JP5683811B2 - キメラインフルエンザウイルス様粒子 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
〔国庫補助〕
本発明は、助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ−０５−Ｃ−０１３５、および助成金番号Ｗ８１ＸＷＨ−０５−Ｃ−０１５０に基づく米国陸軍衛生研究資材司令部からの、米国国庫援助を用いてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
〔発明の分野〕
本発明は、インフルエンザウイルス様粒子の分野に関する。特に、キメラインフルエンザウイルス様粒子として本明細書において開示されている。
〔発明の背景〕
インフルエンザ ＡおよびＢは、流行性のヒト疾患を引き起こす２種類のインフルエンザウイルスである（１１１）。インフルエンザ Ａウイルスは、２つの表面抗原：ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）に基づいて、さらにサブタイプに分類される。インフルエンザ Ｂウイルスは、サブタイプには分類されないが、種が長い時間をかけて分かれる連続変異を受けていく。１９７７年以来、インフルエンザ Ａ（Ｈ１Ｎ１）ウイルス、インフルエンザ Ａ（Ｈ３Ｎ２）、およびインフルエンザ Ｂウイルスは、世界的規模に循環している。ヒト Ａ（Ｈ３Ｎ２）およびＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの間において遺伝的な再会合の後におそらく出現した、インフルエンザ Ａ（Ｈ１Ｎ２）ウイルスは、多くの国において最近、検出されている。インフルエンザ ＡおよびＢウイルスは、抗原特性に基づく群に、さらに分けられる。新たなインフルエンザウイルスのバリアントは、ウイルス複製の間に起こる点変異の結果として生じる頻繁な抗原変化（すなわち、抗原連続変異）の結果として、生じる。インフルエンザ Ｂウイルスは、インフルエンザ Ａウイルスよりも緩やかな速度において抗原連続変異を受ける。抗原連続変異を介した抗原バリアントの頻繁な発生は、季節的な流行に対するウイルス学的な原理であり、かつ毎年のインフルエンザワクチンに少なくとも１つの株が編入される理由である。
表面抗原、特にヘマグルチニンに対する人の免疫性は、感染の可能性、および感染が生じた場合における疾患の重篤性を低下させる（１１２）。１つの種類またはサブタイプのインフルエンザウイルスが、他のウイルスに対して制限された防御を与えるか、または防御を与えないと、一般的に考えられている。さらに、インフルエンザウイルスの１つの抗原バリアントに対する抗体が、同じ種類またはサブタイプの新たな抗原バリアントに対して防御し得ないことは、一般的に受け容れられている（１１３）。従って、交差防御の証明は、予期されていない。
ヒト−トリ再会合インフルエンザウイルスは、１９５７年および１９６８年における２回のインフルエンザの世界的な流行の原因であった。Ｈ２ウイルスが、１９６８年以降にヒトにおいて循環していないので、Ｈ２再会合ウイルスから発生する抗原不連続変異は、理論上、いつでも起こり得る。しかし、高い病原性のトリインフルエンザ（ＨＰＡＩ）ウイルス（Ｈ５およびＨ７）の最近における出現、および１９９７年以来、トリからヒトに対する直接的な、これらのウイルスの散発的な感染（１−５）は、ますます増加するＨ２ウイルスに対する人々の罹患率に加えて、新たなヒトの世界的流行病に対する恐れの潜在性をもたらす。ヒト ＨＰＡＩ Ｈ５Ｎ１の発生が、抗原的に別の型であるという事実は、世界的流行病の恐れに対して十分に答えられるワクチンの事前の備蓄を準備することを、ほとんど不可能にしている（５、６）。マウスのＨ５免疫化および攻撃のデータは、このモデルにおける種々のＨ５単離物の間において、良好な交差反応性が見られることを示している（７）一方において、同様の交差反応性が、存在するワクチン技術を用いてヒトにおいて見られるか否かは、知られていない。従って、新たなウイルスの発生から得られる抗原を含むために、素早く適合され得るインフルエンザワクチンプラットホーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）に対する必要性がある。
現在の卵から作られる不活化ワクチン技術は、卵においてＨＰＡＩウイルスが増殖不能であることに起因して新たに起こる世界的流行病の要求、および高まった生物学的封じ込めに対する必要性に応えるためには、不十分である（６、８）。逆遺伝学的手段は、卵において培養され得る、所望のＨＡおよびＮＡ構造を有する低病原性再会合体を製造する方法を提供するが（７、９−１１）；この手段によって製造されたワクチンは、以前の知的所有権および規制の問題に起因して、現在、診療所にのみ入っている（８）。付加的な懸念は、改善されたワクチン、送達系および免疫賦活剤の利用が、完全にＨ５ナイーブである集団に防御を効率的に誘導することを求められ得ることを明確にしている、ヒトの臨床治験において評価されたＨ５ヘマグルチニンと関連付けられた、明らかに低い免疫原性である。従って、免疫賦活剤との組み合わせにおいて、ＨＰＡＩ抗原の発現を可能にするインフルエンザワクチンプラットホームに対する必要性がある。
インフルエンザＶＬＰは、インフルエンザワクチン生成にとって代替的な技術を代表する。インフルエンザＶＬＰは、鼻腔内送達に続いて顕著に免疫原性を示す、昆虫細胞において発現されたインフルエンザのマトリック、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質を用いて製造されている（２６、２７）。実際に、ＶＬＰは、ロタウイルス、ノロウイルスおよびパピローマウイルスのＶＬＰに関して示されているように（２８−３１）、鼻腔内送達に続いて、粘膜および全身性の免疫の誘導に十分に適していると、一般的に思われる。インフルエンザＶＬＰは、インフルエンザのマトリックス、ＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の発現によって、真核細胞発現系において製造されている。インフルエンザマトリクスは、ウイルスの出芽後における推進力であり、かつ細胞表面におけるシアル酸とのＨＡの会合に起因してＨＡがまた発現されている場合に、ＮＡは、産生細胞からの出芽ＶＬＰの放出に必要である（５１）。また、マトリックスとＨＡとの間における相互作用が出芽過程の一部として、膜に対するマトリックスの対象化に関与することを示す、データがある（５１）。昆虫細胞バキュロウイルス発現系において産生されるインフルエンザＶＬＰは、動物試験において免疫原性であることを証明されており、かつ将来の世界的流行病の備えにとって重要な戦略を意味する（２６、２７、４７）。さらに、インフルエンザＶＬＰの鼻腔内送達は、腸管外投与に続く抗体価を越える、抗体価を生じることができる。しかし、予備的なデータは、インフルエンザＶＬＰ生成におけるマトリックスタンパク質の利用が、マトリックス由来インフルエンザＶＬＰを与えるＶＬＰの乏しい収量 インフルエンザワクチンの代替可能な形態に関する期間に対して乏しい選択を生じることを示した。これは、インフルエンザ粒子のアッセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）が複雑であり、かつマトリックスタンパク質が、実際に粒子のアッセンブリ後における推進力ではないことを示す最近のデータと一致する（Chen et al J Virol. 2007 Jul;81(13):7111-23）。従って、ワクチン製造用に、十分な量のＶＬＰを生成することができるインフルエンザワクチンプラットホームに対する必要性がある。さらに、より好適に適合するワクチンが開発され得、かつ製造され得る前に、新たに現れる株およびサブタイプに対する防御を素早く提供するために、インフルエンザに対する連続変異防御および異種亜型防御を提供可能な、インフルエンザワクチンプラットホームに対する必要性がある。
〔概要〕
本発明は、ワクチン製造にとって十分な量に生成され得、鼻腔内を含む種々の種々の手段によって送達され得、新たな株のウイルスに対してそれらが生じるときに素早く適合され得、かつ免疫原性の増強に必要とされるようなＶＬＰの一部として免疫賦活剤を含み得る、キメラインフルエンザＶＬＰの製造および利用に関して、本明細書に開示されているような種々の方法および組成物を提供することによって、これらの必要性を満たす。さらに、本明細書に開示されているインフルエンザＶＬＰは、インフルエンザに対する異種亜型防御を提供することができる。全体に渡って使用されるように、インフルエンザは、特に指定がない限り、一般的にインフルエンザ ＡおよびＢのいずれか、または両方を指す。
１つの局面において、キメラインフルエンザウイルス様粒子は、ｇａｇポリペプチド、およびノイラミニダーゼポリペプチドを有する。また好ましい実施形態において、キメラインフルエンザウイルス様粒子は、ヘマグルチニンポリペプチドを有する。ｇａｇポリペプチドは、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、デルタレトロウイルスおよびレンチウイルスを含み得る、レトロウイルスから好ましく得られる。ある特定の実施形態において、キメラインフルエンザウイルス様粒子は、異なるインフルエンザ株から得られる２つ以上のヘマグルチニンポリペプチド、好ましくはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７およびＨ９ヘマグルチニンを含み得る。ある特定の実施形態において、キメラインフルエンザウイルス様粒子は、異なるインフルエンザ株から得られる２つ以上のノイラミニダーゼポリペプチドを含み得る。
ある特定の実施形態において、キメラインフルエンザウイルス様粒子のヘマグルチニンポリペプチドは、付加的なインフルエンザ抗原または免疫賦活化ポリペプチドと共有結合的に連結される。共有結合の好ましい形態は、インフルエンザ抗原の遺伝子を、ヘマグルチニン遺伝子とインフレームにスプライシングすることによって、キメラポリペプチドを産生することであり、インフルエンザ抗原は、ヘマグルチニンポリペプチドのＮ末端に好ましく連結される。ある特定の実施形態において、キメラインフルエンザウイルス様粒子のｇａｇポリペプチドは、インフルエンザ抗原または免疫賦活剤と共有結合的に連結される。共有結合の好ましい形態は、インフルエンザ抗原の遺伝子を、ｇａｇポリペプチド遺伝子とインフレームにスプライシングすることによって、キメラポリペプチドを産生することであり、インフルエンザ抗原は、ｇａｇポリペプチドのＣ末端に好ましく連結される。ある特定の実施形態において、キメラインフルエンザウイルス様粒子のノイラミニダーゼポリペプチドは、インフルエンザ抗原または免疫賦活剤と共有結合的に連結される。共有結合の好ましい形態は、インフルエンザ抗原の遺伝子を、ノイラミニダーゼポリペプチド遺伝子と、インフレームにスプライシングすることによって、キメラポリペプチドを産生することであり、インフルエンザ抗原は、ノイラミニダーゼポリペプチドのＣ末端に好ましく連結される。
キメラインフルエンザウイルス様粒子に対して付着され得るか、または含まれ得るインフルエンザ抗原の例としては、特に限定はないが、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）、ＢＭ２、ＮＳ、ＮＳ１、およびＮＳ２か、またはタンパク質もしくはポリペプチド内の個々のエピトープ、そしてより好ましくはインフルエンザウイルスのＭ２が挙げられる。インフルエンザ Ａに関して、好ましい例としては、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２が挙げられる。インフルエンザ Ｂに関して、好ましい例としては、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳおよびＢＭ２が挙げられる。ある実施形態において、キメラインフルエンザウイルス様粒子は、多コピーの同じ抗原、好ましくは２コピー以上、３コピー以上、５コピー以上もしくは８コピー以上の同じ抗原、または多コピーの異なる抗原、好ましくは２つ以上、３つ以上または５つ以上の異なる抗原であり得る複数のインフルエンザ抗原を含み得る。ある特定の実施形態において、複数のインフルエンザ抗原は、同じ抗原であるが、インフルエンザの異なる株から得られる抗原であり得る。
キメラインフルエンザウイルス様粒子に付着され得るか、または含まれ得る免疫賦活剤の好ましい例は、本明細書の全体に渡って見出され得る。特に好ましい免疫賦活剤は、ｇａｇポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、もしくはヘマグルチニンポリペプチドと、共発現され得るか、またはインフレーム融合体として発現され得るポリペプチドである免疫賦活剤である。ポリペプチド免疫賦活剤の好ましい例としては、フラゲリンおよびこれらの免疫賦活断片、サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＣＳＦなど）；インターフェロン；腫瘍壊死因子；インターロイキン−２、−７−１２、ならびに類似の他の成長因子が挙げられる。
本明細書に開示されているキメラインフルエンザウイルス様粒子の他の局面は、発現ベクター系である。当該発現ベクター系は、ｇａｇポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、およびノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列を、典型的に含む。好ましい実施形態において、発現ベクター系は、ヘマグルチニンポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列を含み得る。宿主細胞における発現ベクター系の発現によって、ポリペプチドは、キメラインフルエンザウイルス様粒子を形成する。ある特定の実施形態において、発現ベクター系は、別個のベクターにおいてヌクレオチド配列のそれぞれを有するが、好ましくは、ヌクレオチド配列のいくつかは、同じベクターにあり、かつ最も好ましくは、ヌクレオチド配列のすべては、同じベクターにある（すなわち、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列が、単一の発現ベクターにある）。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列のそれぞれは、それら自身のプロモータに対して作動可能に連結されるが、ある実施形態において、２つまたは３つのヌクレオチド配列が、同じプロモータに対して動作可能に連結され、かつある実施形態において、ヌクレオチド配列のすべてが、同じプロモータに対して動作可能に連結されている（すなわち、第１、第２、および第３のヌクレオチド配列が、単一のプロモータと作動可能に連結される）。種々の実施形態において、発現ベクター系は、付加的なエレメント（例えば、ポリペプチド免疫賦活剤をコードするヌクレオチド配列、およびインフルエンザ抗原をコードするヌクレオチド配列（これらのそれぞれが、ｇａｇポリペプチドノイラミニダーゼポリペプチド、ヘマグルチニンポリペプチド、ポリペプチド免疫賦活剤またはインフルエンザ抗原をコードするヌクレオチド配列と、別個のポリヌクレオチドとして発現され得るか、またはインフレーム融合体として発現され得る））を包含して、全体を通して説明されているキメラインフルエンザウイルス様粒子を産生し得る。好ましい発現ベクター系は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、およびレトロウイルス、ならびに好ましくはバキュロウイルスを含むウイルスベクター系である。
本明細書に開示されているキメラインフルエンザウイルス様粒子の他の局面は、キメラインフルエンザウイルス様粒子を製造する方法である。好ましい方法は、本明細書に開示されている発現ベクター系の利用を含む。好ましくは、ｇａｇポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、およびある実施形態においてヘマグルチニンポリペプチドを一緒に発現する、１つ以上の発現ベクターを提供すること；細胞に１つ以上の発現ベクターを導入すること；ならびにｇａｇポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチド、およびある実施形態においてヘマグルチニンポリペプチドを発現することによって、そして上記キメラインフルエンザウイルス様粒子を製造することである。キメラインフルエンザウイルス様粒子が製造されるとすぐに、それは、上記細胞が培養されている培地から回収され得る。好ましい細胞としては、昆虫細胞および哺乳類細胞が挙げられる。
本明細書に開示されているキメラインフルエンザウイルス様粒子の他の局面は、本明細書に記載されているキメラインフルエンザウイルス様粒子のうちのあらゆるものの、免疫原性のある量を対象に投与することを包含する、インフルエンザを処置するかまたは予防する方法である。投与は、対象における感染防御免疫応答を好ましく誘導する。投与方法の例としては、皮下送達（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、皮内送達、皮下送達（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、経皮送達、筋肉内送達、経口送達（ｐｅｒｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、経口送達（ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、鼻腔内送達、口腔内送達、舌下送達、腹腔内送達、膣内送達、肛門送達および頭蓋内送達が挙げられる。
本明細書に開示されているキメラインフルエンザウイルス様粒子の他の局面は、本明細書に記載されているキメラインフルエンザウイルス様粒子の内のあらゆるものの、免疫原性のある量または治療的な量を含み得る薬学的組成物である。当該薬学的組成物は、好ましい送達方法に対して好ましく調合される薬学的に受容可能な担体を、好ましく含む。
ある特定の実施形態において、本明細書に開示されているキメラインフルエンザウイルス様粒子は、異なるサブタイプからの攻撃に対する防御（例えば、Ｈ１ヘマグルチニンポリペプチドを含む本発明のウイルス様粒子が、Ｈ３またはＨ５サブタイプを含有するインフルエンザウイルスによる感染から、防御することができる異種亜型防御）を誘導する。他のある特定の実施形態において、本明細書に開示されているキメラインフルエンザウイルス様粒子は、特定のインフルエンザウイルスの範囲内にある、ウイルスバリアントまたはウイルス変異体からの防御（例えば、Ｈ１ヘマグルチニンポリペプチドを含む本発明のキメラインフルエンザウイルス様粒子が、Ｈ１ヘマグルチニンポリペプチド、またはＨ１サブタイプの連続変異バリアントを含有するインフルエンザウイルスによる感染から防御することができる同型防御）を誘導する。従って、本発明のワクチンは、世界的に流行するインフルエンザの発生という事態において特に重要であり得る、非常に多岐なウイルスに対する強い防御を提供することができる。
従って、開示されているキメラウイルス様粒子の他の局面は、本明細書に開示されているようなキメラインフルエンザウイルス様粒子の免疫原性のある量を、対象に対して投与することによって、インフルエンザに対する連続変異バリアントの防御、同型防御および／または異種亜型防御を提供するために、本明細書に開示されているウイルス様粒子のうちのあらゆるものを利用する方法を含む。
ある特定の実施形態において、キメラインフルエンザウイルス様粒子ワクチンは、現在において循環しているインフルエンザウイルス株と適合し、かつこれらの株および連続変異バリアントに対する同型防御を提供する、ヘマグルチニンポリペプチドおよびノイラミニダーゼポリペプチドを包含する。ある実施形態において、同型防御は、ヘマグルチニンポリペプチドの連続変異バリアント（例えば、Ｈ１ポリペプチドのバリアント）からの防御を包含する。他の実施形態において、同型防御は、ノイラミニダーゼポリペプチド連続変異バリアント（例えば、Ｎ１ポリペプチドのバリアント）からの防御を包含する。
他の実施形態において、キメラインフルエンザウイルス様粒子ワクチンは、キメラＶＬＰに存在しないヘマグルチニン株およびノイラミニダーゼ株に対する異種亜型防御を提供する。例えば、Ｈ１Ｎ１ ＶＬＰは、Ｈ３Ｎ２からの防御を提供し、かつＨ５Ｎ１ ＶＬＰは、Ｈ１Ｎ１からの防御を提供する。さらなる例として、ＶＬＰは、以下の種類の異種亜型防御：投与されたヘマグルチニンポリペプチドがＨ１である場合に、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９ インフルエンザウイルスからの防御；投与されたヘマグルチニンポリペプチドがＨ３である場合に、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９ インフルエンザウイルスからの防御；投与されたヘマグルチニンポリペプチドがＨ５である場合に、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ７またはＨ９ インフルエンザウイルスからの防御；投与されたヘマグルチニンポリペプチドがＨ５である場合に、Ｈ１ インフルエンザウイルスからの防御；投与されたヘマグルチニンポリペプチドがＨ１である場合に、Ｈ３ インフルエンザウイルスからの防御；ならびに投与されたノイラミニダーゼがＮ１である場合に、Ｎ２ インフルエンザウイルスからの防御を提供し得る。
好ましい実施形態において、ヘマグルチニン（例えば、Ｈ１）を含むキメラインフルエンザウイルス様粒子ワクチンは、異なるヘマグルチニンインフルエンザウイルスのサブタイプ（例えば、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９）からの異種亜型防御、ならびにＨ１およびＨ１ヘマグルチニンの連続変異バリアントからの同型防御の両方を提供する。他の好ましい実施形態において、ノイラミニダーゼポリペプチド（例えば、Ｎ１）を含むウイルス様粒子は、異なるノイラミニダーゼインフルエンザウイルスのサブタイプ（例えば、Ｎ２）からの異種亜型防御、ならびにＮ１およびＮ１ノイラミニダーゼの連続変異バリアントからの同型防御の両方を提供する。キメラウイルス様粒子は、本明細書に開示されている方法を含めて、当該技術において利用可能なあらゆる方法によって投与され得る。
〔図面の概要〕
図１は、別個のＧａｇ、ＨＡまたは対照ベクター、およびＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ三重ベクターを用いて感染させたＳｆ９細胞からの培地の、ウエスタンブロッティングを示す。（Ａ）は、抗Ｇａｇ抗体を用いて調べられ、かつ（Ｂ）は、抗ＨＡ抗体を用いて調べられた。
図２は、ペレット化されたＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ ＶＬＰのスクロース段階勾配遠心分離から得られる画分の、ウエスタンブロッティングを示す。（Ａ）は、抗Ｇａｇ抗体ウィお用いて調べられ、かつ（Ｂ）は、抗ＨＡ抗体を用いて調べられた。
図３は、ｉ．ｎ．およびｉ．ｐ．免疫群における動物の１００％が、防御レベルのＨＡＩ力価（１：４０、グラフにおいて破線によって示される）、または初回免疫に続いてより高い力価を伴って応答した、ＨＡＩアッセイの結果を示す。
図４は、後述の実施例１に関する３重発現ベクターにおけるコーディング配列の配置を示す。
図５は、ｉ．ｐ．接種を介した初回免疫および追加免疫に続く、ｇａｇ−ＨＡ−ＮＡ ＶＬＰ（Ｈ１Ｎ１）の免疫原性を示す。
図６は、Ｈ１Ｎ１攻撃およびＨ３Ｎ２スワーム攻撃に続く、ＶＬＰワクチン接種マウスおよび未処置マウスから得られる生存データを示す。
図７は、Ｈ１Ｎ１攻撃およびＨ３Ｎ２スワーム攻撃に続く、ＶＬＰワクチン接種マウスおよび未処置マウスから得られる体重低下データを示す。
図８は、ＥＬＩＳＡアッセイに使用される、市販の組み換えＨ５ベトナムＨＡ分子に対して免疫化されたマウスから得られる血清の特異性を示す。
図９は、Ｈ１Ｎ１攻撃に続いて、インドネシアＨ５Ｎ１ ＶＬＰをワクチン接種したマウス、ベトナムＨ５Ｎ１ ＶＬＰをワクチン接種したマウス、および未処置マウスから得られる体重低下データおよび生存データを示す。
〔好ましい実施形態の詳細な説明〕
本発明は、キメラインフルエンザＶＬＰの形成を基準にして、好ましくはマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）から得られるｇａｇポリペプチドを包含する。ＶＬＰを生成する好ましい方法は、バキュロウイルス発現系において種々のレトロウイルスから取得され得るｇａｇ ＶＬＰの顕著な収量（２３、２４、４６、４９、５２−５８）といった理由から、好ましくはインフルエンザＨＡポリペプチド抗原、およびインフルエンザＮＡポリペプチド抗原の共発現を含めた、昆虫細胞における発現によるものである。Ｇａｇポリペプチドは、機能的なｇａｇタンパク質が、リボソームフレームシフトに起因する、レトロウイルスプロテアーゼ活性、逆転写酵素活性、およびインテグラーゼ活性を含む巨大なＣ末端伸張を天然に有する、天然のレトロウイルスアッセンブリ過程において、固有にＣ末端伸張を含む。人工的な伸張を用いた機能的なｇａｇタンパク質の産生は、ＲＳＶ ｇａｇ（５９）およびＭＬＶ ｇａｇ（６０）の両方に関して達成されている。ｇａｇＣ末端の操作におけるこの自由度は、本明細書に開示されている、インフルエンザキメラＶＬＰにおける他のポリペプチド（例えば、他の抗原および免疫刺激性タンパク質の配列（例えば、ＴＬＲアゴニストであるフラゲリン））の包含にとって重要な部位を提供する。
１つのウイルスから得られるコア粒子、および他のウイルスから得られる表面抗原を含有するキメラＶＬＰの産生は、偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｉｎｇ）と呼ばれる。ＭＬＶ ｇａｇ ＶＬＰは、インフルエンザＨＡおよびＮＡを用いて効率的に偽型化される、というのもこれらのタンパク質は、脂質ラフトドメイン内に濃縮される（６１、６２）一方において、また、ミリストイル化ｇａｇタンパク質は、出芽過程の間に脂質ラフトドメインの内表面に濃縮される（６３）からである。最近のデータは、哺乳類細胞におけるＭＬＶｇａｇ粒子上に対するインフルエンザＨＡの組み込みが、同時発生的な場所において両方の構成要素の濃縮を介して、細胞膜において受動的に生じることを示している。さらに、インフルエンザＨＡｐ分子は、ＳＩＶ ＶＬＰの免疫原性を顕著に向上させる手段として、ＳＩＶ ＶＬＰ上に対して効率的に偽型化されている（２４、２５）。
さらに、バキュロウイルス昆虫細胞系におけるインフルエンザＶＬＰ産生に関して、スポドプテラ フルギペルダ Ｓｆ９細胞において、末端シアル酸残基が糖化物に見られないので、ＮＡがＶＬＰ放出に必要ではないことについて論じられている。これは、上述されているように、インフルエンザＨＡが、ＮＡの非存在下においてＳＩＶ ＶＬＰ上に対して偽型化され得る（２４、２５）こと示すデータと一致する。しかし、驚くべきことに、後述の実施例に記載されているように、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるｇａｇ−ＨＡ ＶＬＰの産生および放出は、ＮＡの発現を必要とする。本発現系において、ＮＡ非存在下におけるｇａｇ−ＨＡ共発現は、有意な数において発生する融合現象を伴って、相当な細胞の凝集を生じた。予想外にも、発現ベクターにおけるＮＡの追加は、培地におけるＶＬＰ放出、およびＶＬＰワクチンにおける追加の重要な抗原の組み込みを結果として生じた。
最後に、本明細書に開示されているキメラウイルス様粒子は、実施例に記載されているように、それらがインフルエンザに対する異種亜型防御を提供する点において、予想外の性質を示す。当該異種亜型防御は、実際の感染または生ワクチンを伴って観察されているのみである。従って、開示されているキメラウイルス様粒子は、異種亜型防御およびウイルスのサブタイプの範囲内である連続変異バリアントからの防御を、提供するために使用され得る。この能力は、インフルエンザの流行病に導き得るインフルエンザの新しいバリアントからの防御において、開示されているウイルス様粒子の有用性を大きく伸ばす。
開示されている方法および手順の実践は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内にある化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来技術を利用する。当該技術は、論文に説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989、分子クローニング：A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)；B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996、ＤＮＡ単離および配列決定：Essential Techniques, John Wiley & Sons：J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990、インシチュ ハイブリダイゼーション：Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984、オリゴヌクレオチド合成：A Practical Approach, Irl Press；and, D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992、酵素学的方法：DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Pressを参照すればよい。これらの一般的な文書のそれぞれは、言及によって本明細書に組み込まれる。
（定義）
本明細書において使用されるときに、“Ｇａｇポリペプチド”は、本明細書に記載されているウイルス様粒子の形成を担う、レトロウイルス由来の構造ポリペプチドである。ある実施形態において、ｇａｇポリペプチドは、ある特定の性質（例えば、ＲＮＡをパッケージする性質、または粒子形成および出芽の効率）に影響を与えるために、わざと変異され得る。当該変異の一例は、ＲＮＡを組み込むｇａｇ由来ＶＬＰの能力に影響を与える、アミノ酸変更である。ＶＬＰの出芽効率を向上または修飾する他のアミノ酸変更が、なされ得る。レトロウイルスのゲノムは、３つの主要な遺伝子産物をコードする：構造タンパク質をコードするｇａｇ遺伝子、核酸分解酵素およびインテグラーゼ関連機能である逆転写酵素、および関連タンパク質分解性ポリペプチドをコードするｐｏｌ遺伝子、感染細胞の表面上、および成熟した放出ウイルス粒子の表面上にもまた検出される糖タンパク質膜タンパク質をコードするｅｎｖ。すべてのレトロウイルスのｇａｇ遺伝子は、全体として構造的な類似性を有し、レトロウイルスの各群の内部において、アミノ酸レベルにおいて保存されている。ｇａｇ遺伝子は、逆転写酵素を除いて、コアタンパク質を生じる。ＭＬＶに関して、Ｇａｇ前駆体タンパク質は、Ｐｒ６５Ｇａｇであり、かつ前駆体における順番が、ＮＨ２−ｐ１５−ｐｐ１２−ｐ３０−ＣＯＯＨである４つのタンパク質に切断される。これらの切断は、ウイルスプロテアーゼによって媒介され、かつウイルスに依存してウイルス放出の前または後に生じ得る。ＭＬＶ Ｇａｇタンパク質は、糖鎖付加形態および非糖鎖付加形態において存在する。糖鎖付加形態は、非糖鎖付加Ｐｒ６５ＧａｇにとってのＡＵＧコドンから上流に位置する別のインフレーム開始コドンから合成される、ｇＰｒ８０Ｇａｇから切断される。糖鎖付加Ｐｒ６５Ｇａｇを合成しないＭＬＶの欠失変異体は、依然として感染性であり、かつ非糖鎖付加Ｇａｇは、依然としてウイルス様粒子を形成でき、従って糖鎖付加現象の重要性に関して疑問を生じる。ウイルスにコードされるプロテアーゼによる、ＨＩＶ−１ Ｇａｇ前駆体 ｐｒ５５Ｇａｇの転写後切断は、Ｎ−ミリストイル化および内的なリン酸化ｐ１７ マトリックスタンパク質（ｐ１７ＭＡ）、リン酸化ｐ２４ カプシドタンパク質（ｐ２４ＣＡ）、ならびにｐ９およびｐ６にさらに切断されるヌクレオカプシドタンパク質 ｐ１５（ｐ１５ＮＣ）を生じる。
構造的に原型のＧａｇポリタンパク質は、レトロウイルスｇａｇ遺伝子においていつも同じ順番（マトリックスタンパク質（ＭＡ）（同じマトリックスという名前を共有するが、ＭＡとは異なるタンパク質であるインフルエンザマトリックスタンパク質 Ｍ１と混同されるべきではない）、カプシドタンパク質（ＣＡ）、およびヌクレオカプシドタンパク質（ＮＣ））に生じる３つの主要なタンパク質に分割される。成熟タンパク質へのＧａｇポリタンパク質のプロセシングは、レトロウイルスにコードされるプロテアーゼに触媒され、かつ新たに出芽したウイルス粒子の成熟につれて生じる。機能的に、Ｇａｇポリタンパク質は、３つのドメイン：細胞膜に対してＧａｇタンパク質を標的化する膜結合ドメイン；Ｇａｇ重合を促進する相互作用ドメイン；および宿主細胞から発生しかけているビリオンの放出を容易にする後期ドメインに、分割される。アッセンブリを媒介するＧａｇタンパク質の形態は、ポリタンパク質である。従って、アッセンブリドメインは、後に形成される切断産物のあらゆるものの内部にきちんと位置する必要はない。従って、本明細書に包含されるようなＧａｇポリペプチドは、ＶＬＰの形成および放出にとって重要な機能を含む。当該技術の状態は、これらの重要な機能的エレメントに関して非常に進められている。例えば、Hansen et al. J. Virol 64, 5306-5316, 1990：Will et al., AIDS 5, 639-654, 1991：Wang et al. J. Virol. 72, 7950-7959, 1998：McDonnell et al., J. Mol. Biol. 279, 921-928, 1998：Schultz and Rein, J. Virol. 63, 2370-2372, 1989：Accola et al., J. Virol. 72, 2072-2078, 1998：Borsetti et al., J. Virol., 72, 9313-9317, 1998：Bowzard et al., J. Virol. 72, 9034-9044, 1998：Krishna et al., J. Virol. 72, 564-577, 1998：Wills et al., J. Virol. 68, 6605-6618, 1994：Xiang et al., J. Virol. 70, 5695-5700, 1996：Garnier et al., J. Virol. 73, 2309-2320, 1999を参照すればよい。
本発明のＶＬＰにおいて使用されるときに、ｇａｇポリペプチドは、最低でもＶＬＰの形成にとっての機能的なエレメントを含む。ｇａｇポリペプチドは、１つ以上の付加的なポリペプチドに関するコーディング配列をｇａｇポリペプチドコーディング配列内にスプライシングすることによって生成され得る、１つ以上の付加的なポリペプチドを任意に含み得る。付加的なポリペプチドのｇａｇポリペプチドへの挿入に好ましい部位は、Ｃ末端である。
Ｇａｇポリペプチドにとって好ましいレトロウイルス供給源としては、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス（例えば、トリ白血病ウイルスまたはラウス肉腫ウイルス）、ベータレトロウイルス（例えば、マウス乳がんウイルス、ヤーグジークテヒツジレトロウイルスおよびメイソン−ファイザーサルウイルス）、ガンマレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびテナガザル白血病ウイルス）、デルタレトロウイルス（例えば、ヒトＴリンパ球増殖性ウイルスおよびウシ白血病ウイルス）、イプシロンレトロウイルス（例えば、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス）、またはレンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型、ＨＩＶ−２、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびヤギ関節炎脳炎ウイルス）が挙げられる。
本明細書において使用されるときに、“ヘマグルチニンポリペプチド”は、感染させられる細胞に対するウイルスの結合を媒介するインフルエンザウイルスタンパク質から得られる。タンパク質は、単一の膜架橋（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインによってインフルエンザウイルスの表面に対して固着され（ａｎｃｈｏｒｅｄ）て、見られる抗原性糖タンパク質である。インフルエンザヘマグルチニンの少なくとも１６のサブタイプが、Ｈ１からＨ１６まで分類されて、同定されている。Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３は、ヒトインフルエンザウイルスに見られる。Ｈ５、Ｈ７またはＨ９ヘマグルチニンを伴う高い病原性のトリインフルエンザウイルスは、低い確率においてヒトに感染することを見出されている。トリウイルス株のタイプＨ５ヘマグルチニンにおける単一のアミノ酸変化が、Ｈ５ヘマグルチニンがトリＨ５Ｎ１ウイルスの受容体特異性を変えることを可能にする（ヒト受容体に対する結合能を与える）までに受容体特異性を変えることを、ヒト患者において見出されていることは、報告されている（１０９および１１０）。この知見は、いかにして通常にはヒトに感染しないＨ５Ｎ１ウイルスが変異することができ、かつヒト細胞に対して効率的に感染できるようになるかについて説明している。
ヘマグルチニンは、ホモ３量体の必須の膜ポリペプチドである。膜架橋ドメインは、ラフト−脂質ドメインと天然に会合し、ＶＬＰへの取り込みに関してｇａｇポリペプチドとの会合を可能にする。それは円柱状の形状を有し、かつ約１３５オングストロームの長さである。ＨＡを構成する３つの等しい単量体が、ＶＬＰの表面上に露出される、中央のコイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）、およびシアル酸結合部位を含む球状の頭部を形成している。ＨＡ単量体は、糖鎖付加され、かつ２つのより小さいポリペプチド：ＨＡ１およびＨＡ２サブユニットに切断される、単一のポリペプチド前駆体として合成される。ＨＡ２サブユニットは、膜に対して固着される３量体のコイルドコイルを形成し、かつＨＡ１サブユニットは、球状の頭部を形成する。
本発明のＶＬＰに使用されるときに、ヘマグルチニンポリペプチドは、最低でもヘマグルチニンから得られる膜固着領域および少なくとも１つのエピトープを含む。ヘマグルチニンポリペプチドは、あらゆるインフルエンザウイルスのタイプ、サブタイプ、株または亜種から、好ましくはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９ヘマグルチニンから得られ得る。さらに、ヘマグルチニンポリペプチドは、異なるインフルエンザヘマグルチニンのキメラ体であり得る。ヘマグルチニンポリペプチドは、１つ以上の付加的なポリペプチドにとってのコーディング配列をヘマグルチニンポリペプチドコーディング配列にスプライシングすることによって生成され得る、１つ以上の付加的なポリペプチドを含み得る。ヘマグルチニンポリペプチドに対する付加的なポリペプチドの挿入にとって好ましい部位は、Ｎ末端である。
本明細書において使用されるときに、“ノイラミニダーゼポリペプチド”は、糖タンパク質からの末端のシアル酸残基の切断によって、細胞からのインフルエンザウイルスの放出を媒介する、インフルエンザウイルスから得られる。ノイラミニダーゼ糖タンパク質は、ウイルス表面上において発現される。ノイラミニダーゼタンパク質は、４量体であり、かつベータ−ピン歯車（ｂｅｔａ−ｐｉｎｗｈｅｅｌ）構造を有する頭部、細長い軸領域、および単一の膜架橋ドメインによってウイルス膜にタンパク質を固着する小さな疎水性領域、からなる通常の構造を共有する。シアル酸残基切断にとっての活性部位は、インフルエンザ Ａウイルスのすべてに保存される電荷を帯びた１５のアミノ酸によって形成されるサブユニットのそれぞれの表面上におけるくぼみを含む。少なくとも９つのインフルエンザノイラミニダーゼのサブタイプが、Ｎ１からＮ９までに分類されて、同定されている。
本発明のＶＬＰに使用されるときに、ノイラミニダーゼポリペプチドは、膜固着ドメイン、および少なくともシアル酸残基切断活性を最低でも含む。機能的な領域に関する当該技術の状態は、非常に高い。例えば、Varghese et al., Nature 303, 35-40, 1983；Colman et al., Nature 303, 41-44, 1983；Lentz et al., Biochem, 26, 5321-5385, 1987；Webster et al., Virol. 135, 30-42, 1984を参照すればよい。ノイラミニダーゼポリペプチドは、あらゆるインフルエンザウイルスのタイプ、サブタイプ 株または亜種から、好ましくはＮ１およびＮ２ノイラミニダーゼから得られ得る。さらに、ノイラミニダーゼポリペプチドは、異なるインフルエンザノイラミニダーゼのキメラ体であり得る。ノイラミニダーゼポリペプチドは、１つ以上の付加的なポリペプチドに関するコーディング配列をノイラミニダーゼポリペプチドコーディング配列にスプライシングすることによって生成され得る、１つ以上の付加的なポリペプチドを任意に含み得る。付加的なポリペプチドのノイラミニダーゼポリペプチドへの挿入にとって好ましい部位は、Ｃ末端である。
“キメラウイルス様粒子”および“ＶＬＰ”という用語は、その前後関係によってＶＬＰが、本明細書に開示されているようなｇａｇポリペプチドを用いて形成されていない、ウイルス様粒子を指す場合を除いて、交換可能に使用される。
（ＶＬＰを作製する好ましい方法）
ＶＬＰは、ｇａｇポリペプチドおよびノイラミニダーゼポリペプチドを含み、かつヘマグルチニンポリペプチドをさらに含み得るアセンブリしたＶＬＰを好ましく生じる、当業者に利用可能なあらゆる方法によって容易にアッセンブリされ得る。好ましい実施形態において、ポリペプチドは、利用可能なあらゆるタンパク質発現系、好ましくは脂質におけるラフト−脂質ドメインを含む細胞から作られる系（例えば、哺乳類細胞発現系および昆虫細胞発現系）において共発現され得る。
ｇａｇポリペプチドを用いて形成されるＶＬＰの発現の多くの例が、ＶＬＰの生成に利用可能な発現系の範囲を明らかにして、公開されている。種々のレトロウイルスを用いた研究は、他のウイルス構成要素の非存在下において発現されるＧａｇポリペプチドが、細胞表面におけるＶＬＰ形成および出芽にとって十分であることを、証明している（Wills and Craven AIDS 5, 639-654, 1991；Zhou et al., 3. Virol. 68, 2556-2569, 1994；Morikawa et al., Virology 183, 288-297, 1991; Royer et al., Virology 184, 417-422, 1991；Gheysen et al., Cell 59, 103-112, 1989; Hughes et al., Virology 193, 242-255, 1993；Yamshchikov et al., Virology 214, 50-58, 1995）。バキュロウイルスベクターを用いた昆虫細胞におけるＧａｇ前駆体の発現によるＶＬＰの形成は、様々なグループによって証明されている（Delchambre et al., EMBO J. 8, 2653-2660, 1989; Luo et al., Virology 179, 874-880, 1990; Royer et al., Virology 184, 417-422, 1991; Morikawa et al., Virology 183, 288-297, 1991; Zhou et al., J. Virol. 68, 2556-2569, 1994; Gheysen et al., Cell 59, 103-112, 1989; Hughes et al., Virology 193, 242-255, 1993; Yamshchikov et al., Virology 214, 50-58, 1995）。これらのＶＬＰは、未成熟なレンチウイルス粒子をアセンブリし、かつ昆虫細胞の原形質膜からの出芽によって、効率的にアセンブリされかつ放出される。
Ｇａｇ前駆体のアミノ末端領域は、ウイルスアッセンブリに要求される、細胞表面に対する輸送および膜結合にとっての標的化シグナルである（Yu et al., J. Virol. 66, 4966-4971, 1992；an, X et al., J. Virol. 67, 6387-6394, 1993；Zhou et al., J. Virol. 68, 2556-2569, 1994；Lee and Linial J. Virol. 68, 6644-6654, 1994；Dorfman et al., J. Virol. 68, 1689-1696, 1994；Facke et al., J. Virol. 67, 4972-4980, 1993）。Ｇａｇ構造タンパク質ならびにＥｎｖ糖タンパク質 ｇｐ１２０およびｇｐ４１を含む、組み換えＨＩＶに基づくＶＬＰのアセンブリは、ワクシニアウイルス発現系を用いて報告されている（Haffar et al., J. Virol. 66, 4279-4287, 1992）。
ＶＬＰに関するポリペプチドの組み換え発現は、１つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクターの構築を必要とする。１つ以上のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが得られると、ポリペプチド産生用のベクターは、当該技術において公知の技術を用いた組み換えＤＮＡ技術によって産生され得る。従って、ＶＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のあらゆるものを含有するポリヌクレオチドを発現させることによって、タンパク質を調製する方法は、本明細書に記載されている。当業者にとって公知の方法は、ＶＬＰポリペプチドコーディング配列ならびに適切な転写制御シグナルおよび翻訳制御シグナルを含む、発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法としては、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組み換えが挙げられる。従って、本発明は、１つ以上のプロモータに作動可能に連結されたｇａｇポリペプチド、ノイラミニダーゼポリペプチドおよび／またはヘマグルチニンポリペプチドをコードする、複製可能なベクターを提供する。
発現ベクターは、従来の技術を用いて宿主細胞に転移され、かつそれからトランスフェクトされた細胞は、従来の技術によって培養されて、ＶＬＰを産生する。従って、本発明は、１つ以上のＶＬＰポリペプチドをコードし、異種プロモータと作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、包含する。ＶＬＰの産生に関して好ましい実施形態において、ｇａｇポリペプチドおよびノイラミニダーゼポリペプチドの両方、ならびに任意にヘマグルチニンポリペプチドをコードするベクターは、後に詳述されるように、ＶＬＰの産生用の宿主細胞において共発現され得る。
種々の宿主発現ベクター系が利用されて、ＶＬＰポリペプチドを発現し得る。当該宿主発現系は、ＶＬＰポリペプチドが、好ましくは共発現によってＶＬＰを生成するために産生され得る媒介物に代表される。広範な宿主は、適切な発現ベクターの構築に使用され得、かつ好ましい宿主発現系は、ＶＬＰのアッセンブリにとって好適な脂質ラフトを有するそれらの宿主である。これらとしては、ＶＬＰポリペプチドコーディング配列を含有する、組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換された細菌（例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）といった微生物；ＶＬＰポリペプチドコーディング配列を含有する組み換え酵母発現ベクターを用いて形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；ＶＬＰポリペプチドコーディング配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて感染させられた昆虫細胞系；ＶＬＰポリペプチドコーディング配列を含有する組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を用いて感染させられたか、もしくはＶＬＰポリペプチドコーディング配列を含有する組み替えプラスミドベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換された、植物細胞系；または哺乳類細胞のゲノムから得られるプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）、もしくは哺乳類ウイルスから得られるプロモータ（例えば、アデノウイルスの後期プロモータ；ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモータ）を含む組み換え構築物を内部に含む、哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が挙げられるが、これらに限定されない。哺乳類細胞およびより好ましくは昆虫細胞が、ＶＬＰのアッセンブリに好適な脂質ラフトを含む膜を有する両方の細胞として、ＶＬＰポリペプチドの発現に好ましく使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）といった哺乳類細胞は、ヒトサイトメガロウイルスから得られる主要な前初期遺伝子プロモータといったベクターとの接合において、ＶＬＰポリペプチドにとって効率的な発現系である（Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)）。
昆虫系において、アウトグラファ カリフォルニカ 核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用され得る。ウイルスは、スポドプテラ フルギペルダ細胞において増殖する。（複数の）ＶＬＰポリペプチドコーディング配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヒドリン遺伝子）の中に個々にクローン化され得、かつＡｃＮＰＶプロモータ（例えば、ポリヒドリンプロモータ）の制御下に配置され得る。
哺乳類宿主細胞において、ウイルスから作られた多くの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、関心のある（複数の）ＶＬＰポリペプチド配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモータおよび３部（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列）に対して連結される。それから、このキメラ遺伝子は、インビボまたはインビトロ組み換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、感染宿主細胞において生存可能であり、かつ（複数の）ＶＬＰポリペプチドを発現可能である組み換えウイルスを、結果として生じ得る（例えば、Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355-359 (1984) を参照すればよい）。また、特異的な開始シグナルは、挿入された（複数の）ＶＬＰポリペプチドコーディング配列の効率的な翻訳に要求され得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、挿入全部の翻訳を保証するために、所望のコーディング配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外来性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源に属し得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどによって増強され得る（例えば、Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)）。
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特異的な様式において遺伝子産物を修飾し、かつプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物の当該修飾（例えば、糖鎖付加）およびプロセシング（例えば、切断または膜への輸送）は、ＶＬＰの生成、またはＶＬＰポリペプチドもしくは付加的なポリペプチド（例えば、免疫賦活剤または付加的な抗原）の機能にとって、重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の転写後プロセシングおよび修飾に関する、特性ならびに特定の機序を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを保証するために選択され得る。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物の糖鎖付加およびリン酸化に関する細胞機序を保有する、真核宿主細胞が使用され得る。
宿主細胞は、本明細書に記載されている２つの発現ベクター、ｇａｇポリペプチドをコードする第１のベクター、およびノイラミニダーゼポリペプチドをコードするベクターを用いて、共トランスフェクトされ得る。また、ある特定の実施形態において、ヘマグルチニンポリペプチドをコードするベクターが、共トランスフェクトされ得るか、または第１もしくは第２のベクターが、ヘマグルチニンポリペプチドを付加的に発現し得る。２つのベクターは、ＶＬＰポリペプチドのそれぞれの等しい発現を可能にする、同一の選択マーカーを含有し得る。代替可能に、ｇａｇポリペプチドおよびノイラミニダーゼポリペプチドの両方、および任意にヘマグルチニンポリペプチドをコードし、かつ発現できる単一のベクターが、使用され得る。
ＶＬＰが宿主細胞によって発現されると、それは、ポリペプチドの精製に関する当該技術における公知のあらゆる方法によって（例えば、クロマトグラフィーに（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特にポリペプチドに対して付加されたあらゆるアフィニティー精製タグに関するアフィニティー、およびサイジングクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質もしくは他の巨大分子の精製に関する他の標準的なあらゆる技術によって）、精製され得る。さらに、ＶＬＰポリペプチドは、ＶＬＰの精製を容易にするために、本明細書に記載されているか、またはそうでなければ当該技術において公知の異種ポリペプチド配列に対して融合され得る。精製の後に、付加的なエレメント（例えば、付加的な抗原または免疫賦活剤）は、ＶＬＰポリペプチドに対する共有結合を介してか、または他の非共有結合的な結合機序によって、ＶＬＰに対して物理的に連結され得る。ラフト−脂質ドメインを有する宿主細胞（例えば、哺乳類細胞および昆虫細胞）において共発現される場合の好ましい実施形態において、ＶＬＰは、上述の方法のあらゆるものによってＶＬＰの精製を可能にする、自己アッセンブリし、かつ放出する。
（ＶＬＰを使用する好ましい方法）
調合物
本明細書に記載されているＶＬＰの好ましい利用は、ワクチン調製物としてである。典型的に、当該ワクチンは、液体溶液または懸濁液；また注射の前に液体が調製され得る溶液にいれるか、または懸濁液にいれるために好適な固体の形態のいずれかとしての注射可能物質として調製される。また、当該調製物は、乳化され得るか、または乾燥粉末として製造される。活性な免疫原性成分は、当該活性成分と薬学的に受容可能であり、かつ適合性である賦形剤としばしば混合される。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、スクロース、グリセロール、もしくはエタノールなど、およびこれらの組み合わせである。さらに必要に応じて、ワクチンは、補助剤（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンの有効性を増強する免疫賦活剤）を含有し得る。
ワクチンは、注射によって非経口的に（例えば、皮下的、皮内的、皮下的または筋肉内のいずれかに）、慣習的に投与される。投与の他の態様に好適である付加的な調合物としては、座剤ならびにある場合において、経口、鼻腔内、口腔、舌下、腹腔内、膣内、および頭蓋内の調合物が挙げられる。座剤に関して、従来の結合剤および担体としては、例えば、ポリアルカレン（ｐｏｌｙａｌｋａｌｅｎｅ）グリコールまたはトリグリセリドが挙げられ得；当該座剤は、０．５％から１０％、好ましくは１−２％の範囲において活性成分を含有する混合物から形成され得る。ある特定の実施形態において、低融点ワックス（例えば、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物）が、まず融解され、かつ本明細書に記載されているＶＬＰが、例えば攪拌によって、均質に分散される。それから溶解した均質な混合物は、冷やすこと、および凝固させることが可能な従来の大きさの鋳型に注がれる。
鼻腔内送達に好適な調合物としては、液体または乾燥粉末が挙げられる。調合物としては、例えば、マンニトール、ラクトース、スクロース、トレハロースおよびキトサンの製薬的等級品として、そのまま通常に採用される賦形剤が挙げられる。キトサンといった粘膜付着剤は、鼻腔内的投与調合物の粘膜毛様体クリアランスを遅らせるために、液体調合物または粉末調合物のいずれかにおいて使用され得る。マンニトールおよびスクロースといった糖は、液体調合物における安定剤、ならびに乾燥粉末調合物における安定剤および崩壊剤として使用され得る。さらに、賦形剤（例えば、モノホスホリル脂質 Ａ（ＭＰＬ）ならびに、一例としてであってこれらに限定されないが、２重鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリイノシン酸、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）、コレラトキシンおよびその誘導体、熱不安定性エンテロトキシンおよびその誘導体、ならびに明細書全体に渡って挙げられている多くの免疫賦活剤）は、免疫刺激性の免疫賦活剤として液体調合物および乾燥粉末調合物の両方に使用され得る。
経口送達に好適な調合物としては、液体、固体、半固体、ゲル、錠剤、カプセル剤、およびトローチ剤などが挙げられる。経口送達に好適な調合物としては、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、ゲル、液体、食品、飲料、および栄養補助食品などが挙げられる。調合物としては、例えば、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムなどの薬学的等級物として、そのまま通常に採用される賦形剤が挙げられる。他のＶＬＰワクチン組成物は、溶液、懸濁液、丸薬、持続性徐放剤または粉末の形態を取り得、かつ１０−９５％、好ましくは２５−７０％の活性成分を含有し得る。経口調合物に関して、コレラトキシンは、興味深い調合物のパートナー（そしてまた、見込みのある接合パートナー）である。
膣投与様に調合される場合のＶＬＰワクチンは、膣座薬、止血栓、クリーム、ゲル、ペースト、発泡体またはスプレーの形態であり得る。上述の調合物のあらゆるものが、適切であることを当該分野に知られている、ＶＬＰに加える薬剤（例えば、担体）を含有し得る。
ある実施形態において、ＶＬＰワクチンは、全身送達または局所送達用に調合され得る。当該調合物は、当該技術において公知である。非経口的な輸送物としては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸塩リンガーオイルもしくは固定化オイルが挙げられる。血管内的な輸送物としては、水分補充液および栄養補充液、ならびに電解質補充液（例えば、リンガーデキストロースに基づくもの）などが挙げられる。投与の全身性経路および局所的経路としては、例えば、皮内、局所適用、血管内、筋肉内などが挙げられる。
ＶＬＰは、中性調合物または塩に基づく調合物を含むワクチンに調合され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基を用いて形成される）を含み、かつ例えば、塩酸もしくはリン酸といった無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、およびマンデル酸といった有機酸などを用いて形成される。また、遊離カルボキシル基を用いて形成された塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム、または水酸化第二鉄といった無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインなどといった有機塩基から得られる。
ワクチンは、投与調合物と適合する様式において、かつ治療有効量および免疫原性のある量において、投与され得る。投与されるべき量は、処置される対象（例えば、個体の免疫系の、免疫反応を起こす能力、および所望の防御の程度が挙げられる）に依存する。好適な用量の範囲は、ワクチン毎に数百マイクログラムの水準の活性成分であるとともに、０．１μｇから２０００μｇまでの範囲（例えば、０．５μｇから１０００μｇの範囲、好ましくは１μｇから１００μｇの範囲）が好ましい（とはいえ、１−１０ｍｇの範囲におけるより高い量も予想される）。また、初回投与および追加の試みに好適な投与計画は変えられるが、初回投与、続く後の接種または他の投与によって代表される。
適用の様式は、広く変更され得る。ワクチンの投与に関する従来の方法のあらゆるものが、適用可能である。これらとしては、固体の生理学的に受容可能な基材に関するか、もしくは生理学的に受容可能な分散剤における経口適用、注射などによる非経口が挙げられる。ワクチンの用量は、投与の経路に依存し、かつワクチン接種される個人の年齢および抗原の調合物に従って変わる。
ワクチン調合物のいくつかは、それ自身によって十分に免疫原性があるが、他のいくつかに関して、ワクチンが免疫賦活物質をさらに包含する場合に、免疫応答が増強される。
また、粘膜付着を向上させる送達薬剤が使用されて、特に鼻腔内、経口または肺を基本とする送達調合物に関して、送達および免疫原性を向上させ得る。キトサン、キチンのＮ−脱アセチル化形態である、当該化合物の１つが、多くの薬学的調合物に使用される（３２）。それは、粘膜毛様体クリアランスを遅らせること、ならびに粘膜による抗原取り込みの長時間化およびプロセシングを可能にすることに起因して、鼻腔内ワクチン送達にとって魅力的な粘膜付着剤である（３３、３４）。さらに、それは、ＮＡＬＴに対する抗原の経上皮輸送を増強し得る、密着結合を一次的に開くことができる。最近のヒトにおける試行において、キトサンを伴うが、付加的なあらゆる免疫賦活剤なしで、鼻腔内的に投与される３価の不活化インフルエンザワクチンが、筋肉内接種に続いて得られる血清変換およびＨＩ力価よりもほんの少しだけ低い、血清変換およびＨＩ力価を生じた（３）。
また、キトサンは、鼻腔内的に十分に機能する免疫賦活剤（例えば、遺伝的に解毒されたＥ． ｃｏｌｉの熱不安定性エンテロトキシン変異体 ＬＴＫ６３）とともに、調合され得る。これは、送達の初期における免疫刺激性の効果、ならびに結果として粘膜および全身の増強された応答を生じる、キトサンによって与えられる付着の援助を加える（３５）。
また最後に、キトサン調合物が、ワクチンの安定性向上すること、および液体調合物を越えて粘膜毛様体クリアランスに関してさらに遅れを生じさせることを示されている（４２）、乾燥粉末形式において調製され得ることに留意されるべきである。これは、キトサンとともに調合された鼻腔内の乾燥粉末ジフテリア変性毒素ワクチンに関する、最近のヒトの臨床試験において見られ、鼻腔内経路が、分泌型ＩｇＡ応答の追加の利益を有する従来の筋肉内経路と同程度に効果的であった（４３）。また、ワクチンは、非常に良好に免疫寛容化されていた。キトサンおよびＭＰＬを含有する炭疽菌用の鼻腔内の粉末乾燥化ワクチンは、筋肉内接種よりも強い応答をウサギにおいて誘導し、かつまた吸入性的な胞子の攻撃から防御性である（４４）。
従来のインフルエンザワクチンが、非経口的に投与され、かつ下気道を防御する全身性のＩｇＧ応答を大きく誘導（促進）する限りにおいて、粘膜応答を誘導する新たなワクチン手法が、上気道および下気道の両方におけるウイルスの増殖を制限可能であり、かつ個体の防御および伝播の減少にとっておそらく最も良好なワクチン手法であるので、粘膜応答を誘導する新たなワクチン手法はより好ましい（１５）。この方向性において保証を提供するワクチン手法としては、弱毒化した、寒冷に適合したウイルス（８）、および非複製性の抗原（例えば、ウイルス様粒子、組み換えＨＡ抗原、および複製欠損ウイルスベクター）の鼻腔内調合物の利用が挙げられる。
上気道および下気道の両方における防御の提供に加えて、鼻腔内ワクチンは、針接種の問題を回避し、かつ粒状および／または可溶性の抗原の、鼻咽頭関連リンパ組織（ＮＡＬＴ）との相互作用を介して粘膜および全身の液性往々および細胞性応答を誘導する手段を提供する（１６−１９）。鼻腔内経路は、従来、非経口摂取よりも有効性が低いが、ＶＬＰ、新規な送達調合物および免疫賦活剤の利用は、範例を変え始めている。実際に、増強されたＨＡ抗原結合および低下した粘膜毛様体クリアランスを結果として生じる、鼻粘膜におけるシアル酸含有受容体の豊富さに起因して、機能的なヘマグルチニン分子を含有するインフルエンザワクチンは、鼻腔内送達にとって特によく適している。
インフルエンザに関して、異種亜型防御を含む防御性の免疫応答は、実験において鼻腔内ワクチン送達に続くこと（ここで、平行した非経口投与が、免疫原性が低く、かつ異種亜型防御を誘導しなかった）について、報告されている（２０−２２）。さらに、不活化インフルエンザは、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ） ＶＬＰワクチンと混合されて、鼻腔内に投与される場合に、全身および粘膜の液性応答および細胞性応答にとって効果的な免疫賦活剤であることを示されている（２３）。この免疫賦活剤の効果は、不活化インフルエンザビリオンの、ＶＬＰとの凝集能および増強した粘膜表面に対する結合を導く能力に、帰された。また、インフルエンザＨＡが、樹状細胞（ＤＣ）に対する増強された結合および樹状細胞の増強された活性化を導くＳＩＶ ＶＬＰに対して直接に組み込まれた場合に、類似の免疫賦活剤の効果が見られた（２４、２５）。
免疫賦活剤
ワクチンに対して免疫賦活剤の効果を実現する種々の方法は、公知であり、かつ本明細書に開示されているＶＬＰと併せて使用され得る。一般的な原理および方法は、本明細書において言及することによって本明細書によって組み込まれる以下の２つの、"The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, and also in "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G et al. (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9において、詳述されている。
ある実施形態において、ＶＬＰワクチンは、ＶＬＰ：免疫賦活剤の約１０：１から約１０１０：１まで（例えば、ＶＬＰ：免疫賦活剤の約１０：１から約１００：１まで、約１００：１から約１０３：１まで、約１０３：１から約１０４：１まで、約１０４：１から約１０５：１まで、約１０５：１から約１０６：１まで、約１０６：１から約１０７：１まで、約１０７：１から約１０８：１まで、約１０８：１から約１０９：１まで、または約１０９：１から約１０１０：１まで）の質量に基づく割合において少なくとも１つの免疫賦活剤を伴った混合物において、ＶＬＰを包含する。当業者は、免疫賦活剤に関する情報、および最適な割合を決定するための常習的な実験を介して、適切な割合を容易に決定することができる。当業者は、免疫賦活剤に関する情報、および最適な割合を決定するための常習的な実験を介して、適切な割合を容易に決定することができる。本明細書において開示されているＶＬＰおよび免疫賦活剤の混合物は、当業者に利用可能な組み合わせのあらゆる形態（限定されないが、同じ溶液における個々のＶＬＰおよび免疫賦活剤の混合物、共有結合的に連結されたＶＬＰおよび免疫賦活剤の混合物、イオン的に連結されたＶＬＰおよび免疫賦活剤の混合物、疎水性的に連結されたＶＬＰおよび免疫賦活剤の混合物（ＶＬＰ膜において部分的または完全に埋め込まれていることが挙げられる）、親水性的に連結されたＶＬＰおよび免疫賦活剤の混合物、ならびに上述のもののあらゆる組み合わせが挙げられる）を包含し得る。
免疫賦活剤の好ましい例は、ＶＬＰポリペプチドとの共発現またはキメラポリペプチドを産生するためのＶＬＰポリペプチドとの融合によって、本明細書に記載されているＶＬＰに対して容易に付加され得るポリペプチド免疫賦活剤である。鞭毛を構成する主要なタンパク質である細菌のフラゲリンは、トールライク受容体ＴＬＲ５による先天性の免疫系によるその認識が理由になって、免疫賦活剤タンパク質としてますます注目を受けている好ましい免疫賦活剤である（６５）。ＴＬＲ５を介したフラゲリンシグナル伝達は、ＤＣの成熟および遊走、ならびに炎症誘発性媒介物質の産生を結果として生じるマクロファージ、好中球、および腸管上皮細胞の活性化を誘導することによって、先天性および順応性の免疫の両方に対する効果を有する（６６−７２）。
ＴＬＲ５は、免疫淘汰に応じてその変異体を排除している、このタンパク質にとって固有の、鞭毛機能に必要なフラゲリン単量体内に保存された構造を認識する（７３）。受容体は、１００Ｍｆの濃度に対して感受性であるが、原型の繊維を認識しない。鞭毛の単量体への分解が、結合および刺激に要求される。
免疫賦活剤として、フラゲリンは、非経口的または鼻腔内的のいずれかにおいて投与される異種抗原に対する防御応答に関して、潜在的な活性を有し（６６、７４−７７）、かつまた、ＤＮＡワクチンに対する免疫賦活剤の効果が報告されている（７８）。インフルエンザといった呼吸器系ウイルスに対して適切であるＴｈ２偏向は、フラゲリンが採用された場合に観察されたが、マウスまたはサルにおけるＩｇＥ誘導に関する証拠は、観察されていない。さらに、サルにおける鼻腔内または全身性の投与を受けての、局所的または全身的な炎症性応答は、報告されていない（７４）。Ｍｙｄ８８依存性の様式におけるＴＬＲ５を介したフラゲリンシグナル、およびＴＬＲ５を介した他のすべてのＭｙＤ８８依存性シグナルが、Ｔｈ１偏向を結果として生じることを示されているので、フラゲリンの使用に続いて誘発される応答のＴｈ２特性は、幾分か意外である（６７、７９）。重大なことに、フラゲリンに対する事前の抗体は、多目的免疫賦活剤として注目させている免疫賦活効果に対して、明らかな効果を有さない（７４）。
最近の多くの鼻腔内ワクチン試行における通常の主題は、ワクチン有効性を向上させるための、免疫賦活剤および／または送達系の利用である。そのような研究において、遺伝的に解毒したＥ． ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン免疫賦活剤（ＬＴ Ｒ１９２Ｇ）を含有するインフルエンザＨ３ワクチンは、Ｈ５攻撃に対して異種亜型防御を、鼻腔内送達に続いてのみ、結果として生じた。防御は、交差中和抗体の誘導に基づいており、かつ新たなインフルエンザワクチンの開発において鼻腔内経路に関する重要な関連を証明した（２２）。
また、サイトカイン、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＣＳＦなど）；腫瘍壊死因子；インターロイキン−２、−７、−１２および成長因子様の他のものは、免疫賦活剤として使用され得、かつまた、ＶＬＰポリペプチドと混合するか、または融合することによって、容易にＶＬＰワクチンに含まれ得るので、好ましい。
ある実施形態において、本明細書に開示されているＶＬＰワクチン組成物は、トールライク受容体を介して作用する他の免疫賦活剤（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチドを含む核酸ＴＬＲ９リガンド；イミダゾキノリンＴＬＲ７リガンド；置換グアニンＴＬＲ７／８リガンド；他のＴＬＲ７リガンド（例えば、ロクソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ））、７−ジアザデオキシグアノシン、７−チア−８−オキソデオキシグアノシン、２重鎖ポリ（Ｉ：Ｃ、）、ポリイノシン酸、イミキモド（Ｒ８３７）、およびレシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８）；またはＴＬＲ４アゴニスト（例えば、ＭＰＬ（登録商標）または合成誘導体））を包含し得る。
ある特定の免疫賦活剤は、ＡＰＣ（例えば、樹状細胞）によるワクチン分子の取り込みを容易にし、かつこれらを活性化する。非限定的な例は、免疫標的化する免疫賦活剤；免疫修飾する免疫賦活剤（例えば、トキシン、サイトカイン、および微生物派生物）；油状調合物；重合体；ミセル形成免疫賦活剤；サポニン；免疫刺激性複合体マトリックス（ＩＳＣＯＭマトリックス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウム免疫賦活剤；ＤＮＡ免疫賦活剤；ＭＰＬ；および被包性免疫賦活剤からなる群から選択される。
免疫賦活剤の付加的な例としては、薬剤（例えば、アルミニウム塩（例えば、０．０５から０．１パーセントの緩衝化生理食塩水溶液として一般的に使用される、水酸化物もしくはリン酸化物（ミョウバン）（例えば、Nicklas (1992) Res. Immunol. 143:489-493を参照すればよい）、０．２５パーセント溶液として使用される糖の合成重合体（例えば、カルボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（登録商標））との混合物、それぞれ７０°から１０１℃の範囲の温度を用いた３０秒から２分に渡る熱処理による、ワクチンにおけるタンパク質の凝集物、およびまた、適切な架橋剤を用いた凝集物））が挙げられる。また、アルブミンに対するペプシン処理抗体（Ｆａｂ断片）を用いた再活性化による凝集物か、細菌細胞（例えば、Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）またはグラム陰性細菌のエンドトキシンもしくはリポポリサッカライド成分との混合物か、生理学的に受容可能な油状溶媒（例えば、マンニドモノオレイン酸塩（アラセル（Ａｒａｃｅｌ） Ａ））における乳濁剤か、またはブロック置換として使用されるパーフルオロカーボン（フルソル（Ｆｌｕｓｏｌ）−ＤＡ）の２０パーセント溶液を用いた乳濁剤が、採用され得る。また、油状物（例えば、スクアレンおよびＩＦＡ）との混合物が好ましい。
ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイド）が、免疫賦活剤にとって興味深い候補物であるだけでなく、フロインド完全アジュバントおよびフロインド不完全アジュバントならびにクイラヤ（ｑｕｉｌｌａｊａ）サポニン（例えば、クイル（Ｑｕｉｌ） ＡおよびＱＳ２１）が、興味深い。さらなる可能性としては、リポポリサッカライドのポリ［ジ（エアルボキシラートフェノキシ（ｅａｒｂｏｘｙｌａｔｏｐｈｅｎｏｘｙ））ホスファゼン（ＰＣＰＰ）誘導体（例えば、モノホスホリル脂質 Ａ（ＭＰＬ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびスレオニルムラミルジペプチド（ｔＭＤＰ））が挙げられる。ポリリポサッカライドから作られた免疫賦活剤は、優勢なＴｈ１型応答（例えば、モノホスホリル脂質 Ａ、好ましくは３−脱アセチル化モノホスホリル脂質 Ａの、アルミニウム塩との組み合わせが挙げられる）を形成するために好ましい。ＭＰＬ（登録商標）免疫賦活剤は、グラクソスミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）から入手可能である（例えば、特にそれらのリポポリサッカライドに関する教示をともなうそれらの全体が、言及によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，４３６，７２７号明細書；米国特許第４，８７７，６１１号明細書；米国特許第４，８６６，０３４号明細書および米国特許第４，９１２，０９４号明細書を参照すればよい）。
また、リポソーム調合物は、免疫賦活効果を与えることを知られており、かつ従って、リポソーム免疫賦活剤は、ＶＬＰと併用に関して好ましい例である。
免疫複合体マトリックス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリックス）免疫賦活剤は、特にこの種の免疫賦活剤が、ＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩ発現を上方制御することができることを示されているので、ＶＬＰワクチンを伴う使用に対して好ましい選択である。ＩＳＣＯＭマトリックスは、キラヤサポニンから得られる（任意に分取された）サポニン（トリテルペノイド）、コレステロール、およびリン脂質から構成されている。例えばＶＬＰにおいて免疫原性タンパク質と混合される場合に、結果粒子調合物は、ＩＳＣＯＭ粒子として知られているものであり、ここで、サポニンは、６０−７０％の質量対質量比、１０−１５％の質量対質量比のコレステロールおよびリン脂質、ならびに１０−１５％の質量対質量比のタンパク質から構成され得る。免疫刺激性複合体の組成物および利用に関する詳細は、免疫賦活剤を取り扱う上述の教科書に見出され得るが、またMorein B et al., 1995, Clin. Immunother. 3: 461-475 as well as Barr I G and Mitchell G F, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 （いずれも言及によって本明細書に組み込まれる）は、完全な免疫刺激性複合体の調製にとって有用な教授を提供する。
本明細書に開示されているＶＬＰワクチンとの組み合わせ免疫賦活剤として使用され得るサポニン（ＩＳＣＯＭの形態であるか、またはそうではない）としては、米国特許第５，０５７，５４０号明細書（特にクイル Ａの分取物およびこれらの単離方法および利用に対する言及をともなうその全体が、言及によって本明細書に組み込まれる）および"Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55；および欧州特許第０ ３６２ ２７９号明細書に記載されている、クイル Ａと呼ばれるキラヤ サポナリア モリナの樹皮、ならびにそれらの分取物から得られるそれらが挙げられる。クイル Ａの特に好ましい分取物は、ＱＳ２１ＱＳ７、およびＱＳ１７である。
β−エスチン（Ｅｓｃｉｎ）は、本明細書に記載されているＶＬＰワクチンの免疫賦活剤組成物における使用にとって、他の好ましい溶血性サポニンである。エスチンは、セイヨウトチノキ（ラテン語：Ａｅｓｃｕｌｕｓ ｈｉｐｐｏｃａｓｔａｎｕｍ）の種子に生じるサポニンの混合物としてメルクインデックス（Ｍｅｒｃｋ ｉｎｄｅｘ）（第１２版：登録３７３７）に記載されている。その単離は、クロマトグラフィーおよび精製による（Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)）、ならびにイオン交換樹脂による（Erbring et al., 米国特許第３，２３８，１９０号明細書）と、説明されている。エスチンの分取物は、精製され、かつ生物学的に活性であることを示されている（Yoshikawa M, et al. (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August;44(8):1454-1464)）。また、β−エスチンは、アエスチンとして知られている。
ＶＬＰワクチンとともに使用する他の好ましい溶血性サポニンは、ジギトニンである。ジギトニンは、メルクインデックス（第１２補足版、登録３２０４）に、ジギタリス プルプレア（Ｇｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｒｅａ）の種子から得られ、かつGisvold et al., J.Am.Pharm.Assoc., 1934, 23, 664; and Ruhenstroth-Bauer, Physiol.Chem., 1955, 301, 621に記載の手法に従って精製されているサポニンとして記載されている。その利用は、コレステロール定量に関する臨床試薬であるとして記載されている。
他の興味深い（そして従って、好ましい）免疫賦活効果を達成する可能性は、Gosselin et al., 1992（言及によって本明細書によって組み込まれる）に記載の技術を採用することである。簡単に言うと、関連する抗原（例えば、本明細書に記載されているＶＬＰポリペプチドまたは付加的な抗原）の提示が、単核球／マクロファージ上におけるＦｃ受容体に対する抗体（または抗原結合抗体断片）に対して、抗原を接合することによって増強され得る。特に、抗原および抗ＦｃＲＩの間における接合体は、ワクチン接種を目的とした免疫原性を増強することを証明されている。抗体は、生成後のＶＬＰに対して、または生成物の一部（例えば、ＶＬＰポリペプチドのいずれか１つのに対する融合体として発現することによることが挙げられる）として接合され得る。
他の可能性は、標的化および免疫調節物質（すなわち、サイトカイン）の利用に関する。さらに、サイトカインの合成誘発因子（例えば、ポリＩ：Ｃ）が使用され得る。
好適な放線菌派生物は、ムラミルジペプチド、完全フロインドアジュバント、およびトレハロースのジエステル（例えば、ＴＤＭおよびＴＤＥ）からなる群から選択され得る。
好適な免疫標的化免疫賦活剤の例としては、ＣＤ４０リガンドおよびＣＤ４０抗体またはこれらの特異的結合断片（上述の論述を参照すればよい）、マンノース、Ｆａｂ断片、ならびにＣＴＬＡ−４が挙げられる。
好適な重合体免疫賦活剤の例としては、糖質（例えば、デキストラン、ＰＥＧ、スターチ、マンナン、およびマンノース）；合成樹脂重合体；および天然ゴム（例えば、天然ゴムビーズ）が挙げられる。
免疫応答を調節するさらに他の興味深い方法は、“仮想リンパ節（ｖｉｒｔｕａｌ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅ）”（ＶＬＮ）（イミュノセラピー（ニューヨーク州、ニューヨーク、レキシントン通り３６０ １００１７−６５０１）によって開発された専売医療用具）に免疫原（免疫賦活剤ならびに薬学的に受容可能な担体および溶媒を、任意に伴って）を含めることである。ＶＮＬ（細い管状の用具）は、リンパ節の構造および機能を模倣する。皮下へのＶＬＮの挿入は、サイトカインおよびケモカインの急増を伴う無菌の炎症部位を作り出す。Ｔ細胞およびＢ細胞ならびにＡＰＣは、危険シグナルに対して急速に応答し、炎症性部位に存在し、かつＶＬＮの多孔性マトリックスの内側に蓄積する。免疫応答を起こすために要求される抗原の必要な用量が、ＶＬＮを用いる場合に低減されること、およびＶＬＮを用いたワクチン接種によって与えられる免疫防御が、免疫賦活剤としてＲｉｂｉを用いる従来の免疫化を凌いだことは、示されている。技術は、Gelber C et al., 1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", in: "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, Oct. 12-15, 1998, Seascape Resort, Aptos, Calif."に、簡単に記載されている。
オリゴヌクレオチドは、ＶＬＰワクチンと併用する免疫賦活剤として使用され得、かつ少なくとも３つ、またはより好ましくは少なくとも６つのヌクレオチドによって分けられる、２つ以上のジヌクレオチド ＣｐＧモチーフを好ましく含有し得る。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていない）は、Ｔｈ１応答を優勢に誘導する。当該オリゴヌクレオチドは、公知であり、かつ例えば、特に免疫賦活剤としてＣｐＧオリゴヌクレオチドを作製、および使用する方法に関する言及を含めて、それらの全体が言及によって本明細書によって組み込まれる、国際公開第９６／０２５５５号パンフレット、国際公開第９９／３３４８８号パンフレットおよび米国特許第６，００８，２００号明細書および米国特許第５，８５６，４６２号明細書に記載されている。
当該オリゴヌクレオチド免疫賦活剤は、デオキシヌクレオチドであり得る。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドにおけるヌクレオチド骨格は、ホスホロジチオネート結合、またはより好ましくはホスホロチオネート結合であるが、ホスホジエステルおよび他のヌクレオチド骨格（例えば、複合骨格連鎖を有するオリゴヌクレオチドを含むＶＬＰワクチンとともに使用され得るＰＮＡ）である。ホスホロチオネートまたはホスホロジチオネートを産生する方法は、特にホスホロチオネートおよびホスホロジチオネートを教示する言及とともに、それらの全体が言及によって本明細書によって組み込まれる、米国特許第５，６６６，１５３号明細書、米国特許第５，２７８，３０２号明細書および国際公開第９５／２６２０４号パンフレットに記載されている。
好ましいオリゴヌクレオチドの例としては、以下の配列が挙げられる。配列は、ホスホロチオネート修飾ヌクレオチド骨格を好ましく含有する。
（配列番号１）ＯＬＩＧＯ１：ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＣＧ ＴＴ（ＣｐＧ１８２６）
（配列番号２）ＯＬＩＧＯ２：ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＴＧ ＣＧＣ ＣＡＴ（ＣｐＧ１７５８）
（配列番号３）ＯＬＩＧＯ３：ＡＣＣ ＧＡＴ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＣＣ ＧＧＴ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＣＧ
（配列番号４）ＯＬＩＧＯ４：ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ ＧＴＣ ＧＴＴ（ＣｐＧ２００６）
（配列番号５）ＯＬＩＧＯ５：ＴＣＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＡＴＧ ＣＴ（ＣｐＧ１６６８）。
代替可能な好ましいＣｐＧオリゴヌクレオチドとしては、これらに対する重要ではない欠失または付加を有する上述の配列が挙げられる。免疫賦活剤としてのＣｐＧオリゴヌクレオチドは、当該技術において公知のあらゆる方法によって合成され得る（例えば、欧州特許第４６８５２０号明細書）。好ましくは、当該オリゴヌクレオチドは自動化された合成器を利用して合成され得る。当該オリゴヌクレオチド免疫賦活剤は、長さに関して１０−５０塩基の間であり得る。他の免疫賦活系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドおよびサポニン誘導体の組み合わせ、特に国際公開第００／０９１５９号パンフレットに開示されている、ＣｐＧおよびＱＳ２１の組み合わせに関する。
多くの単相または多相の乳化系が、説明されている。当業者は、乳化剤がＶＬＰの構造を崩壊させないように、ＶＬＰを用いた利用に対して当該乳化系を容易に適合し得る。水中油型乳化剤免疫賦活剤のそれ自体が、免疫賦活剤組成物として有用であることを示唆されており（欧州特許第３９９ ８４３ Ｂ号明細書）、また、水中油型の乳化剤および他の活性薬剤の組み合わせが、ワクチン用の免疫賦活剤として説明されている（国際公開第９５／１７２１０号パンフレット；国際公開第９８／５６４１４号パンフレット；国際公開第９９／１２５６５号パンフレット；国際公開第９９／１１２４１号パンフレット）。他の油型乳化剤免疫賦活剤は、例えば、油中水型乳化剤（米国特許第５，４２２，１０９号明細書；欧州特許第０ ４８０ ９８２ Ｂ２号明細書）、および水中油中水型乳化剤（ｗａｔｅｒ ｉｎ ｏｉｌ ｉｎ ｗａｔｅｒ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）（米国特許第５，４２４，０６７号明細書；欧州特許第０ ４８０ ９８１ Ｂ号明細書）について記載されている。
本明細書に記載されているＶＬＰワクチンを用いた利用に対する油型乳化剤は、天然物または合成物であり得、かつ無機物または有機物であり得る。無機油状物および有機油状物の例は、当業者にとって容易に理解できる。
ヒト投与に好適であるべきあらゆる水中油型組成物にふさわしくは、乳化剤の油相が、代謝によって転換可能な油状物を好ましく包含する。代謝によって転換可能な油状物という用語の意味は、当該技術においてよく知られている。代謝によって転換可能は、“代謝によって転換される能力がある”と定義され得る（Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)）。油状物は、受容者にとって無害であり、かつ代謝によって転換される能力がある、あらゆる植物油、魚油、動物油または合成油であり得る。ナッツ（例えば、ピーナツ油）、種子、および穀粒が、一般的な植物油の原料である。また、合成油が、ＶＬＰワクチンとともに使用され得、かつ市販の油（例えば、ＮＥＯＢＥＥ（登録商標））および他の物を含むことができる。スクアレン（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）は、サメの肝油において大量に見られ、かつオリーブ油、小麦の胚種油、糠油、および酵母においてより少量に見られる不飽和油であり、本明細書に開示されているＶＬＰワクチンを用いた利用にとって特に好ましい油である。スクアレンは、コレステロールの生合成における中間物質であるという事実の長所 代謝によって転換可能な油である（メルクインデックス、第１０版、登録８６１９）。
特に好ましい油型乳化剤は、水中油型乳化剤であり、かつ特に水中スクアレン型乳化剤である。
さらに、ＶＬＰワクチンにおける使用に最も好ましい油型乳化剤は、好ましくはオイル α−トコフェノール（ビタミンＥ、欧州特許第０ ３８２ ２７１ Ｂ１号明細書）である酸化防止剤を包含する。
国際公開第９５／１７２１０号パンフレットおよび国際公開第９９／１１２４１号パンフレットは、免疫刺激剤ＱＳ２１および／または３Ｄ−ＭＰＬとともに任意に調合される、スクアレン、α−トコフェノール、およびＴＷＥＥＮ８０に基づく乳化剤免疫賦活剤について開示している。国際公開第９９／１２５６５号パンフレットは、油相に対するステロールの添加を伴った、これらのスクアレン乳化剤に対する改善について開示しいている。付加的に、トリグリセリド（例えば、トリカプリリン（Ｃ２７Ｈ５０Ｏ６））、は、乳化剤を安定化するために油相に対して加えられ得る（国際公開第９８／５６４１４号パンフレット）。
安定な水中油型乳化剤内に見られる油液滴の大きさは、光子相関分光法によって測定されるときに、好ましくは１ミクロン以下であり、実質的に３０−６００ｎｍの範囲内、好ましくは直径が実質的に約３０−５００ｎｍ、そして最も好ましくは直径が実質的に約１５０−５００ｎｍ、そして特に直径が約１５０ｎｍであり得る。この点において、適切に油液滴の８０％、より好ましくは９０％以上が好ましい範囲内にあるべきであり、かつ最も好ましくは適切に油液滴の９５％が定義される大きさの範囲内にある。油型乳化剤に存在する成分の量は、慣習的に２から１０％まで範囲内の油（例えば、スクアレン）であり；かつ存在する場合に２から１０％までのアルファトコフェノールであり；０．３から３％までの界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン ソルビタンモノオレイン酸塩）である。好ましくは、油：トコフェノールの比率は、この比率がより安定な乳化剤を提供するので、等しいかまたは１未満である。また、スパン（Ｓｐａｎ）８５は、約１％の濃度において存在し得る。ある場合において、本明細書に開示されているＶＬＰワクチンが、安定化剤をさらに含有することは、有利であり得る。
水中油型乳化剤を生産する方法は、当業者によく知られている。通常、方法は、油相を界面活性剤（例えば、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）溶液）と混合し、続いてホモジナイザーを用いた均質化を包含し、シリンジ針の中に混合物を２回通して混合することを包含する方法が、少量の液体にとって好適であることは、当業者にとって明らかである。同様に、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）における乳化過程（Ｍ１０Ｓ 微小流体工学機器、６ｂａｒの最小圧力入力（約８５０ｂａｒの出力圧力）において２分間において、最大５０回）が、少量のまたは大量の乳化剤を生産するために、当業者によって適合され得る。この適合は、要求される直径の油液滴を伴って達成される調製までに、結果乳化物の測定を含む常習的な実験によって達成され得た。
本明細書に開示されているＶＬＰワクチン調製物は、鼻腔内的、筋肉内的、腹腔内的、皮内的、経皮的、血管内的、または皮下的な投与による上記ワクチンの投与を用いて、ウイルスインフルエンザにかかりやすいか、またはかかっている哺乳類またはトリを防御するか、または処置するために使用され得る。ワクチン調製物の全身性の投与方法としては、シリンジおよび針、または固体ワクチンの衝撃送達（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）用に設計される装置（国際公開第９９／２７９６１号パンフレット）、または針なしの圧力液体噴射装置（米国特許第４，５９６，５５６号明細書；米国特許第５，９９３，４１２号明細書）、または経皮パッチ（国際公開第９７／４８４４０号パンフレット；国際公開第９８／２８０３７号パンフレット）が挙げられる。また、ＶＬＰワクチンは、皮膚に対して適用され得る（経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）または経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）な送達 国際公開第９８／２０７３４号パンフレット；国際公開第９８／２８０３７号パンフレット）。従って、本明細書に開示されているＶＬＰワクチンは、ＶＬＰワクチンまたは免疫賦活剤組成物を事前に充填した、全身投与用の送達器具を含む。従って、本明細書に記載されているＶＬＰ組成物の内のあらゆるものを包含し、かつ免疫賦活剤および／または担体を任意に含むワクチンの、個体に対する投与を包含する、個体、好ましくは哺乳類またはトリにおいて免疫応答を誘導する方法を提供され、ここで、ワクチンは、非経口的または全身的な経路を介して投与される。
好ましくは、本明細書に開示されているＶＬＰワクチン調製物は、粘膜の経路（例えば、経口／食事性の、または鼻腔内の経路）を介して上記ワクチンを投与することによって、ウイルスインフルエンザにかかりやすいか、またはかかっている哺乳類またはトリを防御または処置するために使用され得る。代替可能な粘膜経路は、膣内および直腸内である。好ましい投与の粘膜経路は、鼻腔内ワクチン接種と呼ばれる経鼻の経路を介するものである。鼻腔内ワクチン接種の方法は、当該技術においてよく知られている（免疫化される個体の鼻咽頭内への、ワクチンの液滴、噴霧または乾燥粉末の形態の投与が挙げられる）。従って、霧状化、またはエアロゾル化したワクチン調合物は、本明細書に開示されているＶＬＰワクチンの好ましい形態である。また、腸様性調合物（例えば、経口投与用の胃耐性のカプセル剤および顆粒）、直腸または膣の投与用の座剤は、本明細書に開示されているＶＬＰワクチンの調合物である。
本明細書に開示されている好ましいＶＬＰワクチン組成物は、全身性投与を粘膜投与によって置き換えるための、ヒトにおける適用に好適な粘膜ワクチンの分類に相当する。
また、ＶＬＰワクチンは、経口経路を介して投与され得る。また、当該場合において、薬学的に受容可能な補助剤としては、アルカリ性緩衝液、または腸溶性カプセル剤もしくは微小顆粒が挙げられ得る。また、ＶＬＰワクチンは、膣経路によって投与され得る。また、当該場合において、薬学的に受容可能な補助剤としては、乳化剤重合体（例えば、カルボポル（登録商標））、ならびに膣クリーム座剤の他の公知の安定化剤が挙げられ得る。また、ＶＬＰワクチンは、直腸経路によって投与され得る。また、当該場合において、補助剤としては、直腸座剤を形成するための、当該技術において公知のワックスおよび重合体が挙げられ得る。
代替可能に、ＶＬＰワクチン調合物は、キトサン（上述されている）または他のポリカチオン重合体、ポリラクチドおよびポリラクチド−コグリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン重合体マトリックス、ポリサッカライドまたは化学修飾ポリサッカライドから構成される粒子、リポソームおよび脂質から作られる粒子、グリセロールモノエステルから構成される粒子などと組み合わせられ得る。また、サポニンは、コレステロール存在下において調合されて、特定の構造（例えば、リポソームまたはＩＳＣＯＭ）を形成し得る。さらに、サポニンは、非粒子性の溶液もしくは懸濁液、または粒子構造（例えば、パウチラメラ（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌａｒ）リポソームまたはＩＳＣＯＭ）のいずれかにおいて、ポリオキシエチレン エーテルまたはエステルとともに調合され得る。
本明細書に記載されているようなＶＬＰを用いた、薬学的組成物およびワクチン組成物における利用に関する付加的な例示の免疫賦活剤としては、ＳＡＦ（カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）、カリフ（Ｃａｌｉｆ）、米国）、ＭＦ−５９（カイロン、例えば、Granoff et al. (1997) Infect Immun. 65 (5):1710-1715を参照すればよい）、免疫賦活剤のＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢ−ＡＳ２（スミスクライン ビーチャム免疫賦活剤系＃２；ＭＰＬおよびＱＳ２１を含有する水中油型乳化剤）；ＳＢＡＳ−４（スミスクライン ビーチャム免疫賦活剤系＃４；ミョウバンおよびＱＳ２１を含有する）、スミスクライン ビーチャム、リクセンサルト（Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ）、ベルギーから入手可能である）、デトックス（Ｄｅｔｏｘ）（エンハンジン（Ｅｎｈａｎｚｙｎ）（登録商標）（グラクソスミスクライン）および他のアミノアルキルグルコサミニド ４−ホスフェート（ＡＧＰｓ）（例えば、開示内容の全体が言及によって本明細書に組み込まれる、米国出願公開第０８／８５３，８２６号明細書および米国出願公開第０９／０７４，７２０号明細書に記載されているもの））が挙げられる。
免疫賦活剤の他の例としては、限定されないが、ハンタータイターマックス（Ｈｕｎｔｅｒ‘ｓ ＴｉｔｅｒＭａｘ）（登録商標）免疫賦活剤（ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐ、ノルクロス（Ｎｏｒｃｒｒｏｓ）、Ｇａ）；ゲルブ（Ｇｅｒｂｕ）免疫賦活剤（ビオテクニーク（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）株式会社、ガイベルク（Ｇａｉｂｅｒｇ）、ドイツ）；ニトロセルロース（Nilsson and Larsson (1992) Res. Immunol. 143:553-557）；ミョウバン（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）乳化剤から作られた調合物（無機油、非無機油、油中水型乳化剤または水中水型乳化剤を含む）（例えば、モンタミド（Ｍｏｎｔａｍｉｄｅ）免疫賦活剤のセピック（Ｓｅｐｐｉｃ）ＩＳＡシリーズ（例えば、ＩＳＡ−５１、ＩＳＡ５７、ＩＳＡ−７２０、ＩＳＡ−１５１など；セピック、パリ、フランス））；プロバックス（ＰＲＯＶＡＸ）（登録商標）（ＩＤＥＣ製薬）；ＯＭ−１７４（脂質 Ａに関連するグルコサミンジサッカライド）；リーシュマニア属の伸張因子；ミセル（例えば、ＣＲＬ１００５）を形成する非イオン性ブロック共重合体；およびシンテックス（Ｓｙｎｔｅｘ）免疫賦活剤調合物が挙げられる。例えば、O'Hagan et al. (2001) Biomol Eng. 18(3):69-85；および"Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols" D. O'Hagan, ed. (2000) Humana Pressを参照すればよい。
他の好ましい免疫賦活剤としては、一般式
ＨＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ａ−Ｒ （Ｉ）
（ここで、ｎは１−５０であり、Ａは結合または−−Ｃ（Ｏ）−−であり、ＲはＣ１−５０のアルキルまたはフェニル Ｃ１−５０アルキルである）の免疫賦活分子が挙げられる。
本明細書に記載されているＶＬＰワクチン調合物の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）（ここで、ｎは、１および５０、好ましくは４−２４の間、最も好ましくは９であり、Ｒ構成要素は、Ｃ１−５０、好ましくはＣ４−２０のアルキル、そして最も好ましくはＣ１２アルキルであり、かつＡは結合である）のポリオキシエチレン エーテルを含む。ポリオキシエチレン エーテルの濃度は、０．１−２０％、好ましくは０．１−１０％の範囲であり、かつ最も好ましくは０．１−１％の範囲であるべきである。好ましいポリオキシエチレン エーテルは、以下の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリル エーテルポリオキシエチレン−９−ステオリル エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリル エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリル エーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリル エーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリル エーテルから選択される。ポリオキシエチレン エーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリル エーテル）は、メルクインデックス（第１２版：登録７７１７）に記載されている。これらの免疫賦活剤分子は、国際公開第９９／５２５４９号パンフレットに記載されている。
上述の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレン エーテルは、必要に応じて、他の免疫賦活剤と組み合わせられ得る。例えば、好ましい免疫賦活剤の組み合わせは、好ましくは上述のＣｐＧと、である。
本明細書に開示されているＶＬＰワクチンを用いた利用にとって好適な、薬学的に受容可能な補助剤のさらなる例としては、水、リン酸緩衝液生理食塩水、等張緩衝溶液が挙げられる。
付加的なインフルエンザ抗原
本明細書に開示されているＶＬＰは、インフルエンザの特定の株に関しておよび／またはインフルエンザの複数の株に渡って、免疫原性を増加させるために、インフルエンザから得られる付加的な抗原を含み得る。
好ましい付加的なインフルエンザ抗原は、Ｍ２ポリペプチド（また、インフルエンザ ＢにおけるＢＭ２と呼ばれる）である。インフルエンザウイルスのＭ２ポリペプチドは、小さな９７アミノ酸であり、ＲＮＡセグメント７にコードされ、スプライシング現象を受けるクラスＩＩＩインテグラル膜タンパク質である（８０、８１）。ごくわずかなＭ２が、ウイルス粒子上に存在するが、感染細胞においてより豊富に見られ得る。Ｍ２は、ウイルスの侵入に必要な、陽子選択的イオンチャネルとして機能する（８２、８３）。Ｍ２は、保存性を説明する、感染またはワクチン接種の間において最小限に免疫原性であるが、代わりの様式において提示される場合に、Ｍ２は、より免疫原性であり、かつ防御的である（８４−８６）。これは、インビボにおけるＭ２モノクロナル抗体の受動免疫が、ウイルスのクリアランスを促進し、かつ防御を結果として生じるという観察と一致する（８７）。Ｍ２外部ドメインエピトープが、融合タンパク質としてＨＢＶのコア粒子に対して連結される場合に、非経口接種および鼻腔内接種の両方を介してマウスにおいて防御的であり、かつ３つの縦列コピーがコアタンパク質のＮ末端に対して融合される場合に、最も免疫原性がある（８８−９０）。これは、増加したエピトープ密度が、免疫原性を増加させるという他の担体−ハプテンのデータと一致している（９１）。
Ｍ２ワクチンの鼻腔内送達に関して、免疫賦活剤は、ＬＴＲ１９２Ｇ（８８、９０）およびＣＴＡ１−ＤＤ（８９）を用いて達成されている良好な防御、および良好な結果を達成するために要求される。また、ペプチドは、担体（例えば、ＫＬＨ）、またはＮ．メニンジチデスの他の外部膜タンパク質複合体、またはヒトパピローマウイルスＶＬＰに対して、化学的に接合され得、かつマウスおよび他の動物においてワクチンとして防御的である（９２、９３）。
Ｍ２タンパク質が、高度に保存されている限りにおいて、配列相違なしで、完全ではない。通常株Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Ａｉｃｈｉ／６８のＭ２外部ドメインエピトープは、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１５６／９７（Ｈ５Ｎ１）を除いた他の現代的な配列決定されたヒトの株のすべてと、免疫学的に交差反応性であることを示されている（９２）。また、インフルエンザデータベース配列の調査は、他の最近の病原性Ｈ５Ｎ１ヒト臨床分離株（例えば、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）のＭ２配列において、同様の相違を示す。この知見は、Ｍ２エピトープを組み込んでいる、成功するＨ５特異的な流行病のワクチンは、現在、循環しているヒトＨ１およびＨ３臨床分離株におけるＭ２配列よりむしろ、病原性トリ株に対して固有であるＭ２配列を反映する必要があることを証明している。
インフルエンザウイルスから得られる付加的なタンパク質（ＨＡ、ＮＡおよびＭ２以外）は、ｇａｇまたはＨＡポリペプチドに対する付加的な抗原のすべてもしくは一部の共発現によってか、または連結を介してのいずれかにおいて、ＶＬＰワクチンに含まれ得る。これらの付加的な抗原としては、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ，核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）、ＢＭ２、ＮＳ、ＮＳ１、およびＮＳ２が挙げられる。インフルエンザ Ａにとって、好ましい例としては、ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、核タンパク質、マトリックス（Ｍ１）、Ｍ２、ＮＳ１、およびＮＳ２が挙げられる。インフルエンザ Ｂにとって、好ましい例としては、ＨＡ、ＮＡ、ＮＰ、Ｍ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡ、ＮＳおよびＢＭ２が挙げられる。これらの後方の抗原は、一般的に、中和抗体反応の標的ではないが、Ｔ細胞によって認識されるある特定の重要なエピトープを含有し得る。当該エピトープに対してＶＬＰワクチンによって誘導されるＴ細胞応答は、防御免疫の促進において恩恵を与えることを確かめ得る。
〔好ましい方法〕
（実施例１−キメラインフルエンザＶＬＰの産生）
ＭＬＶｇａｇコーディング配列は、完全なモロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）マウス白血病ウイルスの広宿主性プロウイルス配列を含有するプラスミド ｐＡＭＳ（ＡＴＣＣ）から、ＰＣＲによって得られた。ｇａｇコーディング配列は、ｐＦａｓｔＢａｃＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ））の中に、多角体プロモータの後ろに挿入され、かつ結果のプラスミドは、バキュロウイルスゲノムへの組み換えのために、ＤＨ１０Ｂａｃ形質転換受容性細胞の中に形質転換された。それから、高分子量バックミドＤＮＡは、精製され、かつｇａｇ発現組み換えバキュロウイルス生成のために、Ｓｆ９細胞にトランスフェクトされた。Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼのそれぞれをコードする、２つの他の組み換えバキュロウイルスは、ウイルスＲＮＡからのＨＡおよびＮＡコーディング配列のＲＴ−ＰＣＲ後に、同様の方法において産生された。最後に、３つの産物のすべて（ＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ）をコードする単一のバキュロウイルスベクターは、個々のｐＦａｓｔＢａｃＩプラスミドからのＨＡ、ｇａｇおよびＮＡ発現ユニット（多角体プロモータ−コーディング配列−ポリＡ部位）を、単一のｐＦａｓｔＢａｃＩベクター内に一体化することによって産生された。最初の分析用に、ｇａｇまたはＨＡまたはｇａｇ−ＨＡ−ＮＡをコードする組み換えバキュロウイルスは、６ウェルプレートにおけるＳｆ９細胞内に、１を越えるＭＯＩにおいて感染させられた。感染後の３日目に、培養上清が、壊死組織片を除去されて、それから２０％スクロース緩衝によって１０００００×ｇにおいてペレット化された。ペレットは、ｇａｇ特異的抗血清およびＨ１Ｎ１特異的抗血清を用いた、ウエスタンブロッティング分析によって分析された（図１ＡおよびＢを参照すればよい）。
図１ＡおよびＢにおいて、それぞれのブロットにおける左にある３つのレーンのそれぞれは、培地を回収する前の、別々のｇａｇまたはＨＡまたは対照（ＥＶ＝空ベクター）のバキュロウイルスに感染しているＳｆ９細胞の結果を示している。予想されたように、ｇａｇのみのバキュロウイルスを用いた感染は、ＶＬＰ出芽に起因する、高分子量画分における有意な量のｇａｇ抗原を生じる（図１Ａ、レーン“Ｇａｇ”）。対照的に、ＨＡのみのバキュロウイルス感染は、それ自体によって、培地に放出されたごく少量のＨＡを結果として生じる（図１Ｂレーン“ＨＡ”）。しかし、ＨＡ−ｇａｇ−ＮＡの３重ベクターを用いたＳｆ９の感染は、ｇａｇの発現が細胞外にＨＡを引き出すことができることを示す、１０００００×ｇ画分に現れる有意な量のｇａｇおよびＨＡの両方を結果として生じる（レーン１−９、図１ＡおよびＢ）。
図２ＡおよびＢは、２０−６０％のスクロース段階勾配に対するペレット化したＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ ＶＬＰの再遠心分離に続く、個々の勾配画分のウエスタンブロット分析の結果を示す。約１．１６ｇ／ｍｌの密度における一致したバンドを示している、同じ画分におけるｇａｇおよびＨＡの両方のピークは、ｇａｇおよびＨＡがＶＬＰ内にあることを示している。
（実施例２−インフルエンザＶＬＰの鼻腔内送達）
ＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ ＶＬＰは、インフルエンザウイルス Ａ／ＰＲ／８／３４のＭＬＶ ｇａｇおよびＨＡ産物およびＮＡ産物をコードする、３重発現バキュロウイルスベクターを用いて感染させたＳｆ９細胞の培地から調製された。培地は、細胞生存度が１０％未満に下がったときに回収され、かつ２０００ｒｐｍにおける１５分に渡る遠心分離によって細胞片を除去された。不純物を除去した４０ｍｌの培地（ＭＬＡ−８０ 超遠心チューブ毎に５ｍｌ）は、ｐＨ７．４のトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）において、１ｍｌの２０％スクロース緩衝の上に層状化され、それからＭＬＡ−８０ ローターにおいて４５０００ｒｐｍ、１０℃において２時間に渡って遠心分離された。ペレット化された物質は、ＴＢＳにおいて再懸濁化され、かつ２０−６０％のスクロース段階勾配の上に層状化され、かつＭＬＡ−８０ ローターにおいて、３６０００ｒｐｍ、１０℃において２時間に渡って遠心分離された。勾配は、０．５ｍｌの画分に分画され、かつＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上において、ｐ６５ ｇａｇの存在に関してアッセイされた。ＶＬＰを含有するプールした画分（２つの勾配から得られる約３ｍｌ）は、濃縮され、かつ緩衝液は、遠心分離微量濃縮器を用いてＴＢＳに交換した。ＶＬＰの収量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる少量の分量の分析によって、評価された。
メスのＢａｌｂ／ｃマウスの２つの群（免疫群ごとに５匹）は、約５−１０μｇのＶＬＰ（ｇａｇの定量化に基づく）を用いて、鼻腔内経路および腹腔内経路のそれぞれを介して、ワクチン接種された。２つの当該免疫化を受けた動物のそれぞれは、１ヶ月間の間隔を空けた。鼻腔内の免疫化は、５μｌのＶＬＰ懸濁液、水における４．５μｌの１０％のキトサン、および９０％のエタノールにおける０．５μｌの１０ｍｇ／ｍｌのモノホスホリル脂質 Ａ（ＭＰＬ）から作られて、なされた。１０μｌの免疫化用量は、２つの鼻孔に、等分に分けられた。腹腔内の免疫化は、５μｌのＶＬＰ懸濁液、９０％のエタノールにおける２μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＭＰＬ、９３μｌの生理食塩水（用量ごとに１００μｌの総量）から構成された。血清試料は、それぞれの免疫化から２週間後にマウスのそれぞれから回収され、インフルエンザワクチン研究の分野における広く採用される標準的なアッセイを用いて、赤血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）活性に関してアッセイされた。また、未処置のマウスから得られる血清試料は、平行して処理されて、陰性対照の役割を果たした。図３は、ｉ．ｎ．免疫化群およびｉ．ｐ．免疫化群の両方における１００％の動物が、防御的レベルのＨＡＩ力価（１：４０、グラフにおいて破線によって示される）または初回免疫よりも高度に応答した、ＨＡＩアッセイの結果を示している。免疫応答は、追加免疫を受けた後に、さらに顕著に増加した。対照動物は、ＨＡＩ活性を示さなかった（力価＜１：１０）。
この実施例は、本発明に開示されているＶＬＰワクチンの鼻腔内送達の有効性を証明している。
（実施例３−ＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ ＶＬＰの産生、性質決定および免疫原性試験）
実施例１に記載されているように、Ａ／ＰＲ／８／３４のＭＬＶ ｇａｇおよびＨＡ産物およびＮＡ産物を発現する個々のバキュロウイルスが、産生されている。またさらに、３つの産物のすべてをコードする３重発現バキュロウイルスベクターが、構築されており、かつ感染昆虫細胞から得られるペレット化された培養上清のスクロース密度勾配遠心分離は、ＨＡを有するＶＬＰが形成されていることを示すウエスタンブロッティングによって検出されるように、ｇａｇおよびＨＡの一致したバンドを示した。ＨＡ、ｇａｇ、およびＮＡのコーディングエレメントが、それ自身のプロモータ（Ｐｒ）およびポリアデニル化配列（ｐＡ）を伴って、頭−尾様式に配置される、３重発現ベクターにおけるコーディング配列の配置は、図４に示されている。単一のベクター内にすべてのコーディング配列を組み合わせることは、別々のウイルスを用いた共感染を実施する必要、および３つの別々のウイルスの一致した感染多重度を達成する関連した困難性を回避する。
ｇａｇのみ、およびＨＡのみを用いたＶＬＰ形成の可能性を試験する以前の研究は、あまり上手く行かなかった。ＮＡ非存在下におけるＳｆ９細胞におけるＨＡのバキュロウイルス発現は、細胞に対する細胞の凝集に特徴付けられる細胞および有意な数の融合現象を結果として生じた。これは、ＮＡがＨＡと共発現される場合には、観察されなかった。Ｓｆ９昆虫細胞が有意な量のシアル酸を欠如している（１０３）にもかかわらず、驚くべきことに、ＮＡの共発現は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞からのＶＬＰ放出を増強した。
赤血球凝集反応アッセイ
バンド化されたＶＬＰのスクロース密度勾配画分は、ＭＬＶ ｇａｇと同時に結合するＨＡ抗原活性が、機能的なＨＡであることを証明するために、ニワトリまたはテンジクネズミのＲＢＣを採用する標準的なアッセイを用いた赤血球凝集反応活性に関して、ふるい分けされる。また、孵化鶏卵において培養されたインフルエンザウイルス Ａ／ＰＲ／８／３４は、スクロース勾配上において層状化され、かつ陽性対象として赤血球凝集反応アッセイにかけられる。
サイズ排除クロマトグラフィー
スクロース密度勾配精製ＶＬＰが、セファロース（Ｓｐｈａｒｏｓｅ） ＣＬ−４Ｂを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにかけられ、かつ画分がウエスタンブロットによって、ＭＬＶ ｇａｇおよびＨＡに関して観察される。ＶＬＰは、空隙容量において溶出し、かつＭＬＶ ｇａｇ、ＨＡおよびＮＡを含有する。Ａ／ＰＲ／８／３４ ウイルスは、対照としてクロマトグラフにかけられる。
電子顕微鏡
スクロース勾配からのＶＬＰ試料は、２％のグルタルアルデヒドを用いて処理され、ＥＭグリッド上に吸着され、リンタングステン酸ナトリウムを用いて陰性染色され、かつ電子顕微鏡によって調べられる。
免疫原性
ＶＬＰ免疫原性は、参考文献（４４）および上述の実施例２に記載されている炭疽病防御抗原（ＰＡ）調合物と類似の鼻腔内的なキトサン／ＭＰＬ調合物を用いて、メスのＢａｌｂ／ｃマウスにおいて評価される。ＶＬＰは、それらが後に、トリス緩衝化生理食塩水に再懸濁され、かつ２０−６０％スクロース密度勾配上に層状化される、１０００００×ｇにおいて１時間に渡って２０％のスクロース緩衝を介して、ＶＬＰ含有培養培地をペレット化することによって精製される。ＶＬＰ含有画分は、ウエスタンブロットまたは赤血球凝集反応アッセイによって同定され、かつ貯蔵される。ＶＬＰ試料は、ＰＢＳ内において透析され、かつ遠心分離微量濃縮器を用いてか、または１０００００×ｇにおいて遠心分離によって濃縮される。
免疫化に関して、４０μｌのキトサン、２０μｌのＶＬＰ（ｇａｇに基づく）、および５μｇのＭＰＬを含有する液体調合物（１５μｌ）は、単回の免疫化に関して２つの鼻孔に分けられる。動物は、０週および４週における鼻腔内投与の前に、イソフルランを用いて軽く麻酔される。また、ＶＬＰは、陽性対照としての腹腔内接種用に、ＭＰＬまたはコレラトキシンとともにＰＢＳにおいて調合される。付加的な陽性対照動物は、化学的に不活化したＭＤＣＫ細胞において増殖させたＡ／ＰＲ／８／３４ ウイルスを用いた、筋肉内接種を受ける。全身性のＩｇＧ応答は、赤血球凝集反応（ＨＡＩ）アッセイおよびＥＬＩＳＡによって観察される。ＥＬＩＳＡに関して、抗原の供給源は、昆虫細胞において産生されたＶＬＰを混入し得る血清産物に対する免疫応答の検出を避けるために、鶏卵において増殖されたＡ／ＰＲ／８／３４ ウイルスである。ウイルス攻撃に関して生存し続けない動物に関して、ブロンコアベオラ（ｂｒｏｎｃｏａｖｅｏｌａｒ）胃洗浄試料が、最後の免疫化の１０−１４日後に、インフルエンザ特異的ＩｇＡ応答のＥＬＩＳＡによる測定用に、回収される。
本実施例２および以下の実施例における典型的な免疫化実験は、１群ごとに最低でも８匹のマウスを採用し、これが、ステューデント独立ｔ検定を用いて示されるような統計的な有意さを達成する合理的な可能性を与える。免疫化は、各免疫化の１０−１４日後に起こる採血と、４週間の間隔を空けた初回免疫および追加免疫を、典型的に伴う。上述のように、ブロンコアベオラ胃洗浄試料は、ＩｇＡ測定用に、犠牲になった動物から回収される。
また、上述のように免疫化したマウスが、誘導された応答の防御的性質を確かめるために、マウス適合化Ａ／ＰＲ／８／３４ウイルスの約１０のＬＤ５０を用いて、鼻腔内的に攻撃される投与が、実施される。各群における動物（８匹）は、体重低下に関して監視され、かつ２５％の体重低下が観察される場合に、犠牲にされる。各群における残りの８匹の動物は、攻撃後の４日に犠牲にされ、鼻および肺の組織が回収され、かつ素早く凍結される。組織は、後ほど融かされ、冷ＰＢＳにおいてホモジナイズされ、不純物が取り除かれ、かつＭＤＣＫ細胞におけるプラークアッセイによってウイルスに関する力価測定される。表１は、本実施例２に関する動物研究の概要を示す。
Figure 0005683811
（実施例４：増強したＶＬＰの産生および免疫原性試験）
本実施例４は、適応性の免疫応答の強度を高めるためのＴＬＲ５アゴニストであるフラゲリンの組み込みによって、ならびに連続変異バリアントおよび異種亜型に対する防御を向上するためのＭ２外部ドメインエピトープの組み込みによって、向上した免疫原性および防御に対するＶＬＰ増強を証明している。
フラゲリン取り込みに起因する免疫賦活作用
フラゲリンコーディング配列は、最近になってＳ．ティピムリウムのゲノムＤＮＡからクローン化され、かつ終止コドンまでのちょうど５’までをｇａｇコーディング配列の３’末端に挿入された。また、フラゲリンコーディング配列は、シグナル配列および成熟なコーディング配列の間における境界に位置するＰｓｔＩ部位を用いて、Ａ／ＰＲ／８／３４のＮ末端に挿入されている。ＨＡにおけるこの配置におけるＨＡは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって証明されているような予想される分子量の増加を伴う、キメラＨＡ分子の適切な発現を導く。フラゲリン修飾ｇａｇおよびＨＡコーディング配列は、実施例１に記載されるような３重バキュロウイルス組み換え体（ＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ）を生成するために使用される。フラゲリン修飾ｇａｇまたはフラゲリン修飾ＨＡを有するＶＬＰをコードする組み換えバキュロウイルスは、産生され、かつフラゲリン配列を欠如する基本的なＶＬＰをと比較した、免疫原性試験用のＶＬＰを生成するために使用される。実施例３に述べたように、免疫化試験のすべては、４週間の間隔を空けて初回接種および追加接種を用いた。免疫応答的な読み出しは、全身性ＩｇＧ応答および粘膜ＩｇＡ応答の両方を試験する、上述のようなＨＡＩおよびＥＬＩＳＡアッセイを介してである。
フラゲリン組み込み用のＨＡおよびｇａｇ挿入部位は、ＶＬＰの内部および外部のそれぞれにあるので、異なる程度の免疫賦活作用が観察される。ＨＡのＮ末端におけるフラゲリン挿入は、上皮粘膜における細胞上のＴＬＲ５受容体に対するフラゲリンの容易な接近を生じる。対照的に、挿入のｇａｇ部位は、異なる接近を生じる。細胞に対するＶＬＰ結合および通常のインフルエンザウイルスの侵入経路を介した内部移行は、細胞内におけるｇａｇ−フラゲリン産物の堆積を生じる。これは、ｇａｇ−フラゲリンおよびＨＡ−フラゲリン構築物の間におけるＴＬＲ５媒介免疫賦活作用を生じる。粘膜上皮細胞に対するＶＬＰの結合能および侵入能が、免疫原性に対する影響を本来的に有しているので、我々は、ＴＰＣＫトリプシン処理の有無における、フラゲリン修飾のおよび通常のＶＬＰＶＬＰ免疫原性研究を実施する。トリプシン処理したＶＬＰのＨＡ切断は、ＶＬＰ侵入の重要性を試験する免疫原性研究を始める前に、ウエスタンブロットによって確認される。さらに、トリプシン処理したＶＬＰの、細胞との融合能および細胞への侵入能が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）修飾ｇａｇ産物を含有するＶＬＰを採用する、インビトロ蛍光顕微鏡研究によって試験される。ＭＬＶ ｇａｇが、出芽活性の抑止なしで、ＧＦＰを用いてＣ末端修飾され得ることは、すでに示されている（６０）。
また、フラゲリンの非ＴＬＲ結合領域の多くを除去することによってｇａｇ出芽活性を最大化するための、フラゲリンコーディング配列の細断片の利用が、試験される。フラゲリン単量体内におけるＴＬＲ５認識部位の最近の解析は、この試みを容易にする（７３）。
Ｍ２エピトープ挿入を介した増強された防御
Ｍ２外部ドメインエピトープコーディング配列は、ＰＣＲによって生成され、かつこの配列の１コピーが、単一のペプチドおよびＰＲ／８／３４ ＨＡの成熟コーディング配列と境を接するＰｓｔＩ部位に挿入される。昆虫細胞におけるこのキメラ体の発現のウエスタンブロット分析は、ＨＡ特異的およびＭ２特異的な抗体と反応する、予想された大きさのキメラＨＡ−Ｍ２産物を示した（図示せず）。この同じ位置においてＭ２の２つおよび３つの縦列コピーを含有する構築物が、進行中である。ＨＡ（Ｍ２）−ｇａｇ−ＮＡ ＶＬＰをコードする３重発現バキュロウイルス組み換え体（Ｍ２の１、２または３コピーを有する）は、基本のＶＬＰに対しての、免疫原性および攻撃防御の比較用に産生される。マウスは、上述のように鼻腔内のキトサン／ＭＰＬ調合物を用いて免疫化され、かつ免疫応答は、ＨＡＩおよびＥＬＩＳＡアッセイを介して監視される。ＥＬＩＳＡアッセイは、ＨＡ／ＮＡおよびＭ２に対する応答を別々に監視するために、完全なウイルスまたはＭ２外部ドメインペプチドのいずれかを採用する。さらに、免疫化された動物は、同型防御および異種亜型防御のそれぞれを監視するために、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）またはＡ／ＫＨ／６８（Ｈ３Ｎ２）のいずれかを用いて攻撃される。攻撃後における体重低下／生存およびＭＤＣＫ細胞におけるウイルスの力価測定は、上述のように実施される。以下の表２は、特定の目標２（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｉｍ ２）を目的とした動物実験の概要を示している。
上述のように、Ｎ末端において単コピーのＭ２外部ドメイン配列を含有する組み換えＨＡ分子は、上手く発現されている。ＮＡ非存在下のＳｆ９における通常のＨＡ発現は、有意な細胞の凝集および融合を生じる。同様に、Ｍ２修飾ＨＡ構築物の発現は、Ｍ２と共発現したＨＡが機能的であることを示して、細胞の凝集および融合の同一の様式を生じた。さらにまた、Ｎ末端に５００ｂｐの配列を含有する組み換えＨＡは、上手く発現されるので、より大きな他の構築物を発現することは、出くわす問題（もしあるとすれば、この位置におけるさらなるフラゲリンコーディング配列の挿入および複数のＭ２の挿入が挙げられるが、これらに限定されない）がより少なくなる。
Figure 0005683811
（実施例５：Ｈ５含有ＶＬＰの免疫原性および防御的有効性の測定）
Ａ／ベトナム／１２０３／０４（Ｈ５Ｎ１）およびＡ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）のＨＡおよびＮＡ遺伝子は、Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰの産生および続くＨ５Ｎ１の免疫原性研究用に取得されている。両方のＨ５Ｎ１株から得られるＨＡ−ｇａｇ−ＮＡをコードする３重のバキュロウイルス発現ベクターは、実施例３に記載されているように、産生され、かつ性質決定されている。２つの３重バキュロウイルス発現ネクターによってコードされる、ベトナムおよびインドネシアのＨ５Ｎ１ ＶＬＰは、２０−６０％スクロース密度勾配における層状化によって精製され、かつＶＬＰを含有する画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、および赤血球凝集反応アッセイによって同定された。３つのアッセイのすべては、多量のＨ５Ｎ１ ＶＬＰを含有するような同じピーク画分を同定した。マウスの免疫化に関して、ピーク画分が貯蔵され、トリス緩衝化生理食塩水を用いて３倍に希釈され、かつＶＬＰが、１０００００×ｇにおける遠心沈降によって濃縮され、かつＰＢＳにおいて再懸濁された。
Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰの免疫原性を調べるために、１５匹および１６匹のマウスの２つの群が、Ａ／ベトナム／１２０３／０４ ＶＬＰおよびＡ／インドネシア／５／０５ ＶＬＰのそれぞれを用いた筋肉内接種によって免疫化された。ＶＬＰを含んだ接種（ＰＢＳにおける約１０μｌ）は、１０μｇのＭＰＬを用いて補った。動物は、２回の当該免疫化を４週の間隔を空けて受け、かつ血清試料は２回目の免疫化の１４日後に回収された。図８は、ＥＬＩＳＡアッセイに使用される市販の組み換えＨ５ ベトナム ＨＡ分子に対する免疫化マウスから得られる、血清の特異性を示している。強いＨ５特異的反応性は、Ｈ５Ｎ１ ＶＬＰ調製物のいずれかを用いて免疫化したマウスにおいて観察されるが、Ｈ５反応は、未処理対照マウスにおいて観察されなかった。
Ｈ５特異的応答が、異種亜型のＨ１Ｎ１攻撃に対する防御を誘導するか否かを決定するために、Ｈ５Ｎ１免疫化マウスのすべて、および１６匹の未処理対照マウスは、１０のＬＤ５０のＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１） ウイルスを用いて攻撃された。図９は、未処理群において０／１６の生存個体、インドネシアＨ５Ｎ１免疫化群において１１／１６の生存個体、そしてベトナムＨ５Ｎ１免疫化群において１３／１５の生存個体がいる、この研究における攻撃後の体重低下データを示している。攻撃後５日において、Ｈ５免疫化マウスは、未処理マウスと比較して低い体重低下を示し始め、かつ９日において低下した体重を取り戻し始めた。未処理のマウスは、すべての動物が死ぬまで、体重を低下させ続けた。これらのデータは、このインフルエンザワクチン技術プラットホームを用いて得られ得る防御の広さを示している、キメラＨ１Ｎ１ ＶＬＰが、Ｈ１Ｎ１攻撃に対する部分的な異種亜型防御（７７％の生存個体）を誘導できることを証明している。
（実施例６：Ｈ１およびＨ５増強ＶＬＰワクチンに対する、ウサギにおける乾燥粉末の鼻腔内調合物の評価）
鼻腔内ワクチンの乾燥粉末調合物は、液体調合物と比較して、増強された有効性を示している（４２−４４）。マウスは、鼻腔内の乾燥粉末送達には小さすぎ、かつ鼻腔内の乾燥粉末ワクチンがウサギモデルにおいて証明されているので、ウサギが、乾燥粉末調合物および免疫化研究に利用される。
重要な検討事項は、この計画において産生されるインフルエンザイＶＬＰが、凍結乾燥され、かつＶＬＰ構造および免疫原性を脅かすことなく乾燥粉末として調合され得る程度である。乾燥粉末ワクチンに関する過程は、ガラスの乳鉢および乳棒を用いた混合を介してキトサンが加えられた後における、充填剤として働く過剰のマンニトールの存在下における、ＭＰＬおよびワクチンの凍結乾燥に関する（４４）。最終混合物は、バロア モノパウダー（Ｖａｌｏｉｓ Ｍｏｎｏｐｏｗｄｅｒ）鼻腔内送達装置に充填される前に、２５０ミクロンのふるいに通される。また、マンニトールが好適な充填剤として採用されている一方において、マンニトールは、凍結乾燥の間におけるリン脂質：コレステロール リポソームの安定性に寄与することが示されている（１０４）。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の添加は、リポソーム統合性をさらに増強させることができ、かつ凍結乾燥の間における成分の損失を最小化することができる（１０４）。また、本明細書に記載されているＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ ＶＬＰが、脂質ラフトドメインを通って出芽することを介したリン脂質：コレステロール膜から構成されているので、凍結乾燥の間における統合性は、マンニトールおよびＰＶＰの存在によって増強される。
エンベロープを被ったＶＬＰを上手く凍結乾燥する能力に関するさらなる証拠は、生きたインフルエンザウイルスおよび他のエンベロープウイルスが、感染性の低下を最小限にして、凍結乾燥され得、かつ保存され得ることを示すデータに由来する（１０５−１０７）。最も新しいデータは、リン酸緩衝化生理食塩水、ＳＰＧ（スクロース、１塩基および２塩基のリン酸カリウム、ならびにグルタミン酸カリウム）およびカシトン（Ｃａｓｉｔｏｎｅ）（カゼイン加水分解産物）の存在下における、低温生存適合の弱毒化インフルエンザウイルスの成功した凍結乾燥および貯蔵を証明している。また、カゼインと比較して低アレルギー誘発性であり、かつ牛乳アレルギーである子供に安全に与えられ得るので、カゼイン加水分解産物は、鼻腔内粉末送達にとって受容可能な充填剤として働くことができる（１０８）。
動物の免疫化の前に、種々の凍結乾燥調合物は、乾燥粉末調合物にとっての、ＶＬＰの構造および抗原統合性を最適化するために、試験される。安定化剤の濃度の変動を有する、マンニトール、マンニトール＋ＰＶＰ、およびＳＰＧ＋カシトンを含有する調合物が試験される。凍結乾燥に続くＶＬＰ統合性の分析は、ショ糖密度勾配による層状化の後におけるＶＬＰの再水和に関する。勾配画分は、ＨＡおよびｇａｇの存在に関してウエスタンブロットによって分析され、かつＨＡの統合性は、ＨＡアッセイによって観察される。非凍結乾燥対照と比較して最も一致するＶＬＰ統合性を示す調合物は、続く乾燥粉末ワクチン調合物に採用される。
キトサンおよびＭＰＬを含有する増強したＨ１ ＶＬＰの液体、および乾燥粉末の鼻腔内調合物の、ウサギにおける有効性が、比較される。それぞれ６匹のウサギの２群は、液体および乾燥粉末の調合物のそれぞれを用いた増強したＨ１ ＶＬＰを用いて免疫化される。２匹のウサギの付加的な群は、陽性対照（ｉ．ｍ． ＶＬＰ＋ＭＰＬ）および陰性対照（鼻腔内のキトサンのみ）としての役割を果たす。初回免疫および追加免疫に続いて回収される血清試料は、ＥＬＩＳＡおよびＨＡアッセイを介してインフルエンザ反応性に関して試験される。応答が不十分と思われる場合には、２回目の追加免疫化が行われる。同型のＨ１攻撃または異種亜型（Ｈ３Ｎ２）の攻撃に対する防御に関する証拠は、攻撃の１時間前における、マウスに対する免疫ウサギ血清の受動伝達（マウスごとに貯蔵群のウサギ血清の１ｍｌの腹腔内注射）によって得られる。マウス攻撃群のそれぞれは、１６匹の動物を含み、その内の８匹は、体重低下について観察され、かつ８匹は、肺におけるウイルス力価測定用に４日に犠牲にされる。実施例６ 動物研究に関する概要の表は、以下にある（表４）。
Ｈ１ウサギ免疫化試験から得られるデータが、鼻腔内乾燥粉末ワクチンの有効性の証拠を示す場合には、確証的な鼻腔内乾燥粉末実験が、ウサギにおいて増強されたＨ５ ＶＬＰワクチンを用いて、同様に実施される。この目的のために、６匹のウサギの２群のそれぞれが、増強したＨ５／ベトナム ＶＬＰ、およびＨ５／インドネシア ＶＬＰのそれぞれを有する鼻腔内乾燥粉末送達を介して免疫化される。動物それぞれは、０日および２８日に初回免疫および追加免疫を受ける。陰性対照群は、キトサンのみのワクチンを受ける。２回目の免疫化から１４日において回収されるウサギ血清は、Ａ／ベトナム／１２０３／０４に対する中和活性に関して分析される。必要に応じて、２回目の追加免疫化が行われる。ウサギは、ウサギは採血され、かつ貯蔵群の血清は、マウスの受動免疫化、および群ごとに１６匹のマウス（体重低下／生存について観察される８匹のマウス、およびＭＤＣＫ細胞におけるウイルス力価測定用に４日に犠牲にされる８匹のマウス）を使用してＡ／ベトナム／１２０３／０４を用いた攻撃に使用される。この実験から得られるデータは、増強したＨ５ ＶＬＰワクチンを用いた鼻腔内乾燥粉末免疫化が、同型防御および連続変異バリアント防御を誘導するか否かを決定する。
Figure 0005683811
（実施例７：基本的なＶＬＰは、マウスにおける致死的な攻撃に対する同型防御および異種亜型防御を誘導する）
免疫化に対して、基本的なＨ１Ｎ１ ＶＬＰ（ｇａｇ＋ＨＡ（Ｈ１）＋ＮＡ（Ｎ１））、およびマウス適合化Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ／８／３４）ウイルス、およびＨ３Ｎ２スワーム（Ａ／ＨＫ／６８＋Ａ／Ｍｅｍ／８５）攻撃ウイルスを採用する、免疫化ならびに攻撃研究が、実施された。図５は、生理食塩水における５μｇのＨ１Ｎ１ ＶＬＰおよび２０μｇのモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）を伴った初回免疫および追加免疫の後における、マウスにおける赤血球凝集反応阻害（ＨＡＩ）力価を示す。Ｉ．Ｐ．免疫化は、４週間の間隔を空けられ、かつ血清試料は、免疫化のそれぞれの２週間後に回収された。血清試料は、受容体破壊酵素（ＲＤＥ）を用いて処理され、かつ新鮮なヒヨコのＲＢＣを採用する標準的なアッセイを用いて、ＨＡＩ活性についてアッセイされた。１６匹のＶＬＰ免疫化マウスのすべては、鶏卵増殖Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ／８／３４）に対する強いＨＡＩ力価を示した。予想される通り、ＨＡＩ活性は、Ｈ３Ｎ２スワーム（Ａ／ＨＫ／６８＋Ａ／Ｍｅｍ／８５）に対して観察されなかった。また、未処理対照動物は、Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２ウイルスのいずれかに対してもＨＡＩ反応性を示さなかった。
追加免疫後の５週間において、ワクチン接種マウスおよび未処理マウス（１群ごとに１６匹のマウス）は、８匹のマウスからなる２つの集団に分けられ、かつ１０ＬＤ５０のマウス適合化Ｈ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ／８／３４）、およびＨ３Ｎ２スワーム（Ａ／ＨＫ／６８＋Ａ／Ｍｅｍ／８５）のそれぞれを用いて攻撃された。また予想外に、１００％の生存は、検出可能なあらゆるＨ３ ＨＡＩ活性が存在しないにもかかわらず（他の液性アッセイおよび細胞性アッセイがさらに実施されるべきである）、Ｈ３Ｎ２スワームを用いて攻撃されたＶＬＰワクチン接種動物において、観察された。Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２を用いて攻撃されたすべての未処置動物は、顕著な死亡率を示し、かつ未処理攻撃群のそれぞれにおける動物の７／８匹が、死亡したか、または瀕死であると気付いた後に犠牲にされた。
攻撃の後における体重低下データは、図７においてプロットされており、かつ種々の群における死亡率の異なる様式を明らかにしている。動物は、病期の徴候および体重低下について毎日、調べられた。予想通りに、Ｈ１Ｎ１を用いて攻撃されたＶＬＰワクチン接種動物は、体重低下を示す場合でもわずかに示し、病気の徴候を示さなかった。一方において、Ｈ３Ｎ２スワームを用いて攻撃されたＶＬＰワクチン接種動物は、初期体重の約１５％の最大の体重低下を示したが、攻撃後１３日にまでに低下した体重のほとんどを回復した。これらの動物は、十分に活動的であり、かつ孵化手金徴候に関してわずかに示した。上述のように、未処置の動物のすべては、生存データおよび体重低下データの両方によって示されるように、Ｈ１およびＨ３攻撃に対して十分に感受性であった。
図６および７における生存データおよび体重低下データは、インフルエンザウイルス攻撃に対する有意な異種亜型防御を誘導する、この技術プラットホームの固有の能力を証明している。マウスおよび他のモデルにおけるインフルエンザに対する異種亜型防御は、実際の感染または（不活化免疫原というよりも）生ワクチンと関連付けられ、かつしばしばＮＰおよびＭ１、およびＭ２といった保存された抗原を認識する液性成分および細胞性成分の両方と、関与することを示されている。Ｈ１ ＨＡおよびＮ１ ＮＡのみを含有する非複製性ＶＬＰワクチンを用いた、この実験において証明されている、異種亜型防御は予想外である。Ｈ３Ｎ２ウイルスが、Ｈ３Ｎ２の２つの連続変異バリアントを包含したスワームウイルスであったことは、特に注目に値する。従って、ＶＬＰワクチンは、インフルエンザウイルスの異なるサブタイプの２つのバリアントに対する防御を与えた。異種亜型防御の機序を割り出すために、付加的な研究が進行中である一方において、これらのデータは、広範に分岐するウイルスに対する防御を与えるこのＶＬＰワクチンプラットホームの固有の健全さを証明する。これは、利用可能なワクチンおよび循環するウイルスが不完全にしか適合し得ない場合に、世界的流行病の恐れといった状況において、明らかに重要である。
〔付加的な参考文献〕
以下の参考文献は、それらのすべてが教示することについて参照することによって、本明細書によって組み込まれる。
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別個のＧａｇ、ＨＡまたは対照ベクターならびにＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ三重ベクターを用いて感染させたＳｆ９細胞からの培地の、ウエスタンブロッティングを示す。 ペレット化されたＨＡ−ｇａｇ−ＮＡ ＶＬＰのスクロース段階勾配遠心分離から得られる画分の、ウエスタンブロッティングを示す。 ｉ．ｎ．およびｉ．ｐ．免疫群における動物の１００％が、防御レベルのＨＡＩ力価（１：４０、グラフにおいて破線によって示される）、または初回免疫に続いてより高い力価を伴って応答した、ＨＡＩアッセイの結果を示す。 実施例１に関する３重発現ベクターにおけるコーディング配列の配置を示す。 ｉ．ｐ．接種を介した初回免疫および追加免疫に続く、ｇａｇ−ＨＡ−ＮＡ ＶＬＰ（Ｈ１Ｎ１）の免疫原性を示す。 Ｈ１Ｎ１攻撃およびＨ３Ｎ２スワーム攻撃に続く、ＶＬＰワクチン接種マウスおよび未処置マウスから得られる生存データを示す。 Ｈ１Ｎ１攻撃およびＨ３Ｎ２スワーム攻撃に続く、ＶＬＰワクチン接種マウスおよび未処置マウスから得られる体重低下データを示す。 ＥＬＩＳＡアッセイに使用される、市販の組み換えＨ５ベトナムＨＡ分子について免疫されたマウスから得られる血清の特異性を示す。 Ｈ１Ｎ１攻撃に続いて、インドネシアＨ５Ｎ１ ＶＬＰをワクチン接種したマウス、ベトナムＨ５Ｎ１ ＶＬＰをワクチン接種したマウス、および未処置マウスから得られる体重低下データおよび生存データを示す。

Claims (17)

  1. ｇａｇポリペプチド、インフルエンザのヘマグルチニンポリペプチド、およびインフルエンザのノイラミニダーゼポリペプチドを包含するキメラインフルエンザウイルス様粒子であって、
    上記ヘマグルチニンポリペプチドが、インフルエンザ抗原に対して共有結合的に連結されており、
    上記キメラインフルエンザウイルス様粒子は昆虫細胞から生成されている、キメラインフルエンザウイルス様粒子。
  2. 上記ｇａｇポリペプチドが、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルスおよびレンチウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスから得られる請求項１に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子。
  3. 上記インフルエンザ抗原が、インフルエンザウイルスＭ２エピトープである請求項１に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子。
  4. 上記ウイルス様粒子との混合物において免疫賦活剤をさらに包含する請求項１に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子。
  5. 上記免疫賦活剤が、上記ウイルス様粒子の内部または外部にある請求項４に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子。
  6. 上記免疫賦活剤が、上記ウイルス様粒子の内部にあり、上記免疫賦活剤が、上記ｇａｇポリペプチドに対して共有結合的に連結されて、共有結合を形成している請求項５に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子。
  7. 上記免疫賦活剤が、上記ウイルス様粒子の外側にあり、上記ヘマグルチニンポリペプチドに対して共有結合的に連結されて、共有結合を形成している、請求項５に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子。
  8. 上記免疫賦活剤が、上記ウイルス様粒子の外側にあり、上記ノイラミニダーゼポリペプチドに対して共有結合的に連結されて、共有結合を形成している請求項５に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子。
  9. ｇａｇポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、インフルエンザのノイラミニダーゼポリペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列、およびインフルエンザのヘマグルチニンポリペプチドをコードする第３のヌクレオチド配列を包含し、ここで、昆虫細胞における発現によって、上記ポリペプチドが、キメラウイルス様粒子を形成し、
    第１、第２、および第３のヌクレオチド配列が、単一の発現ベクター内にある、キメラインフルエンザウイルス様粒子発現ベクター系。
  10. 第１、第２、および第３のヌクレオチド配列が、単一のプロモータに対して作動可能に連結されている請求項９に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子発現系。
  11. キメラインフルエンザウイルス様粒子の製造方法であって
    （ａ）ｇａｇポリペプチド、インフルエンザのヘマグルチニンポリペプチド、およびインフルエンザのノイラミニダーゼポリペプチドをともに発現する１つ以上の発現ベクターを準備すること；
    （ｂ）培地における昆虫細胞内に上記１つ以上の発現ベクターを導入すること；
    （ｃ）上記ｇａｇポリペプチド、ヘマグルチニンポリペプチド、およびノイラミニダーゼポリペプチドを発現して上記キメラインフルエンザウイルス様粒子を製造すること；ならびに
    （ｄ）上記昆虫細胞が培養されている培地から上記キメラインフルエンザウイルス様粒子を回収することを包含しており、
    上記発現ベクターが、バキュロウイルスベクターである、方法。
  12. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のキメラインフルエンザウイルス様粒子の免疫原性のある量を包含する、薬学的組成物。
  13. インフルエンザの処置または予防のための医薬品を製造するための、ｇａｇポリペプチド、インフルエンザのヘマグルチニンポリペプチド、およびインフルエンザのノイラミニダーゼポリペプチドを含んでおり、昆虫細胞を用いて生成されるキメラインフルエンザウイルス様粒子の、使用。
  14. 対象に対する上記医薬品の投与によって、上記対象における防御免疫応答が誘導される請求項１３に記載の使用。
  15. 処置されるかまたは予防される上記インフルエンザが、ヘマグルチニンポリペプチドの連続変異バリアントを有するインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザ、およびノイラミニダーゼポリペプチドの連続変異バリアントを有するインフルエンザウイルスによって引き起こされるインフルエンザを含む請求項１３に記載の使用。
  16. 上記防御免疫応答は、異種亜型防御または連続変異バリアント防御を含んでおり、
    上記異種亜型防御はＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスに対する防御を含んでおり、
    上記ヘマグルチニンポリペプチドはＨ５であり、かつ上記ノイラミニダーゼポリペプチドはＮ１である請求項１４に記載の使用。
  17. 上記防御免疫応答は、異種亜型防御または連続変異バリアント防御を含んでおり、上記異種亜型防御が、Ｈ３Ｎ２ インフルエンザウイルスに対する防御を含み、かつ上記ヘマグルチニンポリペプチドが、Ｈ１であり、かつ上記ノイラミニダーゼポリペプチドが、Ｎ１である請求項１４に記載の使用。
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