当な温度に調整し、水酸化カリウムを用いて適当なｐＨに調整した。実施例６に記載のアルドラーゼを、標的タンパク質０．０２ｍｇ／ｍＬで清澄した細胞抽出物として加えた。配列番号：２２０ ＤＡＴポリペプチドを、標的タンパク質０．２５ｍｇ／ｍＬで加えた（精製された酵素としてか、清澄した細胞抽出物としてのいずれかで）。
反応の進捗度は、実施例３に記載のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法論を用いてモナチン濃度を測定することにより追跡調査した。
Ｄ−トリプトファンを用いて出発し、試験した条件下で、配列番号：２２０ポリペプチドを用いたモナチン形成反応の最適なｐＨが約ｐＨ８．０であることを見出し、配列番号：２２０ポリペプチドを利用したモナチン形成反応の最適な温度は、約２５℃であることを見出した。これらの反応は、複雑な動力学を有しており、完全なモナチン産生反応についての最適な反応条件は、ＤＡＴポリペプチドにより触媒される個々の反応についての最適な条件と同じではないであろう。
実施例１６−ＤＡＴポリペプチドの可溶性発現を増大させるためのシャペロンの共発現
標準的な発現プロトコ（ＬＢにおいて１ｍＭのＩＰＴＧか、またはノバジェン（Novagen）オーバーナイトエクスプレス・オートインダクションシステム（AutoinductionSystem）２のいずれか、実施例８を参照のこと）を用いた場合、配列番号：８９４ ＤＡＴポリペプチドの可溶性発現は低かったので、配列番号：８９４ポリペプチドと商業的に入手可能なさまざまなシャペロンの共発現を試験した。
シャペロン：
タカラ・シャペロンセット（TaKaRa Chaperone Set、TAKARA BIOカタログ番号３３４０）は、ＨＳＰ研究所（HSP Research Institute, Inc）により開発された５種のシャペロンのセットから構成される。それらは、折り畳み過程に協調して働くことが知られている複合分子シャペロンの効率的な発現を可能にするように設計されている。そのセットは以下のものを含んだ：
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形質転換プロトコル
ケミカルコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）セル（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号 ６９４５０）を、２０ｎｇのタカラ・シャペロンプラスミドの１つおよび２０ｎｇの配列番号：８９３／ｐＥＴ３０ａ（配列番号：８９４ポリペプチドをコードする；プラスミド構築物に関しては実施例Ｃ２を参照のこと）を用いて、３０秒間の４２℃でのヒートショックにより形質転換させた。形質転換細胞を０．５ｍＬのＳＯＣ培地中で１時間、３７℃で回復させ、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢプレートに撒いた。そのプレートを一晩３７℃でインキュベートした。コロニーをその一晩プレートから拾い上げ、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含む５ｍＬの２×ＴＹ培地に植菌するために用いた。３７℃での一晩インキュベーション後に、プラスミドを、キアプレップ・スピンミニプレップキット（QUIAprep Spin Miniprep Kit）（Qiagenカタログ番号２７１０４）を用いて細胞ペレットから単離した。プラスミドは、シャペロンプラスミドおよび配列番号：８９３／ｐＥＴ３０ａプラスミドをの両方について、製造業者の推奨するプロトコルに従い、ニューイングランド・バイオラボ（New England Biolabs）（Beverly, MA）の一箇所切断酵素を用いた制限消化により分析した。
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配列番号：８９３／ｐＥＴ３０ａおよびｐＫＪＥ７の両方を含む単離されたＤＮＡを、ＮｈｅＩおよびＸｂａＩを用いて消化した。
発現の研究
溶液１〜６、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（各フラスコ２５ｍＬ）を含むノバジェン・オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））オートインダクションシステム２（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７１３６６）のフラスコに、シャペロンプラスミドおよび配列番号：８９３／ｐＥＴ３０を用いて同時形質転換した細胞の新鮮なプレートから植菌した。植菌時に、シャペロンプラスミドに供給される誘導物質もまた加えた。
Figure 0005683962
細胞を３０℃で一晩インキュベートし、６００ｎｍのＯＤが６に達するかまたはそれを越えたときに遠心分離により回収した。細胞を、冷５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）を用いて洗浄し、再び遠心分離にかけ、すぐに用いるかまたは−８０℃にて凍結させた。
細胞抽出物は、細胞ペレット１ｇあたり５ｍＬの、５μＬ／ｍＬのプロテアーゼインヒビターカクテルＩＩ（EMD Bioscience/Calbiochemカタログ番号５３９１３２）、１μｌ／ｍＬのベンゾナーゼ（Benzonase（登録商標））ヌクレアーゼ（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７０７４６）、および０．０３３μｌ／ｍＬのｒ−リソザイム（Lysozyme ）溶液（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７１１１０）を含むバッグバスター（BugBuster（登録商標））（第一級アミン不含）抽出試薬（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７０９２３）を細胞に加えることにより調製した。その細胞懸濁液を、穏やかに混合しながら１５分間室温でインキュベートし；１４,０００ｒｐｍで２０分間（４℃）回転させ、上清を慎重に取り出した。総タンパク質濃度は、ピアース・ＢＣＡプロテインアッセイキット（Pierceカタログ番号２３２２５）を用い、ウシ血清アルブミンを基準として、マイクロタイタープレート形式で決定した。Ｄ−アミノトランスフェラーゼの発現は、バイオラッド・レディーゲル（Ready Gel（登録商標））プレキャスト（Precast）４％〜１５％ポリアクリルアミド・グラジエントゲル（Bio-Rad Laboratoriesカタログ番号１６１−１１０４）をにより分析した。バイオラッドＳＤＳ−ＰＡＧＥローレンジ・スタンダード（low range standard；カタログ番号１６１−０３０４）を各ゲルの基準として流した。細胞抽出物の一部試料（１５μｇのタンパク質）を、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、１２．５％の２−メルカプトエタノール、０．１％のブロモフェノールブルーおよび６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を含むタンパク質ローディングバッファーと混合し、９５℃で５分間インキュベートし、冷却した後にゲルにロードした。添加の際に、可溶性および不溶性タンパク質発現（総タンパク質）を、各形質転換体について分析した。遠心分離前の各細胞懸濁液の一部試料１０μｌを９０μLのタンパク質ローディングバッファーに希釈し、９５℃で１０分間インキュベートして冷却した。１０μLの各冷却した溶液をゲルにロードした。
可溶性タンパク質ゲルにより、配列番号：８９４の配列を有するポリペプチドの可溶性発現が、シャペロンのＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ（ｐＧｒｏ７）と共発現させたときに最も良好であったことが示された。
ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳシャペロンの存在下での、別のプラスミドを用いた配列番号：８９４ポリペプチドの発現もまた調べた。配列番号：８９３核酸を、ニューイングランド・バイオラボ（New England Biolabs）からの制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを用いてｐＭＥＴ１ａプラスミド中にサブクローニングした。このプラスミドは、ｐＥＴ２３ａ（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号６９７４５−３）の派生物であり、ｍｅｔＥ遺伝子（プラスミドのＮｇｏＭＩＶ部位に挿入されている）を保有し、大腸菌株Ｂ８３４（ＤＥ３）および大腸菌ＢＷ３０３８４（ＤＥ３）ｏｍｐＴｍｅｔＥ（“ＥＥ２Ｄ”）のメチオニン栄養要求性を補完することができる。「ＥＥ２Ｄ」株の構築は、国際公開第２００６／０６６０７２号に記載されている。ｐＥＴ２３ｄの派生物であるｐＭＥＴ１ａに対するアナログプラスミドの構築は、同じＰＣＴ出願中に記載されている。
配列番号：８９３／ｐＭＥＴ１ａプラスミド（２５ｎｇ）を、「ＥＥ２Ｄ」エレクトロコンピテントセルに単純に形質転換し、大腸菌細胞についての標準的なバイオラッド・エレクトロポレーションプロトコルを用いてバイオラッド・ジーンパルサーＩＩシステム（Bio-Rad Gene Pulser II system；カタログ番号１６５−２１１１）により、ｐＧｒｏ７（２０ｎｇ）を同時形質転換した。その形質転換した細胞を、０．５ｍＬのＳＯＣ培地中で１時間３７℃にて回復させ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートか、または１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（二重プラスミド形質転換体）を含むＬＢプレートに撒いた。そのプレオートを一晩３７℃でインキュベートした。各プレートから１個のコロニーを用いて、溶液１〜６、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび２ｍｇ／ｍＬのアラビノースを含む５０ｍＬのノバジェン・オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））オートインダクションシステム２に植菌した。ｐＧｒｏ７プラスミドを含有する細胞を用いて植菌した培養物は、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールもまた含んだ。細胞を、３０℃で一晩インキュベートし、ＯＤ６００が６またはそれを越えたときに遠心分離により回収した。細胞ペレットを、冷５０ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液を用いて洗浄し、再び遠心分離し、すぐに用いたか、または−８０℃で凍結した。細胞抽出物は、ノバジェン・バッグバスター（BugBuster（登録商標））（第一級アミン不含）抽出試薬を用いて上記のように調製した。可溶性および総Ｄ−アミノトランスフェラーゼの発現は、上記のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
ゲルにより、可溶性配列番号：８９４ポリペプチドの発現は、ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳタンパク質を同時発現させた場合により高くなることが示された。しかしながら、可溶性発現は、上記のｐＥＴ３０ａ構築物ほど高くはなかった。
発現の間のインキュベーション温度の影響もまた試験した。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培養液５ｍＬに、ＥＥ２Ｄ：：配列番号：８９４ＭＥＴ１ａ＋ｐＧｒｏ７の新鮮なプレートから植菌した。その培養液
を３０℃で一晩インキュベートし、次いで、溶液１〜６、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン、２５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールおよび２ｍｇ／ｍＬのアラビノースを含有する５０ｍＬのノバジェン・オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））オートインダクションシステム２をそれぞれ含む３個のフラスコに植菌するために用いた。第１のフラスコは２０℃で培養し、第２は２５℃で、そして第３は３０℃で培養した。ＯＤ６００が６に達するかまたはそれを超えたときに、細胞を集めた。細胞を回収し、細胞抽出物は上記のように調製した。総タンパク質濃度は、ピアースＢＣＡプロテインアッセイキット（Pierceカタログ番号２３２２５）を用いて、スタンダードとしてウシ血清アルブミンを用い、マイクロタイタープレート形式で決定した。Ｄ−アミノトランスフェラーゼの発現は、バイオラッド・エクスペリオン（Bio-Rad Experion）Ｐｒｏ２６０自動電気泳動ステーション（Automated Electrophoresis Station）を用い、製造業者のプロトコルに従って、１ｍｇ／ｍＬに希釈した細胞抽出液により分析した。その結果を表２３に示す。最も低い温度で、配列番号：８９４ポリペプチドの最大の発現量が得られた。
表３２
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活性アッセイプロトコル
ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳシャペロンと共発現させた配列番号：８９４ ＤＡＴの酵素活性を、標準的なモナチン反応プロトコルに従って試験した。簡単には、各アッセイチューブは以下をのものを含ませた（総量で２ｍＬ）：細胞抽出物中に０．０５０ｍｇ／ｍＬのアルドラーゼ（推定２０％の可溶性発現）；細胞抽出物中に１．０ｍｇ／ｍＬのＤ−アミノトランスフェラーゼ（配列番号：８９４ポリペプチドを含む抽出物について推定２０％の可溶性発現）または精製されたＢ．スフェリカスのＤ−アミノトランスフェラーゼ；０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０；２００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；１００ｍＭのＤ−トリプトファン；１００ｍＭのＥＰＰＳ（ｐＨ８．２）；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．０５ｍＭのＰＬＰ；および１０ｍＭのリン酸カリウム。
反応液は、酸素への暴露を最小限にするため、Coy Laboratory Products, Inc.の嫌気チャンバー中、室温にてインキュベートした。酵素を除く全ての成分を一緒に混合した（トリプトファンは、酵素添加後少なくとも１時間までは完全に溶解しなかった）。反応は、酵素の添加により開始された。試料を、１時間、４時間、８時間および２２時間で回収した。１ｍｇ／ｍＬの精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴを用いた対照反応もまた行った。このＤＡＴの構築、発現および精製は実施例６に記載されている。基質および産物の濃度は、実施例３に記載されるように測定した。
結果を表３３に示す。２２時間で、配列番号：８９４ポリペプチドが存在する場合のモナチン濃度は９．２ｍＭであり、Ｂ．スフェリカス酵素を用いた場合は１２．４ｍＭであった。配列番号：８９４ポリペプチドがアッセイ混合物中にある場合（Ｂ．スフェリカス酵素を含有するアッセイ試料と比較した場合、１／３の濃度）、同時生産物ＨＭＧの濃度は顕著に低かった。ＨＭＧ濃度は、ＯＰＡ誘導化資料のピーク領域と比較することによって評価した。
表３３．モナチン形成（ｍＭ）
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実施例１７−ＤＡＴポリペプチドの可溶性発現を増大させるためのアークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））システム
配列番号：８９４ポリペプチドの可溶性発現は標準的な発現プロトコル（ＬＢの１ｍＭのＩＰＴＧか、またはノバジェン・オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標）)オートインダクションシステム２のいずれか−実施例８を参照のこと）を用いた場合には低かったので、ストラタジーン・アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））システム２において配列番号：８９３／ｐＭＥＴ１ａプラスミドの発現を試験した。
ストラタジーン・アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））システムは、低温シャペロン（psychrophilic chaperone）であるＣｐｎ１０およびＣｐｎ６０を保有する大腸菌コンピテントセルを含む。これらは、好冷生物のオレイスピラ・アンタルクティカ（Oleispira antarctica）から単離されたシャペロンである。Ｃｐｎ１０およびＣｐｎ６０は、大腸菌のシャペロンＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳとそれぞれ高い配列類似性を示すが、４℃〜１２℃でのタンパク質フォールディング活性は高い。アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））宿主細胞は、大腸菌ＢＬ２１株に由来する。これらの細胞はＬｏｎプロテアーゼを欠損するだけでなく、ＯｍｐＴプロテアーゼもまた欠くように遺伝子改変されている。
形質転換プロトコル
プラスミド配列番号：８９３／ｐＭＥＴ１ａ（実施例１６に記載される）は、ケミカルコンピテント・アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））（ＤＥ３）セル（カタログ番号２３０１９２）中に、製造業者のプロトコルに従って形質転換した。この形質転換した細胞を、０．５ｍＬのＳＯＣ培地中で１時間３７℃にて回復させ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートに撒いた。このプレートを一晩３７℃でインキュベートし、次いで４℃で保存した。
発現プロトコル
形質転換プレートからのクローンを用いて、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含む５ｍＬの２×ＹＴ培地に植菌し、３０℃で一晩インキュベートした。溶液１〜６、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１２ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含むノバジェン・オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））オートインダクションシステム２（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７１３６６）のフラスコに、一晩培養物を用いて植菌した。３０℃での６時間のインキュベーション後に、オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））培養物を、１５℃または２０℃または２５℃のインキュベーターに移した。インキュベーションは、培養物の６００ｎｍのＯＤが６に達するか、それを越えるまで継続した。細胞を遠心分離により回収し、冷５０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．４を用いて洗浄し、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
細胞抽出物は、細胞ペレット１ｇあたり５ｍＬの、５μＬ／ｍＬのプロテアーゼインヒビターカクテルＩＩ（EMD Bioscience/Calbiochemカタログ番号５３９１３２）、１μｌ／ｍＬのベンゾナーゼ（Benzonase（登録商標））ヌクレアーゼ（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７０７４６）、および０．０３３μｌ／ｍＬのｒ−リソザイム（Lysozyme ）溶液（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７１１１０）を含むバッグバスター（登録商標）（第一級アミン不含）抽出試薬（EMD Biosciences/Novagenカタログ番号７０９２３）を細胞に加えることにより調製した。その細胞懸濁液を、穏やかに混合しながら１５分間室温でインキュベートし；１４,０００ｒｐｍで２０分間（４℃）回転させ、上清を慎重に取り出した。総タンパク質濃度は、ピアース・ＢＣＡプロテインアッセイキット（Pierceカタログ番号２３２２５）を用い、ウシ血清アルブミンを基準として、マイクロタイタープレート形式で決定した。Ｄ−アミノトランスフェラーゼの発現は、バイオラッド・エクスペリオンＰｒｏ２６０自動電気泳動ステーションを用い、製造業者のプロトコルに従って１ｍｇ／ｍＬの細胞抽出溶液を用により分析した。
電気泳動の結果は、アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））システムにより、配列番号：８９４ポリペプチドの可溶性発現が、シャペロンを用いない発現と比較した場合、あるいは実施例１６に記載の大腸菌ＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳシャペロンとの共発現させた場合、顕著に増加したことを示す。可溶性発現は低温でより多かったが、２５℃でもっとも高かった。
Figure 0005683962
活性アッセイプロトコル
アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））システムにて発現させた配列番号：８９４ポリペプチドの酵素活性は、実施例６に記載のアルドラーゼの存在下でのモナチン形成を追跡することにより試験した。各アッセイチューブは、以下のものを含ませた（総量で２ｍＬ）：細胞抽出物中に０．０１０ｍｇ／ｍＬのアルドラーゼ（推定２０％の可溶性発現）；細胞抽出物中に１．０または２．０ｍｇ／ｍＬの配列番号：８９４ポリペプチド（配列番号：８９４ポリペプチドを含む抽出物について推定５０％の可溶性発現）または精製されたＢ．スフェリカスのＤ−アミノトランスフェラーゼ；０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０；２００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；１００ｍＭのＤ−トリプトファン；１００ｍＭのＥＰＰＳ（ｐＨ８．２）；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．０５ｍＭのＰＬＰ；および１０ｍＭのリン酸カリウム。
反応液は、酸素への暴露を最小限にするため、Coy Laboratory Products, Inc.の嫌気チャンバー中、室温にてインキュベートした。酵素を除く全ての成分を一緒に混合した（トリプトファンは、酵素添加後少なくとも１時間までは完全に溶解しなかった）。反応は、酵素の添加により開始された。試料を、１時間、４時間、８時間および２２時間で回収した。１または２ｍｇ／ｍＬの精製されたＢ．スフェリカスＤＡＴを用いた対照反応もまた行った。基質および産物の濃度は、実施例３の記載のように測定した。結果を表３４に示す。配列番号：８９４ポリペプチドを１ｍｇ／ｍＬで、２ｍｇ／ｍＬのＤＡＴポリペプチドを存在させた場合、２２時でのモナチン濃度は８．２ｍＭとなった。Ｂ．スフェリカス酵素を１ｍｇ／ｍＬで加えた場合、２２時でのモナチン濃度は１０．７ｍｇ／ｍＬであり；２ｍｇ／ｍＬではモナチン濃度は１４．５ｍＭであった。産物の立体特異性（実施例３のＦＤＡＡ誘導化プロトコルにより決定されるように）は、酵素と酵素濃度両方とも＞９８％のＲ，Ｒであった。同時生産物ＨＭＧの濃度は、配列番号：８９４ポリペプチドを用いた場合、有意に小さかった（いずれかの酵素濃度でのＢ．スフェリカス酵素を含むアッセイ試料と比較して、〜１／３の濃度）。ＨＭＧ濃度は、ＯＰＡ誘導化試料のピーク領域と比較することにより評価した。
表３４．モナチン形成（ｍＭ）
Figure 0005683962
実施例１８−ＤＡＴの溶解性発現を増大するためのストラタジーン・アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））システムの使用
形質転換プロトコル：
プラスミド配列番号:８９１／ｐＥＴ３０ａ（配列番号：８９２のポリペプチドをコードする）、配列番号：８７３／ｐＥＴ３０ａ（配列番号：８７４のポリペプチドをコードする）およびｐＥＴ３０ａ中のクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）のＤＡＴ（ＣｂＤＡＴ）を、製造業者のプロトコルに従ってケミカルコンピテント・アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））（ＤＥ３）セル（カタログ番号２３０１９２）に形質転換した。これらの遺伝子のクローニングは実施例４に記載されており、アッセイ結果は実施例９に記載されている。形質転換細胞を０．５ｍＬのＳＯＣ培地に３７℃にて１時間回復させ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１３ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含有するＬＢプレートに撒いた。プレートは室温にて２日間インキュベートし、その後４℃にて保存した。
プラスミド配列番号:８９１／ｐＥＴ３０ａ（配列番号：８９２のポリペプチドをコードする）、配列番号：８７３／ｐＥＴ３０ａ（配列番号：８７４のポリペプチドをコードする）およびｐＥＴ３０ａ中のクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）のＤＡＴ（ＣｂＤＡＴ）を、製造業者のプロトコルに従って化学的にコンピテントストラタジーン・アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））（ＤＥ３）セル（カタログ番号２３０１９２）に形質転換した。これらの遺伝子のクローニングは実施例４に記載されており、アッセイ結果は実施例９に記載されている。形質転換細胞を０．５ｍＬのＳＯＣ培地に３７℃にて１時間回復させ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１３ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含有するＬＢプレートに撒いた。プレートは室温にて２日間インキュベートし、その後４℃にて保存した。
発現プロトコル:
形質転換回収プレートからのコロニーを用いて５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび１３ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含有する５ｍＬの２ｘＹＴ培地に植菌し；その液体培地を３０℃にて６時間インキュベートした。１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１３ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンを含む、溶液１−６を含むノバジェン・オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））オートインダクションシステム２のフラスコ（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７１３６６）に、５ｍＬの培養物を植菌した。３０℃にて５−６時間インキュベートした後に、培養物を１５℃のインキュベーターに移した。１５℃でのインキュベーションは、培養物のＯＤ６００が６以上に達するまで続けた。遠心によって細胞を収集し、５０ｍＭの冷ＥＰＰＳ、ｐＨ８．４で洗浄し、次いで細胞ペレットを−８０℃にて凍結した。
細胞ペレット１ｇ当たり５ｍＬのバッグバスター（第一級アミン不含）抽出試薬（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７０９２３）（５μＬ／ｍＬのプロテアーゼインヒビターカクテル（EMD Bioscience/Calbiochem カタログ番号５３９１３２)、１μｌ／ｍＬのベンゾナーゼ・ヌクレアーゼ（Benzonase Nuclease）（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７０７４６)および０．０３３μｌ／ｍＬのr−リソザイム（Lysozyme（商標））溶液（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７１１１０）を含む）を細胞に添加することによって細胞抽出物を調製した。細胞懸濁液を１５分間穏やかに混合しながら室温にてインキュベートし；１４，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）回転させ、その上清を注意深く除去した。標準物質としてウシ血清アルブミンおよびマイクロタイタープレート形式と共にピアースＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce カタログ番号２３２２５）を用いて総タンパク質濃度を測定した。ＤＡＴの発現は、１ｍｇ／ｍＬに希釈した細胞抽出溶液を用い、製造業者のプロトコルに従ってバイオラッド・エクスペリオンＰｒｏ２６０自動電気泳動ステーションを用いて分析した。結果を表３５および３６に示す。
電気泳動の結果は、アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））システムを用いて、配列番号：８７４のポリペプチドの方が配列番号：８９２のポリペプチドよりも僅かに良好に可溶性形態で発現していることを示した。Ｃｂ ＤＡＴの可溶性発現は、形質転換プレートで拾い上げたコロニーに依存して変動した。アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））を用いて可溶性形態で発現したこれらのＤＡＴポリペプチドならびに実施例１６に記載した配列番号：８９４のポリペプチドはいずれも発現しなかった。
表３５
Figure 0005683962
表３６
Figure 0005683962
活性アッセイプロトコル
アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））システムで発現させたＤＡＴポリペプチドの酵素活性を、実施例６に記載した以下のアルドラーゼ存在下のモナチン形成によって試験した。各アッセイチューブには以下のものを含ませた（合計３ｍＬ中）：細胞抽出物中０．０５０ｍｇ／ｍＬのアルドラーゼ（２０％可溶性発現に概算）；細胞抽出物中０．５ｍｇ／ｍＬのＤＡＴポリペプチド（エクスペリオン・データからの概算可溶性発現）または精製Ｂ．スフェリカス（sphaericus）のＤＡＴ；０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０；２００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；１００ｍＭのＤ−トリプトファン；５０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．２；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．０５ｍＭのＰＬＰ；および１０ｍＭのリン酸カリウム。
その反応物を、Coy Laboratory Products，Inc.の嫌気チャンバー中、室温でインキュベートして酸素への曝露を最小限に留めた。酵素以外のすべての成分を一緒に混合した（トリプトファンは酵素を添加後少なくとも１時間は完全に溶解しなかった）。酵素を添加することによって反応を開始した。２、４．５、９および２４時間に試料を取り出した。精製Ｂ．スフェリカスのＤ−アミノトランスフェラーゼを用いた対照反応も行った。物質および生成物の濃度は、実施例３に記載したように測定した。２４時間時、配列番号：８９２または８９４のポリペプチドを含むアッセイはＢ．スフェリカスのＤＡＴ反応物とほぼ同じ力価のモナチンを産生した。Ｃ．ベイジェリンキのＤＡＴ反応物は１／８未満のモナチン産物を産生したが、配列番号：８７４のポリペプチドは約半分を産生した。２４時間の産物の立体純度（stereopurity）（実施例３のＦＤＡＡ誘導化プロトコルによって測定）は、配列番号：８９２のポリペプチドについて９６％以上のＲ，Ｒモナチンであった。副生成物ＨＭＧ（４−ヒドロキシ−４−メチルグルタミン酸）の濃度を、配列番号：８９２、配列番号：８９４およびＢ．スフェリカスのＤＡＴポリペプチドを用いた反応物について測定した。配列番号：８９４に示す配列を有するポリペプチドを用いたアッセイは、他の２（Ｂ．スフェリカスのＤＡＴを含有するアッセイによって産生した約２０％および配列番号：８９２のポリペプチドを用いたアッセイによって産生した約４０％）よりも遙かに少ないＨＭＧ副生成物を生成した。ＨＭＧ濃度はＯＰＡポスト−カラム誘導化試料のピーク面積を比較することによって概算した。
表３７ モナチン形成（ｍＭ）
Figure 0005683962
これらの結果は、適当な条件下で発現させた場合に、配列番号:８９２および８９４の配列を有するポリペプチドを反応物において利用して、陽性対照酵素と同等に高い力価の非常に純粋なＲ，Ｒモナチンを産生し得ることを示している。
実施例１９−ＤＡＴの可溶性発現を増大する別の発現宿主の評価
核酸をＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた場合の配列番号：８９４ポリペプチドの可溶性発現が低かったため（実施例８を参照されたい）、可溶性発現を改善することについて、別の発現宿主を評価した。オーバーエクスプレス（OverExpress（商標））Ｃ４１（ＤＥ３）およびＣ４３（ＤＥ３）宿主は、毒性耐性を付与させるために表現型に関して選択された遺伝子変異を含み、他の大腸菌宿主よりも高い力価で幾つかの毒性タンパク質を発現する。
形質転換プロトコル
プラスミド配列番号:８９３／ｐＥＴ３０ａを、製造業者のプロトコルに従ってバイオラッド・ジーンパルサー（Gene Pulsar）ＩＩシステムを用いてオーバーエクスプレス（OverExpress（商標））Ｃ４１（ＤＥ３）およびＣ４３（ＤＥ３）（各々、Lucigen カタログ番号６０３４１および６０３４５）のエレクトロコンピテントセルに形質転換した。形質転換混合物を１ｍＬのＳＯＣ培地に３７℃にて１時間回復させ、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢプレートに撒いた。プレートは３７℃にて一晩インキュベートした。複数のコロニーを新しいプレートに移し、コロニーＰＣＲを用いて適当なインサートのサイズについて分析した。小分けした細胞を０．０２５ｍＬのＨ２Ｏに懸濁し、９５℃にて１０分間インキュベートした。冷却した後に、２μＬの各懸濁液を０．０２５ｍＬ反応物（各々、０．５μＬのＴ７プロモーター・プライマー（０．１ｍＭ）、０．５μＬのＴ７ターミネーター・プライマー（０．１ｍＭ）、０．５μＬのＰＣＲヌクレオチドミックス（Nucleotide Mix）（Roche番号１２５２６７２０；１０ｍＭの各ヌクレオチド)、２．５μLのロッシュ・エクスパンド（Roche Expand）ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液＃２、および０．５μＬのエクパンドＤＮＡポリメラーゼ（Roche Expand High Fidelity PCR System カタログ番号１７３２６５０)も含有する）中の鋳型として用いた。３工程のサーモサイクラープログラムを２５−３０サイクル行った：７２℃にて７分間の最終ポリッシング（polishing）工程を含む、９４℃にて１分間；５４℃にて１分間、７２℃にて１．３分間。
発現実験
溶液１−６および５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するノバジェン・オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））オートインダクションシステム２（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７１３６６）のフラスコ（各フラスコ中の４０ｍＬ）に、形質転換したＣ４１（ＤＥ３）およびＣ４３（ＤＥ３）細胞のパッチプレート（各形質転換について２パッチ）を植菌した。細胞は３０℃にて一晩インキュベートし、ＯＤ６００が６以上に達したら遠心によって収集した。その細胞を冷緩衝液で洗浄し、再度遠心し、直ちに使用するかまたは−８０℃にて凍結した。
細胞抽出物は、５μＬ／ｍＬのプロテアーゼインヒビターカクテルＩＩ（EMD Bioscience/Calbiochem カタログ番号５３９１３２)、１μＬ／ｍＬのベンゾナーゼ（Benzonase（登録商標））ヌクレアーゼ（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７０７４６)および０．０３３μＬ／ｍＬのr−リソザイム（Lysozyme（商標））溶液（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７１１１０）を含むバッグバスター（BugBuster（登録商標））（第一級アミン不含）抽出試薬（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７０９２３）を細胞ペレット１ｇ当たり５ｍＬを細胞に添加することによって調製した。その細胞懸濁液を穏やかに１５分間混合しながら室温にてインキュベートし；１４，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）回転させ、その上清を注意深く取り出した。標準物質としてウシ血清アルブミンおよびマイクロタイタープレート形式と共にピアースＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce カタログ番号２３２２５）を用いて総タンパク質濃度を測定した。ＤＡＴポリペプチドの発現は、バイオラッド・レディーゲル（Ready Gel（登録商標））プレキャスト４−１５％ポリアクリルアミド・グラジエントゲル（Bio−Rad Laboratories カタログ番号１６１−１１０４）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。バイオラッドＳＤＳ−ＰＡＧＥローレンジ・スタンダード（カタログ番号１６１−０３０４）を各ゲル上の標準として流した。小分けした細胞抽出物（１５μｇのタンパク質）を、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、１２．５％の２−メルカプトエタノール、０．１％のブロモフェノールブルーおよび６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を含有するタンパク質ローディングバッファーと混合し、９５℃にて５分間インキュベートし、冷却した後にゲルにロードした。また、合した可溶性および不溶性のタンパク質発現物（総タンパク質）を形質転換体について分析した。遠心前の各細胞懸濁液の小分けした１０μｌを９０μＬのタンパク質ローディングバッファーに希釈し、９５℃にて１０分間インキュベートし、冷却した。１０μＬの各冷却溶液をゲルにロードした。
電気泳動ゲルは、Ｃ４３（ＤＥ３）宿主よりもＣ４１（ＤＥ３）宿主においてタンパク質がより良好に発現することを示したが、ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いた場合よりも見かけの可溶性発現は高くなかった。
実施例２０−ＤＡＴの可溶性発現を増大する低温発現の評価
遺伝子を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株で発現させた場合には、配列番号：８９４のＤ−アミノトランスフェラーゼの可溶性発現が低かったため（実施例８を参照されたい）、遺伝子を、コールドショック・プロテインＡプロモーターを含むベクターにインサートして低温発現を評価した。
タカラ（Takara）ｐＣｏｌｄ発現ベクターは、大腸菌中で高純度、高収量の組換えタンパク質を発現させるためのコールドショック・プロテインＡ（ｓｃｐＡ）プロモーターを利用する４種の異なるベクターである。これらのベクターは、低温（１５℃）において標的タンパク質合成を選択的に誘導し、その場合、他のタンパク質の合成が抑制され、タンパク質活性は低下する。ｃｓｐＡプロモーターに加えて、４種のすべてのベクターはｌａｃオペレーター（発現制御用）、アンピシリン抵抗性遺伝子（Ａｍｐｒ）、ＣｏｌＥ１複製起点、Ｍ１３ ＩＧ断片、およびマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）を含んでいる。これらベクターのうちの３は、翻訳促進エレメント（translation enhancing element）（ＴＥＥ）、Ｈｉｓ−Ｔａｇ配列および／またはファクターＸａ切断サイトも含んでいる。
クローニング・プロトコル
プラスミド配列番号:８９３／ｐＥＴ３０ａからの配列番号：８９３のＤＡＴ核酸（配列番号：８９４の配列を有するポリペプチドをコードする）をｐＣＯＬＤＩＩ（ＴＥＥおよびＨｉｓ−ｔａｇ配列を含む）、ｐＣＯＬＤＩＩＩ（ＴＥＥを含む）およびｐＣＯＬＤＩＶベクターのＮｄｅＩおよびＸｈｏＩサイトでタカラ（Takara）ｐＣｏｌｄベクターにサブクローニングした。消化したベクターおよびインサートのバンドは、製造業者のプロトコルに従ってキアクイック・ゲルエクストラクションキット（Qiagen カタログ番号２８７０４）を用いてゲル精製し、ロッシュ（Roche）ラピッド（Rapid）ＤＮＡライゲーションキット（カタログ番号１６３５３７９）を用いて連結した。その連結混合物を４２℃のヒートショックによってインビトロジェン（Invitrogen）ワン−ショット・（OneShot）ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（カタログ番号Ｃ４０４００３）に形質転換した。５００μＬのＳＯＣ培地に３７℃にて１時間回復させた後に、その形質転換混合物を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢプレートに撒き、３７℃にて一晩インキュベートした。その形質転換プレートからコロニーを拾い上げ、それを１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する５ｍＬのＬＢ培養物に植菌し、３７℃にて一晩インキュベートした。キアプレップ（QIAprep（登録商標））スピン・ミニプレップ（Spin Miniprep）キット（Qiagen カタログ番号２７１０４）を用いて５ｍＬの培養物からプラスミドＤＮＡを精製した。インサートは、配列決定によってＮｄｅＩおよびＸｈｏＩでの制限消化を確認した（Agencourt Bioscience Corp，Beverly，MA)。
配列番号：８９４ｄａｔ ｐＣＯＬＤプラスミドを、製造業者のプロトコルに従ってケミカルコンピテント・ストラタジーン・アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））（ＤＥ３）セルおよびノバジェンＢＬ２１（ＤＥ３）セルに形質転換した。その形質転換混合物を０．５−１ｍＬのＳＯＣ培地に３７℃にて１時間回復させ、１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１３ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンまたは１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢプレート（アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））（ＤＥ３）またはＢＬ２１（ＤＥ３））に撒いた。プレートは３７℃にて一晩インキュベートした。
発現実験
溶液１−６および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンおよび１３ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン（アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））（ＤＥ３））または１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（ＢＬ２１（ＤＥ３））を含有するノバジェン・オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））オートインダクションシステム２（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７１３６６）のフラスコに、形質転換細胞のパッチプレートから植菌した（配列番号：８９３／ｐＣＯＬＤＩＩ、配列番号：８９３／ｐＣＯＬＤＩＩＩおよび配列番号：８９３／ｐＣＯＬＤＩＶ形質転換体の各々について２パッチ）。
３０℃にて３−５時間インキュベートした後に、培養物を１５℃のインキュベーターに移した。１５℃のインキュベーションは、培養物のＯＤ６００が６以上に達するまで続けた。細胞は遠心によって収集し、冷緩衝液で洗浄した後に細胞ペレットを−８０℃にて凍結した。
細胞抽出物は、５μＬ／ｍＬのプロテアーゼインヒビターカクテルＩＩ（EMD Bioscience/Calbiochem カタログ番号５３９１３２）、１μＬ／ｍＬのベンゾナーゼ（Benzonase（登録商標））ヌクレアーゼ（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７０７４６）および０．０３３μＬ／ｍＬのｒ−リソザイム（Lysozyme（商標））溶液（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号71110）を含むバッグバスター（BugBuster（登録商標））（第一級アミン不含）抽出試薬（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７０９２３）を細胞ペレット１ｇ当たり５ｍＬを細胞に添加することによって調製した。その細胞懸濁液を穏やかに１５分間混合しながら室温にてインキュベートし；１４，０００ｒｐｍで２０分間（４℃）回転させ、その上清を注意深く取り出した。標準物質としてウシ血清アルブミンおよびマイクロタイタープレート形式と共にピアースＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce カタログ番号２３２２５）を用いて総タンパク質濃度を測定した。Ｄ−アミノトランスフェラーゼの発現は、１ｍｇ／ｍＬに希釈した細胞抽出物溶液と共に製造業者のプロトコルに従ってバイオラッド・エクスペリオン（Experion（商標））Ｐｒｏ２６０自動電気泳動ステーションを用いて分析した。結果を表３８および３９に示す。
表３８
Figure 0005683962
表３９
Figure 0005683962
エクスペリオンＰｒｏ２６０の結果は、核酸をｐＣＯＬＤＩＩまたはｐＣＯＬＤＩＩＩベクターのいずれかに入れた場合よりもｐＣＯＬＤＩＶベクターに入れた場合に、配列番号：８９４のＤＡＴタンパク質がより良好に発現したことを示している。前記に示した実験から、配列番号：８９３／ｐＣＯＬＤＩＩについての平均発現レベルは使用した発現宿主にかかわりなく約８％であり；配列番号：８９３／ｐＣＯＬＤＩＩＩについての平均発現レベルは約４％であり、一方、配列番号：８９３／ｐＣＯＬＤＩＶについての平均発現レベルは〜１５％であった。これらの発現レベルは、配列番号：８９３核酸をＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳシャペロンと同時発現させた実施例１６およびその核酸をストラタジーン・アークティックエクスプレス（ArcticExpress（商標））システムで発現させた場合の実施例１７に記載したものよりも著しく低かった。
実施例２１−ＤＡＴのコドン修飾
大腸菌で発現させた配列番号：８９４のポリペプチドの溶解性を修飾する試みを、大腸菌における翻訳の速度を鈍化させれば配列番号：８９４のポリペプチドの適当なフォールディングのためにより長い時間が許容され、それによって可溶性タンパク質のより高い発現が付与されるという予想で行った。配列番号：８９４のポリペプチド配列のＢＬＡＳＴサーチ（ＮＣＢＩ）により、最も緊密に関連する公衆の配列の幾つかはクロストリジウム（Clostridium）種、詳細にはクロストリジウム・ベイジェリンキ（Clostridium beijerinckii）からのものであることが明らかになった。実施例９はＣｂＤＡＴをクローニングし、発現させ、およびＣｂＤＡＴおよびモナチン形成反応におけるその使用をアッセイした結果を記載している。詳細には、発現は総タンパク質画分で高かったが、可溶性タンパク質画分においては非常に低かった。
Ｃ．ベイジェリンキおよび大腸菌Ｋ１２のコドン使用頻度表を比較した。Ｃ．ベイジェリンキではあまり使用されていない幾つかのコドンが大腸菌Ｋ１２において非常に豊富であることが判明した（表４０）。これらの稀なコドンは、Ｃ．ベイジェリンキにおいて翻訳休止（translational pause）を引き起こす可能性がある一方で大腸菌Ｋ１２宿主においては休止が存在しないかもしれない。配列番号：８９４配列においては４個のダブレットが同定され、そこではＣ．ベイジェリンキのタンデムの稀なコドンは大腸菌Ｋ１２においては「稀ではない」（すなわち、豊富）となっていた。最終目的はこれらのコドンを、大腸菌Ｋ１２コドン使用頻度表を用いて大腸菌Ｋ１２宿主における発現のための稀なコドンに変化させることである。これらのダブレットを変化させるためにプライマーを設計した。配列番号：８９３／ｐＥＴ３０ａ（実施例４に記載した）を鋳型として用い、ストラタジーン・クイックチェンジキットの指示書に従って変異導入を行った。配列番号：８９３の核酸配列を修飾するために利用したプライマーを、元の遺伝子と一緒に以下に示す（標的にしたダブレット配列に下線を引いている）。
表４０
Figure 0005683962
＞配列番号：８９３ ネイティブ配列
Figure 0005683962
ダブレット１変異体用のプライマー
Figure 0005683962
ダブレット２変異体用のプライマー
Figure 0005683962
ダブレット３変異体用のプライマー
Figure 0005683962
ダブレット４変異体用のプライマー
Figure 0005683962
正確に改変した配列を有するクローンを、酵素発現アッセイのためにＢＬ２１（ＤＥ３）宿主に形質転換した。酵素発現は、細胞をオーバーナイトエクスプレスＩＩ中で一晩増殖させ、その細胞をバッグバスター試薬で溶解し、その後に粗製細胞抽出物および可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行うことによって測定した。
ダブレット１、２および３に対するコドン変化を有する可溶性タンパク質発現に僅かな改善が存在するようであった。ダブレット４におけるコドン変化は、可溶性タンパク質発現に有利ではなかった。ダブレット１、２および３のコドン変化を、ストラタジーン・クイックチェンジキットを用いて対で合し、最初のコドン変化のためにプライマーを設計した。正確に改変した配列を有するクローンを、酵素発現アッセイのためにＢＬ２１（ＤＥ３）宿主に形質転換した。酵素発現は、細胞をオーバーナイトエクスプレスＩＩ中で一晩増殖させ、その細胞をバッグバスター試薬で溶解し、その後に粗製細胞抽出物および可溶性タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行うことによって測定した。ダブレット１および２、２および３ならびに１および３に対する突然変異の組合せは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に視認できる可溶性タンパク質のバンドを与えた。しかしながら、総タンパク質画分にはより多いタンパク質が存在するようであった。
実施例２２−ＤＡＴポリペプチドのペリプラズム発現の評価
大腸菌宿主ＢＬ２１（ＤＥ３）においてペリプラズムタンパク質として遺伝子産物を発現させた場合の配列番号：８９４のポリペプチドの可溶性発現は低かったため（実施例８を参照されたい）、遺伝子をベクターにクローニングしてペリプラズム間隙に輸送される融合タンパク質を作製した。ペリプラズムは適当なフォールディングおよびジスルフィド結合形成を促進する条件を与え、ある種の標的タンパク質の溶解性および活性を高め得る。
ＥＭＤバイオサイエンス／ノバジェン（Biosciences/Novagen）ｐＥＴ２６ｂへのクローニングにより、ペリプラズム・シグナル配列を有する標的タンパク質の産生が可能になる。このシグナル配列は輸送物と同時に存在するシグナルペプチダーゼによって切断される。２０８アミノ酸ＤｓｂＡ−Ｔａｇ（商標）または２３６アミノ酸ＤｓｂＣ−Ｔａｇ（商標）と融合した標的タンパク質をクローニングおよび発現するためにＥＭＤバイオサイエンス／ノバジェンｐＥＴ３９ｂおよびｐＥＴ４０ｂを設計した。ＤｓｂＡおよびＤｓｂＣは、各々、ジスルフィド結合の形成および異性化を触媒するペリプラズム酵素である。融合タンパク質は、典型的にペリプラズムに局在する。
クローニング・プロトコル
プラスミド配列番号:８９３／ｐＥＴ３０ａからの配列番号：８９３の核酸（実施例４に記載した）を、ＥＭＤバイオサイエンス／ノバジェンｐＥＴ２６ｂ（カタログ番号６９８６２−３）、ｐＥＴ３９ｂ（カタログ番号７００９０−３）およびｐＥＴ４０ｂ（カタログ番号７００９１−３）ベクターにベクターのＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩサイトでクローニングした。５’ＥｃｏＲＩサイトおよび３’ＮｏｔＩサイトを有するＤＡＴ核酸を、実施例４に記載した増幅プロトコルおよび以下のプライマーを用いて作製した：
Figure 0005683962
制限サイトはプライマー配列中、イタリック文字としている。得られたＤＮＡ産物ならびにｐＥＴ２６ｂ、ｐＥＴ３９ｂおよびｐＥＴ４０ｂベクターを、示された製造業者のプロトコルに従ってＥｃｏＲ１およびＮｏｔＩ（New England Biolabs）で消化した。ベクター反応混合物をその後にシュリンプ（Shrimp）アルカリホスファターゼ（Roche カタログ番号１７５８２５０)で処理した。消化したベクターおよびインサートのバンドを製造業者のプロトコルに従ってキアゲン・キアクイック（QIAquick（登録商標））ゲルエクストラクションキット（カタログ番号２８７０４）を用いて１％アガロースゲルからゲル精製し、ロッシュ・ラピッド・ライゲーションキット（カタログ番号１６３５３７９）を用いて連結した。その連結混合物をインビトロジェン・ワン−ショット（OneShot（登録商標））ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（カタログ番号Ｃ４０４００３）に４２℃のヒートショックによって形質転換した。５００μＬのＳＯＣ培地に３７℃にて１時間回復させ後に、その形質転換混合物を５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＬＢプレートに撒き、３７℃にて一晩インキュベートした。形質転換プレートからコロニーを拾い上げ、それを用いて５０ｍｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する５ｍＬのＬＢ培養物に植菌し、それを３７℃にて一晩インキュベートした。プラスミドＤＮＡは、キアゲン・キアプレップ・スピン・ミニプレップキット（カタログ番号２７１０４）を用いて５ｍＬ培地から精製した。核酸配列は、配列決定によって確認した（Agencourt Bioscience Corp，Beverly，MA）。正確なインサート配列を有するプラスミドを、前記したヒートショックによってＥＭＤバイオサイエンス／ノバジェンＢＬ２１（ＤＥ３）ケミカルコンピテントセル（カタログ番号６９４５０）に形質転換した。
発現実験
溶液１−６および５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するノバジェン・オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））オートインダクションシステム２（EMD Biosciences/Novagen カタログ番号７１３６６）のフラスコ（各フラスコ中５０ｍＬ）に、ｐＥＴ２６ｂ、ｐＥＴ３９ｂまたはｐＥＴ４０ｂのいずれかに配列番号：８９３のＤＡＴ核酸（配列番号：８９４のポリペプチドをコードする）を運搬するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の新しいプレートから植菌した。細胞は３０℃にて一晩インキュベートし、ＯＤ６００が６以上に達した場合に遠心によって収集した。細胞を冷緩衝液で洗浄し、再度遠心し、直ちに使用するか細胞ペレットを−８０℃にて凍結した。収集する前に、小分けした２ｍＬの培養物を、可溶性および総タンパク質（可溶性および不溶性）発現分析のために各フラスコから取り出した。細胞抽出物は、実施例１６に記載したように調製した。総タンパク質試料は、２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、１２．５％の２−メルカプトエタノール、０．１％のブロモフェノールブルーおよび６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含有するタンパク質ローディングバッファー、ｐＨ８に少量の細胞ペレットを懸濁することによって調製し、それを９５℃にて１０分間インキュベートした。
ペリプラズム細胞画分は、ＥＭＤバイオサイエンス／ノバジェンｐＥＴシステム・マニュアルに記載されたプロトコルに従って核培養物からの細胞の残りから調製した。得られた画分は、アミコン・ウルトラセル（Amicon Ultracel）１０ｋ遠心フィルターデバイス（Millipore カタログ番号ＵＦＣ９０１０２４）を用いて３０倍に濃縮した。標準物質としてウシ血清アルブミンおよびマイクロタイタープレート形式と共にピアースＢＣＡタンパク質アッセイキット（Pierce カタログ番号２３２２５）を用いて、細胞抽出物およびペリプラズム画分の総タンパク質濃度を測定した。細胞抽出物の１５μｇタンパク質試料およびペリプラズム画分の１０μｇタンパク質試料を、バイオラッド・レディーゲル（Ready Gel（登録商標））プレキャスト４−１５％ポリアクリルアミド・グラジエントゲル（Bio−Rad Laboratories カタログ番号１６１−１１０４）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。また、総タンパク質試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。バイオラッドＳＤＳ−ＰＡＧＥローレンジ・スタンダード（カタログ番号１６１−０３０４）を各ゲル上の標準として流した。
総タンパク質ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析は、オーバーナイトエクスプレス（Overnight Express（商標））オートインダクションシステム２を用いて表された予想分子量を有するタンパク質を示す。しかしながら、細胞抽出物画分またはペリプラズム画分を流したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの分析は、これらのタンパク質が可溶性であることを表さず、また、それらはペリプラズムに輸送されないことを示した。
実施例２３−インドール−３−ピルビン酸からのモナチンの生成
実施例５に記載したモナチン形成アッセイにおいてＤ−トリプトファンおよびピルビン酸が出発原料である場合に得られたモナチンの最大濃度は、トリプトファンの溶解性によって制限される。より高いモナチン濃度を達成することにおけるアルドラーゼおよび配列番号：２２０のＤＡＴポリペプチド（実施例１４に記載した）を使用する可能性を調べるために、原料としてインドール−３−ピルビン酸（１３Ｐ）およびピルビン酸を用いて出発する反応を分析した。この場合、Ｄ−アラニンまたはＤ−アラニンとＤ−トリプトファンの両方のようなアミノ供与体蛍光団を提供することも必要であった。
試験は精製した配列番号：２２０のＤＡＴポリペプチド（実施例１５に記載の生成および精製）およびアルドラーゼ（実施例６に記載した）を用いて行った。反応物は以下のように設定した（合計１ｍＬ中）：２００ｍＭのインドール−３−ピルビン酸（Ｉ３Ｐ）；２００ｍＭのピルビン酸ナトリウム；４００ｍＭのＤ−アラニン；１００ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０；１ｍＭのＭｇＣｌ２；０．０５ｍＭのＰＬＰ；および１０ｍＭのリン酸カリウム。
両方の酵素を過剰に添加して、モナチンへの変換を促進して非−酵素分解反応からの競合（competion）を最小限化した。その反応物を、Coy Laboratory Products，Inc.嫌気性チャンバー中、室温にてインキュベートして酸素への曝露を最小限化した。酵素以外のすべての成分を一緒に混合し、ｐＨを８．０に調整した。酵素（細胞抽出物として０．０４ｍｇ／ｍＬのアルドラーゼ（２０％発現を想定）および０．４０ｍｇ／ｍＬの精製した配列番号：２２０ ＤＡＴポリペプチド）を添加することによって反応を開始させた。
以下の表に示す幾つかの試験においては、Ｄ−アラニンに加えて５０または１００ｍＭのいずれかでＤ−トリプトファンを添加して、アミノ供与体として作用させ、また、Ｄ−トリプトファンの形成に消費されるインドール−３−ピルビン酸の量を制限した。モナチンの形成は、実施例３に記載したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いて１８時間後に測定し、その結果を以下の表４１に示す。
表４１． Ｉ３Ｐからのモナチン形成（ｍＭ）
Figure 0005683962
前記に示したように、アミノトランスフェラーゼおよびアルドラーゼ酵素はより高い反応物濃度で活性であり、遙かに高いモナチン濃度を達成した。
２００ｍＭのインドール−３−ピルビン酸、２００ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１００ｍＭのＤ−トリプトファンを用いた１８時間、モナチンの濃度は６１ｍＭであった。５０ｍＭのＤ−トリプトファンの添加−対−４００ｍＭのＤ−アラニンのみ使用する場合に、モナチン産生の小さい増加（４７．８ｍＭ）がアッセイの条件下で観察された。
実施例−２４−ホモロジー表
表４２は、公開されたデータベースまたは文献からの最も活性なＤＡＴポリペプチドおよび対応する最も近いホモログの幾つかを示す。
表４２
Figure 0005683962
実施例９に示すように、配列番号：８６６、９４６、２２０および１７６に示す配列を有するポリペプチドのホモログをクローニングした。それらは、これらのポリペプチドの中で４９％乃至６３％の配列同一性を有するにもかかわらず、Ｒ，Ｒモナチンを生成する活性も有していた。同様にして、オーシャンバクター（Oceanobacter）種からのＤ−アラニントランスアミナーゼおよびロビジニタレア・ビフォルマート（Robinginitalea biformata）のアミノトランスフェラーゼは、配列番号：８８２および９１８の配列を有するＤＡＴポリペプチドのような広範なＤ−アミノ酸・アミノトランスフェラーゼ活性を有していると予想される。
添付書類Ｉは、公開されたデータベースに対する例示的な配列の配列同一性比較を含む、本発明の例示的な核酸およびポリペプチドの選択した特徴を記載する表を示している。例えば、添付書類Ｉの理解をさらに助けるために、「配列番号：」、数字「１，２」と標識された最初の列は、例えば配列番号：１によってコードされる配列番号：２に記載の配列を有する本発明の例示的なポリペプチドを表す。添付書類Ｉに記載の配列（本発明の例示的な配列）は２セットのデータベースに対してＢＬＡＳＴサーチ（本明細書に記載する）にかけられている。最初のデータベースセットはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）を介して入手可能である。これらのデータベースに対するサーチからの結果は、「NR Description」、「NR Accession Code」、「NR E−value」または「NR Organism」なる名称のカラムに見出される。「ＮＲ」とは、ＮＣＢＩによって維持される非−重複ヌクレオチドデータベースをいう。このデータベースはＧｅｎＢａｎｋ、ＧｅｎＢａｎｋアップデートおよびＥＭＢＬアップデートの複合物である。「NR Description」のカラムにある記載は、いずれかの与えられたＮＣＢＩ記録中の定義の行をいい、起源生物、遺伝子名／タンパク質名、または配列の機能の幾分かの記載のような配列の説明が含まれる。「NR Accession Code」のカラムにある記載は、配列記録に付与されたユニークな識別名をいう。「NR E−value」のカラムにある記載は、質問する配列（本発明の配列）と特定のデータベース配列との間に見出されるものと同程度のアライメント・スコアが現在のＢＬＡＳＴサーチで行われたランダムな配列間の同一数の比較で見出される確率を表す期待値（Ｅ−値）をいう。「NR Organism」のカラムにある記載は、最も近いＢＬＡＳＴのヒットとして同定された配列の起源生物をいう。
第２のデータベースセットは、集合的にＧＥＮＥＳＥＱ（商標）データベースとして知られており、Thomson Derwent（Philadelphia，PA)を介して入手可能である。このデータベースに対するサーチの結果は、「GENESEQ Protein Description」、「GENESEQ Protein Accession Code」、「E−value」、「GENESEQ DNA Description」、「GENESEQ DNA Accession Code」または「E−value」なる名称のカラムに見出される。これらのカラムに見出される情報は、それがＮＣＢＩデータベースの代わりにＧＥＮＥＳＥＱ（商標）データベースに対するＢＬＡＳＴサーチに由来することを除いて、前記したＮＲカラムに見出される情報に匹敵する。
また、この表は、「Predicted EC No.」というカラムを含む。ＥＣ番号は、国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名法委員会、酵素委員会によって開発された標準化された酵素命名法のスキームに従って酵素のタイプに割り当てられた番号である。「Predicted EC No.」のカラム中の結果は、Ｋｅｇｇ（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）データベースに対するＢＬＡＳＴサーチによって決定する。上段のＢＬＡＳＴマッチがe-6以下のE−valueを有する場合、上段のマッチに割り当てられたＥＣ番号を表に入れている。「Query DNA Length」および「Query Protein Length」のカラムは、各々、ＮＣＢＩまたはＧＥＮＥＳＥＱ（商標）データベースのいずれかに対してサーチまたは質問した本発明の配列中のヌクレオチドの数またはアミノ酸の数をいう。「Subject DNA Length」および「Subject Protein Length」のカラムは、BLASTサーチからの最高のマッチの配列中の、各々、ヌクレオチドの数またはアミノ酸の数をいう。これらのカラムに記載する結果は、ＮＣＢＩデータベースまたはＧＥＮＥＳＥＱ（商標）データベースのいずれかから、より低いE−valueに戻されるサーチからのものである。「%ID Protein」および「%ID DNA」のカラムは、発明の配列と最高のＢＬＡＳＴマッチの配列との間のパーセント配列同一性をいう。これらのカラムに記載する結果は、ＮＣＢＩデータベースまたはＧＥＮＥＳＥＱ（商標）データベースのいずれかからの、最低のＥ−ｖａｌｕｅに戻るサーチからのものである。
パートＣ
実施例２５−ＧＳＳＭ（商標）変異体の構築および試験
この実施例では、例示的な核酸およびポリペプチドの構築を記載し、それらの酵素活性を記載する。ヌクレオチド配列（配列番号：２１９）をｐＳＥ４２０−Ｃ−Ｈｉｓベクターにサブクローニングし、大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥ宿主（Stratagene，La Jolla，CA）で発現させて配列番号：２２０に示すアミノ酸配列を有する例示的なＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＤＡＴ）酵素を産生させた。ｐＳＥ４２０−Ｃ−Ｈｉｓベクターは、Ｃ−末端Ｈｉｓ−タグをInvitrogen（Carlsbad，CA)からのｐＳＥ４２０ベクターに付加することによって作製した。構築物の配列番号：２２０（大腸菌ＸＬ１−ＢＬＵＥ中の）は、修飾を導入した出発配列として用い、本明細書中において野生型（ＷＴ）配列という。最初のラウンドの修飾（すなわち、単一残基の突然変異）は、遺伝子部位飽和変異導入（Gene Site Saturated Mutagenesis（商標））（ＧＳＳＭ（商標））技術を用いて行った（例えば、米国特許第６，１７１，８２０号を参照されたい）。ＧＳＳＭ（商標）技術を用いて作製した変異体は、大腸菌宿主ＸＬ１−ＢＬＵＥ中のｐＳＥ４２０−Ｃ−Ｈｉｓベクターで発現させ、３８４−ウェルプレートに並べて３７℃にて一晩増殖させた。それらの試料をサブクローニングし、３０℃にて２晩（３６−４８時間）増殖させた。培養物は細胞ライゼートを調製し得るようになるまで−２０℃にて凍結した。
細胞は、各ウェルに１０μＬのＢＰＥＲ ＩＩ（Thermo Scientific，Rockford，IL）を添加することによって溶解した。試料は３回混合し、氷上で１時間溶解した。ついで、粗製ライゼートを一次スクリーニングでアッセイした。２５μＬの粗製ライゼートを室温の５０ｍＭのリン酸ナトリウム中、１ｍＭのＲ，Ｒ−モナチン、２５ｍＭのピルビン酸ナトリウム塩、０．０８ｍＭのＰＬＰ（ｐＨ８）を用いてアッセイした。３時間後に、小分けを取り、それにギ酸を最終濃度２％で添加した。試料を水で希釈して標準曲線の範囲内に入るようにした。実施例１に記載したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法（Ｄ−アラニンまたはＲ，Ｒ−モナチンを検出するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法）を用いて、試料をモナチン消費およびアラニン形成について分析した。試料の能力を野生型対照（すなわち、配列番号：２２０）の能力と比較した。
野生型対照よりも能力が優れる変異体をＧＳＳＭ（商標）からのヒットとして選択した。一次ヒットのグリセロールストックを用いて新たな３８４−ウェルプレートに植菌した。これらのヒットを４回アッセイし、一次スクリーニングについて示したように増殖および溶解した。ついで、最初のヒットを二次スクリーニングで試験した。二次スクリーニング法は、変異体を１ｍＭおよび１５ｍＭのＲ，Ｒ−モナチン基質で試験する以外は一次スクリーニングのものと同じであった。試料をＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いてモナチン消費およびアラニン形成について分析した。試料の能力を野生型対照の能力と比較した。
試料の能力は、アラニン生成およびモナチン消費に基づくスコアリング系を用いて評価した。単一試料の最高スコアは６であった。３点の最高値をアラニン生成に割り当て、３点の最高値をモナチン消費に割り当てた。スコアリングの基準は以下のとおりであった：陽性対照の平均と１の標準偏差との間の値に１ポイントを割り当て；陽性対照の１と２の標準偏差の間の値に２ポイントを割り当て；陽性対照の２の標準偏差を超える値に３ポイントを割り当てた。
突然変異についての最高の可能性のある総スコアは４８であった（試料を１および１５ｍＭのモナチンで４回スクリーニングしたため）一般的に、２０ポイント以上の変異体を二次ヒットとして選択した。しかしながら、２０ポイント未満のスコアの試料については幾つかの例外を設けた。閾値要件の寸前のアラニン形成およびモナチン消費の値を有する試料もヒットとして選択した。これにより、ヒットの早まった削除が防止され、三次スクリーニングにおけるさらなる試験およびキャラクタリゼーションが可能となった。
前記の基準を用いて二次スクリーニングのヒットとして同定した試料を表４３に掲載する。二次ヒットをグリセロールストックから１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢ寒天プレートにストリークし、３７℃にて一晩増殖させた。単一のコロニーを用いて、カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する１ｍＬのＬＢに植菌した。培養物は３７℃にて一晩増殖させた。培養物からＤＮＡを単離し、ついで３７３０ＸＬ自動シークエンサー（Applied Biosystems，Foster City，CA）を用いて調製および配列決定した。
二次ヒットについての突然変異およびアミノ酸の位置を以下の表４３に掲載する。アミノ酸の位置の番号付けはＮ−末端メチオニンから開始する。例えば、「Ｙ６Ｌ」と掲載した最初の突然変異は、野生型酵素（配列番号：２２０）のアミノ酸の位置６におけるチロシンからロイシンへの変化をいう。核酸レベルにおいて、目的の（突然変異）アミノ酸をコードするいずれのコドンも使用し得る。
以下の表４３、４４および５０に記載した全てのアミノ酸配列は例示的なポリペプチドであり、かかるポリペプチドをコードする核酸配列も記載している。
実施例２６−ＧＳＳＭ（商標）突然変異のリスト
表４３：二次スクリーニング・ヒットとして同定されたＧＳＳＭ（商標）変異体
Figure 0005683962
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＊変異体１８２は、鋳型として変異体１３６ ＤＮＡを用い、ついでＶ２３６Ｔ変異体を導入する部位特異的変異導入を用いて作製した。当業者であれば、部位特異的変異導入技術を用いてこの遺伝子を合成することができる。
ついで、表４３に掲載した試料を四次スクリーニング用に調製した。グリセロールストックを用いて、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する５ｍＬのＬＢに植菌した。培養物は３７℃にて一晩培養した。ついで、一晩培養物を用いて、２５０ｍＬバッフル付きフラスコ中の１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する５０ｍＬのＬＢ培地に０．０５のＯＤ６００ｎｍまで植菌した。ＯＤ６００ｎｍが０．４−０．８に達したらＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加した。培養物は３０℃にて一晩誘導した。６，０００ｒｐｍ、２０分間の遠心によって細胞ペレットを収集した。細胞ライゼートを調製し得るようになるまで細胞ペレットを−２０℃にて凍結した。細胞は、氷上、ＢＰＥＲ ＩＩ（Thermo Scientific，Rockford，IL）を用いて１時間溶解した。１２，０００ｒｐｍ、３０分間の遠心によって清澄化したライゼートを調製した。
タンパク質は、製造業者の指示書に従ってバイオラッド・ブラッドフォード・プロテインアッセイ（Bio−Rad，Hercules，CA）によって定量した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびデンシトメトリーを用いて発現したＤ−アミノトランスフェラーゼの量を測定した。試料は発現したＤ−アミノトランスフェラーゼについて規格化した。０．０２ｍｇ／ｍＬのＤ−アミノトランスフェラーゼを四次スクリーニングで試験した。三次スクリーニングの方法は、試料を０、５、１０、１５、３０、６０、１２０および２１０分に試料を採って時間経過を作成する以外は四次スクリーニングの方法と同じとした。アラニン産生およびモナチン消費の値はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって測定し、標準曲線と比較した。試料を野生型対照と比較した。
野生型対照よりもより高い最終力価またはより迅速な初期速度を有する試料をヒットと同定し、上位変異体（upmutant）という。四次スクリーニングで同定したＧＳＳＭ（商標）上位変異体を表４４に掲載する。これらの上位変異体は以下の実施例２７においてさらに記載する。
実施例２７−ポリペプチド上位変異体の酵素活性
本実施例では、本明細書に記載する例示的な上位変異体ポリペプチド、例えば、表４４に記載するアミノ酸配列を有するポリペプチド、の酵素活性を示すデータを記載する。表４４は、１ｍＭおよび１５ｍＭのＲ，Ｒ−モナチン基質を用いた反応における１５分時の野生型対照に対する上位変異体の活性を示す。相対活性とは、（試料によって産生されたアラニンの量）／（野生型対照によって産生されたアラニンの量）である。
表４４：三次スクリーニングにおけるＧＳＳＭ上位変異体の酵素活性
Figure 0005683962
試験した条件下で野生型対照よりも性能が優れた幾つかの試料を同定した。潜在ＫｍおよびＶｍａｘ上位変異体を同定した。これらの結果は、野生型対照（配列番号：２２０）がモナチンに対する増大した特異的Ｄ−アミノトランスフェラーゼ活性についてさらに発達し得ることを示している。
実施例２８−モナチン法におけるＧＳＳＭ（商標）変異体の活性
ｐＳＥ４２０−Ｃ−Ｈｉｓ中のＧＳＳＭ ＤＡＴの分析
本実施例では、本明細書に開示した例示的ポリペプチドの酵素活性を示すデータを記載する。変異体２７、変異体４４、変異体５８、変異体１１９、変異体１３５、変異体１３６、変異体１５４および野生型対照（実施例２５および２６に記載した大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ中のベクターｐＳＥ４２０−Ｃ−Ｈｉｓ中の）をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地を含有する寒天プレートにストリークした。単一のコロニーを用いてアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する５ｍＬのＬＢ培地に植菌した。５００μｌを用いて２５０ｍＬバッフル付きフラスコ中の５０ｍＬの同培地に植菌した。細胞は３０℃にてほぼ０．４のＯＤ６００ｎｍまで増殖させた。ＩＰＴＧは最終濃度１ｍＭで添加した。細胞は３０℃にて４時間増殖させ、遠心によって収集した。細胞は、細胞抽出物を調製するまで−８０℃にて直ちに凍結した。
細胞抽出物は、実施例4に記載したように調製した。タンパク質濃度は、標準としてのＢＳＡ（Pierce Rockford，IL）を用いたＢＣＡ（Pierce，Rockford，IL）マイクロタイタープレートアッセイを用いて測定した。無細胞抽出物中のＤ−アミノトランスフェラーゼの濃度を概算するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、視覚概算を用いて発現のパーセンテージを概算した。ＤＡＴタンパク質は総タンパク質のパーセントとして１０−２５％の範囲の発現で可溶性であり、これを用いてアッセイの用量を算出した。
Ｒ，Ｒ−モナチン形成アッセイは、室温、４ｍＬの反応液中の１００ｍＭのＥＰＰＳ緩衝液ｐＨ７．８、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭのＰＬＰ、２００ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭのリン酸カリウム、０．１ｍｇ／ｍＬのアルドラーゼおよび０．２ｍｇ／ｍＬのＤＡＴを含む０．０１％のＴｗｅｅｎ−８０を含めて行った。変異体２７では、ＤＡＴ酵素０．２ｍｇ／ｍＬの代わりに０．１５ｍｇ／ｍＬを用いた。０．５、１、２、４および２３時間後に、小分けを取り、ギ酸を最終濃度０．２％まで添加し、試料を遠心および濾過した。実施例３６に記載したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いてモナチンについて試料を分析した。結果を表４５に示す。
表４５：（ｐＳＥ４２０−Ｃ−Ｈｉｓにクローニングした）ＤＡＴの活性
Figure 0005683962
表４５に示すデータからわかるように、ＧＳＳＭ（商標）進化（evolution）を介して得た多数のＤＡＴ変異体が、アッセイの条件下で野生型対照を超えるモナチン形成の改善された初期速度を示した。
ｐＭｅｔ１ａ中のＧＳＳＭ（商標）ＤＡＴの分析
この実施例では、本明細書に開示した例示的なポリペプチドの酵素活性を示すデータを記載する。変異体２、変異体６、変異体１１、変異体２７、変異体４０、変異体４４、変異体４５、変異体５８、変異体１１０、変異体１３５、および変異体１３６は、製造業者の指示書に従ってクイックチェンジ複数部位特異的変異導入キット（Stratagene，La Jolla，CA）を用いた部位特異的−変異導入によって再形成した。変異体を作製するために、実施例１６に記載したｐＭＥＴ１ａタグ付き構築物（ｐＭＥＴ１ａ：配列番号：２２０（ＷＴ））を鋳型として使用した。使用した変異導入プライマーを以下の表４６に掲載する。ＰＣＲ断片をＤｐｎ１（Invitrogen，Carlsbad，CA）で１時間消化し、大腸菌Ｔｏｐ１０細胞（Invitrogen，Carlsbad，CA)に形質転換した。得られた精製プラスミド調製物を配列決定して（Agencourt，Beverly，MA）、正確な突然変異が導入されたことを確認した。ついで、プラスミドを大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）発現宿主（Novagen，San Diego，CA)に形質転換した。
表４６：変異導入用のプライマー
Figure 0005683962
変異体２、変異体６、変異体２７、変異体４０、変異体４５、変異体５８、変異体１１０、変異体１１９、変異体１３１、変異体１３５、変異体１３６、変異体１５２、変異体１５４をｐＭＥＴ１ａベクターに作製し、実施例２に記載した和合性大腸菌発現宿主Ｂ８３４（ＤＥ３）（Novagen，San Diego，Ca）に形質転換した。カルベニシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地中の一晩培養物を１００ｍＬの同一培地に１：１０００で希釈し、５００ｍＬバッフル付きフラスコ中で増殖させた。その培養物をオーバーナイトエクスプレスＩＩ培地（溶液１−６，Novagen）中で１０のＯＤ６００ｎｍまで３０℃にて一晩増殖させた。総タンパク質用の試料を収集直前に採った。遠心によって細胞を収集し、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．８を用いて１回洗浄した。細胞は、細胞抽出物を調製するまで−８０℃にて直ちに凍結した。部位−特異的変異導入に加えて、当業者は実施例２５に記載したような多変化変異導入ＰＣＲ技術を用いてこれらのＤ−アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子を合成し得ることを言及する。
細胞抽出物を調製し、緩衝液として１００ｍＭのリン酸カリウムを用いてＰＤ１０カラムを溶出および平衡化して実施例４に記載したように脱塩した。総タンパク質およびＤＡＴ濃度は記載したように測定した。
アミノ受容体としてピルビン酸を用いたＲ，Ｒ−モナチンのトランスアミノ化は、１５ｍＭのＲ，Ｒ−モナチンを利用する以外は実施例５に記載したように行った。アラニン、モナチンおよびモナチン前駆体レベルの初期分析は、表４７に示すように変異体４０、変異体１３５および変異体１３６を最高レベルのアラニン産生を生じる優れた変異体として同定した。種々の時点のアラニン産生の数字（ｍＭの）を表４７に示す。
表４７：ｐＭＥＴ１ａにクローニングしたＤＡＴからのＲ，Ｒモナチントランスアミノ化
反応からのアラニン形成（ｍＭ）
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−−：本条件下で未測定
活性をさらに評価するために、約０．２ｍｇ／ｍＬのＤＡＴ濃度を用いて実施例１に記載したようにモナチン形成アッセイを行った。対照として、０．２ｍｇ／ｍＬ濃度の精製した野生型ＤＡＴを評価した。０．５、１、２および４時間後に、小分けを採り、ギ酸を最終濃度２％まで添加し、試料を遠心および濾過した。試料は、本明細書に記載したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いてモナチンについて分析し、実施例３６に記載したＬＣ／ＯＰＡポスト−カラム蛍光法を用いてトリプトファンおよびアラニンについて分析した。
表４８：ｐＭＥＴ１ａにおけるＤＡＴの活性
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表４８に示した全てのＤＡＴがモナチンを産生した。ＤＡＴ変異体である変異体５８、変異体１３５および変異体１３６は、野生型対照よりも迅速な初期速度を有していた。変異体１３６は反応１（Ｄ−ＴｒｐからＩ３Ｐの変換）についてより遅かったが、野生型対照よりもより良好な全体モナチン産生を有していた。
最終時点については、さらなる小分けを採って（ギ酸を添加することなく）、実施例３６に記載したＦＤＡＡ誘導化法を用いて産生したモナチンの立体異性分布を測定した。試験した選択変異体については、ほとんどないし全く立体純度に影響がなかった。すべての場合において、変異体は試験したアッセイ条件下で９８．８％を超えるＲ，Ｒを産生した。これらの結果を表４９に示す。
表４９：４時間に選択した変異体によって産生されたモナチンの立体純度
Figure 0005683962
実施例２９−テイラード・マルチサイト・コンビナトリアル・アセンブリ（（tailored Multi-Site Combinatorial Assembly；ＴＭＣＡ（商標））変異体の構築および試験
本実施例では、例示的な核酸およびポリペプチドの構築を記載し、それらの酵素活性を記載する。一連のＧＳＳＭ変異体をテイラード・マルチサイト・コンビナトリアル・アセンブリ（tailored Multi-Site Combinatorial Assembly（商標）；ＴＭＣＡ（商標））技術を用いて組合せについて選択した。１または１５ｍＭのモナチン反応のいずれかにおけるＧＳＳＭ進化からの上位１０のものをＴＭＣＡ（商標）について選択した。野生型配列（配列番号：２２０）を３ＤＡＡ−Ｄアミノ酸アミノトランスフェラーゼのモデルに装着した（図４）。図４のモデルはピリドキシル−５’−リン酸Ｄ−アラニンと共に示しており、番号を付けた残基はＴＭＣＡ（商標）進化について選択したサイトを示す。表５０も、ＴＭＣＡ（商標）ライブラリーに含めるために選択した突然変異を掲載している。ＴＭＣＡ（商標）進化は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／０７１７７１号に記載した方法を用いて野生型（配列番号：２２０）および変異体４５に対して行った。
ＴＭＣＡ進化は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／０７１７７１号に記載されており、複数のサイトに種々の突然変異の異なる組合せを有する複数の子孫ポリヌクレオチドを作製する方法を含む。この方法は、一部、以下の工程の少なくとも１以上の組合せによって行い得る：
（「第１」または「鋳型」）ポリヌクレオチドの配列情報を得ること。例えば、第１または鋳型配列は野生型（例えば、配列番号：２２０）または突然変異（例えば、変異体４５）配列とし得る。配列情報は、完全なポリヌクレオチド（例えば、遺伝子または読み取り枠）または、結合用のサイト、結合特異性、触媒または基質特異性をコードする配列のような関心のある部分領域の情報とし得る。
第１または鋳型ポリヌクレオチド配列に沿った関心のある３以上の突然変異の同定。例えば、突然変異は、第１または鋳型配列内の３、４、５、６、８、１０、１２、２０またはそれ以上の部位におけるものとし得る。部位は、絶対的な位置または周囲の残基またはホモロジーの関連によって予め決定し得る。ＴＭＣＡまたはＤＡＴポリペプチドについては、改善された酵素性能を生じる上位１０のコドン変化を関心のある突然変異として含めた。いずれかの側の突然変異部位を挟む配列を知ることができる。かかる突然変異は、本明細書および米国特許第６，１７１，８２０号；６，５６２，５９４号；および６，７６４，８３５号に記載されている遺伝子部位飽和変異導入（Gene Site Saturation Mutagenesis（商標）；ＧＳＳＭ（商標））技術を用いることによって同定し得る。
関心のある突然変異を含むプライマー（例えば、合成オリゴヌクレオチド）を提供すること。１つの実施形態において、関心のある各突然変異についてプライマーを提供する。したがって、関心のある３の突然変異を有する第１または鋳型ポリヌクレオチドは、その部位における３のプライマーを使用し得る。プライマーは、関心のある突然変異がいずれかのヌクレオチドまたは自然に発生するアミノ酸の範囲、またはその範囲のサブセットとなるように、縮重部位（degenerate position）含むプライマーのプールとしても提供し得る。例えば、プライマーのプールは、脂肪族アミノ酸残基に突然変異を優先するプライマーのプールを提供し得る。
プライマーはフォワードまたはリバース・プライマーとして調製し得、あるいはプライマーは少なくとも１のフォワード・プライマーおよび少なくとも１のリバース・プライマーとして調製し得る。突然変異が互いに近くに位置する場合は、１を超える部位または複数の部位における異なる突然変異の組合せの突然変異を含むプライマーを用いる方が都合がよい場合がある。
鋳型配列を含むポリヌクレオチドを提供すること。第1または鋳型ポリヌクレオチドは、クローニング、配列決定または発現用のプラスミドまたはベクターのように、環状にし、あるいはスーパーコイル化し得る。ポリヌクレオチドは一本鎖（ｓｓＤＮＡ）であってもよく、あるいは二本鎖（ｄｓＤＮＡ）とし得る。例えば、ＴＣＭＡ法はスーパーコイル化した（ｓｃ）ｄｓＤＮＡ鋳型を９５℃にて１分の加熱工程に付す（Levy，Nucleic Acid Res.，28(12):e57(i−vii)（2000)を参照されたい)。
プライマーを反応混合物中の鋳型ポリヌクレオチドに添加すること。プライマーおよび鋳型ポリヌクレオチドは、プライマーが鋳型ポリヌクレオチドにアニールできる条件下で合する。ＴＭＣＡプロトコルの１つの実施形態においてはプライマーを単一の反応混合物に添加するが、複数の反応で添加することもできる。
ポリメラーゼ伸長反応を行うこと。伸長産物（例えば、「子孫」または「修飾した伸長ポリヌクレオチド」として）は、慣用的な手段によって増幅し得る。産物は、鎖長、配列、目的の核酸特性について分析し得、あるいはポリペプチドとして発現し得る。他の分析方法には、インサイチュ・ハイブリダイゼーション、配列決定または発現シークエンシングが含まれる。分析は、目的の特性についてスクリーニングおよび選択する1またはそれを超えるラウンドを含み得る。
生成物は、細胞または無細胞系のような他の発現系にも形質転換し得る。無細胞系には、ＤＮＡ複製、修復、組換え、転写または翻訳に関連する酵素が含まれる。例示的な宿主には、細菌、酵母、植物および動物の細胞および細胞系が含まれ、大腸菌（E. coli）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、ピキア・パトリス（Pichia pastoris）およびアスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）が含まれる。例えば、大腸菌のＸＬ１−ＢｌｕｅまたはＳｔｂ１２菌株を宿主として使用し得る。
本発明の方法は、異なる反応条件下で同一または異なるプライマーと一緒に用いて、異なる組合せまたは多数の突然変異を有する産物を促進する。
前記の例示的な方法を行うことによって、このプロトコルも、このＴＭＣＡ進化法によって産生した１またはそれを超えるポリヌクレオチドを提供し、ついでそれを望ましい特性についてスクリーニングまたは選択する。１またはそれを超える子孫ポリヌクレオチドはポリペプチドとして発現させて、所望により望ましい特性についてスクリーニングまたは選択し得る。したがって、ＴＭＣＡ進化プロトコル（evolution protocol）のこの実施形態は、ポリヌクレオチドおよびコードされたポリペプチド、ならびにかかるポリペプチドをコードするかかるポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。ＴＭＣＡ進化プロトコルのこの実施形態は、さらに、ライブラリーをスクリーニングまたは選択して望ましい活性を有する１またはそれを超えるポリヌクレオチドをコードする１またはそれを超えるポリヌクレオチドを得る、ライブラリーをスクリーニングすることを提供する。
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／０７１７７１号に記載のＴＭＣＡ進化プロトコルのもう１つの実施形態は、複数の修飾ポリヌクレオチドを生成する方法を含む。かかる方法は、一般的に、（ａ）単一の反応混合物中の二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに少なくとも３つのプライマーを添加し、ここに該少なくとも３つのプライマーは重複せず、少なくとも３つのプライマーの各々は他のプライマーとは異なる少なくとも１の突然変異を含み、少なくとも１のプライマーは鋳型のマイナス鎖にアニーリングし得るフォワード・プライマーであり、少なくとも１のプライマーは鋳型のプラス鎖にアニーリングし得るリバース・プライマーであり、ついで、（ｂ）反応混合物をポリメラーゼ伸長反応に付して少なくとも３のプライマーからの複数の伸長した修飾ポリヌクレオチドを得る、ことを含む。
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／０７１７７１号に記載のＴＭＣＡ進化プロトコルのもう１つのプロトコルは、リガーゼで処理していない複数の伸長産物で細胞を形質転換する方法を含む。本発明のもう１つの実施形態において、複数の伸長した修飾ポリヌクレオチドを細胞から回収する。もう１つの実施形態において、回収した複数の伸長した修飾ポリヌクレオチドは、例えば、複数の伸長した修飾ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１を発現させ、それから発現したポリペプチドを分析することによって分析する。もう１つの実施形態において、関心のある突然変異を含む複数の伸長した修飾ポリヌクレオチドを選択する。
ＴＭＣＡ進化プロトコルのもう１つの実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドに関する配列情報、および鋳型ポリヌクレオチドに沿った関心のある３またはそれを超える突然変異を同定し得る。もう１つの実施形態において、ポリメラーゼ伸長によって得た産物は、複数の伸長した修飾産物を細胞に形質転換する前に分析し得る。
ＴＭＣＡ進化プロトコルの１つの実施形態において、ポリメラーゼ伸長によって得た産物は、酵素、例えば、ＤｐｎＩ制限酵素のような制限酵素で処理し、それによって鋳型ポリヌクレオチド配列を破壊する。処理した産物は細胞、例えば、大腸菌細胞に形質転換し得る。
ＴＭＣＡ進化プロトコルの１つの実施形態において、少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、または少なくとも９、または少なくとも１０、または少なくとも１１、または少なくとも１２、またはそれを超えるプライマーを使用し得る。１つの実施形態において、各プライマーは単一の点突然変異を含む。もう１つの実施形態において、２つのフォワードまたは２つのリバースプライマーは、鋳型ポリヌクレオチド上の同一の部位に異なる変化を含む。もう１つの実施形態において、少なくとも１のプライマーは、鋳型ポリヌクレオチド上の異なる部位に少なくとも２つの変化を含む。いまだもう１つの実施形態において、少なくとも１のプライマーは異なる部位に少なくとも２つの変化を含み、少なくとも２つのフォワードまたは２つのリバース・プライマーは鋳型ポリヌクレオチド上の同一の部位に異なる変化を含む。
ＴＭＣＡ進化プロトコルの１つの実施形態において、フォワード・プライマーはフォワードグループにグループ分けし、リバース・プライマーはリバースグループにグループ分けし、フォワードグループのプライマーおよびリバースグループのプライマーは、互いに独立して、鋳型ポリヌクレオチドの部位に関係なく対応するグループ中で等濃度に規格化し、ここに、規格化の後に、等量のフォワードおよびリバース・プライマーを反応物に添加する。この規格化法においては、幾つかの部位の組合せをバイアスし得る。バイアスは、例えば、複数のプライマーを含む部位と比較して、単一のプライマーを含む１の部位の比較的低いプライマー濃度に起因し得る。「部位バイアス」とは、フォワードまたはリバース・プライマーグループ内の他の部位と比較して単一の部位におけるプライマーの取込みについて強い優先性を示す得られるポリヌクレオチドをいう。これにより、単一プライマー部位内に高いパーセンテージの突然変異を有し得るが、そのフォワードまたはリバース・プライマー群内の他の部位においては低いパーセンテージの突然変異を有し得る修飾ポリヌクレオチドの組合せが生じる。ＴＭＣＡの目的が鋳型に対する全ての可能な組合せの変化を含む子孫ポリヌクレオチドを生成することにある場合は、このバイアスは望ましくない。バイアスは、例えば、各部位でのプールとしてプライマーを等しく規格化することによって、修正し得る。
ＴＭＣＡ進化プロトコルの１つの実施形態において、プライマーの規格化は、鋳型ポリヌクレオチド上のその場所に依存してプライマーを複数のグループに組織化することによって行い、ここに鋳型上の同じ選択した領域をカバーするプライマーは１のグループ中に存在し；各グループ内でグループ分けされたプライマーは等濃度であり；１のグループ内のフォワード・プライマーをフォワード・グループにプールし、フォワード・プライマーの各グループ間の濃度が等しくなるよに規格化し；ついで、等量のプールしたフォワードおよびリバース・プライマーを反応物に添加することによって行う。部位の組合せについてバイアスは認められなかった。
ＴＭＣＡ進化プロトコルの１つの実施形態において、各々が縮重部位を含む一連の縮重プライマーを提供し、ここに関心のある突然変異は縮重部位の異なるヌクレオチドの範囲である。もう１つの実施形態において、少なくとも１の鋳型ポリヌクレオチドの少なくとも１のコドンおよび鋳型ポリヌクレオチド配列のコドンに近接する配列に相同である少なくとも１の近接配列に対応する少なくとも１の縮重コドンを含む一連の縮重プライマーを提供する。もう１つの実施形態において、縮重したコドンはＮ，Ｎ，Ｎであり、２０の自然に発生するアミノ酸のいずれかをコードする。もう１つの実施形態において、縮重したコドンは２０未満の自然に発生するアミノ酸をコードする。
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０８／０７１７７１号に記載のＴＭＣＡ進化プロトコルのもう１つの実施形態には、関心のある突然変異を含む複数の修飾ポリヌクレオチドを作製する方法が含まれる。一般的に、かかる方法には、（ａ）少なくとも２つのプライマーを単一の反応混合物中の二本鎖鋳型ポリヌクレオチドに添加し、ここに少なくとも２つのプライマーは重複しておらず、少なくとも２つのプライマーの各々は他のプライマー（または複数のプライマー）とは異なる少なくとも１の突然変異を含み、少なくとも１のプライマーは鋳型のマイナス鎖にアニーリングすることができるフォワード・プライマーであり、少なくとも１のプライマーは鋳型のプラス鎖にアニーリングすることができるリバース・プライマーであり、（ｂ）反応混合物をポリメラーゼ伸長反応に付して、少なくとも２つのプライマーから複数の伸長した修飾ポリヌクレオチドを得、（ｃ）複数の伸長した修飾ポリヌクレオチドを酵素で処理し、それによって鋳型ポリヌクレオチドを破壊し、（ｄ）リガーゼで処理していない、処理した伸長した修飾ポリヌクレオチドを細胞に形質転換し、（ｅ）細胞から複数の伸長した修飾ポリヌクレオチドを回収し、（ｆ）関心のある突然変異を含む複数の伸長した修飾ポリヌクレオチドを選択する、ことが含まれる。
表５０：ＴＭＣＡ進化のためのサイトのリスト
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ＴＭＣＡ変異体は、実施例２５のＧＳＳＭ進化に記載したのと同一の方法を用いて増殖させ、整列し、アッセイし、配列決定した。試料の能力は、実施例２５に記載したのと同一のスコアリングシステムを用いてＧＳＳＭ進化からの最高候補−変異体１３５−の能力と比較した。表５２は、ユニークなＤＮＡ配列を用いたＴＭＣＡ二次スクリーニングのヒットを掲載している（ＴＭＣＡ変異体はアルファベット文字で表示して、数字で表示しているＧＳＳＭ変異体と区別している）。
表５２：二次スクリーニングのヒットとして同定したＴＭＣＡ変異体
Figure 0005683962
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表５２に同定した試料を増殖させ、規格化し、実施例２６のＧＳＳＭ進化で記載したのと同一の方法を用いた三次スクリーニングでアッセイした。モナチンおよびアラニン値はＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定し、標準曲線と比較した。試料の能力を変異体１３５（ＧＳＳＭ進化からの最高能力のもの）の活性と比較した。三次スクリーニングで同定したＴＭＣＡ上位変異体（upmutant）を表５３に掲載する。
実施例３１−ＴＭＣＡヒットの活性
本実施例では、例示的ポリペプチドの酵素活性を示すデータを記載する。以下の表５３は、１ｍＭおよび１５ｍＭのＲ，Ｒ−モナチン基質を用いた反応の１５分時点の変異体１３５に対する上位変異体の活性を示す。相対活性は、試料によって産生されたアラニンの量を、変異体１３５によって産生されたアラニンの量で除したものである。
表５３：三次スクリーニングにおけるＴＭＣＡ上位変異体の活性
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試験した条件下で変異体１３５を凌ぐ幾つかの試料を同定した。潜在的ＫｍおよびＶｍａｘ上位変異体を同定した。ＧＳＳＭおよびＴＭＣＡ進化の結果は、野生型の配列番号：２２０がモナチンに対する増大した比活性についてさらに進化させ得ることを示している。
実施例３２−ｐＭＥＴ１ａにおけるＴＭＣＡ変異体ＤＡＴの評価
本実施例では、本明細書に記載した例示的なポリペプチドの酵素活性を示すデータを記載する。変異体Ｅ、変異体Ｇ、変異体Ｉ、変異体Ｍ、変異体Ｏ、変異体Ｐ、変異体ＢＢ、変異体ＰＰ、変異体ＷＷおよび変異体ＡＡＡ（ＴＭＣＡ技術を用いて作製したＤＡＴ、実施例２９および３０を参照されたい）は、製造業者の指示書に従ってクイックチェンジ複数部位特異的変異導入キット（Stratagene，La Jolla，CA）を用いた部位特異的変異導入によって再作製した。変異体を作製するために、実施例１６および実施例２８に記載のｐＭＥＴ１ａタグ付き構築物を鋳型として用いた。使用した変異導入プライマーを以下の表５４に掲載する。ＰＣＲ断片をＤｐｎＩ（Invitrogen，Carlsbad，CA）で１時間消化し、大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞（Stratagene，La Jolla，CA）に形質転換した。得られた精製プラスミド調製物を配列決定して（Agencourt，Beverly，MA）、正しく突然変異が導入されていることを確認した。ついで、プラスミドを大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）発現宿主（Novagen，San Diego，CA）に形質転換した。
表５４：ｐＭＥＴ１ａベクター中の変異体用のプライマー
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カルボキシ−末端Ｈｉｓタグ付き変異体１１０、変異体１３５、変異体１３６、変異体Ｅ、変異体Ｇ、変異体Ｉ、変異体Ｍ、変異体Ｏ、変異体Ｐ、変異体ＢＢ、変異体ＰＰ、変異体ＷＷ、変異体ＡＡＡおよび野生型（配列番号：２２０）タンパク質を発現する大腸菌Ｂ８３４（ＤＥ３）（Novagen，San Diego，CA）培養物を、５００ｍＬバッフル付きフラスコ中の２００ｍＬのオーバーナイトエクスプレスＩＩ培地（溶液１−６、Novagen）中、３０℃にてＯＤ６００が１０に達するまで増殖させた。総タンパク質について試料を収集直前に取得した。細胞は遠心によって収集し、実施例４に記載したように細胞抽出物を調製するまで直ちに−８０℃にて凍結した。
５０μＬのベンゾナーゼ・ヌクレアーゼ（Benzonase Nuclease；Novagen,San Diego，CA）、０．７５μｌのｒ−リソザイム（Lysozyme）（Novagen，San Diego，CA）および２５０μｌのプロテアーゼインヒビターカクテルＩＩ（Calbiochem，San Diego，CA）を含む５０ｍＬのバッグバスター・プライマリーアミンフリー（Bug Buster Primary Amine Free；Novagen,San Diego，CA）を添加することによって細胞抽出物を作製した。細胞は穏やかに揺らしながら室温にて１５分間インキュベートした。エクストラクトは４５，０００×ｇにて１０分間遠心した。
Ｈｉｓタグ付きタンパク質は、ＧＥヘルスケア（Piscataway，NJ）キレーティング・セファロース（Chelating Sepharose（商標））ファストフロウ樹脂を用いて実施例４に記載したように精製した。異なる部分として、変異体１８２を実施例４に記載したＣＦＥとして分析した。精製したタンパク質はＰＤ１０カラムを用いて０．０５０ｍＭのＰＬＰを含む１００ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．８にＰＤ１０カラムを用いて脱塩した。総タンパク質およびＤＡＴ濃度は、実施例４に記載したように測定した。
３−工程モナチン形成アッセイは、ほぼ０．２ｍｇ／ｍＬのＤＡＴ濃度および０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のアルドラーゼを用いて実施例５に記載したように行った。対照として、０．２ｍｇ／ｍＬ濃度の精製した野生型ＤＡＴ（配列番号：２２０）を評価した。０．５時間、１時間、２時間、４時間および２４時間後に、小分けを取得し、ギ酸を２％の最終濃度で添加し、試料を遠心および濾過した。試料はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いてモナチンについて、実施例３６に記載したＬＣ／ＯＰＡポスト−カラム蛍光法を用いてトリプトファンおよびアラニンについて分析した。最後の時点において、さらなる小分けを採り（ｐＨ調整せず）、実施例３６に記載されたＦＤＡＡ−誘導法によって％Ｒ，Ｒモナチンを測定した。種々の時点に生成されたモナチンの量（ｍＭ）は表５５に見出すことができる。立体純度も測定し、Ｒ，Ｒ立体異性体のパーセントは一番右側の欄に見出すことができる。立体異性体Ｒ，Ｓは大部分のバランスを構成している。
表５５：選択ＤＡＴ変異体の活性
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-- = 試験した条件下で未測定
試験した条件下でのモナチン産生の相対比は、変異体および野生型対照（配列番号:２２０）ＤＡＴの間の最初の時間にわたる精製タンパク質とモナチン形成の速度を比較することによって決定した、変異体１３５、変異体１３６、変異体Ｅ、変異体Ｇ、変異体Ｍ、変異体Ｏ、変異体ＢＢおよび変異体ＡＡＡからの初期活性における最大の改善を示している。ＤＡＴ変異体Ｅおよび変異体ＡＡＡは高い活性を有していたが、試験した条件下で良好に発現せず（総タンパク質の５％未満）、また非常に可溶性でもなかった。
アッセイ試料は、モナチン前駆体であるＩ３Ｐおよび実施例３６に記載した副産物４−ヒドロキシ−４−メチルグルタミン酸（ＨＭＧ）のような中間体についても分析した。形成したＨＭＧの量の分析は、変異体Ｅ、変異体Ｇ、変異体Ｉ、変異体Ｍ、変異体Ｏ、変異体ＢＢ、変異体ＰＰ、変異体ＡＡＡおよび変異体１１０、変異体１３５および変異体１３６について測定した。４時間の時点においては、変異体１３５、変異体Ｇ、変異体Ｉ、変異体Ｍおよび変異体ＢＢによってより多量のＨＭＧが形成されたようである。これらの変異体はすべて変化Ｖ２３６Ｔを含有していた。ＨＭＧもおそらく残基Ｐ２０Ｓにおける変化に起因して、変異体Ｅ、変異体Ｇ、変異体Ｍおよび変異体ＡＡＡと共に、野生型対照（配列番号：２２０）のレベルを超えて存在していた。
表５６：４時間後のＤＡＴ変異体によるＨＭＧ形成
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ｎｄ＝検出されず
Ｉ３Ｐ形成をモニタするＤＡＴアッセイ
トリプトファンからのＩ３Ｐの形成は、３４０ｎｍの波長で測定およびモニタした。反応は、前記したように調製したＤＡＴ（総タンパク質）の１００μＬ希釈液と合した９００μＬの２５ｍＭのＤ−トリプトファン、２５ｍＭのピルビン酸ナトリウム塩、０．０５ｍＭのＰＬＰ、１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ７．８）溶液を含む１ｍＬの反応体積で行った。酵素は、アッセイに添加する前に、冷５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．８）および５０μＭのＰＬＰを用いて１：１００および１：２００に希釈した。酵素は反応混合物に１：１００で添加し、１５秒の増大で３分間モニタした。インドール−３−ピルビン酸（Ｉ３Ｐ）の形成は、バイオラッド・スペクトロフォトメーター（Spectrophotometer）（GE Healthscience，Piscataway，NJ）上、３４０ｎｍの波長で３分間モニタし、標準曲線のダイナミックレンジ内で速度を測定した。標準曲線は精製した野生型（配列番号：２２０）ＤＡＴタンパク質を用いて作製し、細胞抽出物中のＤＡＴの濃度は標準曲線の線の等式に基づいて測定した。最初の反応に対する野生型ＤＡＴに対するＤＡＴの有効濃度を表５７に報告する。
表５７：ＤＡＴの活性（Ｉ３Ｐへのトリプトファンの変換）
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野生型ＤＡＴ（配列番号：２２０）および変異体１３６、Ｅ、Ｇ、Ｍ、Ｏ、ＢＢおよびＡＡＡはトリプトファンからＩ３Ｐへのおよびモナチン前駆体からモナチンへの両方の変換を促進し得る。表５７は、これらの変異体が野生型ＤＡＴ（配列番号：２２０）に対してトリプトファンからＩ３Ｐへの変換について低い活性を有したことを示している。また、表５５によれば、同一の変異体は野生型ＤＡＴ（配列番号：２２０）よりもトリプトファンからより多量の総モナチンを生成した。したがって、本明細書に記載したアッセイの条件下では、モナチン生合成経路におけるトリプトファンからＩ３Ｐへの変換を制御することを介してモナチン生成に有利に作用するようである。例えば、変異体ＥはトリプトファンからＩ３Ｐへの変換について最低の相対活性を示したが（表５７を参照されたい）、それは４時間に最大量のモナチンを生成した（表５５を参照されたい）。理論に拘束されるものではないが、反応の第１工程を制御する有利な効果は、Ｉ３Ｐ構成の減少およびその後のモナチン以外の産物までの潜在的なＩ３Ｐ分解に帰し得るであろう。一般的に、例えば１またはそれを超える変異体ＤＡＴを用いて、トリプトファンからモナチンの生成に関与する１またはそれを超える反応の速度を制御することは、生成するモナチンの総量に対して有利な効果を有し得るようである。
実施例３３ ３５℃における変異体ＤＡＴの評価
この実施例では、本明細書に開示する例示的なポリペプチドの酵素活性を示すデータを記載する。初期培養物は、ＯＤ６００ｎｍが０．０５に達するまで穏やかに２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて一晩増殖させた。２００ｍＬのオーバーナイトエクスプレスＩＩ培地（Novagen，San Diego，CA）は実施例３に記載したように植菌および増殖させた。培養物は２重で増殖させ、細胞ペレットを合した。ペレットは０．０５ｍＭのＰＬＰを含む４０ｍＬの５０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）に再懸濁し、製造業者の指示書に従ってフレンチプレス（French Press；Sim Aminco，Rochester，NY）を用いて消化した。上清を清潔な試験管に収集し、使用するまで−８０℃にて保存した。
ガラスバイアル中のほぼ０．２ｍｇ／ｍＬのＤＡＴ濃度および０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のアルドラーゼを用いて、方法に記載したように３工程モナチン形成アッセイを行った。二重の試料は２５℃または３５℃のいずれかでインキュベートし、１時間、３時間および４時間後に小分けを採り、ギ酸を２％の最終濃度で添加し、試料を遠心および濾過した。試料は、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いてモナチンについて、実施例３６に記載したＬＣ／ＯＰＡポスト−カラム蛍光法を用いてアラニンについて分析した。試料は、実施例３６に記載したようにモナチン前駆体、Ｉ３Ｐ、および４−ヒドロキシ−４−メチルグルタミン酸（ＨＭＧ）のような中間体についても分析した。種々の時点で生成したモナチンの量（ｍＭ）を表５８に示す。
モナチン形成活性は、反応をプラスチック・バイアル中で行うことを除いて同様の条件下で野生型対照（配列番号:２２０）、変異体１３５および変異体Ｍについて繰り返した。種々の時点のモナチン産生は表５８に見出すことができる。
表５８：２５℃および３５℃でのモナチン形成
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アッセイの条件下、３５℃での本明細書に記載するＤＡＴ酵素を用いてより低いモナチン力価が観察された。しかしながら、選択変異体である変異体１３５、変異体１３６、変異体Ｍ、変異体Ｏおよび変異体ＢＢは、増大した初期モナチン産生を示し、アッセイ条件下、３５℃にて野生型対照（配列番号：２２０）よりもより大きな４時間モナチン力価を示した。
実施例３４−バイオリアクターにおける変異体ＤＡＴの評価
本実施例では、バイオリアクターにおける本明細書に記載した例示的なポリペプチドの酵素活性を示すデータを記載する。野生型対照（配列番号：２２０）、変異体１３５、変異体１３６、変異体Ｍ、変異体Ｏおよび変異体ＢＢのグリセロールストックを用いて、単一コロニーについてプレートをストリークした。単一コロニーを用いて、適当な抗生物質を含む５ｍＬのＬＢ培地を含有するフラスコに植菌した。スターター培養物は２５０ｒｐｍで振盪しつつ３７℃にて一晩増殖させ、ＯＤ６００ｎｍをチェックした。ＯＤ６００ｎｍが０．０５に達したら、５ｍＬの培養物を２００ｍＬのオーバーナイトエクスプレスＩＩ培地（Novagen，San Diego，CA）に植菌し、ついで２５０ｒｐｍで振盪しつつ３０℃にてインキュベートした。各培養物は二重で増殖させ、細胞ペレットを合した。培養物は４０００ｒｐｍにて１５分間の遠心によって細胞をペレット化することによって収集した。上清を破棄し、ペレットは後に使用するために凍結するか、または４０ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）に再懸濁し、製造業者の指示書に従ってフレンチプレス（Sim Aminco，Rochester，NY）またはマイクロフルイダイザー（Microfluidics Corporation，Newton，MA）を用いて消化した。上清を清潔な試験管に収集し、使用するまで−８０℃にて保存した。ほぼ１ｍＬの清澄化したライゼートを、ＢＣＡアッセイ（Pierce，Rockford，IL）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いたタンパク質定量のために保持した。
ベンチ規模の反応（２５０ｍＬ）を、実施例１５に記載したように窒素ヘッドスペースの下、０．７Ｌのシックスフォルス（Sixfors）攪拌型発酵槽（Infors AG，Bottmingen，Switzerland）で行った。反応混合物には、１０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭのＰＬＰ、２００ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１３０ｍＭのＤ−トリプトファンを含ませた。反応混合物は２５℃に調整し、水酸化カリウムでｐＨ７．８に調節した。実施例６に記載したアルドラーゼを、０．０２ｍｇ／ｍＬの標的タンパク質の清澄化した細胞抽出物として添加した。野生型対照（配列番号：２２０）、変異体１３５、変異体１３６、変異体Ｍ、変異体Ｏおよび変異体ＢＢのＤＡＴは、目視概算に基づいて１５−３５％の範囲の可溶性タンパク質発現を有する。清澄化した細胞抽出物を０．２０ｍｇ／ｍＬの標的タンパク質で添加した。
反応の進行は、実施例３６に記載したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いて１、２、４および２４時間のモナチン産生を測定することによって追跡した。結果を表５９に示す。
表５９：発酵槽におけるモナチン産生
Figure 0005683962
変異体１３６、変異体Ｍ、変異体Ｏおよび変異体ＢＢで観察されたモナチン産生の初期速度は、野生型対照（配列番号：２２０）での速度よりも速かった。すべての変異体は、試験した条件下で２時間に改善されたモナチン形成を示した。変異体１３５についての１時間の予想されたモナチン力価よりも低いことは、最初の時間の間に酸素に不注意に曝露されたことに起因する。４時間後、モナチン力価は試験した条件下で変異体および対照の間で同等であった。
実施例３５−バイオリアクターにおける変異体ＤＡＴに対する温度の影響の評価
本実施例では、異なる温度条件下の本明細書に記載する例示的なポリペプチドの酵素活性を示すデータを記載する。野生型対照（配列番号：２２０）、変異体１３５および変異体Ｍは、実施例１５に記載したように２．５Ｌ規模の発酵槽で生成した。発酵の終了時に、細胞を５０００−７０００×ｇにて１０分の遠心によって収集し、−８０℃の湿潤細胞ペーストとして凍結した。
野生型対照、変異体１３５および変異体ＭのＤ−アミノトランスフェラーゼを含有する無細胞抽出物を調製するために、５０ｇの湿潤細胞ペーストを、０．０５ｍＭのリン酸ピリドキサール（ＰＬＰ）を含有する１５０ｍＬの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）に懸濁し、ついで、懸濁液の温度を１５℃未満に維持しつつマイクロフルイディクス（Microfluidics）ホモジナイザー（Microfluidics，Newton，MA）（１８，０００ｐｓｉで３回通した）を用いて破砕した。細胞の残渣を遠心（２０，０００×ｇ、３０分間）によって除去した。
トリプトファンからのＩ３Ｐの形成速度は、実施例３２に記載したように３４０ｎｍで３分間モニタした。精製したＤＡＴ野生型対照を用いて作成した標準曲線に基づいて、野生型対照の濃度は６．８ｍｇ／ｍＬと測定され、変異体１３５の濃度は７．０ｍｇ／ｍＬと測定され、変異体Ｍは５．６ｍｇ／ｍＬと測定された。Ｉ３Ｐ形成によって測定したＤＡＴ濃度を用いて、Ｉｎｆｏｒｓを０．２ｍｇ／ｍＬのＤＡＴに投薬した。アルドラーゼは、０．０２ｍｇ／ｍＬのアルドラーゼの無細胞抽出物として添加した。反応混合物は、窒素ヘッドスペース下の１０ｍＭのリン酸カリウム、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ｍＭのＰＬＰ、２００ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび１３０ｍＭのＤ−トリプトファンを含んでいた。各々のＤＡＴを、３５℃および２５℃におけるバイオリアクター中のモナチン産生について評価した。
試料は０．５時間、１時間、３時間、４時間および２４時間に採り、実施例３６に記載したＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法を用いて分析した。結果を表６０に示す。
表６０：２５および３５℃の発酵槽
Figure 0005683962
実施例３４に示されるように、選択変異体ＤＡＴは野生型対照ＤＡＴ（配列番号：２２０）と比較して３５℃におけるより高いモナチン力価を与えた。野生型対照ＤＡＴはよりモナチン産生のより遅い初期速度を有していたが、試験した条件下、２５℃ではより高い最終力価を有していた。変異体１３５および変異体Ｍは両方とも、２５℃および３５℃で野生型対照を超える改善された活性を示した。変異体１３５および変異体Ｍはより高いモナチン産生の初期速度および試験した条件下で対照に匹敵するより高い３５℃における力価の両方を有していた。選択した変異体は、より高い温度で野生型対照よりもより安定であった。このことは、野生型対照よりもより大きな熱安定性を有する変異体を作製することにおけるＧＳＳＭおよびＴＭＣＡ技術の利点を示している。当業者であれば、例えば増大した温度耐性を有する変異体についてこれらのＧＳＳＭまたはＴＭＣＡライブラリーをスクリーニングし得るであろう。
実施例３６−モナチン、ＭＰ、トリプトファン、アラニンおよびＨＭＧの検出
本実施例では、本明細書に記載する例示的なＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＤＡＴ）酵素のさらなるキャラクタリゼーションに関連する分析法を記載する。
モナチンおよびトリプトファンのＵＰＬＣ／ＵＶ分析
生化学反応に由来するモナチンおよびトリプトファンについての混合物の分析は、ウォーターズ・アクイティ・フォトダイオード・アレイ（Waters Acquity Photo−Diode Array、ＰＤＡ）吸収モニタを含むウォーターズ・アクイティ（Waters Acquity）ＵＰＬＣ機器を用いて行った。ＵＰＬＣ分離は、２３℃のアギレントＸＤＢ Ｃ８ １．８μｍ ２．１×１００ｍｍカラム（パート番号９２８７００−９０６）（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて行った。ＵＰＬＣ移動相はＡ）０．１％のギ酸を含有する水、Ｂ）０．１％のギ酸を含有するアセトニトリルからなる。
勾配溶出は、各溶出間の１．２分の再平衡期間を含む、５％のＢから４０％のＢへの線形、０−４分、４０％のＢから９０％のＢへの線形、４−４．２分、９０％のＢから９０％のＢの定組成、４．２−５．２分、９０％のＢから５％のＢへの線形、５．２−５．３分であった。流速は０．５ｍＬ／分で、ＰＤＡ吸収は２８０ｎｍでモニタした。試料の濃度は、９９．９％の最小決定係数で、既知の濃度に対する２８０ｎｍのピーク面積の線形最小二乗較正から計算した。
Ｏ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（ＮＢＨＡ）を用いたモナチン中間体（インドール−３−ピルビン酸（Ｉ３Ｐ）、ヒドロキシメチルオキシグルタル酸、モナチン前駆体およびピルビン酸）の誘導化
モナチン産生のプロセスにおいて、種々の中間体化合物を形成し、利用した。これらの化合物には：インドール−３−ピルビン酸（Ｉ３Ｐ）、ヒドロキシメチルオキシグルタル酸、モナチン前駆体およびピルビン酸が含まれる。これらの化合物上のケトン官能基は、Ｏ−（４−ニトロベンジル）ヒドロキシルアミン塩酸塩（ＮＢＨＡ）を用いて誘導化し得る。
２０μＬの試料または標準に１４０μＬのＮＢＨＡ（ピリジン中の４０ｍｇ／ｍＬ）を琥珀バイアル中で添加した。試料は、時々混合しながら加熱下で１５分間超音波処理した。水中の３５％アセトニトリル中で１：３希釈を行った。
モナチン中間体（インドール−３−ピルビン酸、ヒドロキシメチルオキシグルタル酸、モナチン前駆体およびピルビン酸）のＵＰＬＣ／ＵＶ分析
ウォーターズ・アクイティ・フォトダイオード・アレイ（ＰＤＡ）吸収モニタを含むウォーターズ・アクイティＵＰＬＣ機器（Waters，Milford，MA）を中間体化合物の分析に使用した。ＵＰＬＣ分離は、５０℃にてウォーターズ・アクイティＨＳＳ Ｔ３ １．８ｍｍ×１５０ｍｍカラム（Waters，Milford，MA）を用いて行った。ＵＰＬＣ移動相は、Ａ）０．３％のギ酸および１０ｍＭのギ酸アンモニウムを含有する水およびＢ）０．３％のギ酸および１０ｍＭのギ酸アンモニウムを含有する５０／５０のアセトニトリル／メタノールからなる。
勾配溶出は、各溶出間の３分の再平衡期間を含む、５％のＢから４０％のＢへの線形、０−１．５分、４０％のＢから５０％のＢへの線形、１．５−４．５分、５０％のＢから９０％のＢへの線形、４．５−７．５分、９０％のＢから９５％のＢへの線形、７．５−１０．５分であった。流速は０−７．５分は０．１５ｍＬ／分、７．５−１０．５分は０．１８ｍＬ／分、１０．５−１１分は０．１９ｍＬ／分および１１−１３．５分は０．１５ｍＬ／分であった。ＰＤＡ吸収は２７０ｎｍでモニタした。
試料の濃度は、９９．９％の最小決定係数で、既知の濃度に対する２７０ｎｍのピーク面積の線形最小二乗較正から計算した。
モナチンのキラルＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（ＮＲＭ）測定
生化学反応におけるモナチンの立体異性体分布の決定を、１−フルオロ−２−４−ジニトロフェニル−５−Ｌ−アラニンアミド３０（ＦＤＡＡ）を用いた誘導化につづく逆相ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ ＭＲＭ測定によって行った。
ＦＤＡＡを用いたモナチンの誘導化
アセトン中のＦＤＡＡの１％溶液１００μＬを５０μＬの試料または標準に添加した。２０μＬの１．０Ｍ重炭酸ナトリウムを添加し、その混合物を時々混合しながら４０℃にて１時間インキュベートした。試料を取り出し、冷却し、２０μＬの２．０Ｍ ＨＣｌ（緩衝化された生物混合物の中和に作用するためにはより多量のＨＣｌが必要になり得る）で中和した。思慮はＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって分析した。
モナチンの立体異性体分布を決定するためのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ多反応モニタ
クロマトグラフとマイクロマス（Micromass（登録商標））クアトロウルティマ（Quattro Ultima（登録商標））三連四重極質量分析計との間に直列に配したウォーターズ９９６フォトダイオード・アレイ（ＰＤＡ）吸収モニタ（Waters，Milford，MA）を有するウォーターズ２７９５液体クロマトグラフを含むウォーターズ／マイクロマス（Waters/Micromass（登録商標））液体クロマトグラフィー−タンデム・質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）機器を用いて分析を行った。モナチンのすべての４の立体異性体（詳細には、ＦＤＡＡ−モナチン）を分離することができるＬＣ分離は、４０℃のフェノメネクス・ルナ（Phenomenex Luna（登録商標））２．０×２５０ｍｍ（３μｍ）Ｃ１８逆相クロマトグラフィーカラム上で行った。ＬＣ移動相はＡ）０．０５％（質量／体積）酢酸アンモニウムを含有する水およびＢ）アセトニトリルからなっていた。溶出は、各溶出間の８分の再平衡期間を含む、１３％のＢでの定組成、０−２分、１３％のＢから３０％のＢへの線形、２−１５分、３０％のＢから８０％のＢへの線形、１５−１６分、８０％のＢでの定組成、１６−２１分、および８０％のＢから１３％のＢへの線形、２１−２２分であった。流速は０．２３ｍＬ／分で、ＰＤＡ吸収は２００ｎｍから４００ｎｍでモニタした。ＥＳＩ−ＭＳの全てのパラメータは、ＦＤＡＡ−モナチンの脱プロトン化２０モルイオン（［Ｍ−Ｈ］−）の生成および特徴的なフラグメントイオンの生成に基づいて最適化および選択した。以下の機器パラメータをマイナスイオンＥＳＩ／ＭＳモードでのモナチンのＬＣ／ＭＳ分析に用いた：キャピラリー：３．０ｋＶ；コーン：４０Ｖ；ヘキス１：１５Ｖ；アパーチャー：０．１Ｖ；ヘキス２：０．１Ｖ；ソース温度：１２０℃；脱溶媒温度：３５０℃；脱溶媒ガス：６６２Ｌ／ｈ；コーンガス：４２Ｌ／ｈ；低分解能（Ｑ１）：１４．０；高分解能（Ｑ１）：１５．０；イオンエネルギー：０．５；エントランス：０Ｖ；衝突エネルギー：２０；エグジット：０Ｖ；低分解能（Ｑ２）：１５；高分解能（Ｑ２）：１４；イオンエネルギー（Ｑ２）：２．０；乗算器：６５０。３のＦＤＡＡ−モナチン特異的な親−娘トランジションを用いてインビトロおよびインビボ反応においてＦＤＡＡ−モナチンを特異的に検出した。モナチンについてモニタしたトランジションは、５４２．９７から２６７．９４、５４２．９７から４９９．０７および５４２．９７から５２５．０４であった。ＦＤＡＡ−モナチン立体異性体の同定は、精製したモナチン立体異性体と比較したクロマトグラフィー保持時間および質量分析データに基づいた。
ＯＰＡを用いた液体クロマトグラフィー−ポストカラム誘導化、ヒドロキシメチルグルタミン酸（ＨＭＧ）およびアラニンを含むアミノ酸の蛍光検出
生化学反応に由来するＨＭＧおよびアラニンについての混合物の分析は、検出システムとしてウォーターズ２４８７ ２波長吸光検出器（Dual Wavelengths Absorbance Detector）およびウォーターズ２４７５フルオレセンス（Fluorescence）（Waters，Milford，MA）を含むウォーターズ・アライアンス（Alliance）２６９５およびウォーターズ６００組立機器を用いて行った。ＨＰＬＣ分離は、分析カラムとして直列した２個のフェノメネクス・アクアＣ１８ １２５Ａ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍ、３μ、カタログ番号００Ｆ−４３１１Ｂ０カラムと、オン−ライン固相抽出（ＳＰＥ）カラムとしてフェノメネクス・アクアＣ１８ １２５Ａ、３０ｍｍ×２．１ｍｍ、３μ、カタログ番号００Ａ−４３１１Ｂ０を用いて行った。２個の分析カラムの温度は５５℃に、オン−ラインカラムの温度は室温に設定した。ＨＰＬＣ移動相は、Ａ）１％メタノールを含む０．６％酢酸からなる。流速は（１００％のＡ）０．２ｍＬ／分で０−３．５分、０．２４ｍＬ／分で３．５−６．５分、０．２６ｍＬ／分で６．５−１０．４分および０．２ｍＬ／分で１０．４−１１分であった。ＵＶ−ＶＩＳ吸収検出器を設定して３３６ｎｍ波長でモニタした。蛍光検出器は３４８ｎｍおよび４５０ｎｍに設定して、各々、励起および放出波長をモニタした。
他の実施形態
発明をその詳細な記載と結合して記載したが、前記の記載は説明を目的としたものであって、添付する特許請求の範囲の範囲によって規定される発明の範囲を限定するものではない。他の態様、有利な効果および修飾は、添付する特許請求の範囲の範囲に入る。

Claims (7)

  1. トリプトファンをインドール−３−ピルベートにまたはインドール−３−ピルベートをトリプトファンに転換する方法であって、
    トリプトファンまたはインドール−３−ピルベートを、
    ａ）配列番号：219、891および893からなる群より選択される核酸配列によってコードされる１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはアミノトランスフェラーゼ（AT）またはオキシドレダクターゼ活性を有し；
    ｂ）配列番号：219、891および893からなる群より選択される核酸配列に少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有し；
    ｃ）配列番号：220、870 T242N, 892および894からなる群より選択される１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有し；または
    ｄ）ｃ）に引用したポリペプチドに少なくとも90％の配列同一性を有する１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有する；
    と合することを含む、該方法。
  2. ２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）をモナチンにまたはモナチンをＭＰに転換する方法であって、ＭＰまたはモナチンを、
    ａ）配列番号：219、891および893からなる群より選択される核酸配列によってコードされる１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはアミノトランスフェラーゼ（AT）またはオキシドレダクターゼ活性を有し；
    ｂ）配列番号：219、891および893からなる群より選択される核酸配列に少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有し；
    ｃ）配列番号：220、870 T242N, 892および894からなる群より選択される１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有し；または
    ｄ）ｃ）に引用したポリペプチドに少なくとも90％の配列同一性を有する１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＡＴまたはオキシドレダクターゼ活性を有する
    と合することを含む、該方法。
  3. モナチンを製造する方法であって、
    トリプトファンを、モナチンが産生される条件下で、Ｃ３炭素源および
    ａ）配列番号：219、891および893からなる群より選択される核酸配列によってコードされる１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＤＡＴ）活性を有し；
    ｂ）配列番号：219、891および893からなる群より選択される核酸配列に少なくとも90％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされる１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＤ−アミノトランスフェラーゼ（ＤＡＴ）活性を有し；
    ｃ）配列番号：220、870 T242N, 892および894からなる群より選択される１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＤＡＴ活性を有し；または
    ｄ）ｃ）に引用したポリペプチドに少なくとも90％の配列同一性を有する１つまたはそれを超えるポリペプチド、ここに該１つまたはそれを超えるポリペプチドはＤＡＴ活性を有する
    と接触させることを含む、該方法。
  4. Ｃ３炭素源が、ピルベート、オキサロアセテートおよびセリンからなる群より選択される、請求項３記載の方法。
  5. さらに、アルドラーゼを含む、請求項３記載の方法。
  6. アルドラーゼが、ＫＨＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）またはＨＭＧアルドラーゼ（ＥＣ４．１．３．１６）からなる群より選択される、請求項５記載の方法。
  7. 産生されるモナチンが、Ｒ，Ｒモナチンである、請求項３記載の方法。
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